專利名稱：人toll樣受體蛋白、相關(guān)試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及影響哺乳動(dòng)物生理學(xué)的組合物和方法，所述哺乳動(dòng)物生理學(xué)包括形態(tài)發(fā)生或免疫系統(tǒng)功能。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)發(fā)育和/或免疫系統(tǒng)的核酸、蛋白質(zhì)和抗體。也公開了這些物質(zhì)的診斷用途和治療用途。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)一般是指這些技術(shù)，所述技術(shù)通過將來(lái)自供體來(lái)源的遺傳信息整合到用于后續(xù)加工的載體中，諸如通過引入到宿主中，由此使所轉(zhuǎn)移的遺傳信息在該新環(huán)境中復(fù)制和/或表達(dá)。通常，該遺傳信息以互補(bǔ)DNA(cDNA)的形式存在，所述互補(bǔ)DNA衍生自編碼所需的蛋白產(chǎn)物的信使RNA(mRNA)。該載體通常是一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有將用于隨后復(fù)制的cDNA加入宿主中的能力，在某些情況下，實(shí)際控制該cDNA的表達(dá)，并由此指導(dǎo)所編碼的產(chǎn)物在該宿主中合成。
一段時(shí)間以來(lái)，已經(jīng)知道哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答基于稱為“免疫網(wǎng)絡(luò)”的一系列復(fù)雜的細(xì)胞相互作用。最近的研究已經(jīng)提供了對(duì)該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部運(yùn)作的新的了解。盡管已經(jīng)清楚許多免疫應(yīng)答實(shí)際上確實(shí)圍繞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和其它細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樣相互作用運(yùn)轉(zhuǎn)，但免疫學(xué)家現(xiàn)在一般豎持這樣一種觀點(diǎn)稱為淋巴因子、細(xì)胞因子或單核因子的可溶性蛋白，在控制這些細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。因此，人們對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分離、特征鑒定和作用機(jī)制相當(dāng)感興趣，對(duì)這些信息的了解將導(dǎo)致在許多醫(yī)學(xué)異常(例如免疫系統(tǒng)失調(diào))的診斷和治療方面取得顯著的進(jìn)展。
淋巴因子看來(lái)以多種方式介導(dǎo)細(xì)胞活性。已經(jīng)表明，它們支持多能造血干細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和/或分化為大量的祖細(xì)胞(progenitor)，所述祖細(xì)胞包括構(gòu)成復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的多樣化的細(xì)胞譜系。細(xì)胞組分之間適當(dāng)和平衡的相互作用是健康的免疫應(yīng)答所必需的。當(dāng)結(jié)合其它因子給予淋巴因子時(shí)，不同的細(xì)胞譜系常常以不同方式應(yīng)答。
對(duì)免疫應(yīng)答尤其重要的細(xì)胞譜系包括兩類淋巴細(xì)胞B細(xì)胞，它們可以產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白(具有識(shí)別并結(jié)合外源物質(zhì)以實(shí)現(xiàn)將其去除的能力的蛋白)；和各種亞群的T細(xì)胞，它們分泌淋巴因子，并誘導(dǎo)或抑制B細(xì)胞和構(gòu)成免疫網(wǎng)絡(luò)的各種其它細(xì)胞(包括其它T細(xì)胞)。這些淋巴細(xì)胞與許多其它細(xì)胞類型相互作用。
另一種重要的細(xì)胞譜系是肥大細(xì)胞(在所有哺乳動(dòng)物物種中尚未被明確鑒定)，這是一種含顆粒的結(jié)締組織細(xì)胞，鄰近遍布機(jī)體的毛細(xì)管定位。發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在肺、皮膚以及胃腸道和生殖泌尿道中的濃度尤其高。肥大細(xì)胞如下在變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的病征(特別是過敏反應(yīng))中起中心作用當(dāng)選定的抗原與結(jié)合于肥大細(xì)胞表面上受體的一類免疫球蛋白交聯(lián)時(shí)，該肥大細(xì)胞脫粒并釋放引起變態(tài)反應(yīng)(例如過敏反應(yīng))的介質(zhì)，例如組胺、5-羥色胺、肝素和前列腺素。
一般不能在體外維持免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，這已經(jīng)阻礙了為更好地了解和治療各種免疫失調(diào)而進(jìn)行的研究。免疫學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用T細(xì)胞和其它細(xì)胞的上清液，可以完成對(duì)許多這些細(xì)胞的培養(yǎng)，所述上清液含有各種生長(zhǎng)因子，包括許多淋巴因子。
蛋白的白介素-1家族包括IL-1α、IL-1β、IL-1RA和最近的IL-1γ(也命名為干擾素-γ誘導(dǎo)因子，IGIF)。在范圍廣泛的生物學(xué)功能中已經(jīng)牽涉到該基因相關(guān)家族。參見Dinarello(1994)FASEB J.81314-1325；Dinarello(1991)Blood 771627-1652；和Okamura等(1995)Nature 37888-91。
此外，存在調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生發(fā)育的各種生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)因子。這包括例如Toll配體，它們通過結(jié)合于享有IL-1受體特征性的結(jié)構(gòu)和機(jī)制特征的受體而發(fā)送信號(hào)。參見例如Lemaitre等(1996)Cell 86973-983；Belvin和Anderson(1960)Ann.Rev.Cell & Devel.Biol.12393-416。
根據(jù)以上所述，可明顯看出，新的可溶性蛋白及其受體(包括類似于淋巴因子的蛋白)的發(fā)現(xiàn)和研制，應(yīng)該有助于用于范圍廣泛的退行性病征或異常病征的新療法，所述病征直接或間接涉及例如免疫系統(tǒng)和/或造血細(xì)胞的發(fā)育、分化或功能。特別是，對(duì)于增加或增強(qiáng)其它淋巴因子有益活性的淋巴因子樣分子，其新受體的發(fā)現(xiàn)和了解應(yīng)該是非常有利。本發(fā)明提供新的受體和相關(guān)化合物及其使用方法，其中所述受體為表現(xiàn)出與白介素-1樣組合物相似性的配體的受體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了果蠅屬和人的DTLR蛋白結(jié)構(gòu)的圖示比較、以及它們與脊椎動(dòng)物IL-1受體和植物抗病性蛋白的關(guān)系。三種果蠅屬(Dm)DTLR(Toll、18w和Mst ORF片段)(Morisato和Anderson(1995)Ann.Rev.Genet.29371-399；Chiang和Beachy(1994)Mech.Develop.47225-239；Mitcham等(1996)J.Biol.Chem.2715777-5783；和Eldon等(1994)Develop.120885-899)排列在四個(gè)完整的(DTLR 1-4)和一個(gè)部分的(DTLR5)人(Hu)受體旁邊。清楚地框注了通過PRINTS(Attwood等(1997)Nucleci Acids Res.25212-217)標(biāo)記的所述受體胞外域的各個(gè)LRR；鄰接LRR陣列(LRR array)C末端或N末端的“頂部”和“底部”富含Cys的簇，分別用匯合的半圓畫出。當(dāng)與Toll和18w的784aa和977aa的延伸物相比時(shí)，DTLR 1-5中內(nèi)部Cys富含區(qū)的喪失，主要產(chǎn)生其較小的胞外域(分別為558、570、690和652aa)。DmMst和HuDTLR5的不完整鏈(分別為519aa和153aa的胞外域)由虛線表示。與DTLR、IL-1型受體(IL-1R)、胞內(nèi)蛋白Myd88和煙草抗病性基因N產(chǎn)物(DRgN)共同的胞內(nèi)信號(hào)組件，顯示在該質(zhì)膜下面。參見例如Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475；和Rock等(1998)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95588-。其它域包括IL-1R中Ig樣組件的trio(二硫鍵連接的環(huán))；DRgN蛋白的特征是一個(gè)NTP酶域(方框)，而Myd88具有一個(gè)死域(death domain)(黑色橢圓)。
圖2A-2B顯示Toll樣和IL-1樣細(xì)胞因子受體和兩個(gè)分歧的組件蛋白信號(hào)域中的保守結(jié)構(gòu)模式。圖2A顯示共同的TH域的序列對(duì)比。DTLR按圖1中進(jìn)行標(biāo)記；人(Hu)或小鼠(Mo)IL-1家族受體(IL-1R1-6)按早年提出提出的方法(Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475)順序編號(hào)；Myd88和來(lái)自煙草(To)和亞麻L(zhǎng).usitatissium(Lu)的序列，分別代表較大的多域分子的C末端域和N末端域?？蜃⒘瞬婚g斷的序列區(qū)組(編號(hào)為1-10)。三角表示有害的突變，而箭頭N末端的截短物消除人IL-1R1中的生物活性(Heguy等(1992)J.Biol.Chem.2672605-2609)。標(biāo)出了α-螺旋(H)、β-鏈(E)或螺旋(L)的PHD(Rost和Sander(1994)Proteins 1955-72)和DSC(King和Sternberg(1996)Protein Sci.52298-2310)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。氨基酸遮蔽方案描述了化學(xué)上相似的殘基疏水性、酸性、堿性、Cys、芳族、結(jié)構(gòu)斷裂性和微小的殘基。通過75％嚴(yán)格性下的共有序列，得出IL-1R、DTLR和全部序列對(duì)比(ALL)的診斷序列模式。氨基酸亞組的符號(hào)是(關(guān)于細(xì)節(jié)請(qǐng)參見互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站(internet site))o，醇；l，脂族的；●，任一氨基酸；a，芳族的；c，帶電荷的；h，疏水性；-，陰性；p，極性；+，陽(yáng)性；s，小的；u，微小的；t，轉(zhuǎn)角樣的。圖2B顯示了建議的THβ/α域折疊的拓?fù)鋱D。在其C末端觀察到平行的β-片(具有黃色三角的β-鏈A-E)；α-螺旋(標(biāo)記1-5的圓)連接所述β-鏈；鏈連接在前面(可見的)或后面(隱藏的)。以灰色(Asp)或作為單獨(dú)的黑色(Arg)殘基，標(biāo)注β-片C末端保守的帶電荷的殘基(參見正文)。
圖3顯示信號(hào)域超家族的進(jìn)化。通過相鄰連接法(Thompson等，(1994)Nucleic Acids Res.224673-4680)，用圖2A的多重TH組件序列對(duì)比得出進(jìn)化系統(tǒng)樹。同序列對(duì)比中一樣標(biāo)記蛋白；用TreeView提供該樹。
圖4A-4D顯示人DTLR基因的FISH染色體作圖。使來(lái)自人淋巴細(xì)胞同步培養(yǎng)物的變性染色體，與用于定位的生物素化DTLR cDNA探針雜交。通過使FISH信號(hào)與DAPI顯帶的染色體重疊(中心圖板)，得到具有染色體帶的FISH作圖數(shù)據(jù)(左邊，圖4A，DTLR2；4B，DTLR3；4C，DTLR4；4D，DTLR5)的對(duì)比。Heng和Tsui(1994)Meth.Molec.Biol.33109-122。以人染色體模式圖(ideograms)(右板)的形式總結(jié)分析。
圖5A-5F顯示人DTLR的mRNA印跡分析。用放射標(biāo)記的、編碼上述DTLR1(圖5A-5C)、DTLR2(圖5D)、DTLR3(圖5E)和DTLR4(圖5F)的cDNA，探測(cè)每泳道含有大約2μg多聚(A)+RNA的人多種組織的印跡(He，心臟；Br，腦；Pl，胎盤；Lu，肺；Li，肝臟；Mu，肌肉；Ki，腎臟；Pn，胰臟；Sp，脾臟；Th，胸腺；Pr，前列腺；Te，睪丸；Ov，卵巢；SI，小腸；Co，結(jié)腸；PBL，外周血淋巴細(xì)胞)和癌細(xì)胞系(早幼粒細(xì)胞性白血病，HL60；宮頸癌，HELAS3；慢性髓細(xì)胞性白血病，K562；淋巴細(xì)胞性白血病，Molt4；結(jié)腸直腸腺癌，SW480；黑素瘤，G361；伯基特淋巴瘤Raji，Burkitt’s；結(jié)腸直腸腺癌，SW480；肺癌，A549)。于-70℃用增感屏將印跡對(duì)X光片曝光2天(圖5A-5C)或一周(圖5D-5F)。在某些泳道中出現(xiàn)異常的0.3kB種類；雜交實(shí)驗(yàn)排除了編碼DTLR胞質(zhì)片段的信息。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及9種新的相關(guān)哺乳動(dòng)物受體(例如人)-Toll受體樣分子的結(jié)構(gòu)及其生物活性，所述受體命名為DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9和DTLR10。本發(fā)明包括編碼所述多肽本身的核酸以及它們的生產(chǎn)和使用方法。本發(fā)明核酸的特征，部分在于它們與本文公開的克隆的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列的同源性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自以下物質(zhì)的組合物大致純的或重組的DTLR2蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO4的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO4的天然序列DTLR2；包含DTLR2序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR3蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQID NO6的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO6的天然序列DTLR3；包含DTLR3序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR4蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO26的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO26的天然序列DTLR4；包含DTLR4序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR5蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO10的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO10的天然序列DTLR5；和包含DTLR5序列的融合蛋白。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自以下物質(zhì)的組合物大致純的或重組的DTLR6蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO12的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO12的天然序列DTLR6；包含DTLR6序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR7蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO16或18的序列同一性至少為85％，或；SEQ ID NO16或18的天然序列DTLR7；包含DTLR7序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR8蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO32的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO32的天然序列DTLR8；包含DTLR8序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR9蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQID NO22的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO22的天然序列DTLR9；和包含DTLR9序列的融合蛋白；大致純的或重組的DTLR10蛋白或肽，它在至少大約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO34的序列同一性至少為85％；SEQ ID NO34的天然序列DTLR10；和包含DTLR10序列的融合蛋白。
最好是，所述大致純的或分離的蛋白包含與以下序列的相應(yīng)部分表現(xiàn)出序列同一性的區(qū)段DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10，其中所述同源性至少為大約90％的同一性，而所述部分為至少大約9個(gè)氨基酸；所述同源性至少為大約80％的同一性，而所述部分為至少大約17個(gè)氨基酸；或所述同源性至少為大約70％的同一性，而所述部分為至少大約25個(gè)氨基酸。在具體實(shí)施方案中，所述物質(zhì)的組合物為DTLR2，它包含SEQ ID NO4的成熟序列；或表現(xiàn)出與天然DTLR2不同的翻譯后+修飾模式；為DTLR3，它包含SEQ ID NO6的成熟序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR3不同的翻譯后修飾模式；為DTLR4，它包含SEQ ID NO26的成熟序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR4不同的翻譯后修飾模式；或?yàn)镈TLR5，它包含SEQ ID NO10的完整序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR5不同的翻譯后修飾模式；或?yàn)镈TLR6，它包含SEQ ID NO12的成熟序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR6不同的翻譯后修飾模式；為DTLR7，它包含SEQ ID NO16或18的成熟序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR7不同的翻譯后修飾模式；為DTLR8，它包含SEQ ID NO32的成熟序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR8不同的翻譯后修飾模式；或?yàn)镈TLR9，它包含SEQ ID NO22的完整序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR9不同的翻譯后修飾模式；或?yàn)镈TLR10，它包含SEQ ID NO34的完整序列，或表現(xiàn)出與天然DTLR1O不同的翻譯后修飾模式；或所述物質(zhì)的組合物可以是一種蛋白或肽，該蛋白或肽來(lái)自選自哺乳動(dòng)物(包括諸如人的靈長(zhǎng)類)的溫血?jiǎng)游?；包含SEQ IDNO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的至少一種肽區(qū)段；表現(xiàn)出多個(gè)部分顯示所述同一性；為DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10的天然等位基因變異體；其長(zhǎng)度至少為大約30個(gè)氨基酸；表現(xiàn)出至少兩個(gè)非重疊表位是靈長(zhǎng)類DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10特有的；在至少大約20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與靈長(zhǎng)類DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6的序列同一性至少為大約90％；表現(xiàn)出至少兩個(gè)非重疊表位是靈長(zhǎng)類DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10特有的；在至少大約20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與靈長(zhǎng)類DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10的序列同一性至少為大約90％；為糖基化的；其分子量至少為100kD，并且被天然糖基化；為合成多肽；連接至固體基質(zhì)；與另一化學(xué)部分綴合；為天然序列的5重或更低重取代的取代體；或?yàn)樘烊恍蛄械娜笔Щ虿迦胱儺愺w。
其它實(shí)施方案包括組合物，它包含無(wú)菌DTLR2蛋白或肽；或所述DTLR2蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR3蛋白或肽；或所述DTLR3蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR4蛋白或肽；或所述DTLR4蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR5蛋白或肽；或所述DTLR5蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR6蛋白或肽；或所述DTLR6蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR7蛋白或肽；或所述DTLR7蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR8蛋白或肽；或所述DTLR8蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR9蛋白或肽；或所述DTLR9蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥；無(wú)菌DTLR10蛋白或肽；或所述DTLR10蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
在某些融合蛋白實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種融合蛋白，它包含SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的成熟蛋白序列；一種檢測(cè)或純化標(biāo)記，包括FLAG、His6或Ig序列；或另一受體蛋白的序列。
各種試劑盒實(shí)施方案包括的試劑盒包含一種DTLR蛋白或多肽，和包含所述蛋白或多肽的區(qū)室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說(shuō)明。
結(jié)合化合物的實(shí)施方案包括那些化合物，它們包含來(lái)自抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)特異性地結(jié)合于天然的DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10蛋白，其中所述蛋白為靈長(zhǎng)類蛋白；所述結(jié)合化合物為Fv、Fab或Fab2片段；所述結(jié)合化合物與另一化學(xué)部分綴合；或所述抗體針對(duì)SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的成熟肽的肽序列而產(chǎn)生；針對(duì)成熟的DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10而產(chǎn)生；針對(duì)純化的人DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10而產(chǎn)生；為免疫選擇性的；為多克隆抗體；結(jié)合于變性的DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10；表現(xiàn)出與抗原的Kd至少為30μM；連接至固體基質(zhì)，包括珠?；蛩芰夏?；在無(wú)菌組合物中；或進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。結(jié)合組合物的試劑盒通常包含所述結(jié)合化合物，和包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說(shuō)明。該試劑盒通常能夠進(jìn)行定性或定量分析。
其它組合物包括這樣的組合物，它包含無(wú)菌結(jié)合化合物，或所述結(jié)合化合物和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
核酸的實(shí)施方案包括分離的或重組的核酸，它編碼DTLR2-10的蛋白或肽或融合蛋白，其中所述DTLR來(lái)自哺乳動(dòng)物；或所述核酸編碼SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的抗原肽序列；編碼多個(gè)SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的抗原肽序列；表現(xiàn)出與編碼所述區(qū)段的天然cDNA的同一性至少為大約80％；為一種表達(dá)載體；還包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；來(lái)自天然來(lái)源；包含一種可檢測(cè)標(biāo)記；包含合成的核苷酸序列；小于6kb，最好小于3kb；來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括靈長(zhǎng)類；包含一種天然的全長(zhǎng)編碼序列；為編碼所述DTLR的基因的雜交探針；或?yàn)橐环NPCR引物、PCR產(chǎn)物或誘變引物。也提供包含這樣一種重組核酸的細(xì)胞、組織或器官。所述細(xì)胞最好是原核細(xì)胞；真核細(xì)胞；細(xì)菌細(xì)胞；酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞；小鼠細(xì)胞；靈長(zhǎng)類細(xì)胞；或人細(xì)胞。提供的試劑盒包含這類核酸，和包含所述核酸的區(qū)室；還包含靈長(zhǎng)類DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10蛋白或多肽的區(qū)室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說(shuō)明。通常，該試劑盒能夠進(jìn)行定性或定量分析。
其它實(shí)施方案包括一種核酸，它在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO3雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQID NO5雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO25雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO9雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO11雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO15或17雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO31雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO21雜交；在30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO33雜交；在至少大約30個(gè)核苷酸的一段序列內(nèi)，表現(xiàn)出與靈長(zhǎng)類DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10的同一性至少為大約85％。
優(yōu)選的是，這種核酸將具有這類性質(zhì)，其中洗滌條件為45℃和/或500mM鹽；或所述同一性至少為90％和/或所述一段序列至少為55個(gè)核苷酸。更優(yōu)選的是，所述洗滌條件為55℃和/或150mM鹽；或所述同一性至少為95％和/或所述一段序列至少為75個(gè)核苷酸。
本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞生理學(xué)或發(fā)育的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與哺乳動(dòng)物DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9或DTLR10的激動(dòng)劑或拮抗劑接觸。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述I.一般描述本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物、本文的靈長(zhǎng)類DNAX Toll樣受體分子(DTLR)的氨基酸序列和DNA序列，所述受體分子具有特別限定的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。這些受體分子在本文中已經(jīng)分別命名為DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9和DTLR10，它們將人Toll樣受體家族的成員數(shù)由1增加至10。由例如人的靈長(zhǎng)類的cDNA序列文庫(kù)，獲得編碼這些分子的各種cDNA。也可能需要其它靈長(zhǎng)類或其它哺乳動(dòng)物的相應(yīng)物。
例如在Maniatis等(1982)Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press；Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，(第二版)，第1-3卷，CHS Press，NY；Ausubel等，Biology，Greene PublishingAssociates，Brooklyn，NY；或Ausubel等(1987和定期增刊)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York中描述或引用了可應(yīng)用的某些標(biāo)準(zhǔn)方法，每個(gè)參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
在SEQ ID NO1和2中顯示了人DTLR1編碼區(qū)段的完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。也參見Nomura等(1994)DNA Res127-35。在SEQ ID NO3和4中顯示了人DTLR2編碼區(qū)段的完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO5和6中顯示了人DTLR3編碼區(qū)段的完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ IDNO7和8中顯示了人DTLR4編碼區(qū)段的完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO25和26中顯示了人DTLR4編碼區(qū)段的替代的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO9和10中顯示了人DTLR5編碼區(qū)段的部分核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO11和12中顯示了人DTLR6編碼區(qū)段的完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列，而在SEQ ID NO13和14中提供了小鼠DTLR6的部分序列。在SEQ ID NO27和29(核苷酸序列)和SEQ IDNO28和30(氨基酸序列)中提供了另一小鼠DTLR6的序列。也提供了人DTLR7編碼區(qū)段的部分核苷酸序列(SEQ ID NO15和17)和相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ ID NO16和18)。在SEQ ID NO19和20中顯示了人DTLR8編碼區(qū)段的部分核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQID NO31和32中顯示了一種人DTLR編碼區(qū)段的更完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO21和22中顯示了人DTLR9編碼區(qū)段的部分核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO23和24中顯示了人DTLR10編碼區(qū)段的部分核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO33和34中顯示了人DTLR10編碼區(qū)段的更完整的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。在SEQ ID NO35中顯示了小鼠DTLR10編碼區(qū)段的部分核苷酸序列。表1人DTLR胞內(nèi)域的比較。DTLR1為SEQ ID NO2；DTLR2為SEQ ID NO4；DTLR3為SEQ ID NO6；DTLR4為SEQ ID NO8；DTLR5為SEQ ID NO10；而DTLR6為SEQID NO12。在所述DTLR中，特別重要和保守的(例如特征性的)殘基對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO18的殘基try10-tyr13；trp26；cys46；trp52；pro54-gly55；ser69；lys71；trp134-pro135；和phe144-trp145。DTLR1QRNLQFHAFISYSGHD---SFWVKNELLPNLEKEG-----MQICLHERNFDTLR9KENLQFHAFISYSEHD---SAWVKSELVPYLEKED-----IQICLHERNFDTLR8------------------------NELIPNLEKEDGS---ILICLYESYFDTLR2SRNICYDAFVSYSERD---AYWVENLMVQELENFNPP---FKLCLHKRDFDTLR6SPDCCYDAFIVYDTKDPAVTEWVLAELVAKLEDPREK--HFNLCLEERDWDTLR7TSQTFYDAYISYDTKDASVTDWVINELRYHLEESRDK--NVLLCLEERDWDTLR10 EDALPYDAFVVFDKTXSAVADWVYNELRGQLEECRGRW-ALRLCLEERDWDTLR4RGENIYDAFVIYSSQD---EDWVRNELVKNLEEGVPP---FQLCLHYRDFDTLR5PDMYKYDAYLCFSSKD---FTWVQNALLKHLDTQYSDQNRFNLCFEERDFDTLR3TEQFEYAAYIIHAYKD---KDWVWEHFSSMEKEDQS----LKFCLEERDF:.. :*::DTLR1VPGKSIVENIITC-IEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCH-YELYFAHHNLFHEDTLR9VPGKSIVENIINC-IEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCH-YELYFAHHNLFHEDTLR8DPGKSISENIVSF-IEKSYKSIFVLSPNFVQNEWCH-YEFYFAHHNLFHEDTLR2IPGKWIIDNIIDS-IEKSHKTVFVLSENFVKSEWCK-YELDFSHFRLFEEDTLR6LPGQPVLENLSQS-IQLSKKTVFVMTDKYAKTENFK-IAFYLSHQRLMDEDTLR7DPGLAIIDNLMQS-INQSKKTVFVLTKKYAKSWNFK-TAFYLXLQRLMGEDTLR10 LPGKTLFENLWAS-VYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLR-AIFLLAQQRLLE-DTLR4IPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCI-FEYEIAQTWQFLSDTLR5VPGENRIANIQDA-IWNSRKIVCLVSRHFLRDGWCL-EAFSYAQGRCLSDDTLR3EAGVFELEAIVNS-IKRSRKIIFVITHHLLKDPLCKRFKVHHAVQQAIEQ.* :. * * : ::: :DTLR1GSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANDTLR9GSNNLILILLEPIPQNSIPNKYHKLKALMTQRTYLQWPKEKSKRGLFWA-DTLR8NSDHIILILLEPIPFYCIPTRYHKLEALLEKKAYLEWPKDRRKCGLFWANDTLR2NNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNDTLR6KVDVIILIFLEKPFQK---SKFLQLRKRLCGSSVLEWPTNPQAHPYFWQCDTLR7NMDVIIFILLEPVLQH---SPYLRLRQRICKSSILQWPDNPKAERLFWQTDTLR10 --------------------------------------------------DTLR4SRAGIIFIVLQKVEKT-LLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRDTLR5LNSALIMVVVGSLSQY-QLMKHQSIRGFVQKQQYLRWPEDLQDVGWFLHKDTLR3NLDSIILVFLEEIPDYKLNHALCLRRGMFKSHCILNWPVQKERIGAFRHKDTLR1LRAAINIKLTEQAKK--------------------------DTLR9-----------------------------------------DTLR8LRAAVNVNVLATREMYELQTFTELNEESRGSTISLMRTDCLDTLR2LRAAIKS----------------------------------DTLR6LKNALATDNHVAYSQVFKETV--------------------DTLR7LXNVVLTENDSRYNNMYVDSIKQY-----------------DTLR10 -----------------------------------------DTLR4LRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI------------DTLR5LSQQILKKEKEKKKDNNIPLQTVATIS--------------DTLR3LQVALGSKNSVH-----------------------------
本文所用的術(shù)語(yǔ)DNAX Toll樣受體2(DTLR2)將用來(lái)描述一種蛋白，包括蛋白或肽區(qū)段，所述蛋白或肽區(qū)段具有和享有SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列或其大致的片段。DTLR3和SEQ ID NO6、DTLR4和SEQ ID NO26、DTLR5和SEQ ID NO10、DTLR6和SEQ ID NO12、DTLR7和SEQ ID NO16和18、DTLR8和SEQ IDNO32、DTLR9和SEQ ID NO22、以及DTLR10和SEQ ID NO34具有類似的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
本發(fā)明也包括已提供其序列的相應(yīng)DTLR等位基因的蛋白變異體，例如變異蛋白激動(dòng)劑或拮抗劑。通常，這類激動(dòng)劑或拮抗劑會(huì)表現(xiàn)出低于大約10％的序列差異，因此常常會(huì)具有1-11重取代，例如2重、3重、5重、7重和其它重取代。也包括所述蛋白的等位基因變異體和其它變異體，例如天然的多態(tài)變異體。通常，它會(huì)高親和性地結(jié)合于其相應(yīng)的生物學(xué)受體，其親和性例如為至少大約100nM，通常優(yōu)于大約30nM，優(yōu)選優(yōu)于大約10nM，更優(yōu)選優(yōu)于大約3nM。在本文中該術(shù)語(yǔ)也將用來(lái)指所述哺乳動(dòng)物蛋白相關(guān)的天然存在的形式，例如等位基因變異體、多態(tài)變異體和代謝變異體。
本發(fā)明也包括與SEQ ID NO4中的氨基酸序列具有大致氨基酸序列同一性的蛋白或肽。它將包括具有相對(duì)少取代的序列變異體，例如最好少于3-5重取代。將相似的特征應(yīng)用于SEQ ID NO6、26、10、12、16、18、32、22和34中提供的其它DTLR序列。
大致的多肽“片段”或“區(qū)段”是指一段氨基酸殘基序列，它至少大約為8個(gè)氨基酸，一般至少為10個(gè)氨基酸，更一般至少為12個(gè)氨基酸，經(jīng)常至少為14個(gè)氨基酸，更經(jīng)常至少為16個(gè)氨基酸，典型至少為18個(gè)氨基酸，更典型至少為20個(gè)氨基酸，通常至少為22個(gè)氨基酸，更通常至少為24個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少為26個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少為28個(gè)氨基酸，而在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少為大約30個(gè)或更多的氨基酸?？梢栽诤线m長(zhǎng)度的數(shù)段序列內(nèi)，將不同蛋白區(qū)段的序列與另一蛋白區(qū)段的序列比較。
通過使殘基匹配最優(yōu)化，必要時(shí)，根據(jù)需要引入間隙，確定氨基酸序列的同源性或序列同一性。參見例如Needleham等(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff等，(1983)Time Warps，String Edits，andMacromoleculesThe Theory and Practice of Sequence Comparsion的第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和IntelliGenetics(Mountain View，CA)的軟件包；和Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)(Madison，WI)的軟件包；以上每個(gè)參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。當(dāng)將保守取代考慮為匹配時(shí)，會(huì)有變化。保守取代通常包括以下組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。同源的氨基酸序列計(jì)劃包括該細(xì)胞因子序列中的天然等位基因變異和種間變異。典型的同源蛋白或肽與SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的氨基酸序列區(qū)段的同源性將從50-100％(如果可以引入間隙)至60-100％(如果包括保守取代)。同源性測(cè)量結(jié)果將至少為大約70％，一般至少為76％，更一般至少為81％，常常至少為85％，更常常至少為88％，典型至少為90％，更典型至少為92％，通常至少為94％，更通常至少為大約95％，優(yōu)選至少為大約96％，而更優(yōu)選至少為大約97％，而在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少為98％或更高。同源性的程度將隨所比較的區(qū)段長(zhǎng)度而變化。諸如等位基因變異體的同源蛋白或肽，將與SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34中描述的實(shí)施方案共享大多數(shù)生物活性。在氨基酸水平或核苷酸水平上，特別感興趣的比較區(qū)域?qū)?yīng)于區(qū)組1-10中每個(gè)區(qū)組內(nèi)的那些區(qū)域、或區(qū)組內(nèi)的區(qū)域，所述區(qū)組對(duì)應(yīng)于圖2A中指明的區(qū)組。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物活性”用來(lái)描述(但不限于)相應(yīng)配體對(duì)炎癥反應(yīng)、先天免疫和/或形態(tài)發(fā)生發(fā)育的作用。例如，這些受體應(yīng)該同IL-1受體一樣，介導(dǎo)磷酸酶或磷酸化酶活性，所述活性容易用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。參見例如Hardie等(編輯1995)The Protein Kinase FactBook第I和II卷，Academic Press，San Diego，CA；Hanks等(1991)Meth.Enzymol.20038-62；Hunter等(1992)Cell 70375-388；Lewin(1990)Cell 61743-752；Pines等(1991)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.56449-463；和Parker等(1993)Nature 363736-738。所述受體表現(xiàn)出同可調(diào)節(jié)酶非常相似的生物活性，該活性通過配體結(jié)合而被調(diào)節(jié)。然而，該酶的轉(zhuǎn)換數(shù)比受體復(fù)合物更接近酶。此外，誘導(dǎo)這種酶活性所必需的被占據(jù)的受體數(shù)低于大多數(shù)受體系統(tǒng)，與在每個(gè)細(xì)胞數(shù)以千計(jì)的數(shù)值下觸發(fā)的大多數(shù)受體相反，被占據(jù)的受體數(shù)可能更接近每個(gè)細(xì)胞數(shù)打。所述受體或其部分作為標(biāo)記通用底物或特定底物的磷酸標(biāo)記酶，可能是有用的。
術(shù)語(yǔ)例如DTLR的配體、激動(dòng)劑、拮抗劑和類似物，包括調(diào)節(jié)對(duì)Toll配體樣蛋白特征性細(xì)胞應(yīng)答的分子、以及加工配體-受體相互作用的更標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)特征的分子，例如在所述受體是天然受體或抗體的情況下。細(xì)胞應(yīng)答可能通過不同的Toll配體與細(xì)胞受體結(jié)合而介導(dǎo)，其中所述細(xì)胞受體與I型或II型IL-1受體相關(guān)，但形式可能不同。參見例如Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Dev.Biol.12393-416；Marisato和Anderson(1995)Ann.Rev.Genetics 29371-3991和Hultmark(1994)Nature 367116-117。
此外，配體是這樣一種分子，它或者作為所述受體或其類似物結(jié)合的天然配體起作用，或者作為所述天然配體的功能類似物的分子而起作用。所述功能類似物可以是具有結(jié)構(gòu)修飾的配體，或可以是完全不相關(guān)的分子，該分子具有與所述合適的配體結(jié)合決定基相互作用的分子形狀。所述配體可以用作激動(dòng)劑或拮抗劑，參見例如Goodman等(編輯)(1990)Goodman & Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics，Pergamon Press，New York。
合理的藥物設(shè)計(jì)也可以基于受體或抗體以及其它效應(yīng)物或配體的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究。效應(yīng)物可以是對(duì)配體結(jié)合應(yīng)答而介導(dǎo)其它功能的其它蛋白、或正常與該受體相互作用的其它蛋白。確定哪些位點(diǎn)與特定的其它蛋白相互作用的方法是物理結(jié)構(gòu)測(cè)定，例如X射線晶體學(xué)或2維NMR技術(shù)。這些將提供對(duì)于哪些氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)的指南。關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定的詳細(xì)描述，參見例如Blundell和Johnson(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。II.活性Toll樣受體蛋白將具有許多不同的生物活性，例如在磷酸代謝中，將磷酸加入特定底物(通常為蛋白)或從特定底物去除磷酸。這類活性通常導(dǎo)致對(duì)炎癥功能、其它先天的免疫應(yīng)答或形態(tài)學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)。DTLR2、3、4、5、6、7、8、9或10蛋白與其它Toll樣受體蛋白同源，但它們每種均具有結(jié)構(gòu)差異。例如，人DTLR2基因的編碼序列可能與小鼠DTLR2的核苷酸編碼序列具有大約70％的同一性。在氨基酸水平上，也可能有相當(dāng)?shù)耐恍浴?br> 所述DTLR的生物活性與將磷酸部分添加至底物或從底物去除相關(guān)，通常以特異性方式相關(guān)，但有時(shí)以非特異性方式相關(guān)?？梢澡b定底物，或可以用標(biāo)準(zhǔn)方法分析酶活性的條件，例如如以下文獻(xiàn)中所述Hardie等(編輯1995)The Protein Kinase FactBook第I和II卷，Academic Press，San Diego，CA；Hanks等(1991)Meth.Enzymol.20038-62；Hunter等(1992)Cell 70375-388；Lewin(1990)Cell 61743-752；Pines等(1991)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.56449-463；Parker等(1993)Nuature 363736-738。III.核酸本發(fā)明設(shè)想了分離的核酸或片段的用途，例如它們編碼這些蛋白或密切相關(guān)的蛋白、或它們的片段，例如以編碼相應(yīng)的多肽，最好是具有生物活性的多肽。另外，本發(fā)明包括分離或重組的DNA，所述DNA編碼的這類蛋白或多肽，具有所述相應(yīng)DTLR(單獨(dú)的或作為一組)的特征性序列。通常，該核酸能夠在合適的條件下，與SEQ ID NO3、5、25、9、11、15、17、31、21或33中所示的核酸序列區(qū)段雜交，但最好與SEQ ID NO1的相應(yīng)區(qū)段不雜交。所述生物活性蛋白或多肽可以是全長(zhǎng)蛋白或片段，并且通常會(huì)具有其氨基酸序列與SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34中所示的氨基酸序列同源的區(qū)段。此外，本發(fā)明包括分離的或重組的核酸或其片段的用途，所述核酸編碼的蛋白具有等同于DTLR2-10蛋白的片段。所述分離的核酸在5’和3’側(cè)翼可以具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸添加信號(hào)和來(lái)自所述天然基因的其它調(diào)節(jié)序列。
“分離的”核酸是大致純的核酸，例如RNA、DNA或混合聚合物，它與天然伴隨天然序列的其它組分分離，所述其它組分諸如核糖體、聚合酶和來(lái)自起源物種的側(cè)翼基因組序列。該術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)從其天然存在的環(huán)境中取出的核酸序列，包括重組的或克隆的DNA分離物，它們因此可與天然存在的組分區(qū)別開來(lái)；和化學(xué)合成的類似物或由異源系統(tǒng)生物合成的類似物。大致純的分子包括該分子的分離形式，或者為完全純的，或者為大致純的。
分離的核酸一般為分子的均質(zhì)組合物，但在某些實(shí)施方案中，含有異質(zhì)性，最好具有較少的異質(zhì)性。通常在該聚合物末端或?qū)τ谒璧纳锕δ芑蚧钚圆恢匾牟糠职l(fā)現(xiàn)這種異質(zhì)性。
“重組的”核酸通常根據(jù)生產(chǎn)方法或其結(jié)構(gòu)而定義。對(duì)于其生產(chǎn)方法，例如用使用重組核酸技術(shù)的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述重組技術(shù)例如涉及在所述核苷酸序列中人的干涉。通常，這種干涉涉及體外操作，盡管在某些情況下，它可以涉及更經(jīng)典的動(dòng)物育種技術(shù)?；蛘撸梢允怯靡韵路椒ㄖ苽涞暮怂岙a(chǎn)生包含天然相互不相鄰的兩種片段的融合體的序列，但是指排除天然產(chǎn)物，例如在其天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的天然存在的突變體。因此，例如，包括用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制備的產(chǎn)物，也包括包含用任何合成寡核苷酸方法所衍生序列的核酸。通常進(jìn)行這樣一種方法，以用編碼同一種或保守的氨基酸的豐余密碼子取代一個(gè)密碼子，同時(shí)通常引入或去除一個(gè)限制性酶的序列識(shí)別位點(diǎn)?；蛘?，進(jìn)行該方法，以將所需功能的核酸區(qū)段連接在一起，以產(chǎn)生包括所需功能組合的單一的遺傳實(shí)體，例如編碼融合蛋白的遺傳實(shí)體，其中所述功能組合是未在通?？傻玫降奶烊恍问街邪l(fā)現(xiàn)的組合。限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)常常是這類人工修飾的靶，但可以通過設(shè)計(jì)，加入其它位點(diǎn)特異性靶，例如啟動(dòng)子、DNA復(fù)制位點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征。相似的概念將用于重組(例如融合)多肽。這將包括二體重復(fù)序列。具體包括合成的核酸，它由于遺傳密碼的豐余性而編碼相同的DTLR2-10的多肽或片段；和來(lái)自各種不同的相關(guān)分子(例如其它IL-1受體家族成員)的序列的融合體。
在核酸方面，“片段”是一連續(xù)的區(qū)段，它至少為大約17個(gè)核苷酸，一般至少為21個(gè)核苷酸，更一般至少為25個(gè)核苷酸，通常至少30個(gè)核苷酸，更通常至少為35個(gè)核苷酸，常常至少為39個(gè)核苷酸，更常常至少為45個(gè)核苷酸，典型至少為50個(gè)核苷酸，更典型至少為55個(gè)核苷酸，經(jīng)常至少為60個(gè)核苷酸，更經(jīng)常至少為66個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少為72個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少為79個(gè)核苷酸，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少為85個(gè)或更多個(gè)核苷酸。通常，可以在合適長(zhǎng)度的數(shù)段序列內(nèi)，將不同遺傳序列的片段與另一序列的片段進(jìn)行比較，特別限定的區(qū)段諸如下述的域。
編碼DTLR2-10的核酸將特別有用，以鑒定編碼蛋白本身或其相關(guān)蛋白的基因、mRNA和cDNA種類，以及鑒定編碼來(lái)自不同個(gè)體或相關(guān)物種的多態(tài)變異體、等位基因變異體或其它遺傳變異體。用于這類篩選的優(yōu)選探針是白介素的那些區(qū)域，它們?cè)诓煌鄳B(tài)變異體之間是保守的，或者它們含有缺乏特異性的核苷酸，并且它們最好是全長(zhǎng)的或接近全長(zhǎng)的。在其它情況下，多態(tài)變異體特異性序列將是更有用的。
本發(fā)明還包括重組核酸分子和片段，它們具有與本文提出的分離的DNA相同或高度同源的核酸序列。特別是，所述序列將常常與控制轉(zhuǎn)錄、翻譯和DNA復(fù)制的DNA區(qū)段操作性地連接。這些額外的區(qū)段通常有助于表達(dá)所需的核酸區(qū)段。
當(dāng)相互比較或與SEQ ID NO3、5、25、9、11、15、17、31、21或33中所示的序列比較時(shí)，同源的、或高度相同的核酸序列表現(xiàn)出顯著的相似性。核酸中的同源性標(biāo)準(zhǔn)是以下兩個(gè)測(cè)量結(jié)果之一本領(lǐng)域一般使用的通過序列比較得到的同源性，或基于雜交條件的同源性。以下更詳細(xì)地描述比較性的雜交條件。
在核酸序列比較方面，大致同一性是指當(dāng)對(duì)比時(shí)，或者所述區(qū)段或者其互補(bǔ)鏈，在插入或缺失合適的核苷酸進(jìn)行最佳對(duì)比時(shí)，至少大約60％的核苷酸相同，一般至少為66％，經(jīng)常至少為71％，常常至少為76％，更常常至少為80％，通常至少為84％，更通常至少為大約88％，典型至少為91％，更典型至少為大約93％，優(yōu)選至少為大約95％，更優(yōu)選至少為大約96-98％或更多，而在特定實(shí)施方案中，高達(dá)大約99％或更高的核苷酸相同，所述區(qū)段包括例如編碼結(jié)構(gòu)域的區(qū)段，諸如下述的區(qū)段。另一方面，當(dāng)所述區(qū)段在選擇性雜交條件下與一條鏈或其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)，存在著大致相似性，一般使用由SEQ ID NO3、5、25、9、11、15、17、31、21或33衍生的序列。通常，當(dāng)在一段至少大約14個(gè)核苷酸的序列中有大約55％同源性時(shí)，將發(fā)生選擇性雜交，同源性更通常至少為大約65％，優(yōu)選至少為大約75％，而更優(yōu)選至少為大約90％。參見Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res.12203-213，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。所述的同源性比較的長(zhǎng)度如上所述，可以為更長(zhǎng)的序列，在某些實(shí)施方案中為一段至少為大約17個(gè)核苷酸的序列，一般至少為大約20個(gè)核苷酸，通常至少為大約24個(gè)核苷酸，經(jīng)常至少為大約28個(gè)核苷酸，典型至少為大約32個(gè)核苷酸，更典型至少為大約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少為大約50個(gè)核苷酸，而更優(yōu)選至少為大約75-100或更多個(gè)核苷酸。
關(guān)于雜交方面的同源性，嚴(yán)格條件將是通常在雜交反應(yīng)中控制的鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其它參數(shù)的嚴(yán)格性的組合條件。嚴(yán)格性溫度條件通常包括超過大約30℃的溫度，更通常為超過大約37℃的溫度，典型的為超過大約45℃的溫度，更典型的為超過大約55℃的溫度，優(yōu)選為超過大約65℃的溫度，而更優(yōu)選為超過大約70℃的溫度。嚴(yán)格性的鹽條件一般低于大約500mM，通常低于大約400mM，更通常低于大約300mM，典型的低于大約200mM，優(yōu)選低于大約100mM，而更優(yōu)選低于大約80mM，甚至降至低于大約20mM。然而，參數(shù)的組合比任何單個(gè)參數(shù)的測(cè)量值更為重要。參見例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
另一方面，對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列用作參比序列，將測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用一種序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定亞序列坐標(biāo)，并且指定序列運(yùn)算規(guī)則程序的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)，計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列同一性百分率。
可以用如下進(jìn)行用于比較的序列的光學(xué)序列對(duì)比例如用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法、用Needlman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性序列對(duì)比算法、通過Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 852444的相似性方法的檢索、通過計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)這些算法(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、或通過目測(cè)檢查(一般參見Ausubel等，見上述)。
有用的算法的一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP采用漸進(jìn)的成對(duì)序列對(duì)比，產(chǎn)生來(lái)自一組相關(guān)序列的一個(gè)多重序列對(duì)比，以顯示關(guān)系和序列同一性的百分率。它也繪出一個(gè)樹(tree)或枝叉圖(dendogram)，顯示用來(lái)產(chǎn)生所述序列對(duì)比的成簇關(guān)系。PILEUP采用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進(jìn)序列對(duì)比法的簡(jiǎn)化方法。所用的方法類似于Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5151-153描述的方法。該程序可以對(duì)多達(dá)300個(gè)序列進(jìn)行序列對(duì)比，每個(gè)序列的最大長(zhǎng)度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。多重序列對(duì)比法以兩個(gè)最相似的序列的成對(duì)序列對(duì)比開始，產(chǎn)生一組(a cluster of)兩個(gè)對(duì)比的序列。然后將該組與下一個(gè)最相關(guān)的序列或下一組對(duì)比的序列進(jìn)行序列對(duì)比。通過簡(jiǎn)單地延伸兩個(gè)單獨(dú)序列的成對(duì)序列對(duì)比，將兩組序列進(jìn)行序列對(duì)比。通過一系列漸進(jìn)的成對(duì)序列對(duì)比，得到最后的序列對(duì)比。通過指定序列比較區(qū)的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐標(biāo)，并且指定該程序的參數(shù)，運(yùn)行該程序。例如，可以將參比序列與其它測(cè)試序列比較，以采用以下參數(shù)測(cè)定序列同一性關(guān)系的百分率默認(rèn)間隙加權(quán)值(3.00)、默認(rèn)間隙長(zhǎng)度加權(quán)值(0.10)和加權(quán)的末端間隙。
適用于測(cè)定序列同一性和序列相似性百分率的算法的另一實(shí)例是BLAST算法，在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有描述。公眾可從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/)得到進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒別長(zhǎng)度為W的短字(short words)，而鑒別高計(jì)分序列對(duì)(HSP)，當(dāng)與一數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字進(jìn)行序列對(duì)比時(shí)，它們或者匹配或者滿足某些陽(yáng)性值的閾值T。T稱為相鄰字計(jì)分閾值(Altschul等，見上述)。這些起始的相鄰字命中(word hit)用作種子，起始搜尋以尋找含所述字命中的較長(zhǎng)的HSP。然后，只要可以增加累積的序列對(duì)比計(jì)分，則所述字命中在兩個(gè)方向上沿每個(gè)序列延伸。在以下情況下，每個(gè)方向上所述字命中的延伸停止由于來(lái)自其最大得到的數(shù)值的數(shù)量X，累積的序列對(duì)比計(jì)分下降；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)計(jì)分的殘基序列對(duì)比的累積，累積計(jì)分轉(zhuǎn)到零或零以下；或達(dá)到兩個(gè)序列之一的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定該序列對(duì)比的靈敏度和速度。BLAST程序使用時(shí)，默認(rèn)字長(zhǎng)(W)為11，BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8910915)序列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，并且比較兩條鏈。
除計(jì)算序列同一性百分率外，BLAST算法也進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 905873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一種測(cè)量是最小和概率(P(N))，這提供偶然發(fā)生兩個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列之間匹配概率的指標(biāo)。例如，如果在測(cè)試核酸與參比核酸的比較中，最小和概率低于大約0.1，更優(yōu)選低于大約0.01，最優(yōu)選低于大約0.001時(shí)，認(rèn)為該核酸與參比序列相似。
兩個(gè)多肽的核酸序列大致相同的再一指標(biāo)是第一種核酸編碼的多肽與第二種核酸編碼多肽免疫交叉反應(yīng)，如以下所述。因此，例如在一種多肽與第二種多肽僅由于保守取代而不同時(shí)，這兩種多肽通常大致相同。兩個(gè)核酸序列大致相同的另一指標(biāo)是所述兩種分子在嚴(yán)格條件下相互雜交，如下所述。
通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸序列倒位，可以容易地修飾分離的DNA。這些修飾產(chǎn)生新的DNA序列，它們編碼該蛋白或其衍生物。這些修飾的序列可以用來(lái)產(chǎn)生突變的蛋白(突變蛋白)，或增強(qiáng)變異體種類的表達(dá)。表達(dá)增強(qiáng)可以包括基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增加、翻譯增加和其它機(jī)制。這類突變的DTLR樣衍生物，包括該蛋白或其片段的預(yù)定突變或定點(diǎn)突變，包括利用遺傳密碼簡(jiǎn)并性的沉默突變。本文所用的“突變的DTLR”包括這樣的多肽，它在其它情況下屬于上述DTLR同源性定義范圍內(nèi)，但其氨基酸序列無(wú)論由于缺失、置換，還是由于插入，均不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的其它DTLR樣蛋白的氨基酸序列。特別是，“定點(diǎn)突變DTLR”包括與SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的蛋白大致同源的蛋白，并通常共享大多數(shù)本文公開形式的生物活性或作用。
盡管定點(diǎn)突變位點(diǎn)是預(yù)定的，但突變體不必是定點(diǎn)的。通過在該基因中制造氨基酸插入或缺失，可以達(dá)到對(duì)哺乳動(dòng)物DTLR誘變，并將其與表達(dá)偶聯(lián)?？梢援a(chǎn)生置換、缺失、插入或任何組合，以得到最終的構(gòu)成物。插入包括氨基末端融合或羧基末端融合?？梢杂诎忻艽a子進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后可以根據(jù)所需活性，篩選表達(dá)的哺乳動(dòng)物DTLR突變體。在序列已知的DNA中于預(yù)定位點(diǎn)制造置換突變的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如通過M13引物誘變。也參見Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987和定期增刊)。
所述DNA中的突變應(yīng)該不將編碼序列置于讀框之外，最好不產(chǎn)生可以雜交而產(chǎn)生諸如環(huán)或發(fā)夾的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862描述的亞磷酰胺法將產(chǎn)生合適的合成DNA片段。常?；蛘咄ㄟ^合成互補(bǔ)鏈，并在合適的條件下使所述鏈一起退火，或通過加入互補(bǔ)鏈，用DNA聚合酶與合適的引物序列，獲得雙鏈片段。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)通?？梢杂糜谡T變。另一方面，誘變引物是通常用來(lái)于預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生限定的突變的方法。參見例如Innis等(編輯1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press，San Diego，CA；和Dieffenbach和Dveksler(1995；編輯)PCR PrimerA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，CSH，NY。IV.蛋白質(zhì)、肽如上所述，本發(fā)明包括靈長(zhǎng)類DTLR2-10，例如其序列公開于SEQID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34和上述的靈長(zhǎng)類DTLR2-10。也設(shè)想了等位基因變異體和其它變異體，包括例如將這類序列與其它序列的部分組合的融合蛋白，所述其它序列包括表位標(biāo)記和功能域。
本發(fā)明也提供重組蛋白，例如采用來(lái)自這些嚙齒動(dòng)物蛋白區(qū)段的異源融合蛋白。異源融合蛋白是一種蛋白或區(qū)段的融合體，所述蛋白或區(qū)段在天然狀態(tài)下通常不以同一方式融合。因此，DTLR與IL-1受體的融合產(chǎn)物是一種連續(xù)的蛋白分子，它具有以典型的肽鍵融合的序列，通常作為單一的翻譯產(chǎn)物制備，并表現(xiàn)出例如得自每種源肽的序列或抗原性的特性。相似的概念適用于異源核酸序列。
另外，通過組合來(lái)自其它相關(guān)蛋白的相似功能域或結(jié)構(gòu)域，可以制備新的構(gòu)成物，其中所述其它相關(guān)蛋白例如為IL-1受體或其它DTLR，包括種變異體。例如，在不同的新融合多肽或片段之間，可以“交換”配體結(jié)合區(qū)段或其它區(qū)段。參見例如Cunningham等(1989)Science 2431330-1336；和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992，每個(gè)文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。因此，由于受體結(jié)合特異性的功能的結(jié)合，將產(chǎn)生表現(xiàn)出新的特異性組合的新嵌合多肽。例如，可以加入來(lái)自其它相關(guān)受體分子的配體結(jié)合域，或用其取代該蛋白或相關(guān)蛋白的其它域。所產(chǎn)生的蛋白通常會(huì)具有雜種功能或特性。例如，融合蛋白可以包含一個(gè)引導(dǎo)域，它可以用以將該融合蛋白結(jié)合至特定的亞細(xì)胞細(xì)胞器。
可以從各種序列數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇候選的融合伴侶和序列，所述數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank，c/o IntelliGenetics，Mountain View，CA；和BCG，University of Wisconsin Biotechnology Computing Group，Madison，WI，它們通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明特別提供結(jié)合Toll配體和/或影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的突變蛋白。人DTLR1-10與IL-1家族其它成員的結(jié)構(gòu)對(duì)比，顯示出保守的特征/殘基。參見例如圖3A。人DTLR序列與IL-1家族其它成員的序列對(duì)比，顯示不同的結(jié)構(gòu)和功能共享特征。也參見Bazan等(1996)Nature379591；Lodi等(1994)Science 2631762-1766；Sayle和Milner-White(1995)TIBS 20374-376；和Gronenberg等(1991)Protein Engineering4263-269。
IL-1α和IL-1β配體結(jié)合作為第一受體的IL-1受體I型，然后該復(fù)合物與IL-1受體III型形成一種高親和性的受體復(fù)合物。這類受體亞基可能與所述新IL-1家族成員共享。
DTLR2-10序列的其它物種相應(yīng)物中的相似變異(例如在相應(yīng)的區(qū)域中)，應(yīng)該提供與配體或底物的相似相互作用。特別優(yōu)選用或者小鼠序列或人序列的取代。相反，離開配體結(jié)合相互作用區(qū)的保守取代將可能保留大多數(shù)信號(hào)活性。
靈長(zhǎng)類DTLR2-10的“衍生物”，包括氨基酸序列的突變體、糖基化變異體、代謝衍生物以及與其它化學(xué)部分的共價(jià)綴合物或聚集綴合物。通過例如采用本領(lǐng)域熟知的方法，將官能團(tuán)(functionalities)與所述DTLR氨基酸側(cè)鏈中或于N末端或C末端發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)連接，可以制備共價(jià)綴合物。這些衍生物可以包括但不限于羧基末端的脂族酯或酰胺、或含羧基側(cè)鏈的殘基、含羥基殘基的O-?；苌?、和氨基末端氨基酸或含氨基殘基(例如賴氨酸或精氨酸)的N-?；苌?。?；x自烷基部分，包括C3-C18的正烷基，由此形成烷?；减；N類。
特別是，包括糖基化改變，例如通過在多肽合成和加工期間，或在進(jìn)一步加工步驟中，修飾該多肽的糖基化模式而制備的糖基化改變。完成這一步的特別優(yōu)選的方法是將多肽暴露于糖基化酶，例如哺乳動(dòng)物糖基化酶，所述酶得自正常提供這種加工的細(xì)胞。也設(shè)想了去糖基化酶。也包括一級(jí)氨基酸序列相同的形式，它們具有其它少量修飾，包括磷酸化的氨基酸殘基，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
主要一組衍生物是所述受體或其片段與多肽的其它蛋白的共價(jià)綴合物。這些衍生物可以在重組培養(yǎng)物中合成，諸如為N末端融合體或C末端融合體，通過利用本領(lǐng)域已知的試劑，根據(jù)它們?cè)谕ㄟ^反應(yīng)性側(cè)基使蛋白交聯(lián)的有用性，合成這些衍生物。優(yōu)選用交聯(lián)劑衍生的位點(diǎn)是游離氨基、碳水化合物部分和半胱氨酸殘基。
也提供所述受體和其它同源或異源蛋白之間的融合多肽。同源多肽可以是不同受體之間的融合體，產(chǎn)生例如表現(xiàn)出多種不同Toll配體的結(jié)合特異性的雜種蛋白，或產(chǎn)生可以擴(kuò)大或減弱底物效應(yīng)特異性的受體。同樣，可以構(gòu)建表現(xiàn)出所述衍生蛋白特性或活性組合的異源融合體。典型的實(shí)例是報(bào)道多肽(例如熒光素酶)與受體區(qū)段或域(例如配體結(jié)合區(qū)段)的融合體，使得可以容易地確定所需配體的存在或位置。參見例如Dull等的美國(guó)專利第4,859,609號(hào)，它通過引用結(jié)合到本文中。其它基因融合伴侶包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、α淀粉酶、醇脫氫酶和酵母α交配因子。參見例如Godowski等(1988)Science 241812-816。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862描述的亞磷酰胺法，將產(chǎn)生合適的合成DNA片段。常?；蛘咄ㄟ^合成互補(bǔ)鏈，并在合適的條件下使所述鏈一起退火，或通過使用DNA聚合酶與合適的引物序列加入互補(bǔ)鏈，獲得雙鏈片段。
這類多肽也可以具有已經(jīng)進(jìn)行化學(xué)修飾的氨基酸殘基，所述化學(xué)修飾通過磷酸化、磺化、生物素化、或添加或去除其它部分(特別是分子形狀類似于磷酸基團(tuán)的那些部分)而進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，所述修飾將是有用的標(biāo)記試劑，或用作純化的靶，例如親和配體。
通常通過或者重組核酸方法，或者通過合成肽方法，制備融合蛋白。一般例如在Sambrook等(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual(第二版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，和Ausubel等(編輯1987和定期增刊)Current Protocls in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York中描述了核酸操作和表達(dá)的技術(shù)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。例如在Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science 232341-347；和Atherton等(1989)Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford中描述了多肽合成的技術(shù)，每個(gè)文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。也參見Dawson等(1994) Science 266776-779關(guān)于制備較大多肽的方法。
本發(fā)明也設(shè)想了非氨基酸序列變異或糖基化變異的DTLR2-10衍生物的用途。這類衍生物可以包括與化學(xué)部分的共價(jià)結(jié)合或聚集結(jié)合。這些衍生物一般分為三類(1)鹽，(2)側(cè)鏈和末端殘基共價(jià)修飾，和(3)吸附復(fù)合體，例如與細(xì)胞膜的吸附復(fù)合體。這類共價(jià)或聚集衍生物可用作免疫原、免疫測(cè)定中的試劑，或用于純化方法中，諸如用于受體或其它結(jié)合分子(例如抗體)的親和純化。例如，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法，通過將Toll配體共價(jià)結(jié)合至固相支持體(諸如溴化氰活化的Sepharose)，將Toll配體固定化，或?qū)⑵湮街辆巯N表面上，并且進(jìn)行或不進(jìn)行戊二醛交聯(lián)，用于DTLR受體、抗體或其它相似分子的測(cè)定或純化。該配體也可以用可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記，例如用氯胺T法放射碘化、共價(jià)結(jié)合至稀土螯合物、或綴合至用于診斷測(cè)定的另一熒光部分。
本發(fā)明的DTLR可以用作免疫原，用于生產(chǎn)對(duì)所述DTLR或其各種片段特異性的抗血清或抗體，例如它們能夠區(qū)別其它IL-1受體家族成員。所述純化的DTLR可以用來(lái)篩選單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述抗體或片段是通過用各種形式的含該蛋白的不純制劑免疫而制備的。具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括天然抗體的抗原結(jié)合片段，例如Fab、Fab2、Fv等等。所述純化的DTLR也可以用作試劑，來(lái)檢測(cè)對(duì)存在水平提高的表達(dá)應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體，或檢測(cè)導(dǎo)致針對(duì)該內(nèi)源受體的抗體產(chǎn)生的免疫失調(diào)。另外，DTLR片段也可以用作免疫原，以生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，如下面緊接描述的。例如，本發(fā)明設(shè)想了這樣的抗體或其片段或各種同源肽，所述抗體對(duì)SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34中所示的氨基酸序列具有結(jié)合親和性，或針對(duì)其而產(chǎn)生的。特別是，本發(fā)明設(shè)想了對(duì)特定片段具有結(jié)合親和性或針對(duì)其產(chǎn)生的抗體，所述特定片段預(yù)期或?qū)嶋H上暴露于所述天然DTLR的外部蛋白表面上。
由于可能通過競(jìng)爭(zhēng)抑制，抑制該配體與所述受體的結(jié)合，可以阻斷對(duì)所述受體配體的生理反應(yīng)。因此，本發(fā)明的體外測(cè)定常常會(huì)采用抗體或這些抗體的抗原結(jié)合區(qū)段，或連接至固相基質(zhì)的片段。這些測(cè)定也提供對(duì)或者配體結(jié)合區(qū)突變和修飾、或者其它突變和修飾(例如影響信號(hào)功能或酶功能的突變和修飾)的效應(yīng)的診斷測(cè)定。
本發(fā)明也設(shè)想了競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選測(cè)定的用途，例如在針對(duì)所述受體或片段的中和抗體與測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng)配體或其它抗體結(jié)合的情況下。以該方式，可以用所述中和抗體或片段檢測(cè)下述多肽的存在，所述多肽享有結(jié)合受體的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且也可以用來(lái)占據(jù)受體上的結(jié)合位點(diǎn)，其中所述結(jié)合位點(diǎn)在其它情況下可能結(jié)合配體。V.制備核酸和蛋白可以通過化學(xué)合成、篩選DNA文庫(kù)、或通過篩選由多種細(xì)胞系或組織樣品制備的基因組文庫(kù)，獲得編碼所述蛋白或其片段的DNA?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)方法和本文提供的序列，分離天然序列。通過雜交技術(shù)，或通過各種PCR技術(shù)，結(jié)合在例如GenBank的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，或通過在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，可以鑒定其它物種的相應(yīng)物。
該DNA可以在種類繁多的宿主細(xì)胞中表達(dá)，用以合成全長(zhǎng)受體或片段，所述全長(zhǎng)受體或片段可以進(jìn)而例如用來(lái)產(chǎn)生多克隆抗體或單克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾的配體結(jié)合域或激酶/磷酸酶域；和用于結(jié)構(gòu)/功能研究。可以在用合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中，表達(dá)變異體或片段。這些分子可以大致不含蛋白質(zhì)或細(xì)胞污染物，不是得自重組宿主中的那些分子，因此當(dāng)結(jié)合藥用可接受的載體和/或稀釋劑時(shí)，在藥用組合物中特別有用。所述蛋白或其部分可以作為與其它蛋白的融合體表達(dá)。
表達(dá)載體通常是自主復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)成物，它們含有所需的受體基因或其片段，通常與在合適宿主細(xì)胞中識(shí)別的合適的遺傳控制元件操作性地連接。這些控制元件能夠在合適的宿主中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。實(shí)現(xiàn)表達(dá)所必需的特定類型的控制元件，將取決于最終使用的宿主細(xì)胞。一般而言，所述遺傳控制元件可以包括原核啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng)，通常包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、一個(gè)控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的可選的操縱子、提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、一段編碼合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、以及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。表達(dá)載體通常也含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，使得該載體獨(dú)立于宿主細(xì)胞而復(fù)制。
本發(fā)明的載體包括這樣的載體，它們含有編碼所述蛋白的DNA或其編碼生物活性相當(dāng)?shù)亩嚯牡钠巍Ｋ鯠NA可以處于病毒啟動(dòng)子的控制之下，并且可以編碼一個(gè)選擇標(biāo)記。本發(fā)明還設(shè)想了這類表達(dá)載體的用途，當(dāng)所述載體與所述宿主匹配，并且將編碼該受體的真核cDNA插入該載體中，使得含所述載體的宿主的生長(zhǎng)表達(dá)所述cDNA時(shí)，所述表達(dá)載體能夠在原核或真核宿主中表達(dá)編碼這種蛋白的真核cDNA。通常，設(shè)計(jì)表達(dá)載體，用于在其宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，或用于擴(kuò)增，以大大提高每個(gè)細(xì)胞所需基因的總拷貝數(shù)。不必總是需要表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制，例如，可以采用不含有被所述宿主細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)的載體，實(shí)現(xiàn)該蛋白或其片段在各種宿主中瞬時(shí)表達(dá)。使用通過重組引起該蛋白編碼部分或其片段整合入宿主DNA中的載體，這也可能。
本文所用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合DNA片段和能夠?qū)NA片段整合入該宿主基因組的其它載體。表達(dá)載體是特化的載體，它們含有實(shí)現(xiàn)表達(dá)操作性連接的基因的遺傳控制元件。質(zhì)粒是最常用的載體形式，但本領(lǐng)域已知的、或成為已知的、起作相當(dāng)用的所有其它形式的載體均適用于本文。參見例如Pouewls等(1985和增刊)Cloing VectorsA Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.和Rodriquez等(編輯)VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses，Buttersworth，Boston，1988，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是已經(jīng)用采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的受體載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，最好是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通常表達(dá)所需的蛋白或其片段，但對(duì)于克隆、擴(kuò)增和操作其DNA的目的，不需要表達(dá)題述蛋白。本發(fā)明還設(shè)想了在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，由此允許該受體在細(xì)胞膜中累積?？梢曰蛘邚脑撆囵B(yǎng)物中，或者在某些情況下從培養(yǎng)基中，回收該蛋白。
對(duì)于本發(fā)明的目的，當(dāng)核酸序列在功能上相互相關(guān)時(shí)，將核酸序列操作性地連接。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA作為蛋白原表達(dá)，或參與將多肽導(dǎo)向至細(xì)胞膜或參與該多肽的分泌，則將該DNA與所述多肽操作性地連接。如果啟動(dòng)子控制該多肽的分泌，則將該DNA與多肽操作性地連接。假如一種啟動(dòng)子控制該多肽的轉(zhuǎn)錄，則將該啟動(dòng)子與編碼序列操作性地連接；如果將一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)定位以允許翻譯，則將其與編碼序列操作性地連接。通常，操作性連接的是指連續(xù)的，并且在讀框內(nèi)，然而，諸如抑制基因的某些遺傳元件是不連續(xù)連接的，但仍結(jié)合于操縱子序列，操縱子序列進(jìn)而控制表達(dá)。
合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、低等真核細(xì)胞和高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性生物，例如大腸桿菌和枯草桿菌(B.subtilis)。低等真核細(xì)胞包括酵母，例如釀酒酵母(S.cerevisiae)和畢赤酵母屬(Pichia)；以及網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)物種。高等真核細(xì)胞包括由動(dòng)物細(xì)胞建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系，所述動(dòng)物細(xì)胞包括非哺乳動(dòng)物來(lái)源，例如昆蟲細(xì)胞和鳥類，也包括哺乳動(dòng)物來(lái)源，例如人類、靈長(zhǎng)類和嚙齒動(dòng)物。
原核宿主-載體系統(tǒng)包括種類繁多的用于許多不同物種的載體。本文所用的大腸桿菌及其載體在種屬上用來(lái)包括用于其它原核細(xì)胞的相當(dāng)?shù)妮d體。用來(lái)擴(kuò)增DNA的代表性載體是pBR322或許多其衍生物?？梢杂脕?lái)表達(dá)該受體或其片段的載體，包括但不限于諸如這樣的載體，它們含有l(wèi)ac啟動(dòng)子(pUC系列)；trp啟動(dòng)子(pBR322-trp)；Ipp啟動(dòng)子(pIN系列)；λ-pP或pR啟動(dòng)子(pOTS)；或雜種啟動(dòng)子，諸如ptac(pDR540)。參見Brosius等(1988)“利用λ-、trp-、lac-和Ipp衍生的啟動(dòng)子的表達(dá)載體”，載于VectorsA Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses，(編輯，Rodriguez和Denhardt)，Buttersworth，Boston，第10章，第205-236頁(yè)，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
低等真核細(xì)胞，例如酵母和網(wǎng)柄菌屬，可以用含DTLR序列的載體轉(zhuǎn)化。對(duì)于本發(fā)明的目的，最常用的低等真核宿主是面包酵母，即釀酒酵母。它將用來(lái)在種屬上代表低等真核細(xì)胞，盡管可利用許多其它菌種和物種。酵母載體通常由一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(整合型除外)、一個(gè)選擇基因、一個(gè)啟動(dòng)子、編碼該受體或其片段的DNA、以及用于翻譯終止、聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止的序列。合適的酵母表達(dá)載體包括組成型啟動(dòng)子，諸如3-磷酸甘油激酶和各種其它糖酵解酶基因的啟動(dòng)子；或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如醇脫氫酶2啟動(dòng)子或金屬硫蛋白啟動(dòng)子。合適的載體包括以下類型的衍生物自主復(fù)制低拷貝數(shù)型(諸如YRp系列)、自主復(fù)制高拷貝數(shù)型(諸如YEp系列)；整合型(諸如YIp系列)，或微型染色體(諸如YCp系列)。
高等真核生物組織培養(yǎng)細(xì)胞一般是用于表達(dá)功能活性的白介素蛋白的優(yōu)選宿主細(xì)胞。原則上，可以使用任何高等真核生物組織培養(yǎng)細(xì)胞系，例如昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，不論其來(lái)自無(wú)脊椎動(dòng)物源還是來(lái)自脊椎動(dòng)物源。然而，最好是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染和繁殖已經(jīng)成為常規(guī)技術(shù)。有用的細(xì)胞系的實(shí)例包括海拉細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼鼠腎(BRK)細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、鳥細(xì)胞系和猴(COS)細(xì)胞系。用于這些細(xì)胞系的表達(dá)載體一般包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(如果使用基因組DNA)、一個(gè)多腺苷酸化位點(diǎn)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。這些載體也通常含有一個(gè)選擇基因或擴(kuò)增基因。合適的表達(dá)載體可以是攜帶啟動(dòng)子的質(zhì)粒、病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒，所述啟動(dòng)子例如得自諸如腺病毒、SV40、細(xì)小病毒、痘苗病毒或巨細(xì)胞病毒這類來(lái)源。合適的表達(dá)載體的代表性實(shí)例包括pCDNA1；pCD，參見Okayama等(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneo PolyA，參見Thomas等(1987)Cell 51503-512；和諸如pAC 373或pAC 610的桿狀病毒載體。
對(duì)于分泌蛋白，一個(gè)可讀框通常編碼一種多肽，它由于其N末端共價(jià)連接于信號(hào)肽的成熟的或分泌的產(chǎn)物組成。在該成熟的、或有活性的多肽分泌之前，該信號(hào)肽被切割。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)性的規(guī)律(例如von-Heihne(1986)Nucleic Acids Research 144683-4690)，可以以高度的精確性預(yù)測(cè)該切割位點(diǎn)，信號(hào)肽精確的氨基酸組成看來(lái)對(duì)其功能不重要，例如Randall等(1989)Science 2431156-1159；Kaiser等(1987)Science 253312-317。
通常需要在提供特定或限定的糖基化模式的系統(tǒng)中，表達(dá)這些多肽。在這種情況下，通常的模式是由該表達(dá)系統(tǒng)天然提供的。然而，將通過將該多肽(例如非糖基化形式)暴露于引入異源表達(dá)系統(tǒng)中的合適的糖基化蛋白，來(lái)修飾該模式。例如，該受體基因可以與一種或多種編碼哺乳動(dòng)物糖基化酶或其它糖基化酶的基因共轉(zhuǎn)化。采用該方法，可在原核細(xì)胞或其它細(xì)胞中得到某些哺乳動(dòng)物糖基化模式。
DTLR源可以是表達(dá)重組DTLR的真核或原核宿主，諸如以上描述的。該源也可以是諸如小鼠Swiss 3T3成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系，但本發(fā)明也設(shè)想了其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選的細(xì)胞系來(lái)自人的種類。
因?yàn)樗鲂蛄惺且阎?，所以可以通過合成肽的常規(guī)方法，制備靈長(zhǎng)類DTLR、其片段或衍生物。這些包括諸如在Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York；和Bodanszky(1984)The Principles ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag，New York中所述的方法，所有這些文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。例如，可以使用疊氮化物法、鹽酸法、酸酐法、混合酐法、活性酯法(例如對(duì)硝基苯酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯或氰基甲酯)、碳化二咪唑法、氧化還原法、或二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)/加成法。固相和液相合成都適用于前述方法。可以使用相似的技術(shù)與部分DTLR序列。
按照通常用于肽合成的以上方法，適當(dāng)?shù)刂苽渌鯠TLR蛋白、片段或衍生物，一般或者用所謂的分段法，該方法包括按順序一個(gè)接一個(gè)地將氨基酸縮合至末端氨基酸，或者通過將肽片段偶聯(lián)至末端氨基酸。通常必須保護(hù)在偶聯(lián)反應(yīng)中不使用的氨基，以防止于不正確的位置進(jìn)行偶聯(lián)。
如果采用固相合成，則將C末端氨基酸通過其羧基結(jié)合至不溶性載體或支持體。不特別限制所述不溶性載體，只要它對(duì)反應(yīng)性羧基具有結(jié)合能力即可。這類不溶性載體的實(shí)例包括鹵代甲基樹脂(諸如氯代甲基樹脂或溴代甲基樹脂)、羥甲基樹脂、酚樹脂、叔烷氧羰基酰肼化(hydrazidated)樹脂等等。
通過將氨基保護(hù)的氨基酸的活化羧基與先前形成的肽或鏈的反應(yīng)性氨基縮合，將氨基保護(hù)的氨基酸按順序結(jié)合，以逐步合成所述肽。合成所述完整的序列后，將該肽切離所述不溶性載體，以產(chǎn)生該肽。Merrifield等(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2156中一般描述了這種固相方法，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
通過肽分離，例如通過抽提、沉淀、電泳、各種形式的層析等等，可以從反應(yīng)混合物中分離和純化所制備的蛋白或其片段。根據(jù)所需的用途，本發(fā)明的受體可以以不同程度的純度獲得。利用本文公開的蛋白純化技術(shù)(參見下文)，或利用本文在免疫吸附親和層析方法中描述的抗體，完成純化。通過首先將所述抗體連接至固相支持體，然后使連接的抗體與合適細(xì)胞的溶解的裂解液、表達(dá)所述受體的其它細(xì)胞的裂解液或通過DNA技術(shù)產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞上清液接觸，進(jìn)行這種免疫吸附親和層析，見下述。
一般而言，該純化蛋白的純度至少為大約40％，一般至少為大約50％，通常至少為大約60％，典型的至少為大約70％，更典型的至少為大約80％，優(yōu)選至少為大約90％，更優(yōu)選至少為大約95％，而在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，為97％-99％或更高。純度通?；谥亓浚部梢曰谀?。將適當(dāng)?shù)貞?yīng)用不同的測(cè)定。VI.抗體可以針對(duì)不同哺乳動(dòng)物(例如靈長(zhǎng)類)的DTLR蛋白及其片段產(chǎn)生抗體，所述DTLR蛋白及其片段包括天然存在的天然形式和其重組形式，不同的是，針對(duì)該活性受體的抗體更可能識(shí)別僅存在于天然構(gòu)象中的表位。變性抗原的檢測(cè)也可以用于例如蛋白質(zhì)分析。也設(shè)想了抗獨(dú)特型抗體，它可以用作天然受體或抗體的激動(dòng)劑或拮抗劑。
通過用蛋白預(yù)定片段與免疫原性蛋白的綴合物免疫動(dòng)物，可以產(chǎn)生針對(duì)所述片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈形式。由分泌所需抗體的細(xì)胞制備單克隆抗體?？梢愿鶕?jù)與正常蛋白或缺陷蛋白的結(jié)合，或根據(jù)激動(dòng)劑或拮抗劑活性，篩選這些抗體。這些單克隆抗體結(jié)合的KD值通常至少為大約1mM，更通常至少為大約300μM，典型的至少為大約100μM，更典型的至少為大約30μM，優(yōu)選至少為10μM，更優(yōu)選至少為3μM。
包括抗原結(jié)合片段在內(nèi)的本發(fā)明的抗體，可以具有顯著的診斷或治療價(jià)值。它們可以是有效的拮抗劑，它們結(jié)合于所述受體，并抑制與配體的結(jié)合，或抑制所述受體引發(fā)生物學(xué)反應(yīng)(例如作用于其底物)的能力。它們也可以用作非中和性抗體，并可以偶聯(lián)于毒素或放射性核素，以結(jié)合生產(chǎn)細(xì)胞或定位為白介素源的細(xì)胞。此外，這些抗體可以與藥物或其它治療劑綴合，或直接綴合，或者通過接頭綴合。
本發(fā)明的抗體也可以用于診斷應(yīng)用。作為捕捉物或非中和性抗體，它們可以結(jié)合至所述受體，而不抑制配體或底物的結(jié)合。作為中和抗體，它們可以用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。它們也可以用來(lái)檢測(cè)配體或?qū)ε潴w定量。它們可以用作蛋白質(zhì)印跡分析的試劑，或用于相應(yīng)蛋白的免疫沉淀或免疫純化。
可以將蛋白片段連接至其它材料，特別是多肽，如待用作免疫原的融合的或共價(jià)連接的多肽。哺乳動(dòng)物DTLR及其片段可以與多種免疫原融合或共價(jià)連接，所述免疫原諸如匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素等。關(guān)于制備多克隆抗血清的方法的描述，參見Microbiology，Hoeber Medical Division，Harper和Row，1969；Landsteiner(1962)Specificity of Serological Reactions，DoverPublications，New York；和Williams等(1967)Methods in Immunologyand Immunochemistry，第1卷，Academic Press，New York；每個(gè)參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。典型的方法包括用免抗原超免疫動(dòng)物。然后在重復(fù)免疫后不久，收集該動(dòng)物的血液，并分離γ球蛋白。
在某些情況下，最好從各種哺乳動(dòng)物宿主制備單克隆抗體，所述哺乳動(dòng)物宿主諸如小鼠、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類等等。在例如以下文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)制備這類單克隆抗體的技術(shù)的描述Stites等(編輯)Basic and Clinical Immunology(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA和其中引用的參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第2版)Academic Press，New York；以及特別是Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497(它討論了產(chǎn)生單克隆抗體的一種方法)。這些參考文獻(xiàn)中的每個(gè)均通過引用結(jié)合到本文中?？傊?，該方法包括給動(dòng)物注射一種免疫原。然后處死該動(dòng)物，取出其脾臟細(xì)胞，然后將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。結(jié)果是雜種細(xì)胞或“雜交瘤”，它能夠在體外繁殖。然后篩選雜交瘤群體，以分離各個(gè)克隆，每個(gè)克隆分泌針對(duì)該免疫原的單種抗體。以該方式，獲得的各個(gè)抗體種類是來(lái)自免疫動(dòng)物的無(wú)限增殖化的和克隆的單種B細(xì)胞，是對(duì)該免疫原性物質(zhì)上識(shí)別的特定位點(diǎn)應(yīng)答而產(chǎn)生的B細(xì)胞。
其它合適的技術(shù)包括，使淋巴細(xì)胞體外暴露于該抗原多肽或者暴露于在噬菌體或相似載體中的抗體文庫(kù)的選擇物。參見Huse等(1989)“免疫球蛋白所有組成成分在噬菌體λ中的大組合文庫(kù)的產(chǎn)生”，Science 2461275-1281；和Ward等(1989)Nature 341544-546，每個(gè)參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的多肽和抗體可以修飾或不修飾使用，包括嵌合抗體和人源化抗體。通常，通過或者共價(jià)或者非共價(jià)連接一種提供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)，來(lái)標(biāo)記所述多肽和抗體。種類繁多的標(biāo)記和綴合技術(shù)是已知的，并且在科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中均廣泛地進(jìn)行了報(bào)道。合適的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等等。指出這類標(biāo)記用法的專利，包括美國(guó)專利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241號(hào)。此外，可以產(chǎn)生重組或嵌合的免疫球蛋白，參見Cabilly的美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；或在轉(zhuǎn)基因小鼠中制備，參見Mendez等(1997)Nature Genetics 15146-156。這些參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的抗體也可以用于分離所述DTLR的親和層析。當(dāng)所述抗體連接至固相支持體(例如顆粒，諸如瓊脂糖、Sephadex等)時(shí)，可以制備柱子，在可以使細(xì)胞裂解液通過該柱的情況下，洗滌該柱，然后提高溫和變性劑的濃度，由此釋放所純化的蛋白。該蛋白可以用來(lái)純化抗體。
所述抗體也可以用來(lái)篩選特定表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)文庫(kù)。通常，用于這種方法中的抗體用一個(gè)部分標(biāo)記，所述部分通過抗體結(jié)合，允許容易地檢測(cè)抗原的存在。
針對(duì)DTLR產(chǎn)生的抗體也可以用來(lái)產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。這些抗體將可用于檢測(cè)或診斷與該蛋白表達(dá)或表達(dá)該蛋白的細(xì)胞相關(guān)的各種免疫疾病。它們也可用作所述配體的激動(dòng)劑或拮抗劑，它們可以是天然存在的配體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或替代物。
通常在免疫測(cè)定中，確定與針對(duì)特定免疫原產(chǎn)生的抗體特異性地結(jié)合或特異性地免疫反應(yīng)的DTLR蛋白，所述特定免疫原諸如由SEQID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的氨基酸序列組成的免疫原。所述免疫測(cè)定通常使用多克隆抗血清，它是針對(duì)例如SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的蛋白產(chǎn)生的。選擇對(duì)其它IL-1R家族成員(例如DTLR1)具有低交叉反應(yīng)性的抗血清，所述抗血清最好來(lái)自相同的物種，并且在用于該免疫測(cè)定之前，通過免疫吸附除去任何這種交叉反應(yīng)性。
為了產(chǎn)生用于免疫測(cè)定的抗血清，按本文所述分離SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的蛋白或其組合的蛋白。例如，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中產(chǎn)生重組蛋白。通常使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑(諸如弗氏佐劑)和標(biāo)準(zhǔn)的小鼠免疫方案(參見Harlow和Lane，見上述)，用選定的蛋白免疫合適的宿主，例如小鼠的近交品系，諸如balb/c?；蛘撸杀疚墓_的序列衍生、且與載體蛋白綴合的合成肽，可以用作免疫原。收集多克隆抗血清，并且在免疫測(cè)定中測(cè)定針對(duì)該免疫原蛋白的效價(jià)，例如在固相免疫測(cè)定中，用固定至固相支持體的免疫原測(cè)定。選擇效價(jià)為104或更高的多克隆抗血清，并用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫測(cè)定，測(cè)試其對(duì)其它IL-1R家族成員(例如小鼠DTLR或人DTLR1)的交叉反應(yīng)性，所述競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定諸如Harlow和Lane(見上述，第570-573頁(yè))所述的免疫測(cè)定。最好是，在該測(cè)定中，結(jié)合人DTLR2-10中任一種或其中某些DTLR，使用至少兩個(gè)DTLR家族成員。這些IL-1R家族成員可以作為重組蛋白產(chǎn)生，并用本文所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和蛋白化學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合形式的免疫測(cè)定，可以用來(lái)測(cè)定交叉反應(yīng)性。例如，可以將SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34的蛋白或其各種片段固定于固相支持體。加入該測(cè)定中的蛋白，與所述抗血清競(jìng)爭(zhēng)與所述固定化抗原的結(jié)合。將上述蛋白與所述抗血清競(jìng)爭(zhēng)與所述固定化抗原結(jié)合的能力，與SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22和/或34的蛋白進(jìn)行比較。采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法，計(jì)算上述蛋白的交叉反應(yīng)性的百分率。選擇并合并與每種以上所列蛋白的交叉反應(yīng)性低于10％的抗血清。然后，通過用以上列出的蛋白進(jìn)行免疫吸附，從合并的抗血清中，除去交叉反應(yīng)性抗體。
然后，將免疫吸附的合并的抗血清用于如上所述的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫測(cè)定中，以將第二種蛋白與該免疫原蛋白(例如SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22和/或34的IL-1R樣蛋白)進(jìn)行比較。為了進(jìn)行這種比較，每次在很寬的濃度范圍內(nèi)分析所述兩種蛋白，并測(cè)定抑制該抗血清與該固定化抗原結(jié)合的50％所需的每種蛋白的量。如果第二種蛋白的所需量低于選定蛋白或所需蛋白的蛋白量的2倍，則認(rèn)為第二種蛋白特異性地結(jié)合于針對(duì)該免疫原產(chǎn)生的抗體。
不用說(shuō)，這些DTLR蛋白是一個(gè)同源蛋白家族的成員，該家族包括迄今鑒定的至少10個(gè)基因。關(guān)于特定基因的產(chǎn)物，諸如DTLR2-10，該術(shù)語(yǔ)不僅是指本文公開的氨基酸序列，而且是指為等位基因變異體、非等位基因變異體或種變異體的其它蛋白。人們也理解，所述術(shù)語(yǔ)包括通過以下方法引入的非天然突變，所述方法為采用常規(guī)的重組技術(shù)(諸如單位點(diǎn)突變)的有意突變，或切下編碼相應(yīng)蛋白的DNA的短片段，或取代新的氨基酸或添加新的氨基酸。這類少量改變必須大體維持原始分子的免疫同一性和/或其生物活性。因此，這些改變包括與指定的天然存在的IL-1R相關(guān)蛋白特異性免疫反應(yīng)的蛋白，所述相關(guān)蛋白例如為SEQ ID NO4、6、26、10、12、16、18、32、22或34中所示的DTLR蛋白?？梢酝ㄟ^在合適的細(xì)胞系中表達(dá)所述改變的蛋白，并測(cè)量對(duì)淋巴細(xì)胞的合適作用，可以確定該蛋白的生物學(xué)特性。認(rèn)為修飾較少的具體蛋白修飾，包括化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸的保守取代，如以上關(guān)于IL-1R大體上所述的。通過將一種蛋白與DTLR2-10的蛋白進(jìn)行最佳序列對(duì)比，并采用本文所述的常規(guī)免疫測(cè)定測(cè)定免疫同一性，人們可以確定本發(fā)明的蛋白組成。VII.試劑盒和定量測(cè)定天然存在形式和重組形式的本發(fā)明IL-1R樣分子在試劑盒和測(cè)定方法中均特別有用。例如，這些方法也可以用來(lái)根據(jù)例如配體對(duì)這些蛋白的結(jié)合活性進(jìn)行篩選。最近數(shù)年，已經(jīng)開發(fā)了幾種自動(dòng)化測(cè)定方法，以便允許每年選數(shù)萬(wàn)種化合物。參見例如BIOMEK自動(dòng)化工作站，Beckman Instruments，Palo Alto，California，和Fodor等(1991)Science251767-773，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。后一篇文獻(xiàn)描述了用固相基質(zhì)上合成的多種特定聚合物測(cè)試結(jié)合的方法。大量純化的活性狀態(tài)的可溶性DTLR(諸如本發(fā)明提供的)的可得性，可以大大促進(jìn)開發(fā)用來(lái)篩選配體或激動(dòng)劑/拮抗劑同源蛋白的合適測(cè)定。
可以將純化的DTLR直接包被于平板上，用于在上述配體篩選技術(shù)中。然而，針對(duì)這些蛋白的非中和抗體，可以用作捕捉抗體，以將相應(yīng)受體固定至固相上，例如可用于診斷用途。
本發(fā)明也設(shè)想了DTLR2-10、其片段、肽和它們的融合產(chǎn)物的用途，即用于檢測(cè)該蛋白或其配體存在的多種診斷試劑盒和方法中?；蛘?，或另外，可以將針對(duì)所述分子的抗體加入所述試劑盒和方法中。通常，該試劑盒將具有一個(gè)區(qū)室，該區(qū)室含有或者特定的DTLR肽或基因區(qū)段，或者含有識(shí)別一種或另一種肽或基因的試劑。通常，在肽的情況下，識(shí)別試劑是一種受體或抗體，或在基因區(qū)段的情況下，識(shí)別試劑通常是雜交探針。
用于測(cè)定例如DTLR4的一種樣品濃度的優(yōu)選試劑盒，通常包含一種標(biāo)記化合物，例如對(duì)DTLR4具有已知結(jié)合親和性的配體或抗體、作為陽(yáng)性對(duì)照的一種DTLR4源(天然存在的或重組的)和一種分離結(jié)合的與游離的標(biāo)記化合物的一種工具，例如用于固定該測(cè)試樣品中的DTLR4的固相。通常提供含有試劑的區(qū)室和說(shuō)明。
對(duì)哺乳動(dòng)物DTLR或肽片段、或受體片段特異性的抗體，包括抗原結(jié)合區(qū)段，可用于診斷應(yīng)用中，以檢測(cè)水平提高的配體/或其片段的存在。診斷測(cè)定可以是均相的(在游離試劑和抗體-抗原復(fù)合物之間沒有分離步驟)或多相的(有分離步驟)。存在各種商業(yè)化測(cè)定，諸如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、酶倍增(enzyme-multiplied)免疫測(cè)定技術(shù)(EMIT)、底物標(biāo)記熒光免疫測(cè)定(SLFIA)等等。例如，通過采用被標(biāo)記并識(shí)別抗DTLR或抗其特定片段的抗體的第二抗體，可以利用未標(biāo)記的抗體。這些測(cè)定也已經(jīng)在參考文獻(xiàn)中進(jìn)行了廣泛地討論。參見例如Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH.，和Coligan(編輯)(1991)和定期增刊，Current Protocols In Immnunology Greene/Wiley，New York。
抗獨(dú)特型抗體可以具有相似的用途，作為DTLR4的激動(dòng)劑或拮抗劑起作用。這些抗體應(yīng)該在合適的情況下用作治療劑。
通常，該試劑盒中提供用于診斷測(cè)定的試劑，以優(yōu)化該測(cè)定的靈敏度。對(duì)于本發(fā)明，根據(jù)該測(cè)定的性質(zhì)，提供所述方案和所述標(biāo)記、或者標(biāo)記或者未標(biāo)記的抗體、或標(biāo)記的配體。這通常結(jié)合其它添加劑，諸如緩沖液、穩(wěn)定劑、用于產(chǎn)生信號(hào)所需的物質(zhì)，諸如酶的底物等等。最好是，該試劑盒也含有正確使用內(nèi)容物和使用后處理內(nèi)容物的說(shuō)明。該試劑盒通常具有用于每種有用試劑的區(qū)室，并且將含有正確使用和處理試劑的說(shuō)明。希望的是，當(dāng)可以在水性介質(zhì)中重建具有合適濃度的所述試劑，以進(jìn)行該測(cè)定時(shí)，所述試劑作為干的凍干粉提供。
可以不加修飾地使用診斷測(cè)定的上述組分，或可以對(duì)其以多種方式進(jìn)行修飾。例如，通過共價(jià)或非共價(jià)連接直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的部分，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。在這些測(cè)定的任何一種中，可以或者直接、或者間接地標(biāo)記測(cè)試化合物、DTLR或其抗體?？赡苡糜谥苯訕?biāo)記的包括標(biāo)記基團(tuán)諸如125I的放射標(biāo)記、諸如過氧化物酶和堿性磷酸酶的酶(美國(guó)專利第3,645,090號(hào))、和能夠監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度變化、波長(zhǎng)偏移或熒光偏振的熒光標(biāo)記(美國(guó)專利第3,940,475號(hào))。這兩個(gè)專利均通過引用結(jié)合到本文中?？赡苡糜陂g接標(biāo)記的包括將一種組分生物素化，然后與偶聯(lián)至一個(gè)上述標(biāo)記基團(tuán)的抗生物素蛋白結(jié)合。
也有許多從游離配體中分離結(jié)合配體、或者從游離的測(cè)試化合物中分離結(jié)合化合物的方法?？梢栽诟鞣N基質(zhì)上固定所述DTLR，然后洗滌。合適的基質(zhì)包括諸如ELISA板的塑料、濾膜和珠粒。將所述受體固定化至基質(zhì)上的方法包括但不限于，直接附著到塑料上、使用捕捉抗體、化學(xué)偶聯(lián)和生物素-抗生物素蛋白。該方案中的最后一步包括通過使用幾種方法中的任何一個(gè)，沉淀抗體/抗原復(fù)合物，所述方法包括那些例如使用諸如聚乙二醇的有機(jī)溶劑或諸如硫酸銨的鹽的方法。其它合適的分離技術(shù)，包括但不限于在Rattle等(1984)Clin.Chem.30(9)1457-1461中描述的熒光素抗體可磁化微粒法，和在美國(guó)專利第4,659,678號(hào)中描述的雙抗體磁性微粒分離，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
在所述文獻(xiàn)中廣泛報(bào)告了用于將蛋白或片段同各種標(biāo)記連接的方法，本文并不需要詳細(xì)討論。所述技術(shù)中的許多技術(shù)涉及使用活化羧基，或者通過使用碳二亞胺或者通過使用活性酯形成肽鍵；涉及通過巰基與諸如氯乙酰的活化鹵素或諸如馬來(lái)酰亞胺的活化烯烴反應(yīng)，形成硫醚來(lái)用于連接等等。在這些應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)使用融合蛋白。
本發(fā)明另一診斷方面，包括使用取自DTLR序列的寡核苷酸或多核苷酸序列。可以使用這些序列作為探針，以檢測(cè)懷疑患有免疫失調(diào)的患者中相應(yīng)DTLR水平。RNA和DNA二者核苷酸序列的制備、所述序列的標(biāo)記和所述序列的優(yōu)選大小，已經(jīng)在所述文獻(xiàn)中得到了充分描述和討論。一般寡核苷酸探針應(yīng)當(dāng)具有至少大約14個(gè)核苷酸，通常至少大約18個(gè)核苷酸，而所述多核苷酸探針最多可以達(dá)到幾千個(gè)堿基?？梢允褂酶鞣N標(biāo)記，最常用的是放射性核素，特別是32P。然而，也可以使用其它技術(shù)，諸如使用生物素修飾的用于引入多核苷酸中的核苷酸。然后，該生物素用作結(jié)合抗生物素蛋白或抗體的位點(diǎn)，所述抗生物素蛋白或抗體可以用各種各樣的標(biāo)記物標(biāo)記，諸如放射性核素、熒光物質(zhì)(fluorescer)、酶等等。另一方面，可以使用可識(shí)別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜種雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體?？梢赃M(jìn)而標(biāo)記所述抗體，并進(jìn)行所述測(cè)定，其中所述雙鏈體結(jié)合于一表面，使得根據(jù)在所述表面上雙鏈體的形成，可以檢測(cè)結(jié)合于所述雙鏈體的抗體的存在。使用任何常規(guī)技術(shù)，諸如核酸雜交、加減篩選、重組探針探測(cè)、雜交分子釋放翻譯(HRT)和雜交分子終止翻譯(HART)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)新型反義RNA的探針的應(yīng)用。這也包括諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增技術(shù)。
也考慮了診斷試劑盒，所述試劑盒也定性或定量測(cè)試其它標(biāo)記的存在。診斷或預(yù)后可以依靠用作標(biāo)記的多種指示的組合。因此，試劑盒可以測(cè)試標(biāo)記物的組合。參見例如Viallet等(1989)Progress in GrowthFactor Res.189-97。VIII.治療用途本發(fā)明提供具有重大治療價(jià)值的試劑。所述DTLR(天然存在的或重組的)、其片段、突變蛋白受體和抗體以及鑒定為對(duì)所述受體或抗體具有結(jié)合親和性的化合物，應(yīng)該可用于治療表現(xiàn)出其配體的受體表達(dá)異常的病征。這類異常通常表現(xiàn)為免疫失調(diào)。另外，本發(fā)明應(yīng)該在與該配體表達(dá)異?；?qū)υ撆潴w應(yīng)答的觸發(fā)異常相關(guān)的各種疾病或病征方面，提供治療價(jià)值。已經(jīng)提示，所述Toll配體參與形態(tài)發(fā)育(例如背腹極性的確定)和免疫應(yīng)答，特別是原始的先天應(yīng)答。參見例如Sun等(1991)Eur.J.Biochem.196247-254；Hultmark(1994)Nature 367116-117。
可以純化重組DTLR、突變蛋白、其激動(dòng)劑或拮抗劑抗體、或抗體，然后將其給予患者。這些試劑可以例如在常規(guī)藥用可接受的載體或稀釋劑以及生理上無(wú)害的穩(wěn)定劑和賦形劑中，與另外的活性組分結(jié)合用于治療用途?？梢岳鐭o(wú)菌過濾這些組合物，并通過在劑量瓶中凍干將其以劑量形式放置，或以穩(wěn)定化的水性制劑貯藏。本發(fā)明也考慮了使用非補(bǔ)體結(jié)合的抗體或其結(jié)合片段。
可以進(jìn)行采用DTLR或其片段的配體篩選，以鑒別與所述受體具有結(jié)合親和性的分子。然后，可以利用后續(xù)的生物測(cè)定，確定推定的配體是否可以提供可阻斷內(nèi)在刺激活性的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。受體片段可以用作阻斷劑或拮抗劑，因?yàn)樗钄嗯潴w的活性。同樣，具有內(nèi)在刺激活性的化合物可以激活所述受體，并因此是一種激動(dòng)劑，因?yàn)樗碳づ潴w的活性，例如誘導(dǎo)信號(hào)。本發(fā)明還考慮了抗DTLR抗體作為拮抗劑的治療用途。
用于有效治療所必需的試劑量取決于許多不同因素，包括給藥方法、靶位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)和給予的其它藥物。因此應(yīng)當(dāng)確定治療劑量，以最優(yōu)化安全性和有效性。一般在體外使用的劑量可以為這些試劑的原位給藥用量提供有用的指南。用于治療特定疾病的有效劑量的動(dòng)物測(cè)試，將對(duì)人的劑量提供進(jìn)一步的預(yù)測(cè)指示。例如在Gilman等(編輯)(1990)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第8版)Pergamon Press；和Remington’s PharmaceuticalSciences(最新版)Mack Publishing Co.，Easton，Penn.中描述了各種考慮，所述每個(gè)文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。在其中和下文討論了給藥方法，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或肌內(nèi)給藥、經(jīng)皮擴(kuò)散和其它方法。藥用可接受的載體包括水、鹽、緩沖液和例如在Merck Index(Merck& Co.，Rahway，New Jersey)中所述的其它化合物。因?yàn)橥贫ǖ呐潴w與其受體之間可能高親和性結(jié)合或轉(zhuǎn)換數(shù)高，所以最初預(yù)期低劑量的這些試劑是有效的。并且信號(hào)途徑提示，極低量的配體可能具有效應(yīng)。因此，一般預(yù)期具有合適載體的劑量范圍低于1mM的濃度，通常低于大約10μM的濃度，一般低于大約100nM，優(yōu)選低于大約10pM(皮摩爾濃度)，最優(yōu)選低于大約1fM(費(fèi)摩爾濃度)。對(duì)于連續(xù)給藥，經(jīng)常使用緩釋配方或緩釋設(shè)備。
可以直接向待治療的宿主給予DTLR、其片段以及抗體或其片段、拮抗劑和激動(dòng)劑，或者根據(jù)所述化合物的大小，可能最好在給藥前將所述化合物同載體蛋白綴合，所述載體蛋白諸如卵清蛋白或血清白蛋白?？梢砸匀魏纬Ｒ?guī)給藥制劑給予治療制劑。盡管可能獨(dú)自給予所述活性成分，但最好是作為藥用制劑將其提呈。制劑包含至少一種如上文定義的活性成分，連同一種或多種可接受的載體。每種載體在與其它成分相容、且不傷害患者的意義上，必須既是藥用可接受的，也是生理上可接受的。制劑包括那些適于經(jīng)口、直腸、鼻或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈在內(nèi)和皮內(nèi))給藥的制劑。所述制劑通?？梢砸詥挝粍┝啃问酱嬖?，并可以通過藥劑學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備。參見例如Gilman等(編輯)(1990)Goodman and GilmansThePharmacological Bases of Therapeutics第8版Pergamon Press；和Remington s Pharmaceutical Sciences(最新版)Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；Avis等(編輯，1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications Dekker，NY；Lieberman等(編輯，1990)Pharmaceutical Dosage FormsTablets Dekker，NY；和Lieberman等(編輯，1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems Dekker，NY。本發(fā)明的療法可以和其它治療劑組合，或與其它治療劑結(jié)合使用，所述治療劑特別是其它IL-1家族成員的激動(dòng)劑或拮抗劑。IX.配體本文對(duì)所述Toll受體的描述，提供了鑒定配體的方法，如上所述。這種配體應(yīng)該以適當(dāng)?shù)母哂H和性，特異性地結(jié)合于相應(yīng)的受體?？傻玫礁鞣N構(gòu)成物，它們?cè)试S對(duì)所述受體進(jìn)行任何一種標(biāo)記，以檢測(cè)其配體。例如，直接標(biāo)記DTLR，將其融合至用于第二標(biāo)記的標(biāo)記物(例如FLAG或其它表位標(biāo)記等)，將允許檢測(cè)受體。這在組織學(xué)上可以作為生化純化的親和方法、或在表達(dá)克隆方法中的標(biāo)記或選擇。也可以應(yīng)用雙雜種選擇系統(tǒng)，制備具有可利用的DTLR序列的合適構(gòu)成物。參見例如Fields和Song(1989)Nature 340245-246。
一般而言，對(duì)DTLR的描述類似地適用于針對(duì)DTLR2、DTLR3、DTLR4、DTLR5、DTLR6、DTLR7、DTLR8、DTLR9和/或DTLR10試劑和組合物的各個(gè)具體實(shí)施方案。
參考以下實(shí)施例，可最好地理解本發(fā)明的廣泛范圍，所述實(shí)施例不會(huì)將本發(fā)明限于所述具體的實(shí)施方案。
實(shí)施例I.一般方法例如在以下文獻(xiàn)中描述和引用了某些標(biāo)準(zhǔn)方法Maniatis等(1982)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY；Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(第2版)第1-3卷，CSH Press，NY；Ausubel等，Biology，Greene PublishingAssociates，Brooklin，NY；或Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley/Greene，NY。用于蛋白純化的方法，包括諸如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶的方法和其它方法。參見例如Ausubel等(1987和定期增補(bǔ)本)；Coligan等(編輯，1996)和定期增補(bǔ)本，Current Protocols In Protein Science，Wiley/Greene，NY；Deutscher(1990)Methods in Enzymology第182卷和在這個(gè)系列中的其它卷中的“蛋白質(zhì)純化指南”；和生產(chǎn)商關(guān)于蛋白純化產(chǎn)品用法的文獻(xiàn)，例如Pharmacia，Piscataway，NJ或Bio-Rad，Richmond，CA。與重組技術(shù)結(jié)合，允許同合適的區(qū)段融合，例如同F(xiàn)LAG序列或可以通過蛋白酶可去除序列融合的相當(dāng)序列融合。參見例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“用金屬螯合物吸收劑純化重組蛋白”，載于Setlow(編輯)Genetic Engineering，Principle andMethods 1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe等(1992)OIAexpressThe High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如在Hertzenberg等(編輯，1996)Weir’s Handbook ofExperimental Immunology第1-4卷，Blackwell Science；Coligan(1991)Current Protocols in Immunology Wiley/Greene，NY；和Methods inEnzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中描述了標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)和測(cè)定。
對(duì)血管生物活性的測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的。它們將包括在腫瘤或其它組織中的血管生成活性和血管抑制活性，例如動(dòng)脈平滑肌增生(參見例如Koyoma等(1996)Cell 871069-1078)、單核細(xì)胞附著于血管上皮(參見McEvoy等(1997)J.Exp.Med.1852069-2077)等。也參見Ross(1993)Nature 362801-809；Rekhter和Gordon(1995)Am.J.Pathol.147668-677；Thyberg等(1990)Atherosclerosis 10966-990；和Gumbiner(1996)Cell 84345-357。
例如在Wouterlood(1995年編輯)Neutoscience Protocols第10單元，Elsevier；Methods in Neurosciences Academic Press；和Neuromethods Humana Press，Totowa，NJ中描述了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生物活性的測(cè)定。例如在Meisami(編輯)Handbook of Human Growth andDevelopmental Biology CRC Press；和Chrispeels(編輯)MolecularTechniques and Approaches in Developmental Biology Interscience中描述了發(fā)育系統(tǒng)方法學(xué)。
例如采用可得到的軟件程序，包括GCG(U.Wisconsin)和GenBank來(lái)源的那些程序，進(jìn)行計(jì)算機(jī)序列分析。也使用例如來(lái)自GenBank、NCBI、EMBO和其它數(shù)據(jù)庫(kù)的公開的序列數(shù)據(jù)庫(kù)。
對(duì)于所有目的，適用于IL-10受體的許多技術(shù)可以用于DTLR，如例如在USSN 08/110,683(IL-10受體)中所述，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。II.人受體的新家族縮寫DTLR，Toll樣受體；IL-1R，白介素-1受體；TH，Toll同源性；LRR，富含亮氨酸的重復(fù)序列；EST，表達(dá)的序列標(biāo)記；STS，序列標(biāo)志位點(diǎn)；FISH，原位雜交中的熒光。
在果蠅屬Toll和人白介素-1的胞質(zhì)域之間發(fā)現(xiàn)序列同源性，已經(jīng)傳播了這兩種分子觸發(fā)依賴于Rel型轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位的相關(guān)信號(hào)途徑的信念。在昆蟲和脊椎動(dòng)物中，這種保守的信號(hào)模式支配進(jìn)化上古老的免疫應(yīng)答。我們報(bào)道了一類新的推定的人受體的分子克隆，所述人受體在胞內(nèi)和胞外區(qū)段中具有與果蠅屬Toll非常相似的蛋白結(jié)構(gòu)。命名為DTLR 1-5的5種人Toll樣受體可能是蠅分子的直接同系物，同樣可能組成人先天免疫的重要的和未識(shí)別的一種組分；有趣的是，在脊椎動(dòng)物中DTLR在進(jìn)化上保留，可能表明在果蠅屬胚胎背腹化中類似于Toll的另一種作用，即作為早期形態(tài)發(fā)生圖式發(fā)育的調(diào)節(jié)物。多種組織的mRNA印跡，顯示人DTLR顯著不同的表達(dá)模式。采用原位雜交中的熒光和序列標(biāo)志位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，我們也顯示了位于第4(DTLR 1、2和3)、9(DTLR4)和1(DTLR5)染色體上的同系DTLR基因。對(duì)來(lái)自以下的序列對(duì)比的Toll同源(TH)域的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，識(shí)別出一個(gè)具有酸性活性位點(diǎn)的平行β/α折疊不同的昆蟲和人的DTLR、脊椎動(dòng)物IL-1受體和MyD88因子以及植物抗病性蛋白；在細(xì)菌中廣泛參與轉(zhuǎn)導(dǎo)感覺信息的一類應(yīng)答調(diào)節(jié)物中，明顯重現(xiàn)相似的結(jié)構(gòu)。
如此顯著地區(qū)分蠅與人的形態(tài)發(fā)生鴻溝的種子植于熟悉的胚胎形狀和模式之中，但產(chǎn)生非常不同的細(xì)胞復(fù)雜度。DeRobertis和Sasai(1996)Nature 38037-40；和Arendt和Nülbler-Jung(1997)Mech.Develop.617-21。顯著相似的信號(hào)途徑設(shè)計(jì)了昆蟲和脊椎動(dòng)物之間的這種發(fā)育計(jì)劃的趨異，強(qiáng)調(diào)了來(lái)自不同基因所有組分成分的蛋白網(wǎng)絡(luò)和生化機(jī)制更大的保守性。Miklos和Rubin(1996)Cell 86521-529；和Chothia(1994)Develop.1994增刊，27-33。繪出這些調(diào)節(jié)途徑進(jìn)化設(shè)計(jì)的一個(gè)有功效的方法，是通過蛋白序列和結(jié)構(gòu)的種間比較推斷出它們可能的分子組分(和生物學(xué)功能)。Miklos和Rubin(1996)Cell86521-529；Chothia(1994)Develop.1994增刊，27-33(3-5)；和Banfi等(1996)Nature Genet.13167-174。
胚胎發(fā)育中的一個(gè)關(guān)鍵的通用步驟是體軸(body axes)的特化，所述特化或者來(lái)自先天的不對(duì)稱，或者由外部信號(hào)觸發(fā)。DeRobertis和Sasai(1996)Nature 38037-40；和Arendt和Nülbler-Jung(1997)Mech.Develop.617-21。作為一個(gè)模型系統(tǒng)，已經(jīng)將特殊的關(guān)注集中于系統(tǒng)發(fā)育基礎(chǔ)和背腹極化的細(xì)胞機(jī)制。DeRobertis和Sasai(1996)Nature38037-40；和Arendt和Nülbler-Jung(1997)Mech.Develop.617-21。由果蠅屬胚胎形成了這種轉(zhuǎn)化的一個(gè)原型分子策略，其中少數(shù)基因的順序作用，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子Dorsal的腹例梯度。St.Johnston和NüssleinVolhard(1992)Cell 68201-209；和Morisato和Anderson(1995)Ann.Rev.Genet.29371-399。
該信號(hào)途徑以跨膜受體Toll為中心，Toll將母體分泌的腹側(cè)因子Sptzle轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合到輔助分子Tube的胞質(zhì)接合(cytoplasmic engagement)中并轉(zhuǎn)導(dǎo)Ser/Thr激酶Pelle的激活，Pelle催化Dorsal與抑制劑Cactus的解離，并允許Dorsal轉(zhuǎn)移至腹側(cè)核(Morisato和Anderson(1995)Ann.Rev.Genet.29371-399；和Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.CellDevelop.Biol.12393-416。所述Toll途徑也控制成體蠅中有效抗微生物因子的誘導(dǎo)(Lemaitre等(1996)Cell 86973-983)；在果蠅屬免疫防御中的該作用加強(qiáng)了與IL-1途徑平行的機(jī)械途徑，它們?cè)诩棺祫?dòng)物中支配免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.CellDevelop.Biol.12393-416；和Wasserman(1993)Molec.Biol.Cell4767-771。IL-1受體中的Toll相關(guān)胞質(zhì)域，指導(dǎo)Pelle樣激酶IRAK的結(jié)合和反映出含有Dorsal和Cactus的潛伏NF/κB/I-κB復(fù)合物的激活。Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Develop.Biol.12393-416；和Wasserman(1993)Molec.Biol.Cell 4767-771。
我們描述了人類4種新Toll樣分子的克隆和分子鑒定，所述4種分子命名為DTLR 2-5(根據(jù)Chiang和Beachy(1994)Mech.Develop.47225-239)，這揭示了一個(gè)與果蠅屬Toll同系物的關(guān)系比與脊椎動(dòng)物IL-1受體的關(guān)系更密切的受體家族。所述DTLR序列得自人EST；這些部分cDNA用來(lái)繪出人組織中5種DTLR的完整的表達(dá)分布型，對(duì)同源基因的染色體位置進(jìn)行作圖，并縮減用于全長(zhǎng)cDNA挽回的cDNA文庫(kù)的選擇。我們被其它努力(Banfi等(1996)Nature Genet.13167-174；和Wang等(1996)J.Biol.Chem.2714468-4476)所激勵(lì)，我們根據(jù)結(jié)構(gòu)的保守和分子簡(jiǎn)約性，裝配了一個(gè)人類的生物學(xué)系統(tǒng)，它是果蠅屬中令人注目的調(diào)節(jié)方案的對(duì)應(yīng)方案。此外，提出的由DTLR、廣泛的IL-1受體家族、哺乳動(dòng)物MyD88因子和植物抗病性蛋白共享的一個(gè)核心組件-Toll同源(TH)域的三級(jí)折疊，提示驅(qū)動(dòng)Toll信號(hào)的生物化學(xué)機(jī)制。Mitcham等(1996)J.Biol.Chem.271-5777-5783；和Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475。我們提出在昆蟲、植物和動(dòng)物中將形態(tài)發(fā)生和原始免疫偶聯(lián)的信號(hào)途徑(Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Develop.Biol. 12393-416；和Wilson等(1997)Curr.Biol.7175-178)可能來(lái)源于細(xì)菌的雙組分途徑。計(jì)算機(jī)分析。
采用BLAST服務(wù)器(Altschul等(1994)Nature Genet.6119-129)，從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)(dbEST)，鑒定出與昆蟲DTLR相關(guān)的人類序列。使用更敏感的基于模式和分布型的方法(Bork和Gibson(1996)Meth.Enzymol.266162-184)，分離出所述DTLR家族中與非豐余數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的脊椎動(dòng)物和植物蛋白共享的信號(hào)域。用ClustalW(Thompson，等(1994)Nucleic Acids Res.224673-4680)，進(jìn)行DTLR胞內(nèi)域和胞外域序列的漸進(jìn)序列對(duì)比；該程序也通過相鄰連接法(5000自引導(dǎo)程序的復(fù)制提供樹歸組的可信度值)，計(jì)算序列對(duì)比的序列的分支順序。
用Consensus程序(internet URL http//www.bork.embl-heidelberg.de/Alignment/consensus.html)，繪出在幾個(gè)嚴(yán)格性程度上分辨的保守的序列對(duì)比模式。用靈活地匹配趨異LRR的N末端和C末端特征的一個(gè)化合物基序(PRINTS密碼Leurichrpt)，蛋白指紋的RPINTS文庫(kù)(http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.html)(Attwood等(1997)Nucleic Acids Res.25212-217)可靠地鑒別出DTLR胞外區(qū)段中存在的無(wú)數(shù)富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)。三態(tài)精度(three-state accuracy)高于72％的兩種預(yù)測(cè)算法，用來(lái)得出胞內(nèi)域序列對(duì)比的共有二級(jí)結(jié)構(gòu)，作為折疊識(shí)別努力的橋梁(Fischer等(1996)FASEB J.10126-136)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)程序PHD(Rost和Sander(1994)Proteins 1955-72)和統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)測(cè)方法DSC(King和Sternberg(1996)Protein Sci.52298-2310)有internet服務(wù)器(分別為URLshttp//www.embl-heidelberg.de/predictprotein/phd_pred.html和http//bonsai.lif.icnet.uk/bmm/dsc/dsc_read_align.html)。胞內(nèi)區(qū)編碼例如在Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475；和Rock等(1998)ProcNat’l Acad.Sci.USA 95588-593(每個(gè)文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)中討論的THD區(qū)。該域在受體的信號(hào)機(jī)制中非常重要，它將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物。全長(zhǎng)人DTLR cDNA的克隆用得自Toll樣Humrsc786序列(GenBank登記密碼D13637)(Normura等(1994)DNA Res 127-35)的PCR引物作為探針，探測(cè)人紅白血病TF-1細(xì)胞系衍生的cDNA文庫(kù)(Kitamura等(1989)Blood73375-380)，產(chǎn)生DTLR1 cDNA序列。通過Research Genetics(Huntsville，AL)，從dbEST和由I.M.A.G.E.聚生體獲得的相關(guān)的EST克隆(Lennon等(1996)Genomics 33151-152)中，標(biāo)記其余的DTLR序列CloneID#80633和117262(DTLR2)、144675(DTLR3)、202057(DTLR4)和227229(DTLR5)。通過DNA雜交分別篩選λgt10噬菌體、成人肺臟、胎盤和胎肝5’-Stretch Plus cDNA文庫(kù)(Clontech)，克隆了人DTLR 2-4的全長(zhǎng)cDNA；所述DTLR5序列得自人多發(fā)性硬化斑的EST。對(duì)所有陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和序列對(duì)比，以鑒定各個(gè)DTLR ORFDTLR1(2366bp的克隆，786aa ORF)、DTLR2(2600bp，784aa)、DTLR3(3029bp，904aa)、DTLR4(3811bp，879aa)和DTLR5(1275bp，370aa)。分別用人胎盤(Stratagene)和成人肝(Clontech)的cDNA文庫(kù)作為模板，通過PCR產(chǎn)生用于DTLR3和DTLR4雜交的探針；引物對(duì)得自相應(yīng)的ESR序列。用棲熱水生菌(T.aquaticus)的Taqplus DNA聚合酶(Stratagene)，在以下條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)1×(94℃，2分鐘)、30×(55℃，20秒；72℃30秒；94℃20秒)、1×(72℃，8分鐘)。對(duì)于DTLR2全長(zhǎng)cDNA的篩選，通過EcoRI/XbaI消化第一個(gè)EST克隆(ID#80633)產(chǎn)生的900bp片段用作探針。mRNA印跡和染色體定位每泳道含有大約2μg poly(A)+RNA的人多種組織印跡(Cat#1、2)和癌細(xì)胞系印跡(Cat#7757-1)，購(gòu)自Clontech(Palo Alto，CA)。對(duì)于DTLR 1-4，將分離的全長(zhǎng)cDNA用作探針；對(duì)于DTLR5，使用EST克隆(ID#277229)質(zhì)粒插入片段。簡(jiǎn)而言之，采用Amersham Rediprime隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(RPN1633)，用[α-32P]dATP放射標(biāo)記所述探針。于65℃，在0.5M Na2HPO4、7％SDS、0.5M EDTA(pH8.0)中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。于65℃下進(jìn)行所有嚴(yán)格性洗滌，最初2次洗滌在2×SSC、0.1％SDS中進(jìn)行40分鐘，然后在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌20分鐘。然后，在增感屏存在下，于-70℃將膜對(duì)X光片(Kodak)曝光。用選定的人DTLR克隆通過cDNA文庫(kù)Southern(14)進(jìn)行的更詳細(xì)的研究，以檢查它們?cè)谠煅?xì)胞亞群中的表達(dá)。
采用Heng和Tsui(1994)Meth.Molec.Biol.33109-122中描述的原位雜交中的熒光(FISH)方法，用各種全長(zhǎng)(DTLR 2-4)或部分(DTLR5)cDNA克隆作為探針，進(jìn)行人染色體作圖。這些分析作為一種服務(wù)，由SeeDNA Biotech Inc.(Ontario，加拿大)進(jìn)行。通過internet服務(wù)器(htpp//www.hgmp.mrc.ac.uk/DHMHD/hum_chromel.html)，在畸形人-小鼠同源性數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行人綜合征(或同線基因座中的小鼠缺陷)的檢索。昆蟲和人DTLR胞外域的保守結(jié)構(gòu)。
果蠅屬中的Toll家族至少包括4種不同的基因產(chǎn)物參與蠅胚胎背腹圖式發(fā)育的原型受體Toll(Morisato和Anderson(1995)Ann.Rev.Genet.29371-399)以及第二種稱為“18 Wheeler”(18w)的產(chǎn)物，后者也可能參與早期的胚胎發(fā)育(Chiang和Beachy(1994)Mech.Develop.47225-239；和Eldon等(1994)Develop.120885-899)；兩種另外的受體根據(jù)雄性特異性轉(zhuǎn)錄物(Mst)基因座(GenBank密碼X67703)下游的不完整的Toll樣ORF來(lái)預(yù)測(cè)，或由“序列標(biāo)志位點(diǎn)”(STS)Dm2245(GenBank密碼G01378)編碼(Mitscham等(1996)J.Biol.Cehm.2715777-5783)。Toll和18w的胞外區(qū)段與眾不同地由不完全的約24個(gè)氨基酸的LRR基元組成(Chiang和Beachy(1994)Mech.Develop.47225-239；和Eldon等(1994)Develop.120885-899)。相似的LRR串聯(lián)排列通常形成不同細(xì)胞表面分子的粘附天線，推定它們的屬三級(jí)結(jié)構(gòu)，以模擬一種核糖核酸酶抑制劑折疊的馬蹄形支架，其中17種LRR顯示出重復(fù)的β/α發(fā)夾，這是一種28個(gè)殘基的基元(Buchanan和Gay(1996)Prog.Biophys.Molec.Biol.651-44)。Toll對(duì)Sptzle的特異性地識(shí)別可能遵循一種模型，該模型是用彎曲β-片的凹面，為蛇受體的多LRR胞外域?qū)﹄装彼峤Y(jié)折疊糖蛋白激素的結(jié)合而提出的(Kajava等(1995)Structure 3867-877)；有趣的是，在Sptzle和果蠅屬孤獨(dú)配體Trunk中的半胱氨酸模式，預(yù)測(cè)了一個(gè)相似的胱氨酸結(jié)三級(jí)結(jié)構(gòu)(Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell & Devel.Biol.12393-416；和Casanova等(1995)Genes Develop.92539-2544)。
根據(jù)序列和模式分析，Toll和18w分別為22個(gè)和31個(gè)LRR的胞外域(Mst ORF片段呈現(xiàn)出16個(gè)LRR)與DTLR 1-4(目前不完整的DTLR5鏈包括4個(gè)膜近接的(membrane-proximal)LRR)相當(dāng)?shù)?8個(gè)、19個(gè)、24個(gè)和22個(gè)LRR排列最密切相關(guān)(Altschul等(1994)NatureGenet.6119-129；和Bork和Gibson(1996)Meth.Enzymol.266162-184)(圖1)。然而，人DTLR鏈中顯著的差異是通常喪失約90個(gè)殘基的半胱氨酸富含區(qū)，該區(qū)可變地包含于Toll、18w和Mst ORF中(分別距膜邊界4個(gè)、6個(gè)和2個(gè)LRR)。這些半胱氨酸簇是等分的，具有明顯的“頂部”(結(jié)束一個(gè)LRR)和“底部”(堆疊在一個(gè)LRR頂部)兩半(Chiang和Beachy(1994)Mech.Develop.47225-239；Eldon等(1994)Develop.120885-899；以及Buchanan和Gay(1996)Prog.Biophys.Molec.Biol.651-44)；在果蠅屬和人DTLR中均作為保守的近膜間隔區(qū)重現(xiàn)所述“頂部”組件(圖1)。我們提出，當(dāng)“頂部”與“底部”接合時(shí)，果蠅屬受體(和其它LRR蛋白)中的可變定位的半胱氨酸簇，形成一個(gè)完整的組件，它具有匹配末端，可以插入任何LRR對(duì)之間，而不改變DTLR胞外域的整體折疊；類似的“擠出”域裝飾其它蛋白的結(jié)構(gòu)(Russell(1994)Protein Engin.71407-1410)。TH信號(hào)域的分子設(shè)計(jì)Toll和IL-1 I型(IL-1R1)受體的序列比較，已經(jīng)揭示了一個(gè)約略相似的約200個(gè)氨基酸的胞質(zhì)域，推測(cè)它由相似的Rel型轉(zhuǎn)錄因子來(lái)介導(dǎo)信號(hào)(Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Develop.Biol.12393-416；和Wasserman(1993)Molec.Biol.Cell 4767-771)。新近加入該功能性范例的包括來(lái)自煙草和亞麻的一對(duì)植物抗病性蛋白，它們的特征為一個(gè)N末端TH組件，后接核苷酸結(jié)合(NTP酶)區(qū)段和LRR區(qū)段(Wilson等(1997)Curr.Biol.7175-178)；相反，一個(gè)“死域”在MyD88的TH鏈之前，MyD88是一種胞內(nèi)骨髓分化標(biāo)記(Mitcham等(1997)J.Biol.Chem.2715777-5783；和Hardiman等(1996)Oncogene132467-2475)(圖1)。新的IL-1型受體包括一種輔助信號(hào)分子IL-1R3、和孤獨(dú)受體IL-1R4(也稱為ST2/Fit-1/T1)、IL-1R5(IL-1R相關(guān)蛋白)和IL-1R6(IL-1R相關(guān)蛋白-2)(Mitcham等(1996)J.Biol.Chem.2715777-5783；Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475)。用所述新的人DTLR序列，通過分析共同TH域的構(gòu)象，我們已經(jīng)找到該進(jìn)化線索的一個(gè)結(jié)構(gòu)定義包含128個(gè)氨基酸的10個(gè)區(qū)組的保守序列，形成最小的TH域折疊；序列對(duì)比中的間隙，標(biāo)記了序列和長(zhǎng)度可變的環(huán)的可能位置(圖2a)。
利用多個(gè)序列對(duì)比序列中保守和變異模式的兩個(gè)預(yù)測(cè)算法PHD(Rost和Sander(1994)Proteins 1955-72)和DSC(King和Sternberg(1996) Protein Sci.52298-2310)，產(chǎn)生TH信號(hào)組件的強(qiáng)的一致的結(jié)果(圖2a)。每個(gè)區(qū)組含有一個(gè)獨(dú)立的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件交替的β-鏈(標(biāo)記為A-E)和α-螺旋(編號(hào)為1-5)的特征，是在平行β-片兩面上具有α-螺旋的β/α類折疊的診斷性特征。預(yù)測(cè)疏水性β-鏈A、C和D形成β-片中的“內(nèi)部”板條，而較短的兩性β-鏈B和E裝配典型的“邊緣”單位(圖2a)。這種布置與核心β-片中B-A-C-D-E的鏈順序一致(圖2b)；折疊比較(“映射(mapping)”)和識(shí)別(“threading”)程序(Fischer等91996)FASEB J.10126-136)強(qiáng)烈地返回該雙纏繞β/α拓?fù)鋵W(xué)。TH域的這種輪廓結(jié)構(gòu)的一個(gè)驚人的功能預(yù)測(cè)是將多重序列對(duì)比中的許多保守的帶電荷的殘基作圖至該β-片的C末端βA末端的殘基Asp16(區(qū)組編碼方案-圖2a)、βB之后的Arg39和Asp40、α3的第一個(gè)轉(zhuǎn)角中的Glu75以及βD-α4環(huán)中或βE之后更松散保守的Glu/Asp殘基(圖2a)。其它4個(gè)保守殘基(Asp7、Glu28和Arg57-Arg/Lys58對(duì))的位置與該β-片相對(duì)的N末端的鹽橋網(wǎng)絡(luò)相匹配(圖2a)。
信號(hào)功能依賴于TH域的結(jié)構(gòu)完整性。對(duì)于IL-1R1和Toll，已經(jīng)將所述組件邊界內(nèi)的失活突變或缺失(圖2a)按目錄分類。Heguy等(1992)J.Biol.Chem.2672605-2609；Croston等(1995)J.Biol.Chem.27016514-16517；Schneider等(1991)Genes Develop.5797-807；Norris和Manley(1992)Genes Develop.61654-1667；Norris和Manley(1995)Genes Develop.9358-369；和Norris和Manley(1996)Genes Develop.10862-872。延伸越過所述最小TH域(分別長(zhǎng)8、0、6、22和18個(gè)殘基)的人DTLR1-5鏈，與Mst ORF的短粗的4aa“尾”最為相似。Toll和18w表現(xiàn)出不相關(guān)的102個(gè)和207個(gè)殘基的尾(圖2a)，它可以負(fù)調(diào)節(jié)所述融合TH域的信號(hào)。Norris和Manley(1995)Genes Develop.9358-369；和Norris和Manley(1996)Genes Develop.10862-872。
攜帶該TH域的不同蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，可能最好通過得自多重序列對(duì)比的系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)鑒別(圖3)。4個(gè)主要的分支分開了所述植物蛋白、MvD88因子、IL-1受體和Toll樣分子；最后一個(gè)分支聚集于果蠅屬和人的DTLR。人DTLR基因的染色體散布。
為了研究該新生的人DTLR基因家族的遺傳連鎖，我們用FISH對(duì)5個(gè)基因中的4個(gè)的染色體位點(diǎn)進(jìn)行了作圖(圖4)。人類基因組計(jì)劃先前已經(jīng)繪制了DTLR1基因Humrc786 cDNA存在一個(gè)STS數(shù)據(jù)庫(kù)基因座(dbSTS登記號(hào)G06709，對(duì)應(yīng)于STS WI-7804或SHGC-12827)(Nomura等，(1994)DNA Res 127-35)，并且將該基因固定至第4染色體標(biāo)記間隔D4S1587-D42405(50-56cM)circa 4p14。最近已經(jīng)通過FISH分析證實(shí)這種排列。Taguchi等(1996)Genomics 32486-488。在本發(fā)明工作中，我們可靠地將其余的DTLR基因排列于染色體4q32(DTLR2)、4q35(DTLR3)、9q32-33(DTLR4)和1q33.3(DTLR5)上的基因座。在該工作期間，已經(jīng)產(chǎn)生了親代DTLR2 EST(CloneID#80633)的STS(STS SHGC-33147的dbSTS登記號(hào)為T57791)，并且根據(jù)我們的發(fā)現(xiàn)，將其作圖至第4染色體4q32的標(biāo)記間隔D4S424-D4S1548(143-153cM)。在第4染色體長(zhǎng)臂上的DTLR2和DTLR3基因之間有一個(gè)約50cM的間隙。差異表達(dá)DTLR基因。
在果蠅屬中，Toll和18w均具有復(fù)雜的空間和時(shí)間表達(dá)模式，這可能指出胚胎模式以外的功能。St.Johnston和Nüsslein-Volhard(1992)Cell 68201-219；Morisato和Anderson(1995)Ann.Rev.Genet.29371-399；Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Develop.Biol.12393-416；Lemaitre等(1996)Cell 86973-983；Chiang和Beachy(1994)Mech.Develop.47225-239；和Eldon等(1994)Develop.120885-899。我們采用放射標(biāo)記的DTLR cDNA，通過用不同的人組織和癌細(xì)胞系的mRNA印跡分析，檢查了DTLR轉(zhuǎn)錄物的空間分布(圖5)。發(fā)現(xiàn)DTLR1是普遍表達(dá)的，并且表達(dá)水平高于其它受體。“短的”3.0kB和“長(zhǎng)的”8.0kB的DTLR1轉(zhuǎn)錄物形式分別存在于卵巢和脾臟中，推定反映出替代剪接(圖5，A板和B板)。癌細(xì)胞mRNA一板也顯示出DTLR1在伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞系中占優(yōu)勢(shì)的過量表達(dá)(圖5，C板)。DTLR2 mRNA的表達(dá)沒有DTLR1的范圍廣，在肺臟中檢測(cè)到一個(gè)4.0kB的種類，在心臟、腦和肌肉中明顯檢測(cè)到一個(gè)4.4kB的轉(zhuǎn)錄物。DTLR3的組織分布模式重復(fù)了DTLR2的組織分布模式(圖5，E板)。DTLR3也以大小約為4.0kB和6.0kB的兩個(gè)主要轉(zhuǎn)錄物存在，在胎盤和胰臟中觀察到最高水平的表達(dá)。相反，DTLR4和DTLR5信息看來(lái)是極度組織特異性的。DTLR4僅在胎盤中作為約7.0kB的單一轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)到。在卵巢和外周血單核細(xì)胞中觀察到DTLR5的4.0kB弱信號(hào)。進(jìn)化上古老的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組分。
通過比較基因組法，可以重建信號(hào)途徑的原始分子藍(lán)圖和趨異命運(yùn)。Miklos和Rubin(1996)Cell 86521-529；Chothia(1994)Develop.1994增刊，27-33；Banfi等(1996) Nature Genet.13167-174；和Wang等(1996)J.Biol.Chem.2714468-4476。我們已經(jīng)采用該邏輯，鑒別出一個(gè)人類中出現(xiàn)的基因家族，它們目前編碼5個(gè)受體的平行進(jìn)化同源物DTLR 1-5，它們是以Toll為首的果蠅屬基因家族的直接進(jìn)化的對(duì)應(yīng)物(圖1-3)。人和蠅DTLR的保守結(jié)構(gòu)即保守的LRR胞外域和胞內(nèi)TH域(圖1)，暗示與果蠅屬中Toll偶聯(lián)的堅(jiān)固的途徑(6、7)在脊椎動(dòng)物中繼續(xù)存在。最佳證據(jù)來(lái)自重復(fù)途徑多功能IL-1系統(tǒng)及其受體融合的TH域的所有組成成分IRAK、NF-κB和I-κB同系物(Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Develop.Biol.12393-416；和Wasserman(1993)Molec.Biol.Cell 4767-771；Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475；和Cao等(1996)Science 2711128-1131)；也已經(jīng)特征鑒定出一種Tube樣因子。尚不知DTLR是否可以有效地偶聯(lián)于IL-1R信號(hào)機(jī)器，或者，而是使用平行的一組蛋白。與IL-1受體不同，預(yù)測(cè)人DTLR的LRR支架保留對(duì)Sptzle-Trunk相關(guān)胱氨酸結(jié)因子的親和性；已經(jīng)分離出適合該模型的候選DTLR配體(所謂的PEN)。
通過途徑中互作蛋白折疊的保守性，可以估計(jì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生化機(jī)制。Miklos和Rubin(1996)Cell 86521-529；Chothia(1994)Develop.1994增刊，27-33。目前，Toll信號(hào)范例包括其作用受其結(jié)構(gòu)、作用或命運(yùn)精密限定的某些分子Pelle是一種Ser/Thr激酶(磷酸化)，Dorsal是一種NF-κB樣轉(zhuǎn)錄因子(DNA-結(jié)合)，而Cactus是一種錨蛋白重復(fù)抑制劑(Dorsal結(jié)合，降解)。Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.CellDevelop.Biol.12393-416。相反，Toll TH域和Tube的功能尚不清楚。與其它細(xì)胞因子受體一樣(Heldin(1995)Cell 80213-223)，配體介導(dǎo)的Toll二聚看來(lái)是觸發(fā)事件Toll近膜區(qū)中的游離半胱氨酸產(chǎn)生組成型活性的受體對(duì)(Schneider等(1991)Genes Develop.5797-807)，而嵌合Torso-Toll受體以二聚體作為信號(hào)(Galindo等(1995)Develop.1212209-2218)；此外，Toll胞外域的嚴(yán)重截短或全部喪失，產(chǎn)生雜亂的胞內(nèi)信號(hào)(Norris和Manley(1995)Genes Develop.9358-369；Winans和Hashimoto(1995)Molec.Biol.Cell 6587-596)，這是具有催化域的癌基因受體的回憶(Heldin(1995)Cell 80213-223)。Tube是膜定位的，它連接Pelle的N末端(死)域并且磷酸化，但雙雜種分析均未顯示出Toll-Tube和Toll-Pelle的相互作用(Galindo等(1995)Develop.1212209-2218；和Groβhans等(1994)Nature 372563-566)；這后一結(jié)果提示Toll TH域的構(gòu)象“狀態(tài)”略微影響因子的募集。Norris和Manley(1996)Genes Develop.10862-872；和Galindo等(1995)Develop.1212209-2218。
這些令人苦惱的問題的本質(zhì)是Toll TH域的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。為了解決該問題，我們已經(jīng)利用了來(lái)自昆蟲、植物和脊椎動(dòng)物的TH序列的進(jìn)化趨異性，加入人DTLR鏈，并提取用于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和折疊識(shí)別的最小的保守蛋白核心(圖2)。強(qiáng)烈預(yù)測(cè)的(β/α)5TH域折疊具有其酸性殘基不對(duì)稱簇，在拓?fù)鋵W(xué)上與細(xì)菌中雙組分信號(hào)途徑中的效應(yīng)調(diào)節(jié)物的結(jié)構(gòu)相同(Volz(1993)Biochemistry 3211741-11753；和Parkinson(1993)Cell 73857-871)(圖2)。原型趨化性調(diào)節(jié)物CheY瞬時(shí)結(jié)合核心β-片C末端“天冬氨酸袋”中的二價(jià)陽(yáng)離子；該陽(yáng)離子提供靜電穩(wěn)定性，并促進(jìn)不變的Asp的活化磷酸化。Volz(1993)Biochemistry 3211741-11753。同樣，該TH域可以捕捉其酸性巢中的陽(yáng)離子，但激活和下游信號(hào)依賴于帶負(fù)電部分的特異性結(jié)合陰離子配體可以通過將其鎖入精確的氫鍵網(wǎng)絡(luò)中，而克服強(qiáng)負(fù)電結(jié)合位點(diǎn)的電勢(shì)。Ledvina等(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 936786-6791。有趣的是，該TH域可以不僅僅用作裝配Toll或植物和脊椎動(dòng)物中同源系統(tǒng)的Tube/Pelle復(fù)合物的被動(dòng)支架，而是作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)器中真正的構(gòu)象觸發(fā)劑而主動(dòng)參與。Toll的二聚可以促進(jìn)由調(diào)節(jié)受體尾引起的解掩蔽，也許解釋了Tube/Pelle復(fù)合物的條件結(jié)合(Norris和Manley(1995)Genes Develop.9358-369；和Norris和Manley(1996)Genes Develop.10862-872)，或促進(jìn)TH袋的小分子激活物的結(jié)合。然而，該細(xì)胞內(nèi)的“游離”TH域(Norris和Manley(1995)Genes Develop.9358-369；Winans和Hashimoto(1995)Molec.Biol.Cell 6587-596)可能通過激活并與游走的Tube/Pelle復(fù)合物對(duì)接，作為催化性的CheY樣觸發(fā)劑起作用。形態(tài)發(fā)生受體和免疫防御昆蟲和脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)之間的進(jìn)化聯(lián)系印在DNA中昆蟲中編碼抗微生物因子的基因顯示出的上游基序與哺乳動(dòng)物中急性期效應(yīng)元件相似，已知所述急性期效應(yīng)元件結(jié)合NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。Hultmark(1993)Trends Genet.9178-183。Dorsal和兩種Dorsal相關(guān)因子Dif和Relish，幫助在細(xì)菌攻擊后誘導(dǎo)這些防御蛋白(Reichhart等(1993)C.R.Acad.Sci.Paris 3161218-1224；Ip等(1993)Cell 75753-763；和Dushay等(1996)Proc Nat’l Acad.Sci.USA 9310343-10347)；Toll或其它DTLR可能在果蠅屬成體中介導(dǎo)這些快速免疫應(yīng)答(Lamaitre等(1996)Cell 86973-983；和Rosetto等(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.209111-116)。在脊椎動(dòng)物中，與IL-1炎癥反應(yīng)機(jī)制平行的反應(yīng)明顯具有Toll信號(hào)途徑的功能多面性，并提示在胚胎圖式發(fā)育和先天免疫之間古老的協(xié)同作用(Belvin和Anderson(1996)Ann.Rev.Cell Develop.Biol.12393-416；Lamaitre等(1996)Cell 86973-983；Wasserman(1993)Molec.Biol.Cell 4767-771；Wilson等(1997)Curr.Biol.7175-178；Hultmark(1993)Trends Genet.9178-183；Reichhart等(1993)C.R.Acad.Sci.Paris 3161218-1224；Ip等(1993)Cell 75753-763；和Dushay等(1996)Proc Nat’l Acad.Sci.USA 9310343-10347；Rosetto等(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.209111-116；Medzhitov和Janeway(1997)Curr.Opin.Immunol.94-9；和Medzhitov和Janeway(1997)Curr.Opin.Immunol.94-9)。昆蟲和人DTLR蛋白的更密切的同系物，引起甚至更強(qiáng)的生物學(xué)功能的重疊，這些功能替代與IL-1系統(tǒng)平行的純免疫系統(tǒng)，并提供對(duì)脊椎動(dòng)物胚胎背腹轉(zhuǎn)化和其它轉(zhuǎn)化的潛在的分子調(diào)節(jié)物。DeRobertis和Sasai(1996)Nature38037-40；和Arendt和Nubler-Jung(1997)Mech.Develop.617-21。
本文對(duì)人類中一個(gè)出現(xiàn)的強(qiáng)大的(robust)受體家族的描述，反映出最近對(duì)Wnt圖式發(fā)育因子的脊椎動(dòng)物Frizzled受體的發(fā)現(xiàn)。Wang等(1996)J.Biol.Chem.2714468-4476。因?yàn)樵S多其它細(xì)胞因子受體系統(tǒng)在早期發(fā)育中有作用(Lemaire和Kodjabachian(1996)Trends Genet.12525-531)，也許致密的胚胎和組合的(gangly)成體的不同細(xì)胞環(huán)境(cellular context)僅僅產(chǎn)生熟悉的信號(hào)途徑和在不同時(shí)間具有不同生物學(xué)結(jié)果的其可擴(kuò)散觸發(fā)劑，所述不同的生物學(xué)結(jié)果例如DTLR的形態(tài)發(fā)生相對(duì)于免疫防御。對(duì)于昆蟲、植物和人的Toll相關(guān)系統(tǒng)(Hardiman等(1996)Oncogene 132467-2475；Wilson等(1997)Curr.Biol.7175-178)，這些信號(hào)通過調(diào)節(jié)性TH域運(yùn)行，所述TH域有趣地類似細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)動(dòng)機(jī)(Parkinson(1993)Cell 73857-871)。
特別是，DTLR6表現(xiàn)出確立在該家族中其成員資格的結(jié)構(gòu)特征。此外，該家族成員已經(jīng)涉及許多明顯的發(fā)育疾病病征，并與先天免疫系統(tǒng)有關(guān)。具體地說(shuō)，已經(jīng)將DTLR6作圖至X染色體的一個(gè)位置，該位置是主要的發(fā)育異常的熱點(diǎn)。參見例如The Sanger Center人X染色體網(wǎng)站http//.sanger.ac.uk/HGP/ChrX/index.shtml；和theBaylor College of Medicine人類基因組測(cè)序網(wǎng)站http//gc.bcm.tmc.edu8088/cgi-bin/seq/home。
登記的PAC的登記號(hào)是AC003046。該登記號(hào)帶有來(lái)自兩種PAC的序列RPC-164K3和RPC-263P4。這兩種PAC序列作圖至人染色體Xp22，于Baylor網(wǎng)站標(biāo)記DX704和DXS7166之間。該區(qū)是嚴(yán)重的發(fā)育異常的“熱點(diǎn)”。III.DTLR片段的PCR擴(kuò)增選擇兩種合適的引物序列(參見表1-10)。在根據(jù)產(chǎn)生部分或全長(zhǎng)cDNA的信息的存在而選擇的合適mRNA樣品上，例如在表達(dá)該基因的樣品上，使用RT-PCR。參見例如Innis等(編輯，1990)PCR PtotocolsA Guide to Methods and Applications Academic Press，San Diego，CA；和Dieffenbach和Dveksler(1995；編輯)PCR PrimerA LaboratoryManual Cold Spring Harbor Press，CSH，NY。這樣將允許確定有用的序列，以探測(cè)cDNA文庫(kù)中的全長(zhǎng)基因。TLR6是該基因組中的一個(gè)連續(xù)序列，這可能提示其它TLR也是連續(xù)的序列。因此，對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR可能產(chǎn)生全長(zhǎng)的連續(xù)序列，然后可應(yīng)用染色體步查方法。或者，序列數(shù)據(jù)庫(kù)會(huì)含有對(duì)應(yīng)于所需實(shí)施方案的部分的序列，或密切相關(guān)的形式，例如替代剪接等。表達(dá)克隆技術(shù)也可以應(yīng)用于cDNA文庫(kù)。IV.DTLR的組織分布已經(jīng)檢測(cè)到編碼這些DTLR的每個(gè)基因的信息。參見圖5A-5F。將用合適的技術(shù)分析其它細(xì)胞和組織，所述合適的技術(shù)例如為PCR、免疫測(cè)定、雜交或其它方法。組織和器官cDNA制備物可得自Clontech，Mountain View，CA。天然表達(dá)源的鑒定是有用的，如所述的。
DNA分析來(lái)自首次擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)的DNA(5μg)用合適的限制性酶消化，以釋放插入片段，在1％瓊脂糖凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)。
用于人mRNA分離的樣品通常包括例如外周血單核細(xì)胞(單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞)，靜息的(T100)；外周血單核細(xì)胞，用抗CD3激活2、6、12小時(shí)的混合物(pooled)(T101)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，靜息的(T102)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T103)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用特定肽無(wú)反應(yīng)性處理2、7、12小時(shí)的混合物(T104)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，靜息的(T107)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T108)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用特定肽無(wú)反應(yīng)性處理2、6、12小時(shí)的混合物(T109)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，靜息的(T110)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，用抗CD28和抗CD3激活2、7、12小時(shí)的混合物(T111)；T細(xì)胞CD4+CD45RO-，在抗CD28、IL-4和抗IFN-γ中極化的T細(xì)胞，極化的TH2，用抗CD3和抗CD28激活4小時(shí)(T116)；T細(xì)胞腫瘤系Jurkat和Hut78，靜息的(T117)；T細(xì)胞克隆，混合的AD130.2、Tc783.12、Tc783.13、Tc783.58、Tc783.69，靜息的(T118)；T細(xì)胞隨機(jī)γδT細(xì)胞克隆，靜息的(T119)；脾細(xì)胞，靜息的(B100)；脾細(xì)胞，用抗CD40和IL-4激活的(B101)；B細(xì)胞EBV系，混合的WT49、RSB、JY、CVIR、721.221、RM3、HSY，靜息的(B102)；B細(xì)胞系JY，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(B103)；混合的K 20克隆，靜息的(K100)；混合的NK20克隆，用PMA和離子霉素激活6小時(shí)(K101)；NKL克隆，得自LGL白血病患者的外周血，IL-2處理的(K106)；NK細(xì)胞毒性克隆640-A30-1，靜息的(K107)；造血前體系TF1，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C100)；U937前單核細(xì)胞系，靜息的(M100)；U937前單核細(xì)胞系，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(M101)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10激活1、2、6、12、24小時(shí)的混合物(M102)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10激活1、2、6、12、24小時(shí)的混合物(M103)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10激活4、16小時(shí)的混合物(M106)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10激活4、16小時(shí)的混合物(M107)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS激活1小時(shí)(M108)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS激活6小時(shí)(M109)；DC 70％CD1a+，來(lái)自CD34+GM-CSF、TNFα12天，靜息的(D101)；DC 70％CD1a+，來(lái)自CD34+GM-CSF、TNFα 12天，用PMA和離子霉素激活1小時(shí)(D102)；DC 70％CD1a+，來(lái)自CD34+GM-CSF、TNFα 12天，用PMA和離子霉素激活6小時(shí)(D103)；DC 95％CD1a+，來(lái)自CD34+GM-CSF、TNFα 12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D104)；DC 95％CD14+，來(lái)自CD34+GM-CSF、TNFα 12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D105)；DC CD1a+CD86+，來(lái)自CD34+GM-CSF、TNFα 12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D106)；DC，來(lái)自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，靜息的(D107)；DC，來(lái)自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，靜息的(D108)；DC，來(lái)自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，用LPS激活4、16小時(shí)的混合物(D109)；DC，來(lái)自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，用TNFα、單核細(xì)胞上清液(supe)激活4、16小時(shí)的混合物(D110)；平滑肌瘤L11良性腫瘤(X101)；正常子宮肌層M5(O115)；惡性平滑肌肉瘤GS1(X103)；肺成纖維細(xì)胞肉瘤系MRC5，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C101)；腎上皮癌細(xì)胞系CHA，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C102)；28周的雄性胎腎(O100)；28周的雄性胎肺(O101)；28周的雄性胎肝(O102)；28周的雄性胎心(O103)；28周的雄性胎腦(O104)；28周的雄性胎兒膀胱(O106)；28周的雄性胎兒小腸(O107)；28周的雄性胎兒脂肪組織(O108)；25周的雌性胎兒卵巢(O109)；25周的雌性胎兒子宮(O110)；28周的雄性胎兒睪丸(O111)；28周的雄性胎脾(O112)；28周的成人胎盤(O113)；和來(lái)自12歲的發(fā)炎扁桃體(X100)。
用于小鼠mRNA分離的樣品可以包括例如靜息的小鼠成纖維細(xì)胞的L細(xì)胞系(C200)；BrafER(與雌激素受體融合的Braf融合體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，對(duì)照(C201)；T細(xì)胞，TH1，極化的(Me114 bright，來(lái)自脾臟的CD4+細(xì)胞，用IFN-γ和抗IL-4極化7天；T200)；T細(xì)胞，TH2，極化的(Me114 bright，來(lái)自脾臟的CD4+細(xì)胞，用IL-4和抗IFN-γ極化7天；T201)；T細(xì)胞，高度極化的TH1(參見Openshaw等(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗CD3激活2、6、16小時(shí)的混合物；T202)；T細(xì)胞，高度極化的TH2(參見Openshaw等(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗CD3激活2、6、16小時(shí)的混合物；T203)；CD44-CD25+前T細(xì)胞，從胸腺分選的(T204)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，用抗原最后一次刺激后靜息3周(T205)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，10μg/ml ConA激活15小時(shí)(T206)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，用抗原最后一次刺激后靜息3周(T207)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，10μg/ml ConA激活15小時(shí)(T208)；Me114+原初T細(xì)胞，來(lái)自脾臟，靜息的(T209)；Me114+T細(xì)胞，用IFN-γ/IL-12/抗IL-4極化6、12、24小時(shí)的混合物，極化成Th1(T210)；Me114+T細(xì)胞，用IL-4/抗IFN-γ極化6、13、24小時(shí)的混合物，極化成Th2(T211)；未刺激的成熟B細(xì)胞白血病細(xì)胞系A(chǔ)20(B200)；未刺激的B細(xì)胞系CH12(B201)；來(lái)自脾臟的未刺激的大B細(xì)胞(B202)；來(lái)自全脾的B細(xì)胞，LPS激活(B203)；來(lái)自脾臟的甲泛葡胺富集的樹突細(xì)胞，靜息的(D200)；來(lái)自骨髓的樹突細(xì)胞，靜息的(D201)；單核細(xì)胞細(xì)胞系RW264.7，用LPS激活4小時(shí)(M200)；骨髓巨噬細(xì)胞，用GM和M-CSF衍生的(M201)；巨噬細(xì)胞系J774，靜息的(M202)；于0.5、1、3、6、12小時(shí)混合的巨噬細(xì)胞系J774+LPS+抗IL-10(M203)；于0.5、1、3、6、12小時(shí)混合的巨噬細(xì)胞系J774+LPS+IL-10(M204)；氣溶膠攻擊的小鼠肺組織，Th2引物(primer)、氣溶膠OVA攻擊7、14、23小時(shí)的混合物(參見Garlisi等(1995)Clinical Immunology andImmunopathology 7575-83；X206)；日?qǐng)A線蟲屬(Nippostrongulus)感染的肺組織(參見Coffman等(1989)Science 245308-310；X200)；全成人肺臟，正常的(O200)；全肺臟，rag-1(參見Schwarz等(1993)Immnodeficiency 4249-252；O205)；IL-10 K.O.脾臟(參見Kuhn等(1991)Cell 75263-274；X201)；全成人脾臟，正常的(O201)；全脾臟，rag-1(O207)；IL-10 K.O.腸系膜淋巴結(jié)(X202)；全腸系膜淋巴結(jié)，正常的(O210)；IL-10 K.O.腸系膜淋巴結(jié)(X203)；全腸系膜淋巴結(jié)，正常的(O211)；IL-10 K.O.結(jié)腸(X203)；全結(jié)腸，正常的(O212)；NOD小鼠胰臟(參見Makino等(1980)Jikken Dobutsu 291-13；X205)；全胸腺，rag-1(O208)；全腎臟，rag-1(O209)；全心臟，rag-1(O202)；全腦，rag-1(O203)；全睪丸，rag-1(O204)；全肝臟，rag-1(O206)；大鼠正常關(guān)節(jié)組織(O300)；和大鼠關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織(X300)。V.DTLR的種對(duì)應(yīng)物的克隆采用各種策略，以獲得這些DTLR的種對(duì)應(yīng)物，最好是來(lái)自其它靈長(zhǎng)類的種對(duì)應(yīng)物。一種方法是采用密切相關(guān)的物種的DNA探針進(jìn)行交叉雜交。調(diào)查進(jìn)化上相似的物種作為中間步驟，可能是有用的。另一方法是采用特異性PCR引物，所述引物基于特定物種(例如人)基因(例如多肽或核苷酸序列高度保守或非保守的區(qū))之間相似性或差異的區(qū)組鑒定?；蛘?，可以將抗體用于表達(dá)克隆。VI.哺乳動(dòng)物DTLR蛋白的生產(chǎn)工程改造合適的(例如GST)融合構(gòu)成物，用于在例如大腸桿菌中表達(dá)。例如，構(gòu)建小鼠IGIF pGex質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)新轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并用IPTG(Sigma，St.Louis，MO)誘導(dǎo)。過夜誘導(dǎo)后，收獲細(xì)菌，并分離含有DTLR蛋白的沉淀。將所述沉淀在2升TE緩沖液(50mM Tris堿pH8.0、10mM EDTA和2mM pefabloc)中勻化。使該材料通過微流化裝置(microfluidizer)(Microfluidics，Newton，MA)三次。在Sorvall GS-3轉(zhuǎn)子上，將流化的上清液以13,000rpm離心1小時(shí)。所產(chǎn)生的上清液含所述DTLR蛋白，將其過濾，并使其通過谷胱甘肽-SEPHAROSE柱，該柱在50mM Tris堿pH8.0中平衡。合并含有所述DTLR-GST融合蛋白的流分，并用凝血酶(Enzyme Research Laboratories，Inc.，SouthBend，IN)酶切。然后，使酶切的合并物通過Q-SEPHAROSE柱，該柱在50mM Tris堿中平衡。合并含有DTLR的流分，并在冷蒸餾水中稀釋，以降低電導(dǎo)率，并再次僅通過新的Q-Sepharose柱，或再次接連通過新的Q-Sepharose和免疫親和抗體柱。合并含有所述DTLR蛋白的流分，將其分成等分樣品，并于-70℃冰箱中貯存。
將CD譜與DTLR1蛋白比較，可以提示該蛋白是正確地折疊的。參見Hazuda等(1969)J.Biol.Chem.2641689-1693。VII.用DTLR進(jìn)行生物測(cè)定生物測(cè)定一般涉及該蛋白的配體結(jié)合特征，或涉及該受體的激酶/磷酸酶活性。該活性通常是可逆的，許多其它酶的作用(介導(dǎo)磷酸酶或磷酸化酶活性)也是可逆的，采用標(biāo)準(zhǔn)方法可容易地測(cè)量所述活性。參見例如Hardie等(編輯，1995)The Protein Kinase FactBook第I和II卷，Academic Press，San Diego，CA；Hanks等(1991)Meth.Enzymol.20038-62；Hunter等(1992)Cell 70375-388；Lewin(1990)Cell 61743-752；Pines等(1991)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.56449-463；和Parker等(1993)Nature 363736-738。
白介素-1家族含有這樣的分子，它們每種均是重要的炎癥疾病的介質(zhì)。關(guān)于綜合性綜述，參見Dinarello(1996)“疾病中白介素-1的生物學(xué)基礎(chǔ)”Blood 872095-2147。提示不同的Toll配體可能在疾病起始、特別是炎癥反應(yīng)中起重要作用。與IL-1家族相關(guān)的新蛋白的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)這種分子的鑒定，所述分子提供疾病起始的分子基礎(chǔ)，并允許開發(fā)范圍和效力增加的治療策略。VIII.對(duì)例如DTLR4特異性的抗體的制備近交Balb/c小鼠用重組形式的所述蛋白(例如純化的DTLR4)腹膜內(nèi)免疫，或用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞腹膜內(nèi)免疫。于合適的時(shí)間點(diǎn)，用加入或不加入額外佐劑的蛋白加強(qiáng)免疫動(dòng)物，以進(jìn)一步刺激抗體產(chǎn)生。收集血清，或用收獲的脾臟產(chǎn)生雜交瘤。
或者，Balb/c小鼠用以該基因或其片段轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(或者內(nèi)源細(xì)胞或者異源細(xì)胞)免疫，或用分離的富集膜免疫，以表達(dá)該抗原。于合適的時(shí)間點(diǎn)收集血清，通常在多次進(jìn)一步給予免疫后收集。在原位生產(chǎn)蛋白中，各種基因治療技術(shù)可能可用以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
可以制備單克隆抗體。例如，將脾細(xì)胞與合適的融合伴侶融合，通過標(biāo)準(zhǔn)方法，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中選擇雜交瘤。例如通過ELISA或其它測(cè)定，根據(jù)與所需DTLR結(jié)合的抗體的存在，篩選雜交瘤上清液。也可以選擇或制備特異性識(shí)別特定DTLR實(shí)施方案的抗體。
在另一方法中，可以將合成的肽或純化的蛋白提呈給免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體。參見例如Coligan(1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press。在合適的情況下，結(jié)合試劑或者如上所述進(jìn)行標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記，或者將其固定至一種基質(zhì)，以用于淘選方法。也可以將核酸引入動(dòng)物細(xì)胞中，以產(chǎn)生用來(lái)誘出免疫應(yīng)答的抗原。參見例如Wang等(1993)Proc.Nat’l Acad.Sci.904156-4160；Barry等(1994)BioTechiques16616-619；和Xiang等(1995)Immunity 2129-135。IX.與例如DTLR5融合的融合蛋白的產(chǎn)生用DTLR5制備不同的融合構(gòu)成物。將該基因的部分融合于一種表位標(biāo)記，例如FLAG標(biāo)記，或融合于雙雜種系統(tǒng)構(gòu)成物。參見例如Fields和Song(1989)Nature 340245-246。
所述表位標(biāo)記可以用于表達(dá)克隆方法中，用抗FLAG抗體檢測(cè)，以檢測(cè)結(jié)合伴侶，例如相應(yīng)DTLR5的配體。所述雙雜種系統(tǒng)也可以用來(lái)分離特異性結(jié)合于DTLR5的蛋白。X.DTLR的染色體作圖制備染色體線(chromosome spreads)。在染色體制備物上進(jìn)行原位雜交，用以植物凝集素刺激、培養(yǎng)72小時(shí)的淋巴細(xì)胞獲得所述染色體制備物。加入5-溴脫氧尿苷培養(yǎng)最后7小時(shí)(60μg/ml培養(yǎng)基)，以確保良好質(zhì)量的雜交后染色體顯帶。
將借助引物在總B細(xì)胞cDNA模板上擴(kuò)增的合適片段(例如PCR片段)，克隆入合適的載體中。通過切口平移，用3H標(biāo)記該載體。使放射標(biāo)記的探針雜交至中期線上，如Mattei等(1985)Hum.Genet.69327-331中所述。
玻片用核示蹤乳液(KODAK NTB2)包被后，于4℃曝光例如18天。為了避免在顯帶步驟期間有任何銀顆?；洌旧w線首先用緩沖的吉姆薩溶液染色，并拍攝中期照片。然后，通過熒光染料-質(zhì)子傳遞作用-吉姆薩(FPG)法，進(jìn)行R-帶顯帶，并且在分析之前，再次拍攝中期照片。
或者，可以如上所述進(jìn)行FISH。將所述DTLR基因定位于不同的染色體。DTLR2和DTLR3定位至人類第4染色體；DTLR4定位于人類第9染色體，而DTLR5定位于人類第1染色體。參見圖4A-4D。XI.結(jié)構(gòu)活性關(guān)系采用標(biāo)準(zhǔn)方法和分析，測(cè)定特定殘基關(guān)鍵性的信息。例如通過于確定的位置(例如于以上鑒定的位置)產(chǎn)生許多不同的變異體，并且評(píng)價(jià)所述變異體的生物活性，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誘變分析。在某種程度上進(jìn)行該分析，以確定修飾活性的位置，或集中于特定的幾個(gè)位置，以確定可以取代的殘基，以或者保留、阻斷或調(diào)節(jié)生物活性。
或者，天然變異體的分析可以指明什么位置耐受天然突變。這可以得自個(gè)體、品系或物種間變異的群體分析。例如通過PCR分析并測(cè)序，分析選定個(gè)體的樣品。這允許評(píng)價(jià)群體多態(tài)性。XI.DTLR配體的分離利用DTLR的結(jié)合特異性，可以將DTLR用作特異性的結(jié)合試劑，以鑒定其結(jié)合伴侶，這非常象使用抗體。結(jié)合試劑或者如上所述標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記或其它標(biāo)記，或者固定至一種基質(zhì)，以用于淘選方法。
所述結(jié)合組合物用來(lái)篩選表達(dá)文庫(kù)，所述表達(dá)文庫(kù)由表達(dá)結(jié)合伴侶(例如配體，最好是膜結(jié)合的)的細(xì)胞系制備。標(biāo)準(zhǔn)染色方法用來(lái)檢測(cè)或分選表面表達(dá)的配體，或通過淘選，篩選表面表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。采用各種染色方法或免疫熒光法，進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)的篩選。也參見McMahan等(1991)EMBO J.102821-2832。
例如，于第0天，用每室1ml纖連蛋白(10ng/ml)的PBS于室溫下預(yù)包被2室的permanox玻片30分鐘。用PBS沖洗1次。然后，將COS細(xì)胞以2-3×105細(xì)胞/室，在1.5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中平板接種。于37℃培養(yǎng)過夜。
對(duì)于每種樣品，第一天，制備0.5ml無(wú)血清DME溶液，該溶液含有66μg/ml DEAE-葡聚糖、66μM氯喹和4μg DNA。對(duì)于每組，制備陽(yáng)性對(duì)照，即1和1/200稀釋度的DTLR-FLAG cDNA，以及制備陰性模擬物。用無(wú)血清DME沖洗細(xì)胞。加入該DNA溶液，于37℃溫育5小時(shí)。去除培養(yǎng)基，加入0.5ml 10％DMSO的DME 2.5分鐘。去除DME，并用DME洗滌1次。加入1.5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)過夜。
第2天，更換培養(yǎng)基。第3或4天，將所述細(xì)胞固定并染色。用Hank緩沖鹽溶液(HBSS)沖洗細(xì)胞2次，并于4％低聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定5分鐘。用HBSS洗滌3次。去除所有液體后，將所述玻片于-80℃貯存。對(duì)于每個(gè)室，如下進(jìn)行0.5ml溫育。加入具有32μl/ml1M NaN3的HBSS/皂苷(0.1％)20分鐘。然后細(xì)胞用HBSS/皂苷洗滌1次。將合適的DTLR或DTLR/抗體復(fù)合物加入細(xì)胞中，并溫育30分鐘。用HBSS/皂苷洗滌細(xì)胞2次。如果合適，加入第一抗體30分鐘。以1/200的稀釋度加入第二抗體，例如Vector抗小鼠抗體，并溫育30分鐘。制備ELISA溶液，例如Vector Elite ABC辣根過氧化物酶溶液，并預(yù)溫育30分鐘。使用例如每2.5ml HBSS/皂苷1滴A溶液(抗生物素蛋白)和1滴B溶液(生物素)。用HBSS/皂苷洗滌細(xì)胞2次。加入ABC HRP溶液，并溫育30分鐘。用HBSS洗滌細(xì)胞2次，第二次洗滌2分鐘，封閉細(xì)胞。然后，加入Vector的二氨基苯甲酸(DAB)5-10分鐘。使用每5ml玻璃蒸餾水2滴緩沖液加4滴DAB加2滴H2O2。小心地除去室，并在水中沖洗玻片。風(fēng)干數(shù)分鐘，然后加入1滴CrystalMount，加上蓋玻片。于85-90℃烘5分鐘。
評(píng)價(jià)庫(kù)和漸進(jìn)亞克隆的陽(yáng)性染色，以分離負(fù)責(zé)結(jié)合的單基因。
或者，用DTLR試劑來(lái)親和純化或分選出表達(dá)推定配體的細(xì)胞。參見例如Sambrook等或Ausubel等。
另一策略是通過淘選，篩選膜結(jié)合受體。如上所述構(gòu)建該受體的cDNA?？梢詫⒃撆潴w固定化，并用以固定表達(dá)的細(xì)胞。利用識(shí)別例如DTLR融合構(gòu)成物的FLAG序列的合適抗體，或利用針對(duì)第一抗體產(chǎn)生的抗體，可以達(dá)到固定化。篩選和擴(kuò)增的遞歸(recursive)循環(huán)導(dǎo)致合適克隆的富集，并且最終分離受體表達(dá)克隆。
用哺乳動(dòng)物DTLR可以篩選噬菌體表達(dá)文庫(kù)。例如抗FLAG抗體的合適的標(biāo)記技術(shù)，將提供合適克隆的特異性標(biāo)記。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中，其程度與具體和單獨(dú)地表明每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用結(jié)合到本文中的程度一樣。
不偏離本發(fā)明的精神和范圍，可以進(jìn)行本發(fā)明的的許多修改和變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。提供本文所述的具體實(shí)施方案僅僅是作為實(shí)例，本發(fā)明由所附的權(quán)利要求書以及賦予這類權(quán)利要求的相當(dāng)權(quán)利要求的全部范圍所限制；本發(fā)明不受作為實(shí)例提出的具體實(shí)施方案的限制。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)姓名Schering Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼07033(G)電話(908)298-4000(H)傳真(908)298-5388(ii)發(fā)明名稱人受體蛋白；相關(guān)的藥劑和方法(iii)序列數(shù)35(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)Macintosh Power PC(C)操作系統(tǒng)8.0(D)軟件Microsoft Word 6.0(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)提交日期(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥SSN 60/044,293(B)提交日期1997年5月7日(A)申請(qǐng)?zhí)朥SSN 60/072,212(B)提交日期1998年1月22日(A)申請(qǐng)?zhí)朥SSN 60/076,947(B)提交日期1998年3月5日(2)SEQ ID NO1的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度2367個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...2358(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置67...2358(xi)順序描述SEQ ID NO1ATG ACT AGC ATC TTC CAT TTT GCC ATT ATC TTC ATG TTA ATA CTT CAG48Met Thr Ser Ile Phe His Phe Ala Ile Ile Phe Met Leu Ile Leu Gln-22 -20 -15 -10ATC AGA ATA CAA TTA TCT GAA GAA AGT GAA TTT TTA GTT GAT AGG TCA96Ile Arg Ile Gln Leu Ser Glu Glu Ser Glu Phe Leu Val Asp Arg Ser-5 1 5 10AAA AAC GGT CTC ATC CAC GTT CCT AAA GAC CTA TCC CAG AAA ACA ACA 144Lys Asn Gly Leu Ile His Val Pro Lys Asp Leu Ser Gln Lys Thr Thr15 20 25ATC TTA AAT ATA TCG CAA AAT TAT ATA TCT GAG CTT TGG ACT TCT GAC 192Ile Leu Asn Ile Ser Gln Asn Tyr Ile Ser Glu Leu Trp Thr Ser Asp30 35 40ATC TTA TCA CTG TCA AAA CTG AGG ATT TTG ATA ATT TCT CAT AAT AGA 240Ile Leu Ser Leu Ser Lys Leu Arg Ile Leu Ile Ile Ser His Asn Arg45 50 55ATC CAG TAT CTT GAT ATC AGT GTT TTC AAA TTC AAC CAG GAA TTG GAA 288Ile Gln Tyr Leu Asp Ile Ser Val Phe Lys Phe Asn Gln Glu Leu Glu60 65 70TAC TTG GAT TTG TCC CAC AAC AAG TTG GTG AAG ATT TCT TGC CAC CCT 336Tyr Leu Asp Leu Ser His Asn Lys Leu Val Lys Ile Ser Cys His Pro75 80 85 90ACT GTG AAC CTC AAG CAC TTG GAC CTG TCA TTT AAT GCA TTT GAT GCC 384Thr Val Asn Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ala95 100 105CTG CCT ATA TGC AAA GAG TTT GGC AAT ATG TCT CAA CTA AAA TTT CTG 432Leu Pro Ile Cys Lys Glu Phe Gly Asn Met Ser Gln Leu Lys Phe Leu110 115 120GGG TTG AGC ACC ACA CAC TTA GAA AAA TCT AGT GTG CTG CCA ATT GCT 480Gly Leu Ser Thr Thr His Leu Glu Lys Ser Ser Val Leu Pro Ile Ala125 130 135CAT TTG AAT ATC AGC AAG GTC TTG CTG GTC TTA GGA GAG ACT TAT GGG 528His Leu Asn Ile Ser Lys Val Leu Leu Val Leu Gly Glu Thr Tyr Gly140 145 150GAA AAA GAA GAC CCT GAG GGC CTT CAA GAC TTT AAC ACT GAG AGT CTG 576Glu Lys Glu Asp Pro Glu Gly Leu Gln Asp Phe Asn Thr Glu Ser Leu155 160 165 170CAC ATT GTG TTC CCC ACA AAC AAA GAA TTC CAT TTT ATT TTG GAT GTG 624His Ile Val Phe Pro Thr Asn Lys Glu Phe His Phe Ile Leu Asp Val175 180 185TCA GTC AAG ACT GTA GCA AAT CTG GAA CTA TCT AAT ATC AAA TGT GTG 672Ser Val Lys Thr Val Ala Asn Leu Glu Leu Ser Asn Ile Lys Cys Val190 195 200CTA GAA GAT AAC AAA TGT TCT TAC TTC CTA AGT ATT CTG GCG AAA CTT 720Leu Glu Asp Asn Lys Cys Ser Tyr Phe Leu Ser Ile Leu Ala Lys Leu205 210 215CAA ACA AAT CCA AAG TTA TCA AGT CTT ACC TTA AAC AAC ATT GAA ACA 768Gln Thr Asn Pro Lys Leu Ser Ser Leu Thr Leu Asn Asn Ile Glu Thr220 225 230ACT TGG AAT TCT TTC ATT AGG ATC CTC CAA CTA GTT TGG CAT ACA ACT 816Thr Trp Asn Ser Phe Ile Arg Ile Leu Gln Leu Val Trp His Thr Thr235 240 245 250GTA TGG TAT TTC TCA ATT TCA AAC GTG AAG CTA CAG GGT CAG CTG GAC 864Val Trp Tyr Phe Ser Ile Ser Asn Val Lys Leu Gln Gly Gln Leu Asp255 260 265TTC AGA GAT TTT GAT TAT TCT GGC ACT TCC TTG AAG GCC TTG TCT ATA 912Phe Arg Asp Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Lys Ala Leu Ser Ile270 275 280CAC CAA GTT GTC AGC GAT GTG TTC GGT TTT CCG CAA AGT TAT ATC TAT 960His Gln Val Val Ser Asp Val Phe Gly Phe Pro Gln Ser Tyr Ile Tyr285 290 295GAA ATC TTT TCG AAT ATG AAC ATC AAA AAT TTC ACA GTG TCT GGT ACA 1008Glu Ile Phe Ser Asn Met Asn Ile Lys Asn Phe Thr Val Ser Gly Thr300 305 310CGC ATG GTC CAC ATG CTT TGC CCA TCC AAA ATT AGC CCG TTC CTG CAT 1056Arg Met Val His Met Leu Cys Pro Ser Lys Ile Ser Pro Phe Leu His315 320 325 330TTG GAT TTT TCC AAT AAT CTC TTA ACA GAC ACG GTT TTT GAA AAT TGT 1104Leu Asp Phe Ser Asn Asn Leu Leu Thr Asp Thr Val Phe Glu Asn Cys335 340 345GGG CAC CTT ACT GAG TTG GAG ACA CTT ATT TTA CAA ATG AAT CAA TTA 1152Gly His Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Ile Leu Gln Met Asn Gln Leu350 355 360AAA GAA CTT TCA AAA ATA GCT GAA ATG ACT ACA CAG ATG AAG TCT CTG 1200Lys Glu Leu Ser Lys Ile Ala Glu Met Thr Thr Gln Met Lys Ser Leu365 370 375CAA CAA TTG GAT ATT AGC CAG AAT TCT GTA AGC TAT GAT GAA AAG AAA 1248Gln Gln Leu Asp Ile Ser Gln Asn Ser Val Ser Tyr Asp Glu Lys Lys380 385 390GGA GAC TGT TCT TGG ACT AAA AGT TTA TTA AGT TTA AAT ATG TCT TCA 1296Gly Asp Cys Ser Trp Thr Lys Ser Leu Leu Ser Leu Asn Met Ser Ser395 400 405 410AAT ATA CTT ACT GAC ACT ATT TTC AGA TGT TTA CCT CCC AGG ATC AAG 1344Asn Ile Leu Thr Asp Thr Ile Phe Arg Cys Leu Pro Pro Arg Ile Lys415 420 425GTA CTT GAT CTT CAC AGC AAT AAA ATA AAG AGC ATT CCT AAA CAA GTC 1392Val Leu Asp Leu His Ser Asn Lys Ile Lys Ser Ile Pro Lys Gln Val430 435 440GTA AAA CTG GAA GCT TTG CAA GAA CTC AAT GTT GCT TTC AAT TCT TTA 1440Val Lys Leu Glu Ala Leu Gln Glu Leu Asn Val Ala Phe Asn Ser Leu445 450 455ACT GAC CTT CCT GGA TGT GGC AGC TTT AGC AGC CTT TCT GTA TTG ATC 1488Thr Asp Leu Pro Gly Cys Gly Ser Phe Ser Ser Leu Ser Val Leu Ile460 465 470ATT GAT CAC AAT TCA GTT TCC CAC CCA TCA GCT GAT TTC TTC CAG AGC 1536Ile Asp His Asn Ser Val Ser His Pro Ser Ala Asp Phe Phe Gln Ser475 480 485 490TGC CAG AAG ATG AGG TCA ATA AAA GCA GGG GAC AAT CCA TTC CAA TGT 1584Cys Gln Lys Met Arg Ser Ile Lys Ala Gly Asp Asn Pro Phe Gln Cys495 500 505ACC TGT GAG CTC GGA GAA TTT GTC AAA AAT ATA GAC CAA GTA TCA AGT 1632Thr Cys Glu Leu Gly Glu Phe Val Lys Asn Ile Asp Gln Val Ser Ser510 515 520GAA GTG TTA GAG GGC TGG CCT GAT TCT TAT AAG TGT GAC TAC CCG GAA 1680Glu Val Leu Glu Gly Trp Pro Asp Ser Tyr Lys Cys Asp Tyr Pro Glu525 530 535AGT TAT AGA GGA ACC CTA CTA AAG GAC TTT CAC ATG TCT GAA TTA TCC 1728Ser Tyr Arg Gly Thr Leu Leu Lys Asp Phe His Met Ser Glu Leu Ser540 545 550TGC AAC ATA ACT CTG CTG ATC GTC ACC ATC GTT GCC ACC ATG CTG GTG 1776Cys Asn Ile Thr Leu Leu Ile Val Thr Ile Val Ala Thr Met Leu Val555 560 565 570TTG GCT GTG ACT GTG ACC TCC CTC TGC ATC TAC TTG GAT CTG CCC TGG 1824Leu Ala Val Thr Val Thr Ser Leu Cys Ile Tyr Leu Asp Leu Pro Trp575 580 585TAT CTC AGG ATG GTG TGC CAG TGG ACC CAG ACC CGG CGC AGG GCC AGG 1872Tyr Leu Arg Met Val Cys Gln Trp Thr Gln Thr Arg Arg Arg Ala Arg590 595 600AAC ATA CCC TTA GAA GAA CTC CAA AGA AAT CTC CAG TTT CAT GCA TTT 1920Asn Ile Pro Leu Glu Glu Leu Gln Arg Asn Leu Gln Phe His Ala Phe605 610 615ATT TCA TAT AGT GGG CAC GAT TCT TTC TGG GTG AAG AAT GAA TTA TTG 1968Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp Ser Phe Trp Val Lys Asn Glu Leu Leu620 625 630CCA AAC CTA GAG AAA GAA GGT ATG CAG ATT TGC CTT CAT GAG AGA AAC 2016Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Met Gln Ile Cys Leu His Glu Arg Asn635 640 645 650TTT GTT CCT GGC AAG AGC ATT GTG GAA AAT ATC ATC ACC TGC ATT GAG 2064Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile Ile Thr Cys Ile Glu655 660 665AAG AGT TAC AAG TCC ATC TTT GTT TTG TCT CCC AAC TTT GTC CAG AGT 2112Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Ser670 675 680GAA TGG TGC CAT TAT GAA CTC TAC TTT GCC CAT CAC AAT CTC TTT CAT 2160Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His685 690 695GAA GGA TCT AAT AGC TTA ATC CTG ATC TTG CTG GAA CCC ATT CCG CAG 2208Glu Gly Ser Asn Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Gln700 705 710TAC TCC ATT CCT AGC AGT TAT CAC AAG CTC AAA AGT CTC ATG GCC AGG 2256Tyr Ser Ile Pro Ser Ser Tyr His Lys Leu Lys Ser Leu Met Ala Arg715 720 725 730AGG ACT TAT TTG GAA TGG CCC AAG GAA AAG AGC AAA CGT GGC CTT TTT 2304Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe735 740 745TGG GCT AAC TTA AGG GCA GCC ATT AAT ATT AAG CTG ACA GAG CAA GCA 2352Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala750 755 760AAG AAA TAGTCTAGA2367Lys Lys(2)SEQ ID NO2的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度786個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO2Met Thr Ser Ile Phe His Phe Ala Ile Ile Phe Met Leu Ile Leu Gln-22 -20 -15 -10Ile Arg Ile Gln Leu Ser Glu Glu Ser Glu Phe Leu Val Asp Arg Ser-51 5 10Lys Asn Gly Leu Ile His Val Pro Lys Asp Leu Ser Gln Lys Thr Thr15 20 25Ile Leu Asn Ile Ser Gln Asn Tyr Ile Ser Glu Leu Trp Thr Ser Asp30 35 40Ile Leu Ser Leu Ser Lys Leu Arg Ile Leu Ile Ile Ser His Asn Arg45 50 55Ile Gln Tyr Leu Asp Ile Ser Val Phe Lys Phe Asn Gln Glu Leu Glu60 65 70Tyr Leu Asp Leu Ser His Asn Lys Leu Val Lys Ile Ser Cys His Pro75 80 85 90Thr Val Asn Leu Lys His Leu Asp Leu Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ala95 100 105Leu Pro Ile Cys Lys Glu Phe Gly Asn Met Ser Gln Leu Lys Phe Leu110 115 120Gly Leu Ser Thr Thr His Leu Glu Lys Ser Ser Val Leu Pro Ile Ala125 130 135His Leu Asn Ile Ser Lys Val Leu Leu Val Leu Gly Glu Thr Tyr Gly140 145 150Glu Lys Glu Asp Pro Glu Gly Leu Gln Asp Phe Asn Thr Glu Ser Leu155 160 165 170His Ile Val Phe Pro Thr Asn Lys Glu Phe His Phe Ile Leu Asp Val175 180 185Ser Val Lys Thr Val Ala Asn Leu Glu Leu Ser Asn Ile Lys Cys Val190 195 200Leu Glu Asp Asn Lys Cys Ser Tyr Phe Leu Ser Ile Leu Ala Lys Leu205 210 215Gln Thr Asn Pro Lys Leu Ser Ser Leu Thr Leu Asn Asn Ile Glu Thr220 225 230Thr Trp Asn Ser Phe Ile Arg Ile Leu Gln Leu Val Trp His Thr Thr235 240 245 250Val Trp Tyr Phe Ser Ile Ser Asn Val Lys Leu Gln Gly Gln Leu Asp255 260 265Phe Arg Asp Phe Asp Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Lys Ala Leu Ser Ile270 275 280His Gln Val Val Ser Asp Val Phe Gly Phe Pro Gln Ser Tyr Ile Tyr285 290 295Glu Ile Phe Ser Asn Met Asn Ile Lys Asn Phe Thr Val Ser Gly Thr300 305 310Arg Met Val His Met Leu Cys Pro Ser Lys Ile Ser Pro Phe Leu His315 320 325 330Leu Asp Phe Ser Asn Asn Leu Leu Thr Asp Thr Val Phe Glu Asn Cys335 340 345Gly His Leu Thr Glu Leu Glu Thr Leu Ile Leu Gln Met Asn Gln Leu350 355 360Lys Glu Leu Ser Lys Ile Ala Glu Met 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Trp575 580 585Tyr Leu Arg Met Val Cys Gln Trp Thr Gln Thr Arg Arg Arg Ala Arg590 595 600Asn Ile Pro Leu Glu Glu Leu Gln Arg Asn Leu Gln Phe His Ala Phe605 610 615Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp Ser Phe Trp Val Lys Asn Glu Leu Leu620 625 630Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Met Gln Ile Cys Leu His Glu Arg Asn635 640 645 650Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile Ile Thr Cys Ile Glu655 660 665Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Ser670 675 680Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His685 690 695Glu Gly Ser Asn Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Gln700 705 710Tyr Ser Ile Pro Ser Ser Tyr His Lys Leu Lys Ser Leu Met Ala Arg715 720 725 730Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe735 740 745Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala750 755 760Lys Lys(2)SEQ ID NO3的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度2355個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...2352(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置67...2352(xi)順序描述SEQ ID NO3ATG CCA CAT ACT TTG TGG ATG GTG TGG GTC TTG GGG GTC ATC ATC AGC48Met Pro His Thr Leu Trp Met Val Trp Val Leu Gly Val Ile Ile Ser-22 -20 -15 -10CTC TCC AAG GAA GAA TCC TCC AAT CAG GCT TCT CTG TCT TGT GAC CGC96Leu Ser Lys Glu Glu Ser Ser Asn Gln Ala Ser Leu Ser Cys Asp Arg-51 5 10AAT GGT ATC TGC AAG GGC AGC TCA GGA TCT TTA AAC TCC ATT CCC TCA 144Asn Gly Ile Cys Lys Gly Ser Ser Gly Ser Leu Asn Ser Ile Pro Ser15 20 25GGG CTC ACA GAA GCT GTA AAA AGC CTT GAC CTG TCC AAC AAC AGG ATC 192Gly Leu Thr Glu Ala Val Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Arg Ile30 35 40ACC TAC ATT AGC AAC AGT GAC CTA CAG AGG TGT GTG AAC CTC CAG GCT 240Thr Tyr Ile Ser Asn Ser Asp Leu Gln Arg Cys Val Asn Leu Gln Ala45 50 55CTG GTG CTG ACA TCC AAT GGA ATT AAC ACA ATA GAG GAA GAT TCT TTT 288Leu Val Leu Thr Ser Asn Gly Ile Asn Thr Ile Glu Glu Asp Ser Phe60 65 70TCT TCC CTG GGC AGT CTT GAA CAT TTA GAC TTA TCC TAT AAT TAC TTA 336Ser Ser Leu Gly Ser Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Tyr 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280 285AAT TTC GGA TGG CAA CAT TTA GAA TTA GTT AAC TGT AAA TTT GGA CAG 912Asn Phe Gly Trp Gln His Leu Glu Leu Val Asn Cys Lys Phe Gly Gln290 295 300TTT CCC ACA TTG AAA CTC AAA TCT CTC AAA AGG CTT ACT TTC ACT TCC 960Phe Pro Thr Leu Lys Leu Lys Ser Leu Lys Arg Leu Thr Phe Thr Ser305 310 315 320AAC AAA GGT GGG AAT GCT TTT TCA GAA GTT GAT CTA CCA AGC CTT GAG 1008Asn Lys Gly Gly Asn Ala Phe Ser Glu Val Asp Leu Pro Ser Leu Glu325 330 335TTT CTA GAT GTC AGT AGA AAT GGC TTG AGT TTC AAA GGT TGC TGT TCT 1056Phe Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gly Leu Ser Phe Lys Gly Cys Cys Ser340 345 350CAA AGT GAT TTT GGG ACA ACC AGC CTA AAG TAT TTA GAT CTG AGC TTC 1104Gln Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Asp Leu Ser Phe355 360 365AAT GGT GTT ATT ACC ATG AGT TCA AAC TTC TTG GGC TTA GAA CAA CTA 1152Asn Gly Val Ile Thr Met Ser Ser Asn Phe Leu Gly Leu Glu Gln Leu370 375 380GAA CAT CTG GAT TTC CAG CAT TCC AAT TTG AAA CAA ATG AGT GAG TTT 1200Glu His Leu Asp Phe Gln His Ser Asn Leu Lys Gln Met Ser Glu Phe385 390 395 400TCA GTA TTC CTA TCA CTC AGA AAC CTC ATT TAC CTT GAC ATT TCT CAT 1248Ser Val Phe Leu Ser Leu Arg Asn Leu Ile Tyr Leu Asp Ile Ser His405 410 415ACT CAC ACC AGA GTT GCT TTC AAT GGC ATC TTC AAT GGC TTG TCC AGT 1296Thr His Thr Arg Val Ala Phe Asn Gly Ile Phe Asn Gly Leu Ser Ser420 425 430CTC GAA GTC TTG AAA ATG GCT GGC AAT TCT TTC CAG GAA AAC TTC CTT 1344Leu Glu Val Leu Lys Met Ala Gly Asn Ser Phe Gln Glu Asn Phe Leu435 440 445CCA GAT ATC TTC ACA GAG CTG AGA AAC TTG ACC TTC CTG GAC CTC TCT 1392Pro Asp Ile Phe Thr Glu Leu Arg Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Ser450 455 460CAG TGT CAA CTG GAG CAG TTG TCT CCA ACA GCA TTT AAC TCA CTC TCC 1440Gln Cys Gln Leu Glu Gln Leu Ser Pro Thr Ala Phe Asn Ser Leu Ser465 470 475 480AGT CTT CAG GTA CTA AAT ATG AGC CAC AAC AAC TTC TTT TCA TTG GAT 1488Ser Leu Gln Val Leu Asn Met Ser His Asn Asn Phe Phe Ser Leu Asp485 490 495ACG TTT CCT TAT AAG TGT CTG AAC TCC CTC CAG GTT CTT GAT TAC AGT 1536Thr Phe Pro Tyr Lys Cys Leu Asn Ser Leu Gln Val Leu Asp Tyr Ser500 505 510CTC AAT CAC ATA ATG ACT TCC AAA AAA CAG GAA CTA CAG CAT TTT CCA 1584Leu Asn His Ile Met Thr Ser Lys Lys Gln Glu Leu Gln His Phe Pro515 520 525AGT AGT CTA GCT TTC TTA AAT CTT ACT CAG AAT GAC TTT GCT TGT ACT 1632Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu Thr Gln Asn Asp Phe Ala Cys Thr530 535 540TGT GAA CAC CAG AGT TTC CTG CAA TGG ATC AAG GAC CAG AGG CAG CTC 1680Cys Glu His Gln Ser Phe Leu Gln Trp Ile Lys Asp Gln Arg Gln Leu545 550 555 560TTG GTG GAA GTT GAA CGA ATG GAA TGT GCA ACA CCT TCA GAT AAG CAG 1728Leu Val Glu Val Glu Arg Met Glu Cys Ala Thr Pro Ser Asp Lys Gln565 570 575GGC ATG CCT GTG CTG AGT TTG AAT ATC ACC TGT CAG ATG AAT AAG ACC 1776Gly Met Pro Val Leu Ser Leu Asn Ile Thr Cys Gln Met Asn Lys Thr580 585 590ATC ATT GGT GTG TCG GTC CTC AGT GTG CTT GTA GTA TCT GTT GTA GCA 1824Ile Ile Gly Val Ser Val Leu Ser Val Leu Val Val Ser Val Val Ala595 600 605GTT CTG GTC TAT AAG TTC TAT TTT CAC CTG ATG CTT CTT GCT GGC TGC 1872Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu Met Leu Leu Ala Gly Cys610 615 620ATA AAG TAT GGT AGA GGT GAA AAC ATC TAT GAT GCC TTT GTT ATC TAC 1920Ile Lys Tyr Gly Arg Gly Glu Asn Ile Tyr Asp Ala Phe Val Ile Tyr625 630 635 640TCA AGC CAG GAT GAG GAC TGG GTA AGG AAT GAG CTA GTA AAG AAT TTA 1968Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp Val Arg Asn Glu Leu Val Lys Asn Leu645 650 655GAA GAA GGG GTG CCT CCA TTT CAG CTC TGC CTT CAC TAC AGA GAC TTT 2016Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe Gln Leu Cys Leu His Tyr Arg Asp Phe660 665 670ATT CCC GGT GTG GCC ATT GCT GCC AAC ATC ATC CAT GAA GGT TTC CAT 2064Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala Ala Asn Ile Ile His Glu Gly Phe His675 680 685AAA AGC CGA AAG GTG ATT GTT GTG GTG TCC CAG CAC TTC ATC CAG AGC 2112Lys Ser Arg Lys Val Ile Val Val Val Ser Gln His Phe Ile Gln Ser690 695 700CGC TGG TGT ATC TTT GAA TAT GAG ATT GCT CAG ACC TGG CAG TTT CTG 2160Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr Glu Ile Ala Gln Thr Trp Gln Phe Leu705 710 715 720AGC AGT CGT GCT GGT ATC ATC TTC ATT GTC CTG CAG AAG GTG GAG AAG 2208Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile Phe Ile Val Leu Gln Lys Val Glu 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Asn Pro Ile Gln Ser Leu Ala Leu Gly65 70 75 80Ala Phe Ser Gly Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Val Ala Val Glu Thr85 90 95Asn Leu Ala Ser Leu Glu Asn Phe Pro Ile Gly His Leu Lys Thr Leu100 105 110Lys Glu Leu Asn Val Ala His Asn Leu Ile Gln Ser Phe Lys Leu Pro115 120 125Glu Tyr Phe Ser Asn Leu Thr Asn Leu Glu His Leu Asp Leu Ser Ser130 135 140Asn Lys Ile Gln Ser Ile Tyr Cys Thr Asp Leu Arg Val Leu His Gln145 150 155 160Met Pro Leu Leu Asn Leu Ser Leu Asp Leu Ser Leu Asn Pro Met Asn165 170 175Phe Ile Gln Pro Gly Ala Phe Lys Glu Ile Arg Leu His Lys Leu Thr180 185 190Leu Arg Asn Asn Phe Asp Ser Leu Asn Val Met Lys Thr Cys Ile Gln195 200 205Gly Leu Ala Gly Leu Glu Val His Arg Leu Val Leu Gly Glu Phe Arg210 215 220Asn Glu Gly Asn Leu Glu Lys Phe Asp Lys Ser Ala Leu Glu Gly Leu225 230 235 240Cys Asn Leu Thr Ile Glu Glu Phe Arg Leu Ala Tyr Leu Asp Tyr Tyr245 250 255Leu Asp Asp Ile Ile Asp Leu Phe Asn Cys Leu Thr Asn Val Ser Ser260 265 270Phe Ser Leu Val Ser Val Thr Ile Glu Arg Val Lys Asp Phe Ser Tyr275 280 285Asn Phe Gly Trp Gln His Leu Glu Leu Val Asn Cys Lys Phe Gly Gln290 295 300Phe Pro Thr Leu Lys Leu Lys Ser Leu Lys Arg Leu Thr Phe Thr Ser305 310 315 320Asn Lys Gly Gly Asn Ala Phe Ser Glu Val Asp Leu Pro Ser Leu Glu325 330 335Phe Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gly Leu Ser Phe Lys Gly Cys Cys Ser340 345 350Gln Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Asp Leu Ser Phe355 360 365Asn Gly Val Ile Thr Met Ser Ser Asn Phe Leu Gly Leu Glu Gln Leu370 375 380Glu His Leu Asp Phe Gln His Ser Asn Leu Lys Gln Met Ser Glu Phe385 390 395 400Ser Val Phe Leu Ser Leu Arg Asn Leu Ile Tyr Leu Asp Ile Ser His405 410 415Thr His Thr Arg Val Ala Phe Asn Gly Ile Phe Asn Gly Leu Ser Ser420 425 430Leu Glu Val Leu Lys Met Ala Gly Asn Ser Phe Gln Glu Asn Phe Leu435 440 445Pro Asp Ile Phe Thr Glu Leu Arg Asn Leu Thr Phe Leu Asp Leu Ser450 455 460Gln Cys Gln Leu Glu Gln Leu Ser Pro Thr Ala Phe Asn Ser Leu Ser465 470 475 480Ser Leu Gln Val Leu Asn Met Ser His Asn Asn Phe Phe Ser Leu Asp485 490 495Thr Phe Pro Tyr Lys Cys Leu Asn Ser Leu Gln Val Leu Asp Tyr Ser500 505 510Leu Asn His Ile Met Thr Ser Lys Lys Gln Glu Leu Gln His Phe Pro515 520 525Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu Thr Gln Asn Asp Phe Ala Cys Thr530 535 540Cys Glu His Gln Ser Phe Leu Gln Trp Ile Lys Asp Gln Arg Gln Leu545 550 555 560Leu Val Glu Val Glu Arg Met Glu Cys Ala Thr Pro Ser Asp Lys Gln565 570 575Gly Met Pro Val Leu Ser Leu Asn Ile Thr Cys Gln Met Asn Lys Thr580 585 590Ile Ile Gly Val Ser Val Leu Ser Val Leu Val Val Ser Val Val Ala595 600 605Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu Met Leu Leu Ala Gly Cys610 615 620Ile Lys Tyr Gly Arg Gly Glu Asn Ile Tyr Asp Ala Phe Val Ile Tyr625 630 635 640Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp Val Arg Asn Glu Leu Val Lys Asn Leu645 650 655Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe Gln Leu Cys Leu His Tyr Arg Asp Phe660 665 670Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala Ala Asn Ile Ile His Glu Gly Phe His675 680 685Lys Ser Arg Lys Val Ile Val Val Val Ser Gln His Phe Ile Gln Ser690695 700Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr Glu Ile Ala Gln Thr Trp Gln Phe Leu705 710 715 720Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile Phe Ile Val Leu Gln Lys Val Glu Lys725 730 735Thr Leu Leu Arg Gln Gln Val Glu Leu Tyr Arg Leu Leu Ser Arg Asn740 745 750Thr Tyr Leu Glu Trp Glu Asp Ser Val Leu Gly Arg His Ile Phe Trp755 760 765Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu Leu Asp Gly Lys Ser Trp Ash Pro Glu770 775 780Gly Thr Val Gly Thr Gly Cys Asn Trp Gln Glu Ala Thr Ser Ile785 790 795(2)SEQ ID NO9的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度1275個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置l...1095(xi)順序描述SEQ ID NO9TGT TGG GAT GTT TTT GAG GGA CTT TCT CAT CTT CAA GTT CTG TAT TTG48Cys Trp Asp Val Phe Glu Gly Leu Ser His Leu Gln Val Leu Tyr Leu1 5 10 15AAT CAT AAC TAT CTT AAT TCC CTT CCA CCA GGA GTA TTT AGC CAT CTG96Asn His Asn Tyr Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gly Val Phe Ser His Leu20 25 30ACT GCA TTA AGG GGA CTA AGC CTC AAC TCC AAC AGG CTG ACA GTT CTT 144Thr Ala Leu Arg Gly Leu Ser Leu Asn Ser Asn Arg Leu Thr Val Leu35 40 45TCT CAC AAT GAT TTA CCT GCT AAT TTA GAG ATC CTG GAC ATA TCC AGG 192Ser His Asn Asp Leu Pro Ala Asn Leu Glu Ile Leu Asp Ile Ser Arg50 55 60AAC CAG CTC CTA GCT CCT AAT CCT GAT GTA TTT GTA TCA CTT AGT GTC 240Asn Gln Leu Leu Ala Pro Asn Pro Asp Val Phe Val Ser Leu Ser Val65 70 75 80TTG GAT ATA ACT CAT AAC AAG TTC ATT TGT GAA TGT GAA CTT AGC ACT 288Leu Asp Ile Thr His Asn Lys Phe Ile Cys Glu Cys Glu Leu Ser Thr85 90 95TTT ATC AAT TGG CTT AAT CAC ACC AAT GTC ACT ATA GCT GGG CCT CCT 336Phe Ile Asn Trp Leu Asn His Thr Asn Val Thr Ile Ala Gly Pro Pro100 105 110GCA GAC ATA TAT TGT GTG TAC CCT GAC TCG TTC TCT GGG GTT TCC CTC 384Ala Asp Ile Tyr Cys Val Tyr Pro Asp Ser Phe Ser Gly Val Ser Leu115 120 125TTC TCT CTT TCC ACG GAA GGT TGT GAT GAA GAG GAA GTC TTA AAG TCC 432Phe Ser Leu Ser Thr Glu Gly Cys Asp Glu Glu Glu Val Leu Lys Ser130 135 140CTA AAG TTC TCC CTT TTC ATT GTA TGC ACT GTC ACT CTG ACT CTG TTC 480Leu Lys Phe Ser Leu Phe Ile Val Cys Thr Val Thr Leu Thr Leu Phe145 150 155 160CTC ATG ACC ATC CTC ACA GTC ACA AAG TTC CGG GGC TTC TGT TTT ATC 528Leu Met Thr Ile Leu Thr Val Thr Lys Phe Arg Gly Phe Cys Phe Ile165 170 175TGT TAT AAG ACA GCC CAG AGA CTG GTG TTC AAG GAC CAT CCC CAG GGC 576Cys Tyr Lys Thr Ala Gln Arg Leu Val Phe Lys Asp His Pro Gln Gly180 185 190ACA GAA CCT GAT ATG TAC AAA TAT GAT GCC TAT TTG TGC TTC AGC AGC 624Thr Glu Pro Asp Met Tyr Lys Tyr Asp Ala Tyr Leu Cys Phe Ser Ser195 200 205AAA GAC TTC ACA TGG GTG CAG AAT GCT TTG CTC AAA CAC CTG GAC ACT 672Lys Asp Phe Thr Trp Val Gln Asn Ala Leu Leu Lys His Leu Asp Thr210 215 220CAA TAC AGT GAC CAA AAC AGA TTC AAC CTG TGC TTT GAA GAA AGA GAC 720Gln Tyr Ser Asp Gln Asn Arg Phe Asn Leu Cys Phe Glu Glu Arg Asp225 230 235 240TTT GTC CCA GGA GAA AAC CGC ATT GCC AAT ATC CAG GAT GCC ATC TGG 768Phe Val Pro Gly Glu Asn Arg Ile Ala Asn Ile Gln Asp Ala Ile Trp245 250 255AAC AGT AGA AAG ATC GTT TGT CTT GTG AGC AGA CAC TTC CTT AGA GAT 816Asn Ser Arg Lys Ile Val Cys Leu Val Ser Arg His Phe Leu Arg Asp260 265 270GGC TGG TGC CTT GAA GCC TTC AGT TAT GCC CAG GGC AGG TGC TTA TCT 864Gly Trp Cys Leu Glu Ala Phe Ser Tyr Ala Gln Gly Arg Cys Leu Ser275 280 285GAC CTT AAC AGT GCT CTC ATC ATG GTG GTG GTT GGG TCC TTG TCC CAG 912Asp Leu Asn Ser Ala Leu Ile Met Val Val Val Gly Ser Leu Ser Gln290 295 300TAC CAG TTG ATG AAA CAT CAA TCC ATC AGA GGC TTT GTA CAG AAA CAG 960Tyr Gln Leu Met Lys His Gln Ser Ile Arg Gly Phe Val Gln Lys Gln305 310 315 320CAG TAT TTG AGG TGG CCT GAG GAT CTC CAG GAT GTT GGC TGG TTT CTT 1008Gln Tyr Leu Arg Trp Pro Glu Asp Leu Gln Asp Val Gly Trp Phe Leu325 330 335CAT AAA CTC TCT CAA CAG ATA CTA AAG AAA GAA AAG GAA AAG AAG AAA 1056His Lys Leu Ser Gln Gln Ile Leu Lys Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys340 345 350GAC AAT AAC ATT CCG TTG CAA ACT GTA GCA ACC ATC TCC TAATCAAAGG 1105Asp Asn Asn Ile Pro Leu Gln Thr Val Ala Thr Ile Ser355 360 365AGCAATTTCC AACTTATCTC AAGCCACAAA TAACTCTTCA CTTTGTATTT GCACCAAGTT1165ATCATTTTGG GGTCCTCTCT GGAGGTTTTT TTTTTCTTTT TGCTACTATG AAAACAACAT1225AAATCTCTCA ATTTTCGTAT CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA TGGCGGCCGC 1275(2)SEQ ID NO10的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度365個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO10Cys Trp Asp Val Phe Glu Gly Leu Ser His Leu Gln Val Leu Tyr Leu1 5 10 15Asn His Asn Tyr Leu Asn Ser Leu Pro Pro Gly Val Phe Ser His Leu20 25 30Thr Ala Leu Arg Gly Leu Ser Leu Asn Ser Asn Arg Leu Thr Val Leu35 40 45Ser His Asn Asp Leu Pro Ala Asn Leu Glu Ile Leu Asp Ile Ser Arg50 55 60Asn Gln Leu Leu Ala Pro Asn Pro Asp Val Phe Val Ser Leu Ser Val65 70 75 80Leu Asp Ile Thr His Asn Lys Phe Ile Cys Glu Cys Glu Leu Ser Thr85 90 95Phe Ile Asn Trp Leu Asn His Thr Asn Val Thr Ile Ala Gly Pro Pro100 105 110Ala Asp Ile Tyr Cys Val Tyr Pro Asp Ser Phe Ser Gly Val Ser Leu115 120 125Phe Ser Leu Ser Thr Glu Gly Cys Asp Glu Glu Glu Val Leu Lys Ser130 135 140Leu Lys Phe Ser Leu Phe Ile Val Cys Thr Val Thr Leu Thr Leu Phe145 150 155 160Leu Met Thr Ile Leu Thr Val Thr Lys Phe Arg Gly Phe Cys Phe Ile165 170 175Cys Tyr Lys Thr Ala Gln Arg Leu Val Phe Lys Asp His Pro Gln Gly180 185 190Thr Glu Pro Asp Met Tyr Lys Tyr Asp Ala Tyr Leu Cys Phe Ser Ser195 200 205Lys Asp Phe 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Arg Leu Ile Leu Ile Leu Phe Asn Ile Ile Leu-22 -20 -15 -10ATT TCC AAA CTC CTT GGG GCT AGA TGG TTT CCT AAA ACT CTG CCC TGT96Ile Ser Lys Leu Leu Gly Ala Arg Trp Phe Pro Lys Thr Leu Pro Cys-5 1 5 10GAT GTC ACT CTG GAT GTT CCA AAG AAC CAT GTG ATC GTG GAC TGC ACA 144Asp Val Thr Leu Asp Val Pro Lys Asn His Val Ile Val Asp Cys Thr15 20 25GAC AAG CAT TTG ACA GAA ATT CCT GGA GGT ATT CCC ACG AAC ACC ACG 192Asp Lys His Leu Thr Glu Ile Pro Gly Gly Ile Pro Thr Asn Thr Thr30 35 40AAC CTC ACC CTC ACC ATT AAC CAC ATA CCA GAC ATC TCC CCA GCG TCC 240Asn Leu Thr Leu Thr Ile Asn His Ile Pro Asp Ile Ser Pro Ala Ser45 50 55TTT CAC AGA CTG GAC CAT CTG GTA GAG ATC GAT TTC AGA TGC AAC TGT 288Phe His Arg Leu Asp His Leu Val Glu Ile Asp Phe Arg Cys Asn Cys60 65 70GTA CCT ATT CCA CTG GGG TCA AAA AAC AAC ATG TGC ATC AAG AGG CTG 336Val Pro Ile Pro Leu Gly Ser Lys Asn Asn Met Cys Ile Lys Arg Leu75 80 85 90CAG ATT AAA CCC AGA AGC TTT AGT GGA CTC ACT TAT TTA AAA TCC CTT 384Gln Ile Lys Pro Arg Ser Phe Ser Gly Leu Thr 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(D)其它信息/注釋＝“核苷酸278標(biāo)示為G，可以為G或C”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置445(D)其它信息/注釋＝“核苷酸445標(biāo)示為A，可以為A或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置572(D)其它信息/注釋＝“核苷酸572、593、600、607、617、622、631、640、646、653、719、755和861標(biāo)示為C；每個(gè)可以為A、C、G或T”(xi)順序描述SEQ ID NO17CAG TCT CTT TCC ACA TCC CAA ACT TTC TAT GAT GCT TAC ATT TCT TAT48Gln Ser Leu Ser Thr Ser Gln Thr Phe Tyr Asp Ala Tyr Ile Ser Tyr1 5 10 15GAC ACC AAA GAT GCC TCT GTT ACT GAC TGG GTG ATA AAT GAG CTG CGC96Asp Thr Lys Asp Ala Ser Val Thr Asp Trp Val Ile Asn Glu Leu Arg20 25 30TAC CAC CTT GAA GAG AGC CGA GAC AAA AAC GTT CTC CTT TGT CTA GAG 144Tyr His Leu Glu Glu Ser Arg Asp Lys Asn Val Leu Leu Cys Leu Glu35 40 45GAG AGG GAT TGG GAC CCG GGA TTG GCC ATC ATC GAC AAC CTC ATG CAG 192Glu Arg Asp Trp Asp Pro Gly Leu Ala Ile Ile Asp Asn Leu Met Gln50 55 60AGC ATC AAC CAA AGC AAG AAA ACA GTA TTT GTT TTA ACC AAA AAA TAT 240Ser Ile Asn Gln Ser Lys Lys Thr Val Phe Val Leu Thr Lys Lys Tyr65 70 75 80GCA AAA AGC TGG AAC TTT AAA ACA GCT TTT TAC TTG GGC TTG CAG AGG 288Ala Lys Ser Trp Asn Phe Lys Thr Ala Phe Tyr Leu Gly Leu Gln Arg85 90 95CTA ATG GGT GAG AAC ATG GAT GTG ATT ATA TTT ATC CTG CTG GAG CCA 336Leu Met Gly Glu Asn Met Asp Val Ile Ile Phe Ile Leu Leu Glu Pro100 105 110GTG TTA CAG CAT TCT CCG TAT TTG AGG CTA CGG CAG CGG ATC TGT AAG 384Val Leu Gln His Ser Pro Tyr Leu Arg Leu Arg Gln Arg Ile Cys Lys115 120 125AGC TCC ATC CTC CAG TGG CCT GAC AAC CCG AAG GCA GAA AGG TTG TTT 432Ser Ser Ile Leu Gln Trp Pro Asp Asn Pro Lys Ala Glu Arg Leu Phe130 135 140TGG CAA ACT CTG AGA AAT GTG GTC TTG ACT GAA AAT GAT TCA CGG TAT 480Trp Gln Thr Leu Arg Asn Val Val Leu Thr Glu Asn Asp Ser Arg Tyr145 150 155 160AAC AAT ATG TAT GTC GAT TCC ATT AAG CAA TAC TAACTGACGT TAAGTCATGA 533Asn Asn Met Tyr Val Asp Ser Ile Lys Gln Tyr165 170TTTCGCGCCA TAATAAAGAT GCAAAGGAAT GACATTTCCG TATTAGTTAT CTATTGCTAC 593GGTAACCAAA TTACTCCCAA AAACCTTACG TCGGTTTCAA AACAACCACA TTCTGCTGGC 653CCCACAGTTT TTGAGGGTCA GGAGTCCAGG CCCAGCATAA CTGGGTCTTC TGCTTCAGGG 713TGTCTCCAGA GGCTGCAATG TAGGTGTTCA CCAGAGACAT AGGCATCACT GGGGTCACAC 773TCCATGTGGT TGTTTTCTGG ATTCAATTCC TCCTGGGCTA TTGGCCAAAG GCTATACTCA 833TGTAAGCCAT GCGAGCCTAT CCCACAACGG CAGCTTGCTT CATCAGAGCT AGCAAAAAAG 893AGAGGTTGCT AGCAAGATGA AGTCACAATC TTTTGTAATC GAATCAAAAA AGTGATATCT 953CATCACTTTG GCCATATTCT ATTTGTTAGA AGTAAACCAC AGGTCCCACC AGCTCCATGG1013GAGTGACCAC CTCAGTCCAG GGAAAACAGC TGAAGACCAA GATGGTGAGC TCTGATTGCT1073TCAGTTGGTC ATCAACTATT TTCCCTTGAC TGCTGTCCTG GGATGGCCGG CTATCTTGAT1133GGATAGATTG TGAATATCAG GAGGCCAGGG ATCACTGTGG ACCATCTTAG CAGTTGACCT1193AACACATCTT CTTTTCAATA TCTAAGAACT TTTGCCACTG TGACTAATGG TCCTAATATT1253AAGCTGTTGT TTATATTTAT CATATATCTA TGGCTACATG GTTATATTAT GCTGTGGTTG1313CGTTCGGTTT TATTTACAGT TGCTTTTACA AATATTTGCT GTAACATTTG ACTTCTAAGG1373TTTAGATGCC ATTTAAGAAC TGAGATGGAT AGCTTTTAAA GCATCTTTTA CTTCTTACCA1433TTTTTTAAAA GTATGCAGCT AAATTCGAAG CTTTTGGTCT ATATTGTTAA TTGCCATTGC1493TGTAAATCTT AAAATGAATG AATAAAAATG TTTCATTTTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1553AAAA 1557(2)SEQ ID NO18的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度171個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO18Gln Ser Leu Ser Thr Ser Gln Thr Phe Tyr Asp Ala Tyr Ile Ser Tyr1 5 10 15Asp Thr Lys Asp Ala Ser Val Thr Asp Trp Val Ile Asn Glu Leu Arg20 25 30Tyr His Leu Glu Glu Ser Arg Asp Lys Asn Val Leu Leu Cys Leu Glu35 40 45Glu Arg Asp Trp Asp Pro Gly Leu Ala Ile Ile Asp Asn Leu Met Gln50 55 60Ser Ile Asn Gln Ser Lys Lys Thr Val Phe Val Leu Thr Lys Lys Tyr65 70 75 80Ala Lys Ser Trp Asn Phe Lys Thr Ala Phe Tyr Leu Gly Leu Gln Arg85 90 95Leu Met Gly Glu Asn Met Asp Val Ile Ile Phe Ile Leu Leu Glu Pro100 105 110Val Leu Gln His Ser Pro Tyr Leu Arg Leu Arg Gln Arg Ile Cys Lys115 120 125Ser Ser Ile Leu Gln Trp Pro Asp Asn Pro Lys Ala Glu Arg Leu Phe130 135 140Trp Gln Thr Leu Arg Asn Val Val Leu Thr Glu Asn Asp Ser Arg Tyr145 150 155 160Asn Asn Met Tyr Val Asp Ser Ile Lys Gln Tyr165 170(2)SEQ ID NO19的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度629個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置l...486(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置144(D)其它信息/注釋＝“核苷酸144和225標(biāo)示為C；可以為C或T”(xi)順序描述SEQ ID NO19AAT GAA TTG ATC CCC AAT CTA GAG AAG GAA GAT GGT TCT ATC TTG ATT48Asn Glu Leu Ile Pro Asn Leu Glu Lys Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ile1 5 10 15TGC CTT TAT GAA AGC TAC TTT GAC CCT GGC AAA AGC ATT AGT GAA AAT96Cys Leu Tyr Glu Ser Tyr Phe Asp Pro Gly Lys Ser Ile Ser Glu Asn20 25 30ATT GTA AGC TTC ATT GAG AAA AGC TAT AAG TCC ATC TTT GTT TTG TCC 144Ile Val Ser Phe Ile Glu Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser35 40 45CCC AAC TTT GTC CAG AAT GAG TGG TGC CAT TAT GAA TTC TAC TTT GCC 192Pro Asn Phe Val Gln Asn Glu Trp Cys His Tyr Glu Phe Tyr Phe Ala50 55 60CAC CAC AAT CTC TTC CAT GAA AAT TCT GAT CAC ATA ATT CTT ATC TTA 240His His Asn Leu Phe His Glu Asn Ser Asp His Ile Ile Leu Ile Leu65 70 75 80CTG GAA CCC ATT CCA TTC TAT TGC ATT CCC ACC AGG TAT CAT AAA CTG 288Leu Glu Pro Ile Pro Phe Tyr Cys Ile Pro Thr Arg Tyr His Lys Leu85 90 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NO22的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度142個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO22Lys Asn Ser Lys Glu Asn Leu Gln Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser1 5 10 15Glu His Asp Ser Ala Trp Val Lys Ser Glu Leu Val Pro Tyr Leu Glu20 25 30Lys Glu Asp Ile Gln Ile Cys Leu His Glu Arg Asn Phe Val Pro Gly35 40 45Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile Ile Asn Cys Ile Glu Lys Ser Tyr Lys50 55 60Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Ser Glu Trp Cys His65 70 75 80Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His Glu Gly Ser Asn85 90 95Asn Leu Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Gln Asn Ser Ile Pro100 105 110Asn Lys Tyr His Lys Leu Lys Ala Leu Met Thr Gln Arg Thr Tyr Leu115 120 125Gln Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala130 135 140(2)SEQ ID NO23的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度662個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...627(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置54(D)其它信息/注釋＝“核苷酸54、103和345標(biāo)示為A；每個(gè)可以為A或G”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置313(D)其它信息/注釋＝“核苷酸313標(biāo)示為G；可以為G或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置316(D)其它信息/注釋＝“核苷酸316、380、407和408標(biāo)示為C；可以為A、C、G或T”(xi)順序描述SEQ ID NO23GCT TCC ACC TGT GCC TGG CCT GGC TTC CCT GGC GGG GGC GGC AAA GTG48Ala Ser Thr Cys Ala Trp Pro Gly Phe Pro Gly Gly Gly Gly Lys Val1 5 10 15GGC GAA ATG AGG ATG CCC TGC CCT ACG ATG CCT TCG TGG TCT TCG ACA96Gly Glu Met Arg Met Pro Cys Pro Thr Met Pro Ser Trp Ser Ser Thr20 25 30AAA CGC AGA GCG CAG TGG CAG ACT GGG TGT ACA ACG AGC TTC GGG GGC 144Lys Arg Arg Ala Gln Trp Gln Thr Gly Cys Thr Thr Ser Phe Gly Gly35 40 45AGC TGG AGG AGT GCC GTG GGC GCT GGG CAC TCC GCC TGT GCC TGG AGG 192Ser Trp Arg Ser Ala Val Gly Ala Gly His Ser Ala Cys Ala Trp Arg50 55 60AAC GCG ACT GGC TGC CTG GCA AAA CCC TCT TTG AGA ACC TGT GGG CCT 240Asn Ala Thr Gly Cys Leu Ala Lys Pro Ser Leu Arg Thr Cys Gly Pro65 70 75 80CGG TCT ATG GCA GCC GCA AGA CGC TGT TTG TGC TGG CCC ACA CGG ACC 288Arg Ser Met Ala Ala Ala Arg Arg Cys Leu Cys Trp Pro Thr Arg Thr85 90 95GGG TCA GTG GTC TCT TGC GCG CCA GTT CTC CTG CTG GCC CAG CAG CGC 336Gly Ser Val Val Ser Cys Ala Pro Val Leu Leu Leu Ala Gln Gln Arg100 105 110CTG CTG GAA GAC CGC AAG GAC GTC GTG GTG CTG GTG ATC CTA ACG CCT 384Leu Leu Glu Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Pro115 120 125GAC GGC CAA GCC TCC CGA CTA CCC GAT GCG CTG ACC AGC GCC TCT GCC 432Asp Gly Gln Ala Ser Arg Leu Pro Asp Ala Leu Thr Ser Ala Ser Ala130 135 140GCC AGA GTG TCC TCC TCT GGC CCC ACC AGC CCA GTG GTC GCG CAG CTT 480Ala Arg Val Ser Ser Ser Gly Pro Thr Ser Pro Val Val Ala Gln Leu145 150 155 160CTG AGG CCA GCA TGC ATG GCC CTG ACC AGG GAC AAC CAC CAC TTC TAT 528Leu Arg Pro Ala Cys Met Ala Leu Thr Arg Asp Asn His His Phe Tyr165 170 175AAC CGG AAC TTC TGC CAG GGA ACC CAC GGC CGA ATA GCC GTG AGC CGG 576Asn Arg Asn Phe Cys Gln Gly Thr His Gly Arg Ile Ala Val Ser Arg180 185 190AAT CCT GCA CGG TGC CAC CTC CAC ACA CAC CTA ACA TAT GCC TGC CTG 624Asn Pro Ala Arg Cys His Leu His Thr His Leu Thr Tyr Ala Cys Leu195 200 205ATC TGACCAACAC ATGCTCGCCA CCCTCACCAC ACACC662Ile(2)SEQ ID NO24的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度209個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO24Ala Ser Thr Cys Ala Trp Pro Gly Phe Pro Gly Gly Gly Gly Lys Val1 5 10 15Gly Glu Met Arg Met Pro Cys Pro Thr Met Pro Ser Trp Ser Ser Thr20 25 30Lys Arg Arg Ala Gln Trp Gln Thr Gly Cys Thr Thr Ser Phe Gly Gly35 40 45Ser Trp Arg Ser Ala Val Gly Ala Gly His Ser Ala Cys Ala Trp Arg50 55 60Asn Ala Thr Gly Cys Leu Ala Lys Pro Ser Leu Arg Thr Cys Gly Pro65 70 75 80Arg Ser Met Ala Ala Ala Arg Arg Cys Leu Cys Trp Pro Thr Arg Thr85 90 95Gly Ser Val Val Ser Cys Ala Pro Val Leu Leu Leu Ala Gln Gln Arg100 105 110Leu Leu Glu Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Pro115 120 125Asp Gly Gln Ala Ser Arg Leu Pro Asp Ala Leu Thr Ser Ala Ser Ala130 135 140Ala Arg Val Ser Ser Ser Gly Pro Thr Ser Pro Val Val Ala Gln Leu145 150 155 160Leu Arg Pro Ala Cys Met Ala Leu Thr Arg Asp Asn His His Phe Tyr165 170 175Asn Arg Asn Phe Cys Gln Gly Thr His Gly Arg Ile Ala Val Ser Arg180 185 190Asn Pro Ala Arg Cys His Leu His Thr His Leu Thr Tyr Ala Cys Leu195 200 205Ile(2)SEQ ID NO25的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度4865個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置107...2617(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置173...2617(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置81(D)其它信息/注釋＝“核苷酸81、3144、3205和3563標(biāo)示為A，每個(gè)可以為A、C、G或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置84(D)其它信息/注釋＝“核苷酸84標(biāo)示為C，可以為C或G”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置739(D)其它信息/注釋＝“核苷酸739標(biāo)示為C，可以為C或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置3132(D)其它信息/注釋＝“核苷酸3132、3532、3538和3553標(biāo)示為G，每個(gè)可以為G或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置3638(D)其它信息/注釋＝“核苷酸A，可以為A或T”
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置3677(D)其它信息/注釋＝“核苷酸3677、3685和3736標(biāo)示為C，每個(gè)可以為A或C”(xi)順序描述SEQ ID NO25AAAATACTCC CTTGCCTCAA AAACTGCTCG GTCAAACGGT GATAGCAAAC CACGCATTCA 60CAGGGCCACT GCTGCTCACA AAACCAGTGA GGATGATGCC AGGATG ATG TCT GCC115Met Ser Ala-22 -20TCG CGC CTG GCT GGG ACT CTG ATC CCA GCC ATG GCC TTC CTC TCC TGC 163Ser Arg Leu Ala Gly Thr Leu Ile Pro Ala Met Ala Phe Leu Ser Cys-15 -10 -5GTG AGA CCA GAA AGC TGG GAG CCC TGC GTG GAG GTT CCT AAT ATT ACT 211Val Arg Pro Glu Ser Trp Glu Pro Cys Val Glu Val Pro Asn Ile Thr1 5 10TAT CAA TGC ATG GAG CTG AAT TTC TAC AAA ATC CCC GAC AAC CTC CCC 259Tyr Gln Cys Met Glu Leu Asn Phe Tyr Lys Ile Pro Asp Asn Leu Pro15 20 25TTC TCA ACC AAG AAC CTG GAC CTG AGC TTT AAT CCC CTG AGG CAT TTA 307Phe Ser Thr Lys Asn Leu Asp Leu Ser Phe Asn Pro Leu Arg His Leu30 35 40 45GGC AGC TAT AGC TTC TTC AGT TTC CCA GAA CTG CAG GTG CTG GAT TTA 355Gly Ser Tyr Ser Phe Phe Ser Phe Pro Glu Leu Gln Val Leu Asp Leu50 55 60TCC AGG TGT GAA ATC CAG ACA ATT GAA GAT GGG GCA 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739Leu His Gln Met Pro Leu Leu Asn Leu Ser Leu Asp Leu Ser Leu Asn175 180 185CCT ATG AAC TTT ATC CAA CCA GGT GCA TTT AAA GAA ATT AGG CTT CAT 787Pro Met Asn Phe Ile Gln Pro Gly Ala Phe Lys Glu Ile Arg Leu His190 195 200 205AAG CTG ACT TTA AGA AAT AAT TTT GAT AGT TTA AAT GTA ATG AAA ACT 835Lys Leu Thr Leu Arg Asn Asn Phe Asp Ser Leu Asn Val Met Lys Thr210 215 220TGT ATT CAA GGT CTG GCT GGT TTA GAA GTC CAT CGT TTG GTT CTG GGA 883Cys Ile Gln Gly Leu Ala Gly Leu Glu Val His Arg Leu Val Leu Gly225 230 235GAA TTT AGA AAT GAA GGA AAC TTG GAA AAG TTT GAC AAA TCT GCT CTA 931Glu Phe Arg Asn Glu Gly Asn Leu Glu Lys Phe Asp Lys Ser Ala Leu240 245 250GAG GGC CTG TGC AAT TTG ACC ATT GAA GAA TTC CGA TTA GCA TAC TTA 979Glu Gly Leu Cys Asn Leu Thr Ile Glu Glu Phe Arg Leu Ala Tyr Leu255 260265GAC TAC TAC CTC GAT GAT ATT ATT GAC TTA TTT AAT TGT TTG ACA AAT 1027Asp Tyr Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Asp Leu Phe Asn Cys Leu Thr Asn270 275 280 285GTT TCT TCA TTT TCC CTG GTG AGT GTG ACT ATT GAA AGG GTA AAA GAC 1075Val Ser Ser Phe Ser Leu Val Ser Val Thr Ile Glu Arg Val Lys Asp290 295 300TTT TCT TAT AAT TTC GGA TGG CAA CAT TTA GAA TTA GTT AAC TGT AAA 1123Phe Ser Tyr Asn Phe Gly Trp Gln His Leu Glu Leu Val Asn Cys Lys305 310 315TTT GGA CAG TTT CCC ACA TTG AAA CTC AAA TCT CTC AAA AGG CTT ACT 117lPhe Gly Gln Phe Pro Thr Leu Lys Leu Lys Ser Leu Lys Arg Leu Thr320 325 330TTC ACT TCC AAC AAA GGT GGG AAT GCT TTT TCA GAA GTT GAT CTA CCA 1219Phe Thr Ser Asn Lys Gly Gly Asn Ala Phe Ser Glu Val Asp Leu Pro335 340 345AGC CTT GAG TTT CTA GAT CTC AGT AGA AAT GGC TTG AGT TTC AAA GGT 1267Ser Leu Glu Phe Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gly Leu Ser Phe Lys Gly350 355 360 365TGC TGT TCT CAA AGT GAT TTT GGG ACA ACC AGC CTA AAG TAT TTA GAT 1315Cys Cys Ser Gln Ser Asp Phe Gly Thr Thr Ser Leu Lys Tyr Leu Asp370 375 380CTG AGC TTC AAT GGT GTT ATT ACC ATG AGT TCA AAC TTC TTG GGC TTA 1363Leu Ser Phe Asn Gly Val Ile Thr Met Ser Ser Asn Phe Leu Gly Leu385 390 395GAA CAA CTA GAA CAT CTG GAT TTC CAG CAT TCC AAT TTG AAA CAA ATG 1411Glu Gln Leu Glu His Leu Asp Phe Gln His Ser Asn Leu Lys Gln Met400 405 410AGT GAG TTT TCA GTA TTC CTA TCA CTC AGA AAC CTC ATT TAC CTT GAC 1459Ser Glu Phe Ser Val Phe Leu Ser Leu Arg Asn Leu Ile Tyr Leu Asp415 420 425ATT TCT CAT ACT CAC ACC AGA GTT GCT TTC AAT GGC ATC TTC AAT GGC 1507Ile Ser His Thr His Thr Arg Val Ala Phe Asn Gly Ile Phe Asn Gly430 435 440 445TTG TCC AGT CTC GAA GTC TTG AAA ATG GCT GGC AAT TCT TTC CAG GAA 1555Leu Ser Ser Leu Glu Val Leu Lys Met Ala Gly Asn Ser Phe Gln Glu450 455 460AAC TTC CTT CCA GAT ATC TTC ACA GAG CTG AGA AAC TTG ACC TTC CTG 1603Asn Phe Leu Pro Asp Ile Phe Thr Glu Leu Arg Asn Leu Thr Phe Leu465 470 475GAC CTC TCT CAG TGT CAA CTG GAG CAG TTG TCT CCA ACA GCA TTT AAC 1651Asp Leu Ser Gln Cys Gln Leu Glu Gln Leu Ser Pro Thr Ala Phe Asn480 485 490TCA CTC TCC AGT CTT CAG GTA CTA AAT ATG AGC CAC AAC AAC TTC TTT 1699Ser Leu Ser Ser Leu Gln Val Leu Asn Met Ser His Asn Asn Phe Phe495 500 505TCA TTG GAT ACG TTT CCT TAT AAG TGT CTG AAC TCC CTC CAG GTT CTT 1747Ser Leu Asp Thr Phe Pro Tyr Lys Cys Leu Asn Ser Leu Gln Val Leu510 515 520 525GAT TAC AGT CTC AAT CAC ATA ATG ACT TCC AAA AAA CAG GAA CTA CAG 1795Asp Tyr Ser Leu Asn His Ile Met Thr Ser Lys Lys Gln Glu Leu Gln530 535 540CAT TTT CCA AGT AGT CTA GCT TTC TTA AAT CTT ACT CAG AAT GAC TTT 1843His Phe Pro Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu Thr Gln Asn Asp Phe545 550 555GCT TGT ACT TGT GAA CAC CAG AGT TTC CTG CAA TGG ATC AAG GAC CAG 1891Ala Cys Thr Cys Glu His Gln Ser Phe Leu Gln Trp Ile Lys Asp Gln560 565 570AGG CAG CTC TTG GTG GAA GTT GAA CGA ATG GAA TGT GCA ACA CCT TCA 1939Arg Gln Leu Leu Val Glu Val Glu Arg Met Glu Cys Ala Thr Pro Ser575 580 585GAT AAG CAG GGC ATG CCT GTG CTG AGT TTG AAT ATC ACC TGT CAG ATG 1987Asp Lys Gln Gly Met Pro Val Leu Ser Leu Asn Ile Thr Cys Gln Met590 595 600 605AAT AAG ACC ATC ATT GGT GTG TCG GTC CTC AGT GTG CTT GTA GTA TCT 2035Asn Lys Thr Ile Ile Gly Val Ser Val Leu Ser Val Leu Val Val Ser610 615 620GTT GTA GCA GTT CTG GTC TAT AAG TTC TAT TTT CAC CTG ATG CTT CTT 2083Val Val Ala Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu Met Leu Leu625 630 635GCT GGC TGC ATA AAG TAT GGT AGA GGT GAA AAC ATC TAT GAT GCC TTT 2131Ala Gly Cys Ile Lys Tyr Gly Arg Gly Glu Asn Ile Tyr Asp Ala Phe640 645 650GTT ATC TAC TCA AGC CAG GAT GAG GAC TGG GTA AGG AAT GAG CTA GTA 2179Val Ile Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp Val Arg Asn Glu Leu Val655 660 665AAG AAT TTA GAA GAA GGG GTG CCT CCA TTT CAG CTC TGC CTT CAC TAC 2227Lys Asn Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe Gln Leu Cys Leu His Tyr670 675 680 685AGA GAC TTT ATT CCC GGT GTG GCC ATT GCT GCC AAC ATC ATC CAT GAA 2275Arg Asp Phe Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala Ala Asn Ile Ile His Glu690 695 700GGT TTC CAT AAA AGC CGA AAG GTG ATT GTT GTG GTG TCC CAG CAC TTC 2323Gly Phe His Lys Ser Arg Lys Val Ile Val Val Val Ser Gln His Phe705 710 715ATC CAG AGC CGC TGG TGT ATC TTT GAA TAT GAG ATT GCT CAG ACC TGG 2371Ile Gln Ser Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr Glu Ile Ala Gln Thr Trp720 725 730CAG TTT CTG AGC AGT CGT GCT GGT ATC ATC TTC ATT GTC CTG CAG 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GTTGAATAAA2907GACAGAGAAA ACAGAAAGAG ACATTGTTCT TTTCCTGAGT CTTTTGAATG GAAATTGTAT2967TATGTTATAG CCATCATAAA ACCATTTTGG TAGTTTTGAC TGAACTGGGT GTTCACTTTT3027TCCTTTTTGA TTGAATACAA TTTAAATTCT ACTTGATGAC TGCAGTCGTC AAGGGGCTCC3087TGATGCAAGA TGCCCCTTCC ATTTTAAGTC TGTCTCCTTA CAGAGGTTAA AGTCTAATGG3147CTAATTCCTA AGGAAACCTG ATTAACACAT GCTCACAACC ATCCTGGTCA TTCTCGAACA3207TGTTCTATTT TTTAACTAAT CACCCCTGAT ATATTTTTAT TTTTATATAT CCAGTTTTCA3267TTTTTTTACG TCTTGCCTAT AAGCTAATAT CATAAATAAG GTTGTTTAAG ACGTGCTTCA3327AATATCCATA TTAACCACTA TTTTTCAAGG AAGTATGGAA AAGTACACTC TGTCACTTTG3387TCACTCGATG TCATTCCAAA GTTATTGCCT ACTAAGTAAT GACTGTCATG AAAGCAGCAT3447TGAAATAATT TGTTTAAAGG GGGCACTCTT TTAAACGGGA AGAAAATTTC CGCTTCCTGG3507TCTTATCATG GACAATTTGG GCTAGAGGCA GGAAGGAAGT GGGATGACCT CAGGAAGTCA3567CCTTTTCTTG ATTCCAGAAA CATATGGGCT GATAAACCCG GGGTGACCTC ATGAAATGAG3627TTGCAGCAGA AGTTTATTTT TTTCAGAACA AGTGATGTTT GATGGACCTC TGAATCTCTT3687TAGGGAGACA CAGATGGCTG GGATCCCTCC CCTGTACCCT TCTCACTGCC AGGAGAACTA3747CGTGTGAAGG TATTCAAGGC AGGGAGTATA CATTGCTGTT TCCTGTTGGG CAATGCTCCT3807TGACCACATT TTGGGAAGAG TGGATGTTAT CATTGAGAAA ACAATGTGTC TGGAATTAAT3867GGGGTTCTTA TAAAGAAGGT TCCCAGAAAA GAATGTTCAT TCCAGCTTCT TCAGGAAACA3927GGAACATTCA AGGAAAAGGA CAATCAGGAT GTCATCAGGG AAATGAAAAT AAAAACCACA3987ATGAGATATC ACCTTATACC AGGTAGATGG CTACTATAAA AAAATGAAGT GTCATCAAGG4047ATATAGAGAA ATTGGAACCC TTCTTCACTG CTGGAGGGAA TGGAAAATGG TGTAGCCGTT4107ATGAAAAACA GTACGGAGGT TTCTCAAAAA TTAAAAATAG AACTGCTATA TGATCCAGCA4167ATCTCACTTC TGTATATATA CCCAAAATAA TTGAAATCAG AATTTCAAGA AAATATTTAC4227ACTCCCATGT TCATTGTGGC ACTCTTCACA ATCACTGTTT CCAAAGTTAT GGAAACAACC4287CAAATTTCCA TTGGAAAATA AATGGACAAA GGAAATGTGC ATATAACGTA CAATGGGGAT4347ATTATTCAGC CTAAAAAAAG GGGGGATCCT GTTATTTATG ACAACATGAA TAAACCCGGA4407GGCCATTATG CTATGTAAAA TGAGCAAGTA ACAGAAAGAC AAATACTGCC TGATTTCATT4467TATATGAGGT TCTAAAATAG TCAAACTCAT AGAAGCAGAG AATAGAACAG TGGTTCCTAG4527GGAAAAGGAG GAAGGGAGAA ATGAGGAAAT AGGGAGTTGT CTAATTGGTA TAAAATTATA4587GTATGCAAGA TGAATTAGCT CTAAAGATCA GCTGTATAGC 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Ser Leu Glu Asn Phe Pro Ile110 115 120Gly His Leu Lys Thr Leu Lys Glu Leu Asn Val Ala His Asn Leu Ile125 130 135Gln Ser Phe Lys Leu Pro Glu Tyr Phe Ser Asn Leu Thr Asn Leu Glu140 145 150His Leu Asp Leu Ser Ser Asn Lys Ile Gln Ser Ile Tyr Cys Thr Asp155 160 165 170Leu Arg Val Leu His Gln Met Pro Leu Leu Asn Leu Ser Leu Asp Leu175 180 185Ser Leu Asn Pro Met Asn Phe Ile Gln Pro Gly Ala Phe Lys Glu Ile190 195 200Arg Leu His Lys Leu Thr Leu Arg Asn Asn Phe Asp Ser Leu Asn Val205210 215Met Lys Thr Cys Ile Gln Gly Leu Ala Gly Leu Glu Val His Arg Leu220 225 230Val Leu Gly Glu Phe Arg Asn Glu Gly Asn Leu Glu Lys Phe Asp Lys235 240 245 250Ser Ala Leu Glu Gly Leu Cys Asn Leu Thr Ile Glu Glu Phe Arg Leu255 260 265Ala Tyr Leu Asp Tyr Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Asp Leu Phe Asn Cys270 275 280Leu Thr Asn Val Ser Ser Phe Ser Leu Val Ser Val Thr Ile Glu Arg285 290 295Val Lys Asp Phe Ser Tyr Asn Phe Gly Trp Gln His Leu Glu Leu Val300 305 310Asn Cys Lys Phe Gly Gln Phe Pro Thr Leu Lys Leu Lys Ser Leu Lys315 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Pro Ser Ser Leu Ala Phe Leu Asn Leu Thr Gln540 545 550Asn Asp Phe Ala Cys Thr Cys Glu His Gln Ser Phe Leu Gln Trp Ile555 560 565 570Lys Asp Gln Arg Gln Leu Leu Val Glu Val Glu Arg Met Glu Cys Ala575 580 585Thr Pro Ser Asp Lys Gln Gly Met Pro Val Leu Ser Leu Asn Ile Thr590 595 600Cys Gln Met Asn Lys Thr Ile Ile Gly Val Ser Val Leu Ser Val Leu605 610 615Val Val Ser Val Val Ala Val Leu Val Tyr Lys Phe Tyr Phe His Leu620 625 630Met Leu Leu Ala Gly Cys Ile Lys Tyr Gly Arg Gly Glu Asn Ile Tyr635 640 645 650Asp Ala Phe Val Ile Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp Val Arg Asn655 660 665Glu Leu Val Lys Asn Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe Gln Leu Cys670 675 680Leu His Tyr Arg Asp Phe Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala Ala Asn Ile685 690 695Ile His Glu Gly Phe His Lys Ser Arg Lys Val Ile Val Val Val Ser700 705 710Gln His Phe Ile Gln Ser Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr Glu Ile Ala715 720 725 730Gln Thr Trp Gln Phe Leu Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile Phe Ile Val735 740 745Leu Gln Lys Val Glu Lys Thr Leu Leu Arg Gln Gln Val Glu Leu Tyr750 755 760Arg Leu Leu Ser Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Glu Asp Ser Val Leu765 770 775Gly Arg His Ile Phe Trp Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu Leu Asp Gly780 785 790Lys Ser Trp Asn Pro Glu Gly Thr Val Gly Thr Gly Cys Asn Trp Gln795 800 805 810Glu Ala Thr Ser Ile815(2)SEQ ID NO27的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度300個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...300(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置186(D)其它信息/注釋＝“核苷酸186、196、217、276和300標(biāo)示為C，每個(gè)可以為A、C、G或T”(xi)順序描述SEQ ID NO27TCC TAT TCT ATG GAA AAA GAT GCT TTC CTA TTT ATG AGA AAT TTG AAG48Ser Tyr Ser Met Glu Lys Asp Ala Phe Leu Phe Met Arg Asn Leu Lys1 5 10 15GTT CTC TCA CTA AAA GAT AAC AAT GTC ACA GCT GTC CCC ACC ACT TTG96Val Leu Ser Leu Lys Asp Asn Asn Val Thr Ala Val Pro Thr Thr Leu20 25 30CCA CCT AAT TTA CTA GAG CTC TAT CTT TAT AAC AAT ATC ATT AAG AAA 144Pro Pro Asn Leu Leu Glu Leu Tyr Leu Tyr Asn Asn Ile Ile Lys Lys35 40 45ATC CAA GAA AAT GAT TTC AAT AAC CTC AAT GAG TTG CAA GTC CTT GAC 192Ile Gln Glu Asn Asp Phe Asn Asn Leu Asn Glu Leu Gln Val Leu Asp50 55 60CTA CGT GGA AAT TGC CCT CGA TGT CAT AAT GTC CCA TAT CCG TGT ACA 240Leu Arg Gly Asn Cys Pro Arg Cys His Asn Val Pro Tyr Pro Cys Thr65 70 75 80CCG TGT GAA AAT AAT TCC CCC TTA CAG ATC CAT GAC AAT GCT TTC AAT 288Pro Cys Glu Asn Asn Ser Pro Leu Gln Ile His Asp Asn Ala Phe Asn85 90 95TCA TCG ACA GAC 300Ser Ser Thr Asp100(2)SEQ ID NO28的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度100個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO28Ser Tyr Ser Met Glu Lys Asp Ala Phe Leu Phe Met Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Val Leu Ser Leu Lys Asp Asn Asn Val Thr Ala Val Pro Thr Thr Leu20 25 30Pro Pro Asn Leu Leu Glu Leu Tyr Leu Tyr Asn Asn Ile Ile Lys Lys35 40 45Ile Gln Glu Asn Asp Phe Asn Asn Leu Asn Glu Leu Gln Val Leu Asp50 55 60Leu Arg Gly Asn Cys Pro Arg Cys His Asn Val Pro Tyr Pro Cys Thr65 70 75 80Pro Cys Glu Asn Asn Ser Pro Leu Gln Ile His Asp Asn Ala Phe Asn85 90 95Ser Ser Thr Asp100(2)SEQ ID NO29的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度1756個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...1182(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1643(D)其它信息/注釋＝“核苷酸1643標(biāo)示為A，可以為A或G”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1664(D)其它信息/注釋＝“核苷酸1664標(biāo)示為C，可以為A、C、G或T”
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1680(D)其它信息/注釋＝“核苷酸1680和1735標(biāo)示為G，可以為G或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1719(D)其它信息/注釋＝“核苷酸1719標(biāo)示為C，可以為C或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1727(D)其它信息/注釋＝“核苷酸1727標(biāo)示為A，可以為A、G或T”(xi)順序描述SEQ ID NO29TCT CCA GAA ATT CCC TGG AAT TCC TTG CCT CCT GAG GTT TTT GAG GGT48Ser Pro Glu Ile Pro Trp Asn Ser Leu Pro Pro Glu Val Phe Glu Gly1 5 10 15ATG CCG CCA AAT CTA AAG AAT CTC TCC TTG GCC AAA AAT GGG CTC AAA96Met Pro Pro Asn Leu Lys Asn Leu Ser Leu Ala Lys Asn Gly Leu Lys20 25 30TCT TTC TTT TGG GAC AGA CTC CAG TTA CTG AAG CAT TTG GAA ATT TTG 144Ser Phe Phe Trp Asp Arg Leu Gln Leu Leu Lys His Leu Glu Ile Leu35 40 45GAC CTC AGC CAT AAC CAG CTG ACA AAA GTA CCT GAG AGA TTG GCC AAC 192Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Thr Lys Val Pro Glu Arg Leu Ala Asn50 55 60TGT TCC AAA AGT CTC ACA ACA CTG ATT CTT AAG CAT AAT CAA ATC AGG 240Cys Ser Lys Ser Leu Thr Thr Leu Ile Leu Lys His Asn Gln Ile Arg65 70 75 80CAA TTG ACA AAA TAT TTT CTA GAA GAT GCT TTG CAA TTG CGC TAT CTA 288Gln Leu Thr Lys Tyr Phe Leu Glu Asp Ala Leu Gln Leu Arg Tyr Leu85 90 95GAC ATC AGT TCA AAT AAA ATC CAG GTC ATT CAG AAG ACT AGC TTC CCA 336Asp Ile Ser Ser Asn Lys Ile Gln Val Ile Gln Lys Thr Ser Phe Pro100 105 110GAA AAT GTC CTC AAC AAT CTG GAG ATG TTG GTT TTA CAT CAC AAT CGC 384Glu Asn Val Leu Asn Asn Leu Glu Met Leu Val Leu His His Asn Arg115 120 125TTT CTT TGC AAC TGT GAT GCT GTG TGG TTT GTC TGG TGG GTT AAC CAT 432Phe Leu Cys Asn Cys Asp Ala Val Trp Phe Val Trp Trp Val Asn His130 135 140ACA GAT GTT ACT ATT CCA TAC CTG GCC ACT GAT GTG ACT TGT GTA GGT 480Thr Asp Val Thr Ile Pro Tyr Leu Ala Thr Asp Val Thr Cys Val Gly145 150 155 160CCA GGA GCA CAC AAA GGT CAA AGT GTC ATA TCC CTT GAT CTG TAT ACG 528Pro Gly Ala His Lys Gly Gln Ser Val Ile Ser Leu Asp Leu Tyr Thr165 170 175TGT GAG TTA GAT CTC ACA AAC CTG ATT CTG TTC TCA GTT TCC ATA TCA 576Cys Glu Leu Asp Leu Thr Asn Leu Ile Leu Phe Ser Val Ser Ile Ser180 185 190TCA GTC CTC TTT CTT ATG GTA GTT ATG ACA ACA AGT CAC CTC TTT TTC 624Ser Val Leu Phe Leu Met Val Val Met Thr Thr Ser His Leu Phe Phe195 200 205TGG GAT ATG TGG TAC ATT TAT TAT TTT TGG AAA GCA AAG ATA AAG GGG 672Trp Asp Met Trp Tyr Ile Tyr Tyr Phe Trp Lys Ala Lys Ile Lys Gly210 215 220TAT CCA GCA TCT GCA ATC CCA TGG AGT CCT TGT TAT GAT GCT TTT ATT 720Tyr Pro Ala Ser Ala Ile Pro Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Ala Phe Ile225 230 235 240GTG TAT GAC ACT AAA AAC TCA GCT GTG ACA GAA TGG GTT TTG CAG GAG 768Val Tyr Asp Thr Lys Asn Ser Ala Val Thr Glu Trp Val Leu Gln Glu245 250 255CTG GTG GCA AAA TTG GAA GAT CCA AGA GAA AAA CAC TTC AAT TTG TGT 816Leu Val Ala Lys Leu Glu Asp Pro Arg Glu Lys His Phe Asn Leu Cys260 265 270CTA GAA GAA AGA GAC TGG CTA CCA GGA CAG CCA GTT CTA GAA AAC CTT 864Leu Glu Glu Arg Asp Trp Leu Pro Gly Gln Pro Val Leu Glu Asn Leu275 280 285TCC CAG AGC ATA CAG CTC AGC AAA AAG ACA GTG TTT GTG ATG ACA CAG 912Ser Gln Ser Ile Gln Leu Ser Lys Lys Thr Val Phe Val Met Thr Gln290 295 300AAA TAT GCT AAG ACT GAG AGT TTT AAG ATG GCA TTT TAT TTG TCT CAT 960Lys Tyr Ala Lys Thr Glu Ser Phe Lys Mer Ala Phe Tyr Leu Ser His305 310 315 320CAG AGG CTC CTG GAT GAA AAA GTG GAT GTG ATT ATC TTG ATA TTC TTG 1008Gln Arg Leu Leu Asp Glu Lys Val Asp Val Ile Ile Leu Ile Phe Leu325 330 335GAA AGA CCT CTT CAG AAG TCT AAG TTT CTT CAG CTC AGG AAG AGA CTC 1056Glu Arg Pro Leu Gln Lys Ser Lys Phe Leu Gln Leu Arg Lys Arg Leu340 345 350TGC AGG AGC TCT GTC CTT GAG TGG CCT GCA AAT CCA CAG GCT CAC CCA 1104Cys Arg Ser Ser Val Leu Glu Trp Pro Ala Asn Pro Gln Ala His Pro355 360 365TAC TTC TGG CAG TGC CTG AAA AAT GCC CTG ACC ACA GAC AAT CAT GTG 1152Tyr Phe Trp Gln Cys Leu Lys Asn Ala Leu Thr Thr Asp Asn His Val370 375 380GCT TAT AGT CAA ATG TTC AAG GAA ACA GTC TAGCTCTCTG AAGAATGTCA1202Ala Tyr Ser Gln Met Phe Lys Glu Thr Val385 390CCACCTAGGA CATGCCTTGG TACCTGAAGT TTTCATAAAG GTTTCCATAA ATGAAGGTCT1262GAATTTTTCC TAACAGTTGT CATGGCTCAG ATTGGTGGGA AATCATCAAT ATATGGCTAA1322GAAATTAAGA AGGGGAGACT GATAGAAGAT AATTTCTTTC TTCATGTGCC ATGCTCAGTT1382AAATATTTCC CCTAGCTCAA ATCTGAAAAA CTGTGCCTAG GAGACAACAC AAGGCTTTGA1442TTTATCTGCA TACAATTGAT AAGAGCCACA CATCTGCCCT GAAGAAGTAC TAGTAGTTTT1502AGTAGTAGGG TAAAAATTAC ACAAGCTTTC TCTCTCTCTG ATACTGAACT GTACCAGAGT1562TCAATGAAAT AAAAGCCCAG AGAACTTCTC AGTAAATGGT TTCATTATCA TGTAGTATCC1622ACCATGCAAT ATGCCACAAA ACCGCTACTG GTACAGGACA GCTGGTAGCT GCTTCAAGGC1682CTCTTATCAT TTTCTTGGGG CCCATGGAGG GGTTCTCTGG GAAAAAGGGA AGGTTTTTTT1742TGGCCATCCA TGAA 1756(2)SEQ ID NO30的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度394個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO30Ser Pro Glu Ile Pro Trp Asn Ser Leu Pro Pro Glu Val Phe Glu Gly1 5 10 15Met Pro Pro Asn Leu Lys Asn Leu Ser Leu Ala Lys Asn Gly Leu Lys20 25 30Ser Phe Phe Trp Asp Arg Leu Gln Leu Leu Lys His Leu Glu Ile Leu35 40 45Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Thr Lys Val Pro Glu Arg Leu Ala Asn50 55 60Cys Ser Lys Ser Leu Thr Thr Leu Ile Leu Lys His Asn Gln Ile Arg65 70 75 80Gln Leu Thr Lys Tyr Phe Leu Glu Asp Ala Leu Gln Leu Arg Tyr Leu85 90 95Asp Ile Ser Ser Asn Lys Ile Gln Val Ile Gln Lys Thr Ser Phe Pro100 105 110Glu Asn Val Leu Asn Asn Leu Glu Met Leu Val Leu His His Asn Arg115 120 125Phe Leu Cys Asn Cys Asp Ala Val Trp Phe Val Trp Trp Val Asn His130 135 140Thr Asp Val Thr Ile Pro Tyr Leu Ala Thr Asp Val Thr Cys Val Gly145 150 155 160Pro Gly Ala His Lys Gly Gln Ser Val Ile Ser Leu Asp Leu Tyr Thr165 170 175Cys Glu Leu Asp Leu Thr Asn Leu Ile Leu Phe Ser Val Ser Ile Ser180 185 190Ser Val Leu Phe Leu Met Val Val Met Thr Thr Ser His Leu Phe Phe195 200 205Trp Asp Met Trp Tyr Ile Tyr Tyr Phe Trp Lys Ala Lys Ile Lys Gly210 215 220Tyr Pro Ala Ser Ala Ile Pro Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Ala Phe Ile225 230 235 240Val Tyr Asp Thr Lys Asn Ser Ala Val Thr Glu Trp Val Leu Gln Glu245 250 255Leu Val Ala Lys Leu Glu Asp Pro Arg Glu Lys His Phe Asn Leu Cys260 265 270Leu Glu Glu Arg Asp Trp Leu Pro Gly Gln Pro Val Leu Glu Asn Leu275 280 285Ser Gln Ser Ile Gln Leu Ser Lys Lys Thr Val Phe Val Met Thr Gln290 295 300Lys Tyr Ala Lys Thr Glu Ser Phe Lys Met Ala Phe Tyr Leu Ser His305 310 315 320Gln Arg Leu Leu Asp Glu Lys Val Asp Val Ile Ile Leu Ile Phe Leu325 330 335Glu Arg Pro Leu Gln Lys Ser Lys Phe Leu Gln Leu Arg Lys Arg Leu340 345 350Cys Arg Ser Ser Val Leu Glu Trp Pro Ala Asn Pro Gln Ala His Pro355 360 365Tyr Phe Trp Gln Cys Leu Lys Asn Ala Leu Thr Thr Asp Asn His Val370 375 380Ala Tyr Ser Gln Met Phe Lys Glu Thr Val385 390(2)SEQ ID NO31的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度999個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2..847
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置4(D)其它信息/注釋＝“核苷酸4和23標(biāo)示為C，每個(gè)可以為A、C、G或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置650(D)其它信息/注釋＝“核苷酸650標(biāo)示為G，可以為A或G”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置715(D)其它信息/注釋＝“核苷酸715、825和845標(biāo)示為C，每個(gè)可以為C或T”(xi)順序描述SEQ ID NO31C TCC GAT GCC AAG ATT CGG CAC CAG GCA TAT TCA GAG GTC ATG ATG 46Ser Asp Ala Lys Ile Arg His Gln Ala Tyr Ser Glu Val Met Met1 5 10 15GTT GGA TGG TCA GAT TCA TAC ACC TGT GAA TAC CCT TTA AAC CTA AGG94Val Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Thr Cys Glu Tyr Pro Leu Asn Leu Arg20 25 30GGA ACT AGG TTA AAA GAC GTT CAT CTC CAC GAA TTA TCT TGC AAC ACA 142Gly Thr Arg Leu Lys Asp Val His Leu His Glu Leu Ser Cys Asn Thr35 40 45GCT CTG TTG ATT GTC ACC ATT GTG GTT ATT ATG CTA GTT CTG GGG TTG 190Ala Leu Leu Ile Val Thr Ile Val Val Ile Met Leu Val Leu Gly Leu50 55 60GCT GTG GCC TTC TGC TGT CTC CAC TTT GAT CTG CCC TGG TAT CTC AGG 238Ala Val Ala Phe Cys Cys Leu His Phe Asp Leu Pro Trp Tyr Leu Arg65 70 75ATG CTA GGT CAA TGC ACA CAA ACA TGG CAC AGG GTT AGG AAA ACA ACC 286Met Leu Gly Gln Cys Thr Gln Thr Trp His Arg Val Arg Lys Thr Thr80 85 90 95CAA GAA CAA CTC AAG AGA AAT GTC CGA TTC CAC GCA TTT ATT TCA TAC 334Gln Glu Gln Leu Lys Arg Asn Val Arg Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr100 105 110AGT GAA CAT GAT TCT CTG TGG GTG AAG AAT GAA TTG ATC CCC AAT CTA 382Ser Glu His Asp Ser Leu Trp Val Lys Asn Glu Leu Ile Pro Asn Leu115 120 125GAG AAG GAA GAT GGT TCT ATC TTG ATT TGC CTT TAT GAA AGC TAC TTT 430Glu Lys Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ile Cys Leu Tyr Glu Ser Tyr Phe130 135 140GAC CCT GGC AAA AGC ATT AGT GAA AAT ATT GTA AGC TTC ATT GAG AAA 478Asp Pro Gly Lys Ser Ile Ser Glu Asn Ile Val Ser Phe Ile Glu Lys145 150 155AGC TAT AAG TCC ATC TTT GTT TTG TCT CCC AAC TTT GTC CAG AAT GAG 526Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Asn Glu160 165 170 175TGG TGC CAT TAT GAA TTC TAC TTT GCC CAC CAC AAT CTC TTC CAT GAA 574Trp Cys His Tyr Glu Phe Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His Glu180 185 190AAT TCT GAT CAC ATA ATT CTT ATC TTA CTG GAA CCC ATT CCA TTC TAT 622Asn Ser Asp His Ile Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Phe Tyr195 200 205TGC ATT CCC ACC AGG TAT CAT AAA CTG GAA GCT CTC CTG GAA AAA AAA 670Cys Ile Pro Thr Arg Tyr His Lys Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Lys210 215 220GCA TAC TTG GAA TGG CCC AAG GAT AGG CGT AAA TGT GGG CTT TTC TGG 718Ala Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Asp Arg Arg Lys Cys Gly Leu Phe Trp225 230 235GCA AAC CTT CGA GCT GCT GTT AAT GTT AAT GTA TTA GCC ACC AGA GAA 766Ala Asn Leu Arg Ala Ala Val Asn Val Asn Val Leu Ala Thr Arg Glu240 245 250 255ATG TAT GAA CTG CAG ACA TTC ACA GAG TTA AAT GAA GAG TCT CGA GGT 814Met Tyr Glu Leu Gln Thr Phe Thr Glu Leu Asn Glu Glu Ser Arg Gly260 265 270TCT ACA ATC TCT CTG ATG AGA ACA GAC TGT CTA TAAAATCCCA CAGTCCTTGG 867Ser Thr Ile Ser Leu Met Arg Thr Asp Cys Leu275 280GAAGTTGGGG ACCACATACA CTGTTGGGAT GTACATTGAT ACAACCTTTA TGATGGCAAT 927TTGACAATAT TTATTAAAAT AAAAAATGGT TATTCCCTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 987AAAAAAAAAA AA 999(2)SEQ ID NO32的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度282個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO32Ser Asp Ala Lys Ile Arg His Gln Ala Tyr Ser Glu Val Met Met Val1 5 10 15Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Thr Cys Glu Tyr Pro Leu Asn Leu Arg Gly20 25 30Thr Arg Leu Lys Asp Val His Leu His Glu Leu Ser Cys Asn Thr Ala35 40 45Leu Leu Ile Val Thr Ile Val Val Ile Met Leu Val Leu Gly Leu Ala50 55 60Val Ala Phe Cys Cys Leu His Phe Asp Leu Pro Trp Tyr Leu Arg Met65 70 75 80Leu Gly Gln Cys Thr Gln Thr Trp His Arg Val Arg Lys Thr Thr Gln85 90 95Glu Gln Leu Lys Arg Asn Val Arg Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser100 105 110Glu His Asp Ser Leu Trp Val Lys Asn Glu Leu Ile Pro Asn Leu Glu115 120 125Lys Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ile Cys Leu Tyr Glu Ser Tyr Phe Asp130 135 140Pro Gly Lys Ser Ile Ser Glu Asn Ile Val Ser Phe Ile Glu Lys Ser145 150 155 160Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Asn Glu Trp165 170 175Cys His Tyr Glu Phe Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His Glu Asn180 185 190Ser Asp His Ile Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Phe Tyr Cys195 200 205Ile Pro Thr Arg Tyr His Lys Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Lys Ala210 215 220Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Asp Arg Arg Lys Cys Gly Leu Phe Trp Ala225 230 235 240Asn Leu Arg Ala Ala Val Asn Val Asn Val Leu Ala Thr Arg Glu Met245 250 255Tyr Glu Leu Gln Thr Phe Thr Glu Leu Asn Glu Glu Ser Arg Gly Ser260 265 270Thr Ile Ser Leu Met Arg Thr Asp Cys Leu275 280(2)SEQ ID NO33的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度1173個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1...1008(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置854(D)其它信息/注釋＝“核苷酸854標(biāo)示為A，可以為A或T”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc特征(B)位置1171(D)其它信息/注釋＝“核苷酸1171和1172標(biāo)示為C，每個(gè)可以為A、C、G或T”(xi)順序描述SEQ ID NO33CTG CCT GCT GGC ACC CGG CTC CGG AGG CTG GAT GTC AGC TGC AAC AGC48Leu Pro Ala Gly Thr Arg Leu Arg Arg Leu Asp Val Ser Cys Asn Ser1 5 10 15ATC AGC TTC GTG GCC CCC GGC TTC TTT TCC AAG GCC AAG GAG CTG CGA96Ile Ser Phe Val Ala Pro Gly Phe Phe Ser Lys Ala Lys Glu Leu Arg20 25 30GAG CTC AAC CTT AGC GCC AAC GCC CTC AAG ACA GTG GAC CAC TCC TGG 144Glu Leu Asn Leu Ser Ala Asn Ala Leu Lys Thr Val Asp His Ser Trp35 40 45TTT GGG CCC CTG GCG AGT GCC CTG CAA ATA CTA GAT GTA AGC GCC AAC 192Phe Gly Pro Leu Ala Ser Ala Leu Gln Ile Leu Asp Val Ser Ala Asn50 55 60CCT CTG CAC TGC GCC TGT GGG GCG GCC TTT ATG GAC TTC CTG CTG GAG 240Pro Leu His Cys Ala Cys Gly Ala Ala Phe Met Asp Phe Leu Leu Glu65 70 75 80GTG CAG GCT GCC GTG CCC GGT CTG CCC AGC CGG GTG AAG TGT GGC AGT 288Val Gln Ala Ala Val Pro Gly Leu Pro Ser Arg Val Lys Cys Gly Ser85 90 95CCG GGC CAG CTC CAG GGC CTC AGC ATC TTT GCA CAG GAC CTG CGC CTC 336Pro Gly Gln Leu Gln Gly Leu Ser Ile Phe Ala Gln Asp Leu Arg Leu100 105 110TGC CTG GAT GAG GCC CTC TCC TGG GAC TGT TTC GCC CTC TCG CTG CTG 384Cys Leu Asp Glu Ala Leu Ser Trp Asp Cys Phe Ala Leu Ser Leu Leu115 120 125GCT GTG GCT CTG GGC CTG GGT GTG CCC ATG CTG CAT CAC CTC TGT GGC 432Ala Val Ala Leu Gly Leu Gly Val Pro Met Leu His His Leu Cys Gly130 135 140TGG GAC CTC TGG TAC TGC TTC CAC CTG TGC CTG GCC TGG CTT CCC TGG 480Trp Asp Leu Trp Tyr Cys Phe His Leu Cys Leu Ala Trp Leu Pro Trp145 150 155 160CGG GGG CGG CAA AGT GGG CGA GAT GAG GAT GCC CTG CCC TAC GAT GCC 528Arg Gly Arg Gln Ser Gly Arg Asp Glu Asp Ala Leu Pro Tyr Asp Ala165 170 175TTC GTG GTC TTC GAC AAA ACG CAG AGC GCA GTG GCA GAC TGG GTG TAC 576Phe Val Val Phe Asp Lys Thr Gln Ser Ala Val Ala Asp Trp Val Tyr180 185 190AAC GAG CTT CGG GGG CAG CTG GAG GAG TGC CGT GGG CGC TGG GCA CTC 624Asn Glu Leu Arg Gly Gln Leu Glu Glu Cys Arg Gly Arg Trp Ala Leu
195 200 205CGC CTG TGC CTG GAG GAA CGC GAC TGG CTG CCT GGC AAA ACC CTC TTT 672Arg Leu Cys Leu Glu Glu Arg Asp Trp Leu Pro Gly Lys Thr Leu Phe210 215 220GAG AAC CTG TGG GCC TCG GTC TAT GGC AGC CGC AAG ACG CTG TTT GTG 720Glu Asn Leu Trp Ala Ser Val Tyr Gly Ser Arg Lys Thr Leu Phe Val225 230 235 240CTG GCC CAC ACG GAC CGG GTC AGT GGT CTC TTG CGC GCC AGC TTC CTG 768Leu Ala His Thr Asp Arg Val Ser Gly Leu Leu Arg Ala Ser Phe Leu245 250 255CTG GCC CAG CAG CGC CTG CTG GAG GAC CGC AAG GAC GTC GTG GTG CTG 816Leu Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu260 265 270GTG ATC CTG AGC CCT GAC GGC CGC CGC TCC CGC TAC GAG CGG CTG CGC 864Val Ile Leu Ser Pro Asp Gly Arg Arg Ser Arg Tyr Glu Arg Leu Arg275 280 285CAG CGC CTC TGC CGC CAG AGT GTC CTC CTC TGG CCC CAC CAG CCC AGT 912Gln Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val Leu Leu Trp Pro His Gln Pro Ser290 295 300GGT CAG CGC AGC TTC TGG GCC CAG CTG GGC ATG GCC CTG ACC AGG GAC 960Gly Gln Arg Ser Phe Trp Ala Gln Leu Gly Met Ala Leu Thr Arg Asp305 310 315 320AAC CAC CAC TTC TAT AAC CGG AAC TTC TGC CAG GGA CCC ACG GCC GAA 1008Asn His His Phe Tyr Asn Arg Asn Phe Cys Gln Gly Pro Thr Ala Glu325 330 335TAGCCGTGAG CCGGAATCCT GCACGGTGCC ACCTCCACAC TCACCTCACC TCTGCCTGCC1068TGGTCTGACC CTCCCCTGCT CGCCTCCCTC ACCCCACACC TGACACAGAG CAGGCACTCA1128ATAAATGCTA CCGAAGGCTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AACCA1173(2)SEQ ID NO34的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度336個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)順序描述SEQ ID NO34Leu Pro Ala Gly Thr Arg Leu Arg Arg Leu Asp Val Ser Cys Asn Ser1 5 10 15Ile Ser Phe Val Ala Pro Gly Phe Phe Ser Lys Ala Lys Glu Leu Arg20 25 30Glu Leu Asn Leu Ser Ala Asn Ala Leu Lys Thr Val Asp His Ser Trp35 40 45Phe Gly Pro Leu Ala Ser Ala Leu Gln Ile Leu Asp Val Ser Ala Asn50 55 60Pro Leu His Cys Ala Cys Gly Ala Ala Phe Met Asp Phe Leu Leu Glu65 70 75 80Val Gln Ala Ala Val Pro Gly Leu Pro Ser Arg Val Lys Cys Gly Ser85 90 95Pro Gly Gln Leu Gln Gly Leu Ser Ile Phe Ala Gln Asp Leu Arg Leu100 105 110Cys Leu Asp Glu Ala Leu Ser Trp Asp Cys Phe Ala Leu Ser Leu Leu115 120 125Ala Val Ala Leu Gly Leu Gly Val Pro Met Leu His His Leu Cys Gly130 135 140Trp Asp Leu Trp Tyr Cys Phe His Leu Cys Leu Ala Trp Leu Pro Trp145 150 155 160Arg Gly Arg Gln Ser Gly Arg Asp Glu Asp Ala Leu Pro Tyr Asp Ala165 170 175Phe Val Val Phe Asp Lys Thr Gln Ser Ala Val Ala Asp Trp Val Tyr180 185 190Asn Glu Leu Arg Gly Gln Leu Glu Glu Cys Arg Gly Arg Trp Ala Leu195 200 205Arg Leu Cys Leu Glu Glu Arg Asp Trp Leu Pro Gly Lys Thr Leu Phe210 215 220Glu Asn Leu Trp Ala Ser Val Tyr Gly Ser Arg Lys Thr Leu Phe Val225 230 235 240Leu Ala His Thr Asp Arg Val Ser Gly Leu Leu Arg Ala Ser Phe Leu245 250 255Leu Ala Gln Gln Arg Leu Leu Glu Asp Arg Lys Asp Val Val Val Leu260 265 270Val Ile Leu Ser Pro Asp Gly Arg Arg Ser Arg Tyr Glu Arg Leu Arg275 280 285Gln Arg Leu Cys Arg Gln Ser Val Leu Leu Trp Pro His Gln Pro Ser290 295 300Gly Gln Arg Ser Phe Trp Ala Gln Leu Gly Met Ala Leu Thr Arg Asp305 310 315 320Asn His His Phe Tyr Asn Arg Asn Phe Cys Gln Gly Pro Thr Ala Glu325 330 335(2)SEQ ID NO35的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度497個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)順序描述SEQ ID NO35TGGCCCACAC GGACCGCGTC AGTGGCCTCC TGCGCACCAG CTTCCTGCTG GCTCAGCAGC 60GCCTGTTGGA AGACCGCAAG GACGTGGTGG TGTTGGTGAT CCTGCGTCCG GATGCCCCAC 120CGTCCCGCTA TGTGCGACTG CGCCAGCGTC TCTGCCGCCA GAGTGTGCTC TTCTGGCCCC 180AGCGACCCAA CGGGCAGGGG GGCTTCTGGG CCCAGCTGAG TACAGCCCTG ACTAGGGACA 240ACCGCCACTT CTATAACCAG AACTTCTGCC GGGGACCTAC AGCAGAATAG CTCAGAGCAA 300CAGCTGGAAA CAGCTGCATC TTCATGTCTG GTTCCCGAGT TGCTCTGCCT GCCTTGCTCT 360GTCTTACTAC ACCGCTATTT GGCAAGTGCG CAATATATGC TACCAAGCCA CCAGGCCCAC 420GGAGCAAAGG TTGGCTGTAA AGGGTAGTTT TCTTCCCATG CATCTTTCAG GAGAGTGAAG 480ATAGACACCA AACCCAC49權(quán)利要求
1.大致純的或重組的DTLR2蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO4的序列同一性至少為大約85％。
2.大致純的或重組的DTLR3蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO6的序列同一性至少為大約85％。
3.大致純的或重組的DTLR4蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO26的序列同一性至少為大約85％。
4.大致純的或重組的DTLR5蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO10的序列同一性至少為大約85％。
5.大致純的或重組的DTLR6蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO12的序列同一性至少為大約85％。
6.大致純的或重組的DTLR7蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO16或18的序列同一性至少為大約85％。
7.大致純的或重組的DTLR8蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO32的序列同一性至少為大約85％。
8.大致純的或重組的DTLR9蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO22的序列同一性至少為大約85％。
9.大致純的或重組的DTLR10蛋白或肽，它們?cè)谥辽俅蠹s12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO34的序列同一性至少為大約85％。
10.融合蛋白，它包含權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的蛋白或肽。
11.結(jié)合化合物，它與權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的蛋白或肽特異性地結(jié)合。
12.權(quán)利要求11的結(jié)合化合物，它是一種抗體或抗體片段。
13.核酸，它編碼權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的的蛋白或肽。
14.表達(dá)載體，它包含權(quán)利要求13的核酸。
15.宿主細(xì)胞，它包含權(quán)利要求14的載體。
16.重組生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括在表達(dá)所述多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞。
全文摘要
編碼與果蠅屬Toll受體和人IL－1受體同源的9種人受體的核酸,所述受體命名為DNAXToll樣受體2—10(DTLR2—10);純化的DTLR蛋白及其片段;針對(duì)這些受體的單克隆抗體/多克隆抗體;和診斷和治療使用的方法。
文檔編號(hào)C07K14/705GK1263555SQ98806640
公開日2000年8月16日 申請(qǐng)日期1998年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月7日
發(fā)明者G·T·哈迪曼, F·L·羅克, J·F·巴贊, R·A·卡斯特萊恩 申請(qǐng)人:先靈公司