專利名稱：溶藻弧菌OmpA作為動物免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)表達的一種外膜蛋白A(outer membraneproteinA，OmpA)的免疫調(diào)節(jié)功能。

背景技術(shù)：
免疫調(diào)節(jié)劑是指能調(diào)節(jié)、增強、興奮和恢復(fù)機體免疫功能的一大類藥物。在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中，使用各種化學(xué)藥物和抗生素來控制有關(guān)疾病是一種常見措施，但長期用藥，不僅明顯導(dǎo)致病原菌的抗藥性增加，而且藥物殘留的危害也日益顯現(xiàn)，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品安全。由此，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)運而生。
免疫調(diào)節(jié)劑也叫免疫增強劑或免疫刺激劑，當(dāng)它和抗原一起使用時能刺激動物特異性免疫機制，單獨使用時能刺激非特異性免疫機制，提高動物對各種抗原的應(yīng)答能力，增強機體的防病能力。常用的免疫刺激劑有弗氏完全佐劑、葡聚糖、左旋咪唑、中草藥和激素、維生素C和E等。因此，研制新型免疫調(diào)節(jié)劑對增強動物免疫能力，防制動物疾病具有重要意義。我們曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)過大腸桿菌OmpA的免疫調(diào)節(jié)功能。但在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的溶藻弧菌OmpA的免疫調(diào)節(jié)功能。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供溶藻弧菌OmpA基因編碼蛋白(OmpA)作為一種新的免疫調(diào)節(jié)劑在調(diào)節(jié)動物免疫，增強動物抗病能力中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過克隆溶藻弧菌OmpA基因，進行原核表達，發(fā)現(xiàn)采用重組OmpA免疫后的鯽魚可以顯著提高對溶藻弧菌、熒光假單胞菌等病原菌的抵抗力。
本發(fā)明將純化溶藻弧菌OmpA和溶藻弧菌1061蛋白混合免疫，發(fā)現(xiàn)前者可以明顯提高后者的抗體效價，提示OmpA具有較好的免疫佐劑作用。
本發(fā)明采用生物信息分析，發(fā)現(xiàn)OmpA在溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌中具有2個共同表位，但在熒光假單胞菌中未發(fā)現(xiàn)共同表位，提示OmpA具有特異性和非特異性免疫的免疫增強作用。



圖1為SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測溶藻弧菌OmpA表達產(chǎn)物 圖2為SDS-PAGE檢測鎳柱純化的溶藻弧菌OmpA 圖3為SDS-PAGE檢測鎳柱純化的溶藻弧菌1061
具體實施例方式 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 溶藻弧菌OmpA的制備和純化 在該實施例中，將全長的溶藻弧菌OmpA編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達載體之中，以達到表達和提純目的蛋白。
溶藻弧菌OmpA基因編碼序列如下(序列表400<1>所示) 1 atgaaaaaac tagcagcggt aatttcagag actctactta tggcttcagc51 agcacaagca gaagtatacg ttggtggtaa gatgggtaag tcatggatgg 101 aagacgcgtg tgtagcgggc caggcttgtg acaaagacga ttctactctt 151 ggcgcttttg ttggttacga aatgaataaa tacttcgcag tagaagcggg 201 tttcgacaac atcggtgatt ttaaccaaac ttctttcagt ggccacgtag 251 aagcaatcac tcttgctcct aaatttagcc taccaatcac tgaagacatc 301 gcactttacg gtaaagtggg tggcgcttac gtaatgtttg atggcaaaga 351 tgattactct tacctaggcg cggctggtct tgaattcaac ctaagccaaa 401 acgtaacagc tcgtgcggaa taccaaacac tgactgacat cagcaacgat 451 gtaactcgtg cgacaggtaa cactgcaaca ctaggtgttt ctttcaaatt 501 cggcggcaac gatgagccag taatcgtaga agagccagtt gttgttgaag 551 aagtggttgt agaagaagtg gtagaagagc cagttgtagt tacgaaaaca 601 ttcgaaactc aaacaattgg cacaggtagc ttcgatctaa acagcacaac 651 tctaaaaccg gagagcgctg caaaacttga taacctagtt gctttcctaa 701 acgagcaccc acaagcgaac gttgaagttg taggttacac agatacgtct 751 ggcccagcag cttacaacct aaaagtttct gagaaacgcg ctgagtctgt 801 tgctaacgca ctcgttgaaa aaggtattga ttcatcacgt atccaagctc 851 gtggcgaagg tgaaaacaac ccaatcgctt caaacgacac tcgtgaaggt 901 cgtcaacaaa accgtcgcgt agaagtcgtt gttccagaat ttgaatacca 951 agttcagcaa taa 溶藻弧菌OmpA氨基酸序列如下(序列表400<2>所示) 1 MKKLAAVISE TLLMASAAQA EVYVGGKMGK SWMEDACVAG QACDKDDSTL51 GAFVGYEMNK YFAVEAGFDN IGDFNQTSFS GHVEAITLAP KFSLPITEDI 101 ALYGKVGGAY VMFDGKDDYS YLGAAGLEFN LSQNVTARAE YQTLTDISND 151 VTRATGNTAT LGVSFKFGGN DEPVIVEEPV VVEEVVVEEV VEEPVVVTKT 201 FETQTIGTGS FDLNSTTLKP ESAAKLDNLV AFLNEHPQAN VEVVGYTDTS 251 GPAAYNLKVS EKRAESVANA LVEKGIDSSR IQARGEGENN PIASNDTREG 301 RQQNRRVEVV VPEFEYQVQQ * 1.溶藻弧菌OmpA基因的擴增 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的副溶血弧菌的全基因組序列，設(shè)計一對引物。引物序列如下Sense Primer5’-ATAGGATCCATGAAAAAACTAGCAGCGGT-3’；Anti-sensePrimer5’-CGCAAGCTTTTATTGCTGAACTTGGTA-3’。為便于克隆和表達載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)酶位點EcoRI和XhoI。引物由大連寶生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件的確立以熱變性法獲得的溶藻弧菌的全基因組為模板，在25μl反應(yīng)體系中加PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，10mmol/L dNTP1μl，5′和3′引物各10umol/L，模板DNA 1-2μl，補水至25μl。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃，2min，然后進行30個PCR循環(huán)(94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)后繼續(xù)在72℃延伸10min，4℃保存。用瓊脂糖膠電泳來鑒定DNA片斷的長度并回收DNA片斷。
2、溶藻弧菌OmpA基因的克隆、篩選和鑒定 用限制性內(nèi)酶EcoRI和Xho I分別酶切DNA片斷和pET-32a(Novagen)表達載體，參照Takara公司的使用說明書，在10μl反應(yīng)體系中加入溶液I 5μl，膠回收的PCR產(chǎn)物1μl，載體0.5μl，補水至10μl，16℃左右保溫14-16小時。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，涂于含Amp(50ug/ml)的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)12～16小時。隨機挑取含Amp的LB平板上的重組子，接種于含Amp(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基上，同時接種含有空pET-32a質(zhì)粒的DH5α，37℃培養(yǎng)12～16小時后，用堿裂解法提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證。將有插入的重組子送至上海生工進行序列測定，結(jié)果表明與NCBI中已報道的溶藻弧菌OmpA有99％的同源性，與數(shù)據(jù)庫公布的副溶血弧菌OmpA序列有87％的同源性。
3、溶藻弧菌OmpA基因的表達 將正確的重組質(zhì)粒以熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達菌，37℃培養(yǎng)12～16小時。接種單菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，同時接種含有pET-32a質(zhì)粒的BL21作為對照，于30℃培養(yǎng)至OD值0.6，加入IPTG 60μg/ml 35℃誘導(dǎo)4-6小時，離心收集菌體，用SDS-PAGE檢測插入片段是否表達，以及表達蛋白的分子量大小，結(jié)果如圖1。接著，鑒定蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物可溶不可溶鑒定。具體過程如下將離心后沉淀重懸于1/10體積的PBS或50mmol/L Tris緩沖液(pH8.0)中；加入溶菌酶至100ug/ml，保溫30min；反復(fù)凍融數(shù)次以破壞細(xì)胞壁，用超聲波處理剪切DNA(超聲波的強度以不能產(chǎn)生氣泡為適宜；裂解的時間根據(jù)實際情況掌握，一般將云霧狀的細(xì)菌懸浮物裂解至比較清朗即可)；離心(12,000rpm)15min后將培養(yǎng)物分為可溶部分和不溶部分；將15ul上清與4ul 4×SDS樣品緩沖液混合，將沉淀物重懸于1×SDS樣品緩沖液；將表達樣品(上清及沉淀)和非表達對照物進行SDS-PAGE電泳并以考馬斯亮藍(lán)染色以便在預(yù)計分子量范圍內(nèi)觀察表達蛋白帶。這一步驟將確定蛋白究竟表達在可溶組分抑或是不溶組分(包涵體)中。經(jīng)鑒定表達產(chǎn)物為可溶蛋白。
4、溶藻弧菌OmpA的純化 大量培育菌體，離心后超聲處理，離心收集上清用Ni-NTA His Bind親和柱進行純化。采用不同濃度咪唑緩沖液純化蛋白。用沖洗緩沖液(30-60M咪唑；0.1MNaH2PO4；10mmTris-Hcl，pH7.9)洗滌5次，每次1ml；用洗脫緩沖液(M咪唑；0.1M NaH2PO4；10mmTris-Hcl，pH 7.9)洗脫目的蛋白4次，每次1ml，收集洗脫液。取收集液進行SDS-PAGE分析，其純化結(jié)果如圖2。純化蛋白進行紫外檢測，回收率約在50-70％之間。
實施例2 溶藻弧菌1061蛋白的制備和純化 在該實施例中，將全長的溶藻弧菌1061基因編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達載體之中，以達到表達和提純目的蛋白。
溶藻弧菌1061基因編碼序列如下(序列表400<3>所示) 1 atgcaactga acaaggttct aaaagggcta ctaatcgcgc ttcctgtaat51 ggctgttaca gcgtgtagtt caagcgacga cgctgcttct aacactggtg 101 cagcaacaaa caacaatggc gcagtggaaa caacagtagc tgcgccaatt 151 gatcaaagcg gtcagttgac agagcaagag ctaaaagagc aagcgctacg 201 tgaaactcaa acaatctact ttgcttttga caactcaaca attgcagcag 251 attacgaaga gatgctagcg gctcacgctt cttacctaag caagaaccca 301 gcacttaacg taactatcga aggtcacgct gatgagcgcg gtacacctga 351 gtacaacatt gctctaggtg agcgtcgtgc acaagcagta gcgaactacc 401 tacaagcact aggtgttcaa gctgaccaaa tctcaatcgt tagctacggt 451 gaagagaagc cacttcttct aggtcaatca gatgaagttt acgctaagaa 501 ccgtcgcgcg gttctagtat actaa 溶藻弧菌1061氨基酸序列如下(序列表400<4>所示) 1 MQLNKVLKGL LIALPVMAVT ACSSSDDAAS NTGAATNNNG AVETTVAAPI 51 DQSGQLTEQE LKEQALRETQ TIYFAFDNST IAADYEEMLA AHASYLSKNP 101 ALNVTIEGHA DERGTPEYNI ALGERRAQAV ANYLQALGVQ ADQISIVSYG 151 EEKPLLLGQS DEVYAKNRRA VLVY* 1、溶藻弧菌1061基因的擴增 根據(jù)NCBI公布的副溶血弧菌的全基因組序列，設(shè)計一對引物，序列如下SensePrimer5’- ACAGGATCCAAGATGCAACTGAACAA-3’；Anti-sense Primer5’-CCGAAGCTTTTCCTCGAATTAGTAT-3’。為便于克隆和表達載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)酶位點EcoRI和HinDIII。引物由大連寶生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件的確立以熱變性法獲得的溶藻弧菌的全基因組為模板，在25μl反應(yīng)體系中加PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，10mmol/L dNTP1μl，5′和3′引物各10μmol/L，模板DNA 1-2μl，補水至25μl。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃，2min，然后進行30個PCR循環(huán)(94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s)后繼續(xù)在72℃延伸10min，4℃保存。用瓊脂糖膠電泳來鑒定DNA片斷的長度并回收DNA片斷。
2、溶藻弧菌1061基因的克隆、篩選和鑒定 用限制性內(nèi)酶EcoR I和HinDIII分別酶切DNA片斷和pET-32a(Novagen)表達載體。用類似實施例1中的方法進行篩選。將有插入的重組子送至上海生工進行序列測定，結(jié)果表明與NCBI中已報道的溶藻弧菌1061有85％的同源性，與數(shù)據(jù)庫公布的副溶血弧菌1061序列有83％的同源性。
3、溶藻弧菌1061基因的表達和純化 用類似實施例1的方法進行表達蛋白可溶組分抑或是不溶組分(包涵體)的鑒定，結(jié)果表達產(chǎn)物為可溶蛋白。用Ni-NTA His Bind親和柱進行純化，其純化結(jié)果如圖3。
實施例3 溶藻弧菌OmpA對鯽魚的主動交叉免疫保護作用 1.鯽魚免疫將買回的鯽魚飼養(yǎng)1周，每天早晚兩次投喂人工配合飼料。馴養(yǎng)1周后無異常分組。取純化OmpA與等體積完全佐劑(羊毛脂∶石蠟油＝1∶4 v/v，卡介苗為30mg/ml)混合，用注射器反復(fù)抽吸后，超聲處理2min，即為制備好的抗原，腹腔注射免疫鯽魚，25μg/尾魚，對照組不加免疫處理。注射2次，每次間隔10天，實驗組第2次使用不完全佐劑與目的純化蛋白(12.5μg/尾魚)混合后免疫注射。
2.交叉免疫保護作用評估第二次免疫后10天分別用5倍半數(shù)致死量的相應(yīng)細(xì)菌(溶藻弧菌和熒光假單胞菌)進行攻毒保護性實驗，觀察其死亡率，根據(jù)相對免疫保護率來比較分析免疫原性蛋白質(zhì)的保護效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌OmpA對溶藻弧菌攻毒的免疫保護率為87.5％，對熒光假單胞菌攻毒的免疫保護率為68.4％(表1)。結(jié)果說明溶藻弧菌OmpA具有交叉免疫保護作用。
表 1溶藻弧菌OmpA主動交叉動免疫保護作用 **P＜0.01，*P＜0.05 實施例3 溶藻弧菌OmpA能夠明顯提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力 發(fā)現(xiàn)重組OmpA可以明顯影響單核/巨噬細(xì)胞THP-1對細(xì)菌的吞噬能力，將吞噬指數(shù)從30％提高至40％，提示0mpA具有非特異性增強吞噬細(xì)胞的吞噬功能。
實施例4 溶藻弧菌OmpA的免疫佐劑作用 1.純化蛋白將純化溶藻弧菌OmpA和溶藻弧菌1061蛋白按照實施例3程序分別制備抗原。
2.免疫小鼠將買回的小鼠馴養(yǎng)1周，每天早晚兩次投喂人工配合飼料。馴養(yǎng)1周后將無異常的小鼠分組。取制備好的抗原免疫小鼠，腹腔注射免疫小鼠，10微克/只，注射3次，第1次注射后10天進行第2次注射，5天后進行第3次注射。第3次免疫結(jié)束后的第5天取血，Dot-ELISA技術(shù)檢測效價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將OmpA與VA1061混合后免疫小鼠，抗VA1061抗血清的效價從1∶1000提高至1∶2000，提示OmpA可能具有類似佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用。
實施例5 溶藻弧菌OmpA生物信息學(xué)分析 采用生物信息分析，發(fā)現(xiàn)OmpA在溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌中具有2個共同表位(表2)，但在熒光假單胞菌中未發(fā)現(xiàn)共同表位。這些結(jié)果提示，對弧菌的交叉保護功能可能與特異性共同表位有關(guān)；而對熒光假單胞菌的交叉保護作用可能與上述非特異性免疫能力增強有關(guān)。
表2 VAOmpA其同抗原表位肽段分析
序列表
<110>中山大學(xué)
<120>溶藻弧菌OmpA作為動物免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用
<160>2
<210>1
<211>963
<212>DNA
<213>溶藻弧菌
<400>1
atgaaaaaac tagcagcggt aatttcagag actctactta tggcttcagc agcacaagca 60
gaagtatacg ttggtggtaa gatgggtaag tcatggatgg aagacgcgtg tgtagcgggc 120
caggcttgtg acaaagacga ttctactctt ggcgcttttg ttggttacga aatgaataaa 180
tacttcgcag tagaagcggg tttcgacaac atcggtgatt ttaaccaaac ttctttcagt 240
ggccacgtag aagcaatcac tcttgctcct aaatttagcc taccaatcac tgaagacatc 300
gcactttacg gtaaagtggg tggcgcttac gtaatgtttg atggcaaaga tgattactct 360
tacctaggcg cggctggtct tgaattcaac ctaagccaaa acgtaacagc tcgtgcggaa 420
taccaaacac tgactgacat cagcaacgat gtaactcgtg cgacaggtaa cactgcaaca 480
ctaggtgttt ctttcaaatt cggcggcaac gatgagccag taatcgtaga agagccagtt 540
gttgttgaag aagtggttgt agaagaagtg gtagaagagc cagttgtagt tacgaaaaca 600
ttcgaaactc aaacaattgg cacaggtagc ttcgatctaa acagcacaac tctaaaaccg 660
gagagcgctg caaaacttga taacctagtt gctttcctaa acgagcaccc acaagcgaac 720
gttgaagttg taggttacac agatacgtct ggcccagcag cttacaacct aaaagtttct 780
gagaaacgcg ctgagtctgt tgctaacgca ctcgttgaaa aaggtattga ttcatcacgt 840
atccaagctc gtggcgaagg tgaaaacaac ccaatcgctt caaacgacac tcgtgaaggt 900
cgtcaacaaa accgtcgcgt agaagtcgtt gttccagaat ttgaatacca agttcagcaa 960
taa963
<210>2
<211>320
<212>PRT
<213>溶藻弧菌
<400>2
Met Lys Lys Leu Ala Ala Val Ile Ser Glu Thr Leu Leu Met Ala Ser
15 10 15
Ala Ala Gln Ala Glu Val Tyr Val Gly Gly Lys Met Gly Lys Ser Trp
20 25 30
Met Glu Asp Ala Cys Val Ala Gly Gln Ala Cys Asp Lys Asp Asp Ser
35 40 45
Thr Leu Gly Ala Phe Val Gly Tyr Glu Met Asn Lys Tyr Phe Ala Val
50 55 60
Glu Ala Gly Phe Asp Asn Ile Gly Asp Phe Asn Gln Thr Ser Phe Ser
65 70 75 80
Gly His Val Glu Ala Ile Thr Leu Ala Pro Lys Phe Ser Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Glu Asp Ile Ala Leu Tyr Gly Lys Val Gly Gly Ala Tyr Val Met
100 105 110
Phe Asp Gly Lys Asp Asp Tyr Ser Tyr Leu Gly Ala Ala Gly Leu Glu
115 120 125
Phe Asn Leu Ser Gln Asn Val Thr Ala Arg Ala Glu Tyr Gln Thr Leu
130 135 140
Thr Asp Ile Ser Asn Asp Val Thr Arg Ala Thr Gly Asn Thr Ala Thr
145 150 155 160
Leu Gly Val Ser Phe Lys Phe Gly Gly Asn Asp Glu Pro Val Ile Val
165 170 175
Glu Glu Pro Val Val Val Glu Glu Val Val Val Glu Glu Val Val Glu
180 185 190
Glu Pro Val Val Val Thr Lys Thr Phe Glu Thr Gln Thr Ile Gly Thr
195 200 205
Gly Ser Phe Asp Leu Asn Ser Thr Thr Leu Lys Pro Glu Ser Ala Ala
210 215 220
Lys Leu Asp Asn Leu Val Ala Phe Leu Asn Glu His Pro Gln Ala Asn
225 230 235 240
Val Glu Val Val Gly Tyr Thr Asp Thr Ser Gly Pro Ala Ala Tyr Asn
245 250 255
Leu Lys Val Ser Glu Lys Arg Ala Glu Ser Val Ala Asn Ala Leu Val
260 265270
Glu Lys Gly Ile Asp Ser Ser Arg Ile Gln Ala Arg Gly Glu Gly Glu
275 280 285
Asn Asn Pro Ile Ala Ser Asn Asp Thr Arg Glu Gly Arg Gln Gln Asn
290 295 300
Arg Arg Val Glu Val Val Val Pro Glu Phe Glu Tyr Gln Val Gln Gln
305 310 315 320
<210>3
<211>525
<212>DNA
<213>溶藻弧菌
<400>3
atgcaactga acaaggttct aaaagggcta ctaatcgcgc ttcctgtaat ggctgttaca 60
gcgtgtagtt caagcgacga cgctgcttct aacactggtg cagcaacaaa caacaatggc120
gcagtggaaa caacagtagc tgcgccaatt gatcaaagcg gtcagttgac agagcaagag 180
ctaaaagagc aagcgctacg tgaaactcaa acaatctact ttgcttttga caactcaaca 240
attgcagcag attacgaaga gatgctagcg gctcacgctt cttacctaag caagaaccca 300
gcacttaacg taactatcga aggtcacgct gatgagcgcg gtacacctga gtacaacatt 360
gctctaggtg agcgtcgtgc acaagcagta gcgaactacc tacaagcact aggtgttcaa 420
gctgaccaaa tctcaatcgt tagctacggt gaagagaagc cacttcttct aggtcaatca 480
gatgaagttt acgctaagaa ccgtcgcgcg gttctagtat actaa 525
<210>4
<211>174
<212>PRT
<213>溶藻弧菌
<400>3
Met Gln Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Leu IleAla Leu Pro Val
1 5 10 15
Met Ala Val Thr Ala Cys Ser Ser Ser Asp Asp Ala Ala Ser Asn Thr
20 25 30
Gly Ala Ala Thr Asn Asn Asn Gly Ala Val Glu Thr Thr Val Ala Ala
35 40 45
Pro Ile Asp Gln Ser Gly Gln Leu Thr Glu Gln Glu Leu Lys Glu Gln
50 55 60
Ala Leu Arg Glu Thr Gln Thr Ile Tyr Phe Ala Phe Asp Asn Ser Thr
65 70 75 80
Ile Ala Ala Asp Tyr Glu Glu Met Leu Ala Ala His Ala Ser Tyr Leu
85 90 95
Ser Lys Asn Pro Ala Leu Asn Val Thr Ile Glu Gly His Ala Asp Glu
100 105 110
Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Glu Arg Arg Ala Gln
115 120 125
Ala Val Ala Asn Tyr Leu Gln Ala Leu Gly Val Gln Ala Asp Gln Ile
130 135 140
Ser Ile Val Ser Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Leu Leu Leu Gly Gln Ser
145 150 155 160
Asp Glu Val Tyr Ala Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr
165 170
權(quán)利要求
1.溶藻弧菌OmpA作為動物免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及溶藻弧菌(E.coli)表達的一種重組外膜蛋白A(outer membraneproteinA，OmpA)的免疫調(diào)節(jié)功能。本發(fā)明通過溶藻弧菌重組外膜蛋白A免疫鯽魚后可以顯著提高對溶藻弧菌、熒光假單胞菌等病原菌的抵抗力，在體外吞噬試驗中可以明顯影響單核/巨噬細(xì)胞THP-1對細(xì)菌的吞噬能力，和溶藻弧菌1061蛋白混合免疫后可以明顯提高1061蛋白抗體的效價等試驗，提供了大腸桿菌OmpA具有調(diào)節(jié)動物免疫功能，提高動物抗病能力的功效。
文檔編號A61K39/106GK101204580SQ20071003141
公開日2008年6月25日 申請日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者惠 李, 熊筱鵬, 王保成, 彭宣憲 申請人:中山大學(xué)