專利名稱：：生產(chǎn)和純化甲型肝炎滅活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)和純化曱型肝炎疫苗的方法，屬于醫(yī)藥生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：曱型肝i^l:由曱型肝炎病毒(HAV)引起的一種以肝臟損害為主要特征的高發(fā)病率的急性傳染病。我國(guó)是世界上曱肝流行最嚴(yán)重的國(guó)家，在已知的所有病毒性肝炎中，曱肝的發(fā)病率具首位。而接種甲肝疫苗是預(yù)防曱肝流行最有效的方法。我國(guó)在90年代初研制成功曱肝減毒活疫苗，10年后又成功研制了曱型肝炎滅活疫苗(Vero細(xì)胞)，這兩種疫苗的研制成功與廣泛使用，為降低我國(guó)曱型肝炎的發(fā)病率，控制曱型肝炎的爆發(fā)流行，起到了極其重要的作用?，F(xiàn)有曱型肝炎疫苗的細(xì)月驢質(zhì)均為人二倍體細(xì)胞，而且均采用單層細(xì)胞瓶培養(yǎng)，細(xì)胞密度低、繁殖效率不高是其共同缺點(diǎn)，而制備曱肝疫苗需要大量的病毒抗原，這是曱肝疫苗生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量難已擴(kuò)大的根本原因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能提高細(xì)胞密度、提高病毒產(chǎn)量、P爭(zhēng)低生產(chǎn)成本的生產(chǎn)純化曱型肝炎疫苗的方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種生產(chǎn)純化曱型肝炎滅活疫苗的方法，其特征在于其工藝步驟為1)從工作細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇Vero細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞的傳代擴(kuò)增，將Vero細(xì)胞接種于2-5層2~5升的盛放培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)瓶中，進(jìn)行高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含2-10%新生小牛血清的199培養(yǎng)MMEM培養(yǎng)基，調(diào)PH至7.2~7.4;2)取工作種子毒種接種于Vera細(xì)胞，經(jīng)吸附后于33°C~37。C培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，其間換培養(yǎng)液3~5次；3)將經(jīng)過Vero細(xì)胞培養(yǎng)的含HAV病毒的細(xì)胞消化后"t^，通過離心后棄上清，加磷酸鹽緩沖液懸浮制成曱肝病毒原液；4)曱肝病毒原液經(jīng)過破碎后，加入氯仿，振搖離心取上層水相，然后再加入磷酸鹽緩沖液，重復(fù)抽提35次，制成粗制曱肝病毒液；5)粗制曱肝病毒液經(jīng)超濾濃縮后，再經(jīng)疏水柱、凝膠柱兩步純化，最后過濾除菌，收集過濾液為純化曱肝病毒液；6)將純化曱肝病毒液進(jìn)行滅活；7)滅活后的甲肝病毒液經(jīng)過佐劑吸附后，制成曱肝半成品，分裝得曱型肝炎滅活疫苗。進(jìn)一步，第5)步中釆用超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，該超濾膜的膜孔的孑L徑為五萬(wàn)十萬(wàn)分子量。采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明采用2~5層2~5升轉(zhuǎn)瓶^姿照已篩選的培養(yǎng)^4f進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度iiJiJ0.8~1.2x107個(gè)/ml,,與原有的工藝相比細(xì)胞密度提高了3~5倍，大幅度降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，并可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。附圖為;^發(fā)明的工藝流4I圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。如圖所示，一種生產(chǎn)和純化曱型肝炎滅活疫苗的方法，工藝步驟為自液氮容器中取出工作庫(kù)中的Vero細(xì)胞(細(xì)胞為國(guó)家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的ATCC系Vero細(xì)月&朱)，接種到細(xì)胞瓶中，加入培養(yǎng)液于37。C培養(yǎng)(培養(yǎng)液為含8%新生小牛血清的199培養(yǎng)基，調(diào)PH值至7.2~7.4)，長(zhǎng)成單層后用胰酶——EDTA消化，加入上述培養(yǎng)液，以1:3分種，每3天傳1次，直至獲得一定批量。將Vero細(xì)胞用胰酶——EDTA消化以1:50比例接種曱肝JS-4毒抹，37°C吸附40分鐘，接種于3層轉(zhuǎn)瓶中，加培養(yǎng)液。置35。C恒溫室進(jìn)行高密度培養(yǎng)。期間換4次維持液，到期后收毒，用胰酶消化細(xì)胞再加磷酸鹽緩沖液懸浮收集于離心杯中，離心后棄上清，用磷酸鹽緩沖液懸浮細(xì)胞(細(xì)胞密度為lxl07個(gè)/ml，)，即為病毒原液，置-2(TC凍存。取出病毒原液化凍后用超聲破^ff義破碎細(xì)胞至破碎率95%以上，加入等體積氯仿，經(jīng)氯仿抽提5次，3000rpm離心30分鐘jR^Ui層7K相，然后再加入等量磷酸鹽緩沖液，重復(fù)抽提35次，制成粗制曱肝病毒液，粗制曱肝病毒液先采用十萬(wàn)分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮后，再經(jīng)疏7K柱、^0交柱2步純化，最后用0.22jum濾膜除菌過濾，收集過濾液。將純化樣品在無(wú)菌條件下加入終濃度為1:4000的福爾馬林，置37。C恒溫室，滅活12天后加入NaHS03中和。滅活后的曱肝病毒液檢定合格后，根據(jù)病毒抗原滴度水平可作適度稀釋，加入氫氧化鋁配制半成品，將制備好的半成品按成人劑量為l.lml/瓶，兒童劑量為0.6ml/瓶分裝于無(wú)菌的西林瓶中制成成品疫苗。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)和純化甲型肝炎滅活疫苗的方法，其特征在于其工藝步驟為1)從工作細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇Vero細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞的傳代擴(kuò)增，將Vero細(xì)胞接種于2～5層2～5升的盛放培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)瓶中，進(jìn)行高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含2-10％新生小牛血清的199培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基，調(diào)PH值至7.2～7.4；2)取工作種子毒種接種于Vero細(xì)胞，經(jīng)吸附后于33℃～37℃培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，其間換培養(yǎng)液3～5次；3)將經(jīng)過Vero細(xì)胞培養(yǎng)的含HAV病毒的細(xì)胞消化后收獲，通過離心后棄上清，加磷酸鹽緩沖液懸浮制成甲肝病毒原液；4)甲肝病毒原液經(jīng)過破碎后，加入氯仿，振搖離心取上層水相，然后再加入磷酸鹽緩沖液，重復(fù)抽提3～5次，制成粗制甲肝病毒液；5)粗制甲肝病毒液經(jīng)超濾濃縮后，再經(jīng)疏水柱、凝膠柱兩步純化，最后過濾除菌，收集過濾液為純化甲肝病毒液；6)將純化甲肝病毒液進(jìn)行滅活；7)滅活后的甲肝病毒液經(jīng)過佐劑吸附后，制成甲肝半成品，分裝得甲型肝炎滅活疫苗。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)和純化曱型肝炎滅活疫苗的方法，其特征在于所述第5)步中采用超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，該超濾膜的膜孔的孑L徑為五萬(wàn)~10萬(wàn)分子量。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)和純化曱型肝炎滅活疫苗的方法，其特征在于所述第7)步中采用的佐劑為氫氧化鋁。全文摘要一種生產(chǎn)和純化甲型肝炎滅活疫苗的方法，其工藝步驟為從工作細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇Vero細(xì)胞，將Vero細(xì)胞接種于2～5層2～5升的盛放培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)瓶中，進(jìn)行高密度培養(yǎng)，取工作種子毒種接種于Vero細(xì)胞，經(jīng)吸附后培養(yǎng)至病毒增殖高峰期；將經(jīng)過Vero細(xì)胞培養(yǎng)的含HAV病毒的細(xì)胞消化后收獲，通過離心后棄上清，加磷酸鹽緩沖液懸浮制成甲肝病毒原液；甲肝病毒原液經(jīng)過破碎后，加入氯仿，掁搖離心取上層水相，然后再加入磷酸鹽緩沖液，制成粗制甲肝病毒液，經(jīng)超濾濃縮后，再經(jīng)疏水柱、凝膠柱兩步純化，最后過濾除菌，收集過濾液為純化甲肝病毒液，進(jìn)行滅活，然后經(jīng)過佐劑吸附后，制成甲肝半成品，分裝得甲型肝炎滅活疫苗。本發(fā)明能提高細(xì)胞密度、提高病毒產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，并可實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。文檔編號(hào)A61K39/29GK101306199SQ20071002242公開日2008年11月19日申請(qǐng)日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2007年5月18日發(fā)明者張玉慧,曹雨露,峰許,趙永強(qiáng),金曉中申請(qǐng)人:江蘇延申生物科技股份有限公司