專利名稱：結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物，具體的說，涉及結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管阻斷劑(Vascular Disrupting Agents，VDA)是近年來出現(xiàn)的抗血管、抗腫瘤藥物領(lǐng)域的一支重要的生力軍。血管阻斷劑(VDA)從機(jī)理上源自于微管蛋白結(jié)合，屬于抗微管藥物。研究認(rèn)為，微管蛋白分子結(jié)構(gòu)中有三個(gè)較為明確的小分子結(jié)合部位，即秋水仙堿結(jié)合部位(Colchicine domain)、長春堿結(jié)合部位(Vinca domain)和紫杉烷結(jié)合部位(Taxane site)，前兩者定位于聚合前的微管蛋白，后者定位于聚合后的微管。與秋水仙堿及長春堿部位相結(jié)合的配體能干擾、阻斷微管的形成，而與紫杉烷部位結(jié)合的配體能穩(wěn)定微管，最終都能阻斷有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
早期發(fā)現(xiàn)的具有抑制微管蛋白作用的化合物應(yīng)屬秋水仙堿(Colchicine)，但由于秋水仙堿的產(chǎn)生毒副作用的劑量與治療劑量相差無幾，臨床應(yīng)用受到極大的限制。目前，已在歐美進(jìn)入臨床研究、具有代表性的VDA類藥物主要有CA4P、CA1P(即Oxi-4503)、
AVE-8062(即AC-7700)、ZD-6126、DMXAA(即AS-1404)及TZT-1027等等。為更有利于血液給藥及提高靶向性，這些化合物大都被設(shè)計(jì)成為水溶性前體藥物，當(dāng)其進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)相應(yīng)的磷酸酯酶或氨基肽酶水解而釋放出原藥，發(fā)揮抗血管、抗腫瘤作用。
在VDA中具有開創(chuàng)意義和領(lǐng)先水平的化合物當(dāng)屬CA4P(Combretastatin A4 Prodrug)。CA4P是第一個(gè)進(jìn)入臨床研究的VDA，它是從非洲灌木Combretum Caffrum的樹皮中分離得到的一種多取代二苯乙烯類化合物、高活性抗腫瘤天然產(chǎn)物——CA4(Combretastatin A4)的磷酸酯化前體藥物。研究證實(shí)CA4是強(qiáng)效的微管蛋白結(jié)合劑，能與微管蛋白β亞基結(jié)合、干擾微管及紡錘體形成、阻斷有絲分裂過程，CA4能區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在增殖特性、細(xì)胞脆性、蛋白水平等方面的差異，選擇性的作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其變形、膨脹、從基底膜上脫落、使腫瘤血管堵塞、關(guān)閉，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性死亡。同時(shí)，對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞及其他非異常增殖的細(xì)胞影響很小。但CA4的水溶性極差，難以通過血管給藥。1995年，Pettit等人設(shè)計(jì)合成了CA4的磷酸酯化二鈉鹽前體藥物CA4P，極大的改善了其水溶性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，利用磷酸酯酶在增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的濃度高于正常細(xì)胞中的特點(diǎn)，使CA4P在腫瘤血管中被選擇性激活，靶向的釋放出CA4并發(fā)揮抗血管、抗腫瘤作用。
近年來的研究認(rèn)為，由于VDA類藥物作用于腫瘤血管并使其關(guān)閉，其對(duì)深部腫瘤細(xì)胞的作用較強(qiáng)，而對(duì)可從正常組織獲取養(yǎng)分的外周腫瘤細(xì)胞的殺傷作用較弱，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)給予VDA類藥物，腫瘤邊緣部位細(xì)胞仍能保持活力并繼續(xù)生長。但VDA類藥物的作用機(jī)理及特點(diǎn)正好與傳統(tǒng)的放化療互補(bǔ)(傳統(tǒng)放化療對(duì)供氧充足的外周腫瘤細(xì)胞殺傷作用較強(qiáng)，而對(duì)深部腫瘤效果較差)，因此，VDA類藥物適合與其他治療方式聯(lián)合應(yīng)用，目前正在進(jìn)行的臨床研究也反應(yīng)了這一點(diǎn)。如有關(guān)CA4P的9項(xiàng)臨床研究中，除退行性甲狀腺癌(ATC)、近視性黃斑病變(MMD)和老年性黃斑病變(AMD)以外，其用于卵巢癌(Ovarian Cancer)、乳腺癌(Breast Cancer)、肺癌(Lung Cancer，包括晚期非小細(xì)胞肺癌NSCL)、頭頸癌(Head & Neck Cancer)、前列腺癌(Prostate Cancer)、結(jié)腸癌(Colorectal Cancer)、晚期復(fù)發(fā)性宮頸癌(Cervical Cancer)等的治療均與放化療聯(lián)合應(yīng)用。另外，由于CA1P作為更新一代的VDA，除保持優(yōu)良的抗血管活性外，其直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯提高，CA1P單獨(dú)用藥的療效明顯優(yōu)于其他VDA。因此，需要進(jìn)一步開發(fā)兼有良好抗血管作用及直接抗腫瘤作用的新型VDA藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物的結(jié)構(gòu)如通式(I)所示
其中，R為-OH或-OPO(ONa)2。
當(dāng)R＝-OH時(shí)，名稱為(Z)-3，4′，5-三甲氧基-3′-羥基二苯乙烯，簡稱為M286，分子式為C17H18O4，分子量為286.32，為棕色液體；其結(jié)構(gòu)式如(II)所示 當(dāng)R＝-OPO(ONa)2時(shí)，名稱為(Z)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯-3′-O-磷酸酯二鈉鹽，簡稱為M410，分子式為C17H17Na2O7P，分子量為410.27，為白色固體；其結(jié)構(gòu)式如(III)所示
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物能用于制備抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤的藥物，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為M410對(duì)微管蛋白聚合的抑制作用圖；圖2為M410對(duì)人結(jié)腸癌(LoVo)在裸鼠體內(nèi)生長的抑制作用圖；圖3為M410單用及聯(lián)合5-Fu對(duì)人肝癌(HepG2)在裸鼠體內(nèi)生長的抑制作用圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1Combretastatin A4類似物的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)所選的細(xì)胞株包括人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，宮頸癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肝癌HepG2，結(jié)腸癌LoVo和白血病HL-60細(xì)胞株等。取對(duì)數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞制成一定濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入一定濃度的待測(cè)藥物，對(duì)照孔不加藥物，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)68小時(shí)加入MTT 100μg/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入200μL二甲基亞砜，震蕩15分鐘完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570/630nm雙波長吸光光度值，用Logit法計(jì)算抑制50％細(xì)胞生長時(shí)的藥物濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表1。
表1的體外藥理實(shí)驗(yàn)表明，化合物M286和M410對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株，包括人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，宮頸癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肝癌HepG2，結(jié)腸癌LoVo和白血病HL-60細(xì)胞株等，具有明顯的生長抑制作用。
表1

*CA4，VCR為陽性對(duì)照，IC50為半數(shù)抑制濃度(IC50，nM)實(shí)施例2Combretastatin A4類似物M410體外抑制微管蛋白聚合活性實(shí)驗(yàn)微管蛋白溶液在0～4℃是無色透明溶液，在37℃保溫時(shí)，微管蛋白聚合成微管，溶液在340nm的吸光度(OD值)上升，并在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到坪值。根據(jù)測(cè)得的OD值對(duì)保溫時(shí)間作圖，可以繪制出特征性的“S”型聚合曲線。干擾微管聚合的藥物可以使曲線形態(tài)發(fā)生改變，曲線坪值也隨之發(fā)生改變。
用General Tubulin Buffer將純化的牛腦微管蛋白粉末溶解為10mg/mL的儲(chǔ)備液并置冰??；用General Tubulin Buffer稀釋微管蛋白儲(chǔ)備液至2mg/mL，加入GTP至1mM，加入甘油至10％，將此混合液迅速加入冰上預(yù)冷的比色杯中，在紫外分光光度計(jì)340nm下調(diào)定零點(diǎn)；將比色杯用37℃恒溫水浴保溫，每6min測(cè)定一次OD值，連續(xù)測(cè)定60min，直到OD值無明顯上升為止；以時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)，OD值(OD340nm)為縱坐標(biāo)，繪制微管蛋白聚合曲線，即對(duì)照組曲線；配制相同的含1mM GTP和10％甘油的微管蛋白溶液，分別加入待檢測(cè)化合物(M410至8μM，Taxol至8μM，Colchicine至8μM)，重復(fù)上述測(cè)定過程；分別繪制聚合曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見圖1。這說明化合物M410對(duì)微管蛋白聚合有明顯抑制作用。
實(shí)施例3Combretastatin A4類似物M410在裸鼠體內(nèi)抑制人結(jié)腸癌(LoVo)生長實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞1×107/mL接種于裸鼠右腋下，每只小鼠0.2mL。一旦腫瘤長成200～300mm3，根據(jù)腫瘤大小將小鼠隨機(jī)分成5組。第1組為生理鹽水對(duì)照組，第2組為CA4P組(25mg/kg)，第3組為DDP組(1mg/kg)，第4組為M410組(25mg/kg)，第5組為DDP(1mg/kg)與M410(25mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用組(M410用于DDP之后1小時(shí))。每3～4天腹腔給藥1次，共4次。每3～4天用游標(biāo)尺測(cè)量腫瘤大小及稱小鼠體重，腫瘤體積(Tumor Volume，mm3)按照(L×S×S)/2計(jì)算，其中L(mm)代表腫瘤長徑，S(mm)代表腫瘤短徑。給藥后第20天處死小鼠，取腫瘤稱重，計(jì)算腫瘤抑制率IR(IR＝1-T/C)，其中T，C分別代表用藥組和對(duì)照組腫瘤平均重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果見圖2，表2。表明化合物M410體內(nèi)能抑制結(jié)腸癌的生長，25mg/kg的腫瘤抑制率為44.3％(P＜0.01)。
表2

實(shí)施例4Combretastatin A4類似物M410在裸鼠體內(nèi)抑制人肝癌(HepG2)生長實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞1×107/mL接種于裸鼠右腋下，每只小鼠0.2mL。一旦腫瘤長成100～200mm3，根據(jù)腫瘤大小將小鼠隨機(jī)分成5組。第1組為生理鹽水對(duì)照組，第2組為CA4P組(25mg/kg)，第3組為M410組(50mg/kg)，第4組為5-Fu組(25mg/kg)，第5組為5-Fu(25mg/kg)與M410(50mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用組(M410用于5-Fu之后1小時(shí))。每3～4天瘤內(nèi)注射給藥1次，共7次。每3～4天用游標(biāo)尺測(cè)量腫瘤大小及稱小鼠體重，腫瘤體積(Tumor Volume，mm3)按照(L×S×S)/2計(jì)算，其中L(mm)代表腫瘤長徑，S(mm)代表腫瘤短徑。給藥后第24天處死小鼠，取腫瘤稱重，計(jì)算腫瘤抑制率IR(IR＝1-T/C)，其中T，C分別代表用藥組和對(duì)照組腫瘤平均重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果見圖3，表3。表明化合物M410體內(nèi)能抑制肝癌的生長，50mg/kg的腫瘤抑制率為61.9％(P＜0.01)；5-Fu與M410聯(lián)合應(yīng)用組的腫瘤抑制率為61.9％，與單用5-Fu組(27.6％)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
表3

權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物的結(jié)構(gòu)如通式(I)所示 其中，R為-OH或-OPO(ONa)2。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)類似Combretastatin A4的化合物能用于制備抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤的藥物，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61K31/661GK101073561SQ20071002874
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者冼勵(lì)堅(jiān), 鄒永, 蔡于琛, 王志新 申請(qǐng)人:中山大學(xué)