專利名稱：蕨類植物提取異黃酮生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蕨類植物提取異黃酮生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
黃酮是指黃酮類化合物，黃酮類化合物泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團。
黃酮是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等。近年來，由于自由基生命科學(xué)的進展，使具有很強的抗氧化和消除自由基作用的類黃酮受到空前的重視。類黃酮參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質(zhì)的磷酸化、鈣離子的轉(zhuǎn)移、自由基的清除、抗氧化活力的增強、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達。它們對健康的好處有抗炎癥、抗過敏、抑制細(xì)菌、抑制寄生蟲、抑制病毒、防治肝病、防治血管疾病、防治血管栓塞、防治心與腦血管疾病、抗腫瘤、抗化學(xué)毒物等。天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，能時入脂肪組織，進而體現(xiàn)出如下功能消除疲勞、保護血管、防動脈硬化、擴張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。
近年來國內(nèi)外對茶多酚、銀杏類黃酮等的藥理和營養(yǎng)性的廣泛深入的研究和臨床試驗，證實類黃酮既是藥理因子，又是重要的營養(yǎng)因子為一種新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)素，對人體具有重要的生理保健功效。目前，很多著名的抗氧化劑和自由基清除劑都是類黃酮。隨著對生物總黃酮與人類營養(yǎng)關(guān)系研究的深入，不遠(yuǎn)的將來可能證明黃酮類化合物是人類必需的微營養(yǎng)素或者是必需的食物因子。
現(xiàn)階段人們常見的天然類黃酮有大豆異黃酮，甘草黃酮，銀杏黃酮等，而對于蕨類植物中提取黃酮的方法，則未見有報道。蕨根司屬中的蕨(Pteridiumaquil-inumL.)的幼嫩葉，因其生長在山林野地，少受污染，加之富含對人體有益的多種營養(yǎng)成分，近年來已成為深受人們喜愛的山野菜。蕨根還具有清掃化痰、利尿安神等功效，經(jīng)常食用蕨根會有一定的保健作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能有效地從蕨根中提取黃酮的方法以彌補現(xiàn)有技術(shù)之不足。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是蕨類植物提取黃酮生產(chǎn)工藝，其特征是取新鮮蕨根70℃烘至8成干，然后剪成2-3mm碎段，再在103℃烘干后研成粉末狀。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量蕨根干粉用索氏提取法(乙醚為抽提劑，45℃水浴)脫脂及除脂溶性色素，當(dāng)乙醚抽提液無色時揮盡蕨根粉中乙醚，將蕨菜干粉放在燒瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70％乙醇(下同)回流提取蕨菜總黃酮。等1次浸提蕨根干粉質(zhì)量∶70％乙醇體積＝1∶5(g∶mL)，以后每次浸提的比例為1∶3(g∶mL)，每次浸提時間約2小時，浸提溫度為90℃，到乙醇浸提液基本無色，共浸提10次。合并所有浸提液并適當(dāng)濃縮，定容至一定體積，按體積比1∶1加入石油醚，再次脫脂，棄上層石油醚，將下層乙醇浸提液定容至蕨根干粉質(zhì)量與乙醇體積比為1∶20(g∶mL)，此為蕨根總黃酮提取液，簡稱為粗黃酮液。
取一定體積粗黃酮液在水浴中進行減壓濃縮成漿狀并于103℃烘干，粉碎得到粗黃酮粉。
取粗黃酮粉1.30g，加水約100ml，經(jīng)水浴加熱溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先乙105℃活化1小時，裝柱30cm高，柱內(nèi)徑為2.5cm)。上柱充分吸附后，先用蒸餾水洗至無色，然后用體積分?jǐn)?shù)95％乙醇洗脫，洗脫速度約為1.5ml/min，洗脫至無色時為止，收集洗脫液在90℃水浴上蒸干后于103℃烘2小時，得粉末狀精制黃酮粉。
本發(fā)明的有益效果在于蕨根中總黃酮含量比銀杏葉等要高，為蕨根干重的7.28％。用70％乙醇浸提可得到約為蕨根干重1/4的粗黃酮粉，其黃酮含量27.03％，經(jīng)聚酰胺純化后的黃酮含量有所提高，但會有大量的黃酮類物質(zhì)損失。蕨根是獲取黃酮類化合物的良好來源。蕨根黃酮類化合物表現(xiàn)出較強的消除自由能力，具有顯著的阻斷亞油酸、豬油過氧化作用，表現(xiàn)出很強的抗氧化能力，而且還能去除油脂中已有的過氧化物，降低油脂的過氧化值?？寡趸饔脺y定結(jié)果均表明，一定濃度范圍內(nèi)，蕨根黃酮類化合物用量越大，其抗氧化性越強。蕨根黃酮化合物是一具有很大開發(fā)價值的天然抗氧化劑。
下面通過實施例，對本發(fā)明作進一步說明具體實施方式
實施例1材料與方法試驗材料采摘蕨根長出地面15-20cm高的幼嫩葉(嫩葉拳卷期)為試驗材料，采摘地點為宜賓市郊區(qū)的丘陵林地。
儀器與劑YU-1201紫外可見興分光光度計(北京普析通用儀器設(shè)備有限公司)，101AS-2型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)，HH-4數(shù)量恒測水浴鍋(國華電器有限公司)，硫代巴上妥酸(TBA，Merck)，亞油酸(上?；瘜W(xué)試劑公司)，氨藍四唑(NBT，Sigma)，蘆丁(上?；瘜W(xué)試劑公司)。
蕨根黃酮的提取與純化蕨根總黃酮的提取取新鮮蕨根70℃烘至8成干，然后剪成2-3mm碎段，再在103℃烘干后研成粉末狀。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量蕨根干粉用索氏提取法(乙醚為抽提劑，45℃水浴)脫脂及除脂溶性色素，當(dāng)乙醚抽提液無色時揮盡蕨根粉中乙醚，將蕨菜干粉放在燒瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70％乙醇(下同)回流提取蕨菜總黃酮。等1次浸提蕨根干粉質(zhì)量∶70％乙醇體積＝1∶5(g∶mL)，以后每次浸提的比例為1∶3(g∶mL)，每次浸提約2h，浸提溫度為90℃，址以乙醇浸提液基本無色，共浸提10次。合并所有浸提液并適當(dāng)濃縮，定容至一定體積，按體積比1∶1加入石油醚，再次脫脂，棄上層石油醚，將下層乙醇浸提液定容至蕨根干粉質(zhì)量與乙醇體積比為1∶20(g∶mL)，此為蕨根總黃酮提取液，簡稱為粗黃酮液。
取一定體積粗黃酮液在水浴中進行減壓濃縮成漿狀并于103℃烘干，粉碎得到粗黃酮粉，計算粗黃酮粉得率。
蕨根黃酮的初步純化稱取粗黃酮粉1.30g，加水約100ml，經(jīng)水浴加熱溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先乙105℃活化1h，裝柱30cm高，柱內(nèi)徑為2.5cm)。上柱充分吸附后，先用蒸餾水洗至無色，然后用體積分?jǐn)?shù)95％乙醇洗脫，洗脫速度約為1.5ml/min，洗脫至無色時為止，收集洗脫液在90℃水浴上蒸干后于103℃烘2h，得粉末狀精制黃酮粉，可計算期得率。
黃酮含量測定按照徐雅琴等方面進行，采用分光光度法測定總黃酮含量，即利用黃酮類化合物與鋁鹽生成紅色絡(luò)合物，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(本文蘆丁以70％乙醇配制)在510nm處測定及光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程C＝0.487A+0.0097(C為蘆丁濃度mg/ml，A為吸光度)，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998。
蕨根黃酮類化合物的抗氧化性測定蕨根黃酮化合物及蘆及的消除O2自由基能測定采用NBT(氮藍四唑)光還原法來測定黃酮類物質(zhì)清除O2自由基能力。NBT反應(yīng)液按衣海青等方法配制，各取3mlNBT反應(yīng)液，分別加入1mL70％乙醇配制的蕨根黃酮液及蘆丁液，然后將NBT反應(yīng)液(該液中加1mL70％乙醇)、含黃酮的NBT反應(yīng)液同時在40w日光燈下15cm處光照15min，于610nm處測定吸光度。從而計算出黃酮類化合物對NBT光還原50％定義為一個“尖似SOD活性單位”，并以此來衡量黃酮類化合物的清除自由基能力。
蕨根黃酮類化合物在市售油中的抗氧化作用豬油由市售板油在燒杯中用文火熬煉而成。稱取粗黃酮粉0.01、0.05、0.20g和精制黃酮粉0.01g，各用4ml無水乙醇溶解后分別加到50.00g溫?zé)嶝i油中，攪勻，以不加蕨根黃酮粉，僅在50.00g豬油中加入4ml無水乙醇為對照樣，在(70±1)℃烘箱中強化保存，定時攪拌，于不同時間取樣測定豬油中的過氧化值(POV值)，并以此來表示豬油的氧化速度，進而衡量蕨根黃酮類化合物的抗氧化活性。過氧化值的測定按GB5009.37-1985方法進行。樣品的過氧化值(POV)計算POV=(V1-V2)×Mm×100%]]>式中POV為樣品的過氧化值，mmol/kg；V1為試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；
V2為空白試驗消耗硫代酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；M為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/kg；m為質(zhì)量，g。
蕨根黃酮類化合物控制亞油酸過氧化作用的測定用無水乙醇配制0.5％的亞油酸乙醇液。稱取粗黃酮粉0.01、0.05g，精制黃酮粉0.01g，各有4ml無水乙醇溶解，然后分別加到50ml0.5％亞油酸乙醇液中混勻，以不加黃酮粉而僅在50ml0.5％亞油酸乙醇液中加入4ml無水乙醇的為對照樣，在(40±1)℃條件下保存，定期取樣按黃雪松等方法中的TBA法(硫代巴比妥酸法)測定其吸光定。
結(jié)果與討論黃酮含量及黃酮得率蕨根干粉中的總黃酮含量取一定體積的蕨根總黃酮提取液(粗黃酮液)測定其中黃酮含量，進而計算出蕨根干粉的總黃酮含量為7.28％，這比柚皮粉、銀杏干葉、黑刺菝葜干粉、穗醋粟葉片干粉中的總黃酮含量高的多，至少都高出2倍以上。
粗黃酮粉、精制黃酮粉得率及其黃酮含量由蕨根干粉得到粗黃酮的得率為25.92％，經(jīng)測定粗黃酮粉中的黃酮含量為27.03％；由粗黃酮經(jīng)聚酰胺初步純化后的精制黃酮粉相對于蕨菜干粉的得率為5.10％，相對于粗黃酮粉的得率為19.67％，精制黃酮粉中的黃酮含量為41.52％。
由上述結(jié)果看出，菜中黃酮類物質(zhì)含量很高，提取的精黃酮粉得率已達蕨根干重的1/4以上，雖未經(jīng)純化但其黃酮粉得率也達27％以上。經(jīng)過初步化純化的精制黃酮粉得率也達蕨菜干重的5％以上。這些都說明，蕨菜是獲取黃酮類物質(zhì)的很好來源。
初步純化的效果經(jīng)聚酰胺純化后，黃酮粉中的黃酮含量由純化前的27.03％提高到了純化后的41.52％，這說明純化有一定效果，但比文獻中報告的蒲公英黃酮類化合物純化后黃酮含量達67.4％要低，這說明聚酰胺對不同的黃酮提取物質(zhì)的純化效果有差異。結(jié)合黃酮粉得率及黃酮含量計算純化后的黃酮回率為30.22％，約70％的黃酮類物質(zhì)在純化過程中損失掉了，如何進一步提高蕨根黃酮粉中的黃酮含量，提高純化過程中的黃酮回收率，尚需進一步研究。
蕨根黃酮類化合物的抗氧化活性消除O2自由基的能力用NBT光還源法測定蕨根黃酮化合物與蘆丁消除自由基能力的結(jié)果顯示，當(dāng)NBT光還原的抑制率在20％-60％范圍內(nèi)時，蘆丁的含量與抑制率間呈高度相關(guān)，蘆丁的抑制曲線為y＝37.09x+0.0775，相關(guān)系數(shù)r＝0.9924，y為抑制百分率，x為反應(yīng)體系中蘆丁毫克數(shù)。經(jīng)測定，1mg蘆丁消除自由基能力相當(dāng)于87.82個類似SOD活性單位；1mg蕨根粗黃酮粉相當(dāng)于24.71個類似SOD活性單位；1mg精制黃酮粉相當(dāng)于48.06個類似SOD活性單位。
NBTI光還原反應(yīng)是個自由其反應(yīng)，NBT光還原是測定SOD酶活性的常用方法之一，SOD可以消除O2自由基而抑制NBT光還原。黃酮類化合物是具有酚羥基的一類還原性化合物，是人們一直關(guān)注的天然自由基消除劑，酚羥基可作為供氫體，使自由基還原從而抑制NBT光還原。從測定結(jié)果看，消除自由基能力較強的為蘆丁，精制黃酮粉次之，粗黃酮粉較之精制黃酮粉又弱一些?？梢猿醪娇闯?，蕨根黃酮粉中的黃酮含量越高，消除自由基的能力越強。
蕨根黃酮類化合物在豬油中的抗氧化性分析各樣品的POV值隨時間變化的情況如

圖1所示。由圖1看出，相對于對照樣，在豬油中添加不同的質(zhì)量的黃酮粉，均可顯著抑制豬油的自動氧化，表現(xiàn)出較強的抗氧化性，即使是最小的添加量(0.01g)。總體看，添加量越大抗氧化效果越好。更值得注意的是，添加黃酮粉后在開始階段，相對對照樣而言，各樣品的POV值皆下降，表現(xiàn)出明顯的降低豬油中過氧化值的作用，這與文獻中用氧化亞錫來降低POV值效果相似，即蕨根黃酮粉添加到豬油后，不僅抑制豬油的自動氧化，而且能很好地去除豬油中已有的過氧化物，從而降低POV值。
蕨根黃酮類化合物抑制亞油酸的過氧作用硫代巴比妥權(quán)法(TBA法)是基于不飽和脂肪酸過自由基反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化自由基，進而氧化生成環(huán)氧化物，后者生成丙二醛，丙二醛與TBA作用生成TBA染料，最大吸收波長為532nm。因此，TBA染料生成的多少就反映在532nm處的吸光度值大小上，是衡量自由基鏈反應(yīng)進程的標(biāo)志?？寡趸瘎种谱杂苫湻磻?yīng)的進行，最終表現(xiàn)出TBA染料生成得少，吸光度值小。2次測定的吸光值結(jié)果如表1所示。
表1不同蕨根黃酮粉添加量與抗氧化性關(guān)系

由表1看出，添加蕨根黃酮粉的較不添加的對照樣吸光度值低，尤其是育溫78h測定值能很好說明蕨根黃酮粉化合物能顯著抑制亞油酸的過氧化，由育溫142h吸光度值看出，黃酮粉添加量大的抑制亞油酸的自動氧化時間要更長些。
結(jié)論蕨根中總黃酮含量比銀杏葉等要高，為蕨根干重的7.28％。用70％乙醇浸提可得到約為蕨根干重1/4的粗黃酮粉，其黃酮含量27.03％，經(jīng)聚酰胺純化后的黃酮含量有所提高，但會有大量的黃酮類物質(zhì)損失。蕨根是獲取黃酮類化合物的良好來源。
蕨根黃酮類化合物表現(xiàn)出較強的消除自由能力，具有顯著的阻斷亞油酸、豬油過氧化作用，表現(xiàn)出很強的抗氧化能力，而且還能去除油脂中已有的過氧化物，降低油脂的過氧化值?？寡趸饔脺y定結(jié)果均表明，一定濃度范圍內(nèi)，蕨根黃酮類化合物用量越大，其抗氧化性越強。
蕨根黃酮化合物是一具有很大開發(fā)價值的天然抗氧化劑。
權(quán)利要求
1.蕨類植物提取黃酮生產(chǎn)工藝，其特征是取新鮮蕨根68℃-72℃烘至8成干，然后剪成2-3mm碎段，再在101℃-105℃烘干后研成粉末狀。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量蕨根干粉用索氏提取法(乙醚為抽提劑，45℃水浴)脫脂及除脂溶性色素，當(dāng)乙醚抽提液無色時揮盡蕨根粉中乙醚，將蕨菜干粉放在燒瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70％乙醇(下同)回流提取蕨菜總黃酮。等1次浸提蕨根干粉質(zhì)量∶70％乙醇體積＝1∶5(g∶mL)，以后每次浸提的比例為1∶3(g∶mL)，每次浸提時間約2小時，浸提溫度為90℃，到乙醇浸提液基本無色，共浸提10次。合并所有浸提液并適當(dāng)濃縮，定容至一定體積，按體積比1∶1加入石油醚，再次脫脂，棄上層石油醚，將下層乙醇浸提液定容至蕨根干粉質(zhì)量與乙醇體積比為1∶20(g∶mL)，此為蕨根總黃酮提取液，簡稱為粗黃酮液。取一定體積粗黃酮液在水浴中進行減壓濃縮成漿狀并于1101℃-105℃烘干，粉碎得到粗黃酮粉。取粗黃酮粉1.30g，加水約100ml，經(jīng)水浴加熱溶解后上聚酰胺柱(聚酰胺事先乙105℃活化1小時，裝柱30cm高，柱內(nèi)徑為2.5cm)。上柱充分吸附后，先用蒸餾水洗至無色，然后用體積分?jǐn)?shù)95％乙醇洗脫，洗脫速度約為1.5ml/min，洗脫至無色時為止，收集洗脫液在90℃水浴上蒸干后于101℃-105℃烘2小時，得粉末狀精制黃酮粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蕨類植物提取黃酮生產(chǎn)工藝，其特征是取新鮮蕨根烘干后用索氏提取法脫脂及除脂溶性色素，將蕨菜干粉放在燒瓶中加入體積分?jǐn)?shù)乙醇提取蕨菜總黃酮。合并所有浸提液并適當(dāng)濃縮加入石油醚，將脫脂后的粗黃酮液粉碎加水上聚酰胺柱，用蒸餾水洗后用乙醇洗脫，再烘2小時，得精制黃酮粉。本發(fā)明的有益效果在于蕨根中總黃酮含量比銀杏葉等要高，為蕨根干重的7.28％。用70％乙醇浸提可得到約為蕨根干重1/4的粗黃酮粉，其黃酮含量27.03％，蕨根是獲取黃酮類化合物的良好來源。蕨根黃酮類化合物表現(xiàn)出較強的消除自由能力，具有顯著的阻斷亞油酸、豬油過氧化作用，表現(xiàn)出很強的抗氧化能力，而且還能去除油脂中已有的過氧化物，降低油脂的過氧化值。
文檔編號A61K36/11GK101066960SQ20071004928
公開日2007年11月7日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者侯志君, 周廣元 申請人:侯志君, 周廣元