專利名稱：一種抗人Nogo-66受體蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白疫苗的制備，尤其涉及抗人Nogo-66受體(NgR)蛋白疫苗的 制備方法及其在脊髓損傷修復(fù)治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前已發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于髓鞘的軸突再生抑制分子主要有三種Nogo-A， MAG和 0Mgp。這三種分子結(jié)構(gòu)明顯不同的蛋白質(zhì)卻有著一個(gè)共同的受體，即Nogo-66 受體(NgR)。 NgR能夠以高親和力與這三種抑制分子結(jié)合，并將其抑制軸突再生 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。
研究者曾使用脊髓勻漿或髓鞘提取物免疫動(dòng)物來(lái)治療脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)，結(jié)果表明，免疫后的機(jī)體可通過產(chǎn)生抗抑制分子的抗體來(lái) 封閉其抑制作用，由此促進(jìn)動(dòng)物損傷脊髓的功能恢復(fù)。但是，脊髓勻漿或髓鞘 提取物中的成分相當(dāng)復(fù)雜，除了含有上述三種抑制分子外，還包括許多其它成 分。用它們來(lái)免疫動(dòng)物，有誘發(fā)自身免疫病的危險(xiǎn)，較理想的方案是使用幾個(gè) 抑制分子或用它們的受體作為免疫原。Sicotte等用聯(lián)合使用重組的Nogo-66和 MAG分子的片段作為免疫原免疫動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生。 也有實(shí)驗(yàn)室將幾個(gè)抑制分子的基因片段串聯(lián)至一個(gè)重組質(zhì)粒中構(gòu)建成DNA疫苗， 發(fā)現(xiàn)也能在一定程度上促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。但是，用其受體NgR作為 免疫原，目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中制備抗人Nogo-66受體蛋白疫苗的方法如下所述。 從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH) cDNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)hNgR基因(不
包含信號(hào)肽)。所用引物如下
上游引物5' -TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG; 下游引物5' -TTMGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC;其中上游引物含BamHI位點(diǎn)，下游引物含HindIII位點(diǎn)和終止密碼子。將 擴(kuò)增的片段插入至克隆載體PUC19中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后再亞克隆至含6個(gè)His 標(biāo)簽的表達(dá)載體pET28a(+)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NgR。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定 正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過 SDS-PAGE和Western Blot對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行鑒定。最后，采用Ni-NTA親 合純化系統(tǒng)(申能博彩公司)純化出目的蛋白，并通過SDS-PAGE分析鑒定。
重組質(zhì)粒pET28-hNgR的雙酶切鑒定(BamH I和HindIII)和PCR鑒定結(jié)果均 顯示，插入片斷與預(yù)先設(shè)計(jì)一致(圖1A)， DNA測(cè)序則進(jìn)一步證明插入位點(diǎn)及序 列完全正確。隨后，重組質(zhì)粒pET28-hNgR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，該質(zhì)粒可在大腸桿菌種表達(dá)一分子量為50KD左右 的蛋白，與目的蛋白的預(yù)期分子量一致；用抗His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Westen Blot 鑒定，則進(jìn)一步證明該條帶即為帶有6XHis標(biāo)簽的hNgR融合蛋白。最終通過 Ni-NTA親和純化系統(tǒng)純化，成功獲得了免疫動(dòng)物所需的且純度較高的hNgR蛋白 (圖1B，圖1C)。本發(fā)明中抗人NgR蛋白疫苗可以在制備治療或預(yù)防脊髓損傷的 藥中加以應(yīng)用，也可以在制備治療或預(yù)防肢體癱瘓的藥中加以應(yīng)用。
本發(fā)明所公開的抗NgR蛋白疫苗可以通過封閉NgR，阻斷抑制因子的作用， 從而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元軸突的再生，減輕損傷區(qū)的組織壞死，促進(jìn)損傷脊 髓的功能恢復(fù),其避免了外源性生物制劑，比較容易被自身免疫系統(tǒng)清除的缺 點(diǎn)，另外也克服了針對(duì)NgR的DNA疫苗接種后主要誘發(fā)細(xì)胞免疫，只有少數(shù)個(gè)
體能誘導(dǎo)出體液免疫的特點(diǎn)。


圖1A是重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hNgR的雙酶切及PCR鑒定結(jié)果圖，其中Ml ， M2: DNA分子參照標(biāo)準(zhǔn)，1:質(zhì)粒pET28a-hNgR經(jīng)BamH I和HindIII酶切后電泳圖， 2:質(zhì)粒pET28a-hNgR的PCR電泳結(jié)果；
圖IB是重組NgR蛋白的原核表達(dá)和純化的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中1:未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白，2:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白，3:經(jīng)純化的 重組NgR蛋白；
圖IC是重組NgR蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果圖，其中1:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白，2:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白；
圖2是ELISA法檢測(cè)大鼠血清中的抗NgR抗體結(jié)果圖3是免疫組化檢測(cè)進(jìn)入損傷脊髓組織中的抗NgR抗體結(jié)果圖4A是免疫組化檢測(cè)損傷脊髓組織中NgR的表達(dá)，用兔抗NgR抗體進(jìn)行免
疫組化染色結(jié)果顯示圖，其中標(biāo)尺50Wn;
圖4B是免疫組化檢測(cè)損傷脊髓組織中NgR的表達(dá)，NgR免疫強(qiáng)度的定量分
析結(jié)果圖(**，與對(duì)照組相比P〈0.01);
圖5A是抗NgR抗血清可逆轉(zhuǎn)抑制分子MAG對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用，在
培養(yǎng)在經(jīng)MAG包被的玻片上的小腦神經(jīng)元培養(yǎng)液中，分別加入PBS對(duì)照組血清，
免疫前血清或NgR免疫血清后，神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)情況圖，其中標(biāo)尺25Mm; 圖5B是抗NgR抗血清可逆轉(zhuǎn)抑制分子MAG對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用，統(tǒng)
計(jì)分析各組神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度圖，其中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤(與對(duì)照
血清組或免疫前血清組相比，*， P〈0.05;**， P〈0.01);
圖6A是脊髓半橫斷模型行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BBB評(píng)分結(jié)果圖(與對(duì)照組相比，
*， P<0. 05; **， P〈0. 01);
圖6B是脊髓半橫斷模型行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，網(wǎng)格步行試驗(yàn)結(jié)果圖(與對(duì)照組
相比，*， P〈0. 05; **， P<0.01);
圖7A是BDA順行示蹤結(jié)果顯示NgR免疫可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，對(duì) 照組和NgR免疫組頭側(cè)(距損傷中心上游大于5ram處)及尾側(cè)(距損傷中心下 游大于5mm處)脊髓冠狀切片圖，在CST的投射部位，BDA標(biāo)記上的背側(cè)CST纖 維(箭頭)，其中標(biāo)尺lmm;
圖7B是BDA順行示蹤結(jié)果顯示NgR免疫可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，脊 髓矢狀切面顯示圖，在對(duì)照組，所有的標(biāo)記的纖維均停止在損傷中心(*)的上 游；而在NgR免疫組部分纖維可穿過損傷中心長(zhǎng)入下游的脊髓組織中(箭頭)， 其中標(biāo)尺lmm;
圖7C是BDA順行示蹤結(jié)果顯示NgR免疫可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，損 傷下游(距損傷中心6-10mm)脊髓組織中再生的CST纖維的高倍圖片，其中標(biāo) 尺IOO陶；
圖7D是BDA順行示蹤結(jié)果顯示NgR免疫可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，對(duì)照組及NgR免疫組CST纖維再生最大距離的散點(diǎn)分布圖8A是脊髓重物傷模型行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BBB評(píng)分結(jié)果圖(與對(duì)照組相比，
*， P〈0. 05; **， P〈0.01; #， P<0. 01);
圖8B是脊髓重物傷模型行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，網(wǎng)格步行試驗(yàn)結(jié)果圖(與對(duì)照組
相比，*， P〈0. 05; **， P〈0. 01; #, P<0. 01);
圖9A是脊髓空洞三維重建結(jié)果，將包含損傷中心的一段lcm的脊髓進(jìn)行連 續(xù)切片后用nurolucida軟件進(jìn)行三維重建圖9B是脊髓空洞三維重建結(jié)果，各組損傷空洞體積占脊髓總體積百分比的 統(tǒng)計(jì)分析圖(*， P<0.05)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施方式
來(lái)描述本發(fā)明中。
其中，NgR免疫強(qiáng)度分析，BBB評(píng)分，網(wǎng)格試驗(yàn)，損傷空洞體積比較采用t 檢驗(yàn)；平均神經(jīng)突起長(zhǎng)度比較采用方差分析(ANOVA)。 P〈0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。
實(shí)施例l、人NgR基因的克隆、蛋白表達(dá)和純化
從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH) cDNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)hNgR基因(不 包含信號(hào)肽)。所用引物如下
上游引物5' -TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG; 下游引物5' -TTMGCTTCAGCAGGGCCCMGCACTGTC;
其中上游引物含BamHI位點(diǎn)，下游引物含HindIII位點(diǎn)和終止密碼子。將 擴(kuò)增的片段插入至克隆載體pUC19中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后再亞克隆至含6個(gè)His 標(biāo)簽的表達(dá)載體pET28a(+)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NgR。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定 正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過 SDS-PAGE和Western Blot對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行鑒定。最后，采用Ni-NTA親 合純化系統(tǒng)(申能博彩公司)純化出目的蛋白，并通過SDS-PAGE分析鑒定。
重組質(zhì)粒pET28-hNgR的雙酶切鑒定(BamH I和HindIII)和PCR鑒定結(jié)果均 顯示，插入片斷與預(yù)先設(shè)計(jì)一致(圖1A)， DNA測(cè)序則進(jìn)一步證明插入位點(diǎn)及序 列完全正確。隨后，重組質(zhì)粒pET28-hNgR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌種表達(dá)一分子量為50KD左右 的蛋白，與目的蛋白的預(yù)期分子量一致；用抗His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Westen Blot 鑒定，則進(jìn)一步證明該條帶即為帶有6XHis標(biāo)簽的hNgR融合蛋白。最終通過 Ni-NTA親和純化系統(tǒng)純化，成功獲得了免疫動(dòng)物所需的且純度較高的hNgR蛋白 (圖1B,C)。
實(shí)施例2、動(dòng)物免疫及抗體檢測(cè)
用純化的NgR蛋白作為抗原免疫SD大鼠(n=20)。初次免疫，每只大鼠用 50ii g抗原加完全弗氏佐劑(FCA， Sigma公司)進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)和后腳掌皮 下注射。以后每隔2w進(jìn)行l(wèi)次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)，每只大鼠用50ug抗原 加不完全弗氏佐劑(FIA， Sigma公司)進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，對(duì)照組用等體 積的PBS代替抗原免疫(n = 15)。在加強(qiáng)免疫3次后，通過眼球采血分離血清 用ELISA法進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)。方法如下首先將純化的NgR抗原用0. 05M碳 酸鹽緩沖液(pH9. 6)稀釋后按lOOii 1/孔(含50u g抗原)包被酶標(biāo)板，置4 t:冰箱過夜后棄上清；用洗滌液將包被好的酶標(biāo)板洗滌3次，每次5min，然后 加入1%BSA-PBS封閉液，每孔200ul， 37。C封閉2h;傾去封閉液，同上洗滌后， 加入不同稀釋度的待檢血清，每孔100ul， 37。C孵育1. 5h，洗滌后再加入1:5000 稀釋的羊抗大鼠IgG-HRP (華美公司)，每孔100ul， 37。C孵育lh;洗滌后加入 底物緩沖液，室溫顯色10-20min后，每孔加入50ul的終止液終止反應(yīng)。用酶 標(biāo)儀讀出490nm波長(zhǎng)吸光度值(0D值)，0D值大于陰性孔3倍以上的判斷為陽(yáng) 性。設(shè)置免疫前血清作為陰性對(duì)照。
結(jié)果表明，所有經(jīng)NgR免疫的大鼠均產(chǎn)生了抗NgR的抗體，且效價(jià)大于 1:8000;免疫PBS的對(duì)照組大鼠血清中NgR抗體檢測(cè)為陰性(圖2)。為了鑒定 誘導(dǎo)的NgR抗體在脊髓損傷后是否能夠透過血腦屏障進(jìn)入損傷局部，我們分別 于損傷后3d及5w對(duì)對(duì)照組和NgR免疫組大鼠脊髓組織中的免疫球蛋白IgG進(jìn) 行了免疫組化染色。結(jié)果顯示，在損傷后3d，對(duì)照組和NgR免疫組IgG染色均 為陽(yáng)性，表明，脊髓損傷后早期隨著血腦屏障的破壞，血清中存在的正常及非 特異的IgG也可進(jìn)入損傷部位。但在損傷后5w，對(duì)照組脊髓組織中IgG染色幾 乎為陰性，而NgR免疫組脊髓中仍有大量的IgG存在于損傷中心及其兩側(cè)較大的范圍內(nèi)(圖3)，表明，5w后非特異的IgG已消失，留下的是對(duì)脊髓分子特異 的IgG，這些IgG應(yīng)該是NgR疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗NgR抗體。為了進(jìn)一步鑒定5w 后留在脊髓的抗體確實(shí)是抗NgR抗體，我們用先前制備的兔抗NgR抗體進(jìn)行了 免疫組化染色。結(jié)果顯示，對(duì)照組損傷后脊髓中NgR的免疫反應(yīng)較強(qiáng)，且在神 經(jīng)元中分布較均勻；而在NgR免疫組損傷后大鼠的脊髓中，NgR的免疫反應(yīng)明顯 減弱，且有的在神經(jīng)元膜上呈點(diǎn)狀分布(圖4)，提示NgR免疫產(chǎn)生的NgR抗體 在進(jìn)入脊髓后已與其靶抗原NgR結(jié)合，因此，再用兔抗NgR抗體進(jìn)行免疫組化 染色時(shí)，由于脊髓中大部分NgR分子已被疫苗產(chǎn)生的抗體封閉，其免疫反應(yīng)明 顯弱于對(duì)照組。
實(shí)施例3、神經(jīng)突起生長(zhǎng)試驗(yàn)
分離P7-9天大鼠的小腦置于D-Hanks液中，剝?nèi)ツX膜，將組織剪成1_2腿3 的小塊，用消化液(含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液)在37° C培養(yǎng)箱中消化 10-12min，然后以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)。反復(fù)吹打得到胞懸 液，再以1500轉(zhuǎn)/min的速度離心3min，棄去上清，沉淀下來(lái)的細(xì)胞用D-Hanks 液洗滌兩次，用分步貼壁培養(yǎng)法分離純化小腦神經(jīng)元，即先將小腦中分離到的 細(xì)胞懸浮在含10y。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，接種在未鋪過多聚賴氨酸的培養(yǎng) 皿上，培養(yǎng)5min，吸取未貼壁的細(xì)胞，棄掉已貼壁的細(xì)胞，主要為一些成纖維 細(xì)胞和部分星狀膠質(zhì)細(xì)胞。然后再將細(xì)胞接種在未鋪過多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng) 皿上，培養(yǎng)20min，輕輕搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸取未貼壁的細(xì)胞，棄掉已貼壁的細(xì) 胞，主要為星狀膠質(zhì)細(xì)胞和一些已貼壁的神經(jīng)元細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。通過分 步貼壁的處理，可以得到相對(duì)較純的小腦神經(jīng)元。將收集的小腦神經(jīng)元細(xì)胞離 心后直接用無(wú)血清培養(yǎng)液Neurobasal/B27 (體積比為50:1)重懸，然后接種至 包被有抑制分子MAG的玻片上，同時(shí)在培養(yǎng)液中分別加入免疫前，NgR免疫組和 對(duì)照組大鼠血清(1:100)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)24h 后，固定細(xì)胞，用NF抗體(1:100， Sigma公司)標(biāo)記神經(jīng)元，用Confocal每 組隨機(jī)拍取幾十個(gè)視野，用nurolucida軟件(MicroBrightField Inc公司)測(cè) 量視野中每個(gè)神經(jīng)元的突起，每組測(cè)量150個(gè)神經(jīng)元，取其平均突起長(zhǎng)度做統(tǒng) 計(jì)分析。結(jié)果顯示，加入免疫前血清和對(duì)照組血清的神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度分別為
12.09Mm和13.63Mm;而加入三個(gè)不同個(gè)體NgR免疫血清的神經(jīng)元平均突起長(zhǎng) 度明顯增長(zhǎng)，分別為23. 27Mm, 24. 78陶和19. 17Mm，差異具有顯著性(其中NgR 免疫組個(gè)體l，個(gè)體2與對(duì)照血清組或免疫前血清組相比P〈0.01;個(gè)體3與對(duì) 照血清組或免疫前血清組相比P<0.05，圖5)。這一結(jié)果表明，抗NgR抗血清 可逆轉(zhuǎn)抑制分子MAG對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的抑制作用。
實(shí)施例4、大鼠脊髓半橫切模型
(1) 脊髓半橫切手術(shù)
脊髓半橫切手術(shù)分為NgR免疫組(n=15)和對(duì)照組(n二lO)。手術(shù)步驟如下 大鼠用戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后剃去背部毛發(fā)；75%酒精消毒皮膚，切開皮 膚，分離肌肉置椎管完全暴露；用咬骨鉗咬去T9椎板至脊髓充分暴露，用做好 標(biāo)記的顯微手術(shù)剪半橫斷背側(cè)脊髓，深度為1.6mm;依次縫合肌肉和皮膚。術(shù)中 注意保溫，術(shù)后一周每天給予液體和抗生素預(yù)防感染，每天三次進(jìn)行常規(guī)護(hù)理 直至動(dòng)物恢復(fù)自主排尿。
(2) 脊髓中抗體的免疫組化檢測(cè)
為了觀察誘導(dǎo)的抗NgR抗體在大鼠脊髓損傷后是否進(jìn)入了脊髓損傷區(qū)域， 我們分別對(duì)NgR免疫組和對(duì)照組損傷后3d和5w的脊髓組織切片中的免疫球蛋 白IgG進(jìn)行了免疫熒光染色。即將組織切片用含10%正常山羊血清的封閉液室 溫封閉lh后，直接加入FITC標(biāo)記的羊抗大鼠IgG的二抗，37"C孵育lh， Confocol 下觀察結(jié)果并拍照。為了進(jìn)一步觀察誘導(dǎo)的抗NgR抗體進(jìn)入損傷的脊髓后是否 能封閉其靶抗原NgR分子，我們進(jìn)一步用兔抗大鼠NgR抗體分別對(duì)NgR免疫組 和對(duì)照組損傷后的脊髓組織切片進(jìn)行了免疫熒光染色，用Confocal顯微鏡 (ZEISS LSM510)觀察結(jié)果和拍照，并用軟件對(duì)NgR的免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行了統(tǒng) 計(jì)分析。
結(jié)果如圖3顯示，在脊髓損傷后3天和35天，用FITC標(biāo)記的羊抗大鼠IgG 抗體檢測(cè)NgR免疫組和對(duì)照組脊髓組織中的免疫球蛋白。在損傷后3d，對(duì)照組 和NgR免疫組IgG染色均為陽(yáng)性；但在損傷后5w，對(duì)照組脊髓組織中IgG染色 幾乎為陰性，而NgR免疫組脊髓中仍有大量的IgG存在于損傷中心及其兩側(cè)較大的范圍內(nèi)。圖片采自損傷中心頭側(cè)約2mm處的脊髓白質(zhì)區(qū)域。
實(shí)施例5、行為學(xué)試驗(yàn)
開放場(chǎng)地試驗(yàn)(Open field locomotor test, BBB)，在損傷前l(fā)d，脊髓 橫斷術(shù)后ld， 3d， lw， 2w， 4w和5w各進(jìn)行一次BBB評(píng)分來(lái)評(píng)價(jià)大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功 能。將每只大鼠放置于一寬敞的場(chǎng)地中，自由活動(dòng)4min，由兩名觀測(cè)者按照BBB 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，將二人的評(píng)分均值用于統(tǒng)計(jì)分析。
網(wǎng)格步行試驗(yàn)(Grid walking)，在損傷后5w即處死前進(jìn)行一次網(wǎng)格步行 試驗(yàn)。將大鼠置于一 lm2的不規(guī)則的網(wǎng)格(0.5-5cm)上自由行走4min,由兩名 觀察者各計(jì)數(shù)一側(cè)后肢的步數(shù)，若行走時(shí)后爪及腳跟掉入網(wǎng)格平面以下，則計(jì) 數(shù)為一次錯(cuò)步。同時(shí)計(jì)數(shù)一側(cè)后肢行走的總步數(shù)和錯(cuò)誤步數(shù)。計(jì)算錯(cuò)誤步數(shù)占 總步數(shù)的百分比用于統(tǒng)計(jì)分析。
在脊髓半橫切手術(shù)后ld，所有大鼠的的后肢均完全不能活動(dòng)，BBB評(píng)分為0 分；從3d開始一直觀察到5w大鼠的后肢功能逐漸恢復(fù)，但NgR免疫組大鼠的 BBB評(píng)分始終要高于對(duì)照組，且從2w開始一直到觀察終點(diǎn)5w，兩組的差異具有 顯著性(P〈0.05，圖6A)。在損傷后5w進(jìn)行的網(wǎng)格步行實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，NgR 免疫組大鼠后肢功能恢復(fù)要好于對(duì)照組，其后肢步行平均出錯(cuò)率分別為41.99 %和23.42% (P〈0.05，圖6B)。這表明，對(duì)于脊髓半橫斷損傷模型，NgR疫苗 可以明顯促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)。
實(shí)施例6、皮質(zhì)脊髓束順行標(biāo)記及免疫組化染色
在脊髓半橫切損傷后3w，將NgR免疫組(ri二12)和對(duì)照組(n=6)大鼠用 生物素化的葡聚糖胺(BDA， Molecular Probes公司)進(jìn)行皮質(zhì)脊髓束順行標(biāo)記， 方法如下將大鼠麻醉后剪去頭頂?shù)拿l(fā)并定位置腦立體定位儀上；消毒皮膚， 切開頭顱頂部中央皮膚，刮去骨膜，清晰暴露出前囟位點(diǎn)及其周圍相應(yīng)部位的 一片顱骨；先將立體定位儀定位出前囟位點(diǎn)，然后以前囟為坐標(biāo)0點(diǎn)分別定位 以下6個(gè)位點(diǎn)(±3腿，2mm)， (±2. 5mm， 0mm)， (±2腿，一lmm)，做好標(biāo)記 后，鉆去這一區(qū)域的顱骨并撕開表面的硬腦膜暴露出皮層，用微量注射針將10 X的BDA立體注射至相應(yīng)的6個(gè)位點(diǎn)，0.5"1/點(diǎn)，注射深度為lmm;縫合皮膚，并給予抗生素預(yù)防感染。2w后即損傷后5w，將大鼠在麻醉狀態(tài)下灌注固定，并 取出腦和脊髓標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)后固定和蔗糖梯度脫水后進(jìn)行冰凍切片。其中從損 傷中心頭側(cè)lcm到尾側(cè)lcm的一段2cm脊髓進(jìn)行矢狀切片；損傷中心頭側(cè) 1. 1-1. 6cm和尾側(cè)1. 1-1. 6cm兩個(gè)節(jié)段進(jìn)行冠狀切片；切片厚度為20um。
BDA免疫組化染色組織切片用先用PBS浸泡5min兩次，然后用含1%仏02 的PBS室溫浸泡15min，經(jīng)PBS清洗后用0. 3%TritonX-100/PBS預(yù)滲透30min， 然后加入HRP耦聯(lián)的avidin(l: 1500)室溫孵育l-3h; PBS清洗后用DAB進(jìn)行顯 色5-10min， PBS清洗終止反應(yīng)，切片經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后用中性樹 膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。
免疫組化染色顯示在脊髓損傷上游ll-16mm (頭側(cè))的冠狀切片上，對(duì)照 組和NgR免疫組CST相應(yīng)的投射區(qū)域均可看到被標(biāo)記上的神經(jīng)纖維，二者并沒 有明顯差別；但在脊髓損傷下游11-16mm (尾側(cè))的冠狀切片上，對(duì)照組(n=6) 沒看到被標(biāo)記上的軸突，而在NgR免疫組(n = 12)中，有33% (n=4)的大鼠 在相應(yīng)投射區(qū)域仍能看到一些被標(biāo)記上的軸突(圖7A)。在包含損傷中心的一段 2cm長(zhǎng)的脊髓矢狀切片上，我們可以看到，在對(duì)照組中，被標(biāo)記上的神經(jīng)纖維均 停止在損傷中心的上游；而在NgR免疫組，有75% (n二9)的個(gè)體，其部份標(biāo) 記的軸突可跨過損傷區(qū)域延伸至損傷下游(圖7B)。我們統(tǒng)計(jì)了 NgR免疫組再生 軸突的長(zhǎng)度，結(jié)果顯示，在12個(gè)個(gè)體中，有9個(gè)個(gè)體的軸突有再生，其再生的 最大距離從7mm-15mm不等，其中有4個(gè)個(gè)體的再生距離超過了 lOram (圖7C)。
實(shí)施例7、大鼠脊髓重物墜落傷模型
我們將另一部分經(jīng)NgR免疫的大鼠用于脊髓撞擊傷模型制作，設(shè)NgR免疫 組(n=5)和對(duì)照組(n=4)。手術(shù)采用紐約大學(xué)脊髓重物墜落傷模型(NYU Impactor)，手術(shù)在保溫墊上操作，具體方法如下
(1) 1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉動(dòng)物，剃去背部毛發(fā)；
(2) 75%酒精消毒，切開皮膚，分離肌肉，暴露椎管；
(3) 用咬骨鉗咬去T9脊突，沿T9與T10間的脊間孔咬去錐板，充分暴露脊髓(直 徑約2.5mm的圓形開口)；
(4) 將大鼠固定于NYU重物墜落裝置上，按物重10g，高度12.5mm的參數(shù)，在暴露的脊髓處制造中等損傷程度的脊髓撞擊傷模型。
術(shù)后每天三次進(jìn)行排尿護(hù)理直至動(dòng)物能進(jìn)行主動(dòng)排尿；術(shù)后三天每天按常
規(guī)給予補(bǔ)液及抗生素以預(yù)防感染。
實(shí)施例8、行為學(xué)試驗(yàn)(方法同前)
脊髓撞擊傷大鼠在損傷前l(fā)d，損傷后ld， 3d， lw及以后每周一次直至8w 進(jìn)行一次BBB評(píng)分；從第2w到第8w，每周進(jìn)行一次網(wǎng)格步行試驗(yàn)。
結(jié)果顯示，在損傷后3d， NgR疫苗免疫組的BBB評(píng)分為3. 167±0. 289，與 對(duì)照組(1±0.632)相比具有顯著性差異(P〈0.01)，且一直到觀察終點(diǎn)一損傷 后8w， NgR疫苗免疫組的BBB評(píng)分始終高于對(duì)照組。在損傷后8w, NgR疫苗免 疫組的BBB評(píng)分已恢復(fù)到15. 33±1.528，而對(duì)照組為13. 33±1. 516 (P〈0.01， 圖8A)。網(wǎng)格試驗(yàn)結(jié)果也顯示，從損傷后2w開始， 一直到8w， NgR疫苗免疫組 大鼠后肢步行時(shí)的出錯(cuò)率要顯著低于對(duì)照組(P<0.01，圖8B)。這表明，對(duì)于重 物墜落脊髓損傷模型，NgR疫苗同樣可以顯著促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)。
實(shí)施例9、組織學(xué)觀察
在脊髓損傷后8w，將動(dòng)物灌注固定，取脊髓標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片。將包含損 傷部位的lcm的脊髓片段(損傷中心頭尾側(cè)各0. 5cm)進(jìn)行連續(xù)的冠狀切片并編 號(hào)，切片厚度為20um。每個(gè)標(biāo)本各取一套切片用Neurolucida軟件對(duì)脊髓片段 進(jìn)行三維重建，將空洞的體積除以整段脊髓的體積獲得空洞的百分比用于統(tǒng)計(jì) 分析。
結(jié)果表明，在對(duì)照組，脊髓空洞的體積百分比在13.9%到29.7%之間，平 均為20.4%;而NgR蛋白免疫組脊髓的空洞體積百分比明顯縮小，平均為9.4 % (P〈0. 05，圖9)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在脊髓半橫斷損傷模型中，BDA順行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 經(jīng)NgR蛋白疫苗免疫的大鼠在脊髓損傷后，其切斷的神經(jīng)纖維可再生，并穿越 損傷區(qū)；在重物墜落脊髓損傷模型中；組織學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)NgR蛋白疫苗免疫 的大鼠在脊髓損傷后，其損傷區(qū)空洞面積顯著縮??；行為學(xué)結(jié)果則證明，接種 NgR疫苗后，兩種動(dòng)物模型癱瘓后肢的功能都有明顯的恢復(fù)。序列表
〈110〉上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院
〈120〉 一種抗人Nogo-66受體蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用
〈130〉
<160> 1
〈170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 1924
〈212〉 隱
<213〉 智人(Homo sapiens)
〈400〉 1
ctgtgcgccc gg已gcgcgcc gatgcggacc gcgccccgcc tgggtgctgt tacaatgagc ggcatccctg gctgccagct gcccgaattg gataatgcac acgctgcacc gctgccctgc ttccgcgacc cccgagcgcg gtggcccatg tttgccaaca tacctgaggc tggctgc卿 gctggccgtg ggcccttacc aagtgctgcc tcggcaggca tctggcccac ccgctcactg cgccggaggc
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acccagcctc tgggccctgc acggggtctc ccaggtcctc acagggttcg agagatatgc ttttcttaaa
權(quán)利要求
1.一種抗人Nogo-66受體蛋白疫苗的制備方法，其步驟如下從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)hNgR基因，不包含信號(hào)肽，所用引物如下上游引物5′-TTGGATCCTGCCCAGGTGCCTGCGTATG；下游引物5′-TTAAGCTTCAGCAGGGCCCAAGCACTGTC；將擴(kuò)增的片段插入至克隆載體pUC19中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后再亞克隆至含6個(gè)His標(biāo)簽的表達(dá)載體pET28a(+)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NgR；經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備蛋白疫苗的方法，其特征在于，所獲得的蛋白的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的抗人Nogo-66受體蛋白疫苗在制備治療或預(yù)防脊髓 損傷疾病的藥中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的抗人Nogo-66受體蛋白疫苗在制備治療或預(yù)防屮樞 神經(jīng)損傷疾病的藥中的應(yīng)用。
全文摘要
一種制備抗人Nogo-66受體蛋白疫苗的方法，從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SK-N-SH)cDNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)hNgR基因，將擴(kuò)增的片段插入至克隆載體中，再亞克隆至含6個(gè)His標(biāo)簽的表達(dá)載體pET28a(+)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NgR。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到hNgR蛋白?？筃gR蛋白疫苗可以通過封閉NgR，阻斷抑制因子的作用，從而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元軸突的再生，減輕損傷區(qū)的組織壞死，促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)，表明NgR蛋白疫苗具有治療脊髓損傷的潛在應(yīng)用價(jià)值，其避免了外源性生物制劑，比較容易被自身免疫系統(tǒng)清除的缺點(diǎn)，另外也克服了針對(duì)NgR的DNA疫苗接種后主要誘發(fā)細(xì)胞免疫，只有少數(shù)個(gè)體能誘導(dǎo)出體液免疫的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101288771SQ20071003966
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日
發(fā)明者于盼盼, 劉欣秋, 亮 徐, 徐曉明, 王小飛, 王艷霞, 虞志華, 陸佩華, 黃立東 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院