專(zhuān)利名稱(chēng)：一種復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)方魚(yú)腥草滴丸質(zhì)量控制方法，具體地說(shuō)是通過(guò)薄層色譜定性法和高效液相定量法控制復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量。
背景技術(shù)：
上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽炎、慢性支氣管炎是臨床上常見(jiàn)病、多發(fā)病，臨床治療以使用抗微生物化學(xué)藥為多見(jiàn)，但治標(biāo)不治本，反復(fù)使用這些藥物反而導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，同時(shí)較多的毒副作用也使應(yīng)用受到限制。傳統(tǒng)的中藥劑型雖然可以克服化藥帶來(lái)的不良反應(yīng)，但其本身的釋藥系統(tǒng)不完善以及質(zhì)量不穩(wěn)定、可控性差的缺陷使臨床推廣應(yīng)用受到限制。復(fù)方魚(yú)腥草滴丸兼顧了上述兩者的優(yōu)點(diǎn)，克服了它們的不足，是一個(gè)利用現(xiàn)代技術(shù)和先進(jìn)適用技術(shù)改造傳統(tǒng)中藥劑型的現(xiàn)代中藥，尤其是對(duì)其質(zhì)量控制指標(biāo)達(dá)到一個(gè)較高水平。
本處方中應(yīng)用了魚(yú)腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花，通過(guò)對(duì)其理化性質(zhì)及藥理藥效學(xué)研究表明，測(cè)定其結(jié)構(gòu)明確的有效活性成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)是一個(gè)優(yōu)選方案。
魚(yú)腥草(Herba houttuyniae)為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的干燥地上部分。
其化學(xué)成分主要為1、揮發(fā)性成分含揮發(fā)油約0.05％，油中有效成分為醛酮化合物、癸酰乙醛(魚(yú)腥草素Decanoylacetaldehyde)、月桂醛(Lauraldehyde)；并含有醛酮化合物2-十一烷酮(2-undecanone)、倍半萜人合物丁香烯(caryophyllene)、單萜烯化合物α-蒎烯(α-pinene)、莰烯(camphene)等；2、黃酮類(lèi)化合物含有槲皮素(quercetin)，槲皮苷(quercitrin)、異槲皮苷(isoquercitrin)等；另外還含有有機(jī)酸及脂肪酸、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等等(陰健.中藥現(xiàn)代化研究與臨床應(yīng)用，I，457頁(yè)。)。
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C-CH3甲基正壬酮[3]魚(yú)腥草的含量測(cè)定主要測(cè)定總?cè)┩衔铩⒐秕Ｒ胰?、?蒎烯等，近年來(lái)的研究主要測(cè)定方法有比色法、容量法、紅外光譜法、氣相層析法、滴定法等(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，458頁(yè))。
黃芩(Radix scutellariae)為唇形科植物黃芩Scutellariabaicalensis Georgi.的干燥根。
其主要成分為黃酮類(lèi)。黃酮 黃芩苷元(baicalein)、黃芩苷(baicalin)、5、6-二羥基-黃酮-7-O-葡萄糖苷(5，6-dihydroxy-7-O-glucoside-flavone)、白楊黃素(chrysin)、5，7，2’-三羥基-黃酮(5，7，2’-trihydrox-y-flavone)、5，7，2’，3’-四羥基黃酮(5，7，2’，3’-tetraflavone)、去甲漢黃芩素(nor-wogonin)、漢黃芩素(Wogonin)、漢黃芩苷(Wogonoside)、黃芩新素I(skullcapflavoneI)、黃芩新素II(skullcapflavone II)等；二氫黃酮7，2’，6’-三羥基-5-甲氧基二氫黃酮(7，2’，6’-trihydroxy-5-methoxyflavanone)等；查爾酮 7，2’，6’-三羥基-5-甲氧基-查爾酮(7，2’，6’-trihydroxy-5-methoxychalcone)等；二氫黃酮醇3，5，7，2’，6’-五羥基二氫黃酮醇(3，5，7，2’，6’-pentahydroxy flavanonll)等；黃酮醇3，5，7，2’，6’-五羥基黃酮醇(3，5，7，2’，6’-pentahydroxyflavanonol)等；還含有苯乙醇葡萄糖苷、氨基酸、揮發(fā)油等(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，560頁(yè))。黃芩素R＝H黃芩新素I R1＝R2＝H黃芩苷R＝gluA黃芩新素II R1＝R2＝OCH3[7]漢黃芩素R＝H漢黃芩苷R＝gluA[7]黃芩的含量測(cè)定主要有比色法、雙波長(zhǎng)紫外分光光度法、薄層層析-比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法等(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，560頁(yè))。板藍(lán)根(Radix isatidis)為十字花科植物菘藍(lán)Isatisindigotica Fort.的干燥根。板藍(lán)根中含有總氨基酸3.8％，氨基酸中有精氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、γ-氨基丁酸等，以及蛋白質(zhì)、樹(shù)脂狀物等。靛藍(lán)、靛玉紅、1-硫氰酸-2-羥基-3-丁烯、左旋5-乙烯基惡唑啶-2硫酮、色胺酮、青黛酮、腺苷、尿苷、次黃嘌吟、尿嘧啶、棕櫚酸、水楊酸、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、胡蘿卜苷等，此外尚含有蔗糖20.3％、樹(shù)脂等(苗明三李振國(guó).現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)，617頁(yè))。
連翹(Fructus forsythiae)為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)。
其主要化學(xué)成分為1、揮發(fā)性成份主要存在于種子中，含量平均3.8％。其烴類(lèi)有α-蒎烯(α-pinene)、莰烯(camphene)、β-蒎烯(β-pinene)、對(duì)聚傘花烯、檸檬烯、γ、松油烯、β-水芹烯、香葉烯、β-羅勒烯等；醛酮類(lèi)有樟腦(camphor)、香葉醛(geranial)；醇酯醚類(lèi)有龍腦(borneol)等。
2、苯乙醇甙類(lèi)連翹酯甙(forsythoside)A，B，C，D，連翹酚(forsythol)其次為。另外還有含有三萜類(lèi)、香豆素類(lèi)等成分(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，356-357頁(yè))。連翹的含量測(cè)定主要有薄層掃描法、反射法等(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，357頁(yè))。金銀花(Floslonicerae)為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。
其主要化學(xué)成分為金銀花中揮發(fā)油中含有30多種成份，主要有芳樟醇(linalool)、(-)-順-2，6，6-三甲基-2-乙烯基-5-羥基四氫吡喃[(-)-cis-2，6，6-trimethyl-2-ethenyl-5-hydroxytetrapyrane]、蒎烯(pinene)、1-己烯(1-hexene)、順-3-己烯醇-1(cis-3-hexenol-1)等，另外花蕾中含有木犀草素(luteolin)、肌醇(inositol)。分離出綠原酸(chlorogenicacid)和異綠原酸(isochlorogenic acid)等(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，449頁(yè))。
金銀花中含量測(cè)定主要有容量法、比色法、薄層層析斑點(diǎn)定量法、氣相層析法、紫外分光光度法、高效液相法等(陰健.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用，I，450-452頁(yè))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明的質(zhì)控方法采用了現(xiàn)代技術(shù)薄層色譜法鑒別復(fù)方魚(yú)腥草滴丸中魚(yú)腥草的甲基正壬酮、黃芩中的黃芩苷、板藍(lán)根中的精氨酸、連翹中的連翹苷、金銀花中的綠原酸。
本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其實(shí)施步驟如下一、魚(yú)腥草中甲基正壬酮的檢測(cè)方法1、供試品的制備取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸30g，加水500ml，按揮發(fā)油測(cè)定法甲法(中國(guó)藥典2000版一部附錄XD)在測(cè)定器刻度部分加滿(mǎn)水，加入2ml醋酸乙酯，提取揮發(fā)油4小時(shí)，放冷，分取蠟酸乙酯層，作為供試品溶液。
2、對(duì)照品溶液的制備另取甲基正壬酮對(duì)照品，加醋酸乙酯到制成每ml含0.1ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。
3、檢測(cè)方法照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶出液6μl，對(duì)照品溶液4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯(7～9∶3～1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜中相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
二、黃芩中黃芩苷的檢測(cè)方法1、供試品的制備取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸2g，加溫水20ml，超聲10分鐘，調(diào)PH1.5~2，80℃保溫1h，離心，棄去上清液，沉淀水洗二次，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試液。
2、對(duì)照品溶液的制備另取黃芩甙對(duì)照品，加甲醇制成每ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
3、檢測(cè)方法照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試液1μl，對(duì)照品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(5～8∶0.5～2∶1～3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。
三、連翹中連翹苷的檢測(cè)方法1、供試品的制備取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸30g，加水100ml，溫?zé)崛芙?，調(diào)PH1.5~2，80℃保溫1h，離心，取上清液，乙醚提取三次(60，40，40ml)，母液用醋酸乙酯提取三次(50，50，50ml)，合并醋酸乙酯提取液，蒸干，10ml水溶解，加在D101大孔樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.6cm，長(zhǎng)度18cm，大孔樹(shù)脂量為柱長(zhǎng)2/3量)上，用100ml水洗脫，再用25％-50％乙醇50ml洗脫，收集洗脫液(備用)，繼用50％-80％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，加10ml水溶解，加入中性氧化鋁適量，拌勻，減壓干燥，加入中性氧化鋁柱(200~300目，5g，內(nèi)徑1.5~2cm，干法裝柱)，50％-80％乙醇洗脫100ml，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?ml甲醇使溶解，作為供試液。
2、對(duì)照品溶液的制備另取連翹甙對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
3、檢測(cè)方法照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試液3μl，對(duì)照品溶液1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
四、金銀花中綠原酸的檢測(cè)方法1、供試品溶液的制備取鑒別(三)下25％-50％乙醇洗脫液，水浴蒸干，甲醇溶解，定容于5ml量瓶，作為供試液。
2、對(duì)照品溶液的制備另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
3、檢測(cè)方法照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試液2μl，對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置365nm熒光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
五、板藍(lán)根中精氨酸的檢測(cè)1、供試品溶液的制備取本品5g，加水150ml溫?zé)崛芙?，加在氫型?qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱上(內(nèi)徑2cm，長(zhǎng)25cm)，加水300ml沖洗(1ml/分鐘)，洗至接近無(wú)色，再用0.25N-0.7N氨水400ml洗脫，收集洗脫液(1ml/分鐘)，水浴蒸干，殘?jiān)?ml稀乙醇溶解，作為供試品溶液。
2、對(duì)照品溶液的制備另取精氨酸對(duì)照品，加稀乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。
3、檢測(cè)方法照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試液、對(duì)照品溶液各1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)。
六、高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為240-340nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2300。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取在40℃-90℃減壓干燥3-6小時(shí)的黃芩苷適量，加30％70％甲醇制成每1ml含20μg-40μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本品1.5g-3.0g，研碎，取0.1g-1.0g，精密稱(chēng)定，加2ml-20ml水溫?zé)崛芙?，?.5ml-5ml 6mol/L鹽酸溶液，搖勻，40℃-90℃保溫0.5-2小時(shí)，放置過(guò)夜，離心，傾去上清液，沉淀加70％乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加50％-90％乙醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液1ml-4ml，水浴蒸干，加30％-70％乙醇分次溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加30％70％乙醇至刻度，搖勻，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀，測(cè)定即得。
本品含黃芩以含黃芩苷(C21H18O11)計(jì)，不得少于2.0％。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的質(zhì)控方法采用了現(xiàn)代技術(shù)薄層色譜法鑒別復(fù)方魚(yú)腥草滴丸中魚(yú)腥草的甲基正壬酮、黃芩中的黃芩苷、板藍(lán)根中的精氨酸、連翹中的連翹苷、金銀花中的綠原酸，并通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確定了用高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量的條件和方法，從而建立了用靈敏度高、重現(xiàn)性好、精確度高的定性定量控制復(fù)方魚(yú)腥草滴丸質(zhì)量的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1魚(yú)腥草1100g黃芩333g板藍(lán)根330g連翹116g 金銀花116g取魚(yú)腥草、板藍(lán)根、連翹、金銀花加12倍量的水浸泡5小時(shí)，蒸餾，揮發(fā)油另器保存，備用；藥渣過(guò)濾，濾液[I]另存；藥渣加10倍量的水繼續(xù)煎煮2次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，與濾液[I]合并，濃縮至在60℃時(shí)測(cè)相對(duì)密度1.15左右，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)到70％，放置24小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙醇并繼續(xù)濃縮成流浸膏，備用；取黃芩，加10-12倍量的水煎煮二次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值1-3，80℃保溫1小時(shí)，靜置24小時(shí)，濾過(guò)，沉淀用乙醇洗，再用水洗至PH5-6，減壓低溫干燥，粉碎，得黃芩提取物粉，加入到上述流浸膏中，加入揮發(fā)油，混勻，取PEG-6000熔融，將藥物加入到熔融液態(tài)基質(zhì)中，藥物與基質(zhì)配比1∶3。在85℃保溫狀態(tài)下滴制，以液狀石蠟或二甲基硅油為冷凝劑，冷卻溫度-5℃，收集滴丸，擦拭，即得。
(1)取本品30g，加水500ml，按揮發(fā)油測(cè)定法甲法(中國(guó)藥典2000版一部附錄XD)在測(cè)定器刻度部分加滿(mǎn)水，加入2ml醋酸乙酯，提取揮發(fā)油4小時(shí)，放冷，分取蠟酸乙酯層，作為供試品溶液。另取甲基正壬酮對(duì)照品，加醋酸乙酯到制成每ml含0.1ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶出液6μl，對(duì)照品溶液4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜中相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
(2)取本品2g，加溫水20ml，超聲10分鐘，調(diào)PH1.5~2，80℃保溫1h，離心，棄去上清液，沉淀水洗二次，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試液。另取黃芩甙對(duì)照品，加甲醇制成每ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試液1μl，對(duì)照品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。
(3)取本品30g，加水100ml，溫?zé)崛芙?，調(diào)PH1.5~2，80℃保溫1h，離心，取上清液，乙醚提取三次(60，40，40ml)，母液用醋酸乙酯提取三次(50，50，50ml)，合并醋酸乙酯提取液，蒸干，10ml水溶解，加在D101大孔樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.6cm，長(zhǎng)度18cm，大孔樹(shù)脂量為柱長(zhǎng)2/3量)上，用100ml水洗脫，再用30％乙醇50ml洗脫，收集洗脫液(備用)，繼用70％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，加10ml水溶解，加入中性氧化鋁適量，拌勻，減壓干燥，加入中性氧化鋁柱(200~300目，5g，內(nèi)徑1.5~2cm，干法裝柱)，70％乙醇洗脫100ml，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?ml甲醇使溶解，作為供試液。另取連翹甙對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試液3μl，對(duì)照品溶液1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。
(4)取鑒別(3)下30％乙醇洗脫液，水浴蒸干，甲醇溶解，定容于5ml量瓶，作為供試液。另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試液2μl，對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置365nm熒光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
(5)取本品5g，加水150ml溫?zé)崛芙猓釉跉湫蛷?qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱上(內(nèi)徑2cm，長(zhǎng)25cm)，加水300ml沖洗(1ml/分鐘)，洗至接近無(wú)色，再用0.5N氨水400ml洗脫，收集洗脫液(1ml/分鐘)，水浴蒸干，殘?jiān)?ml稀乙醇溶解，作為供試品溶液。另取精氨酸對(duì)照品，加稀乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試液、對(duì)照品溶液各1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(19∶5∶5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)。
實(shí)施例2魚(yú)腥草1166g 黃芩290g板藍(lán)根290g連翹126g金銀花126g取魚(yú)腥草、板藍(lán)根、連翹、金銀花加10倍量的水浸泡4小時(shí)，蒸餾，揮發(fā)油另器保存，備用；藥渣過(guò)濾，濾液[I]另存；藥渣加10倍量的水繼續(xù)煎煮2次，每次1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，與濾液[I]合并，濃縮至在60℃時(shí)測(cè)相對(duì)密度1.15左右，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)到70％，放置48小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙醇并繼續(xù)濃縮成流浸膏，備用；取黃芩，加10-12倍量的水煎煮二次，每次2.5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，適當(dāng)濃縮后用鹽酸調(diào)節(jié)PH值1.5，80℃保溫1小時(shí)，靜置24小時(shí)，濾過(guò)，沉淀用乙醇洗，再用水洗至PH5-6，減壓低溫干燥，粉碎，得黃芩提取物粉，加入到上述流浸膏中，加入揮發(fā)油，混勻，取PEG-6000和PGE4000混合熔融，將藥物加入到熔融液態(tài)基質(zhì)中，藥物與基質(zhì)配比1∶4為宜。在80℃保溫狀態(tài)下滴制，以液狀石蠟或二甲基硅油為冷凝劑，冷卻溫度-3℃，收集滴丸，擦拭，即得。
黃芩苷含量測(cè)定按照高效液相色譜法(中華人民共和國(guó)藥典2000年版一部附錄VI D)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2500。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取在60℃減壓干燥4小時(shí)的黃芩苷適量加50％甲醇制成每1ml含30ug的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本品2.5g，研碎，取0.5g，精密稱(chēng)定，加10ml水溫?zé)崛芙猓?.5ml 6mol/L鹽酸溶液，搖勻，80℃保溫1小時(shí)，放置過(guò)夜，離心，傾去上清液，沉淀加70％乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液2ml，水浴蒸干，加50％乙醇分次溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，搖勻，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀，測(cè)定即得。
實(shí)驗(yàn)1色譜條件色譜柱Shimpack VP-ODS Φ4.6×150mm；流動(dòng)相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；柱溫室溫；流量1ml/min。波長(zhǎng)選擇黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，故選擇280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相的確定，以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)作為流動(dòng)相，黃芩苷對(duì)照品出峰時(shí)間約為11分鐘。樣品中，黃芩苷同其他組分能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度為＝13.756，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。
實(shí)驗(yàn)2系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)。
①理論板數(shù)(n)、拖尾因子(T)與分離度(R)的測(cè)定取供試品溶液20ul，注入液相色譜儀中，測(cè)得n＝6124(40830×0.15)，T＝1.02，R＝13.756，理論板數(shù)經(jīng)多次測(cè)定及參照有關(guān)文獻(xiàn)定為不低于2000。
②重復(fù)性試驗(yàn)黃芩苷對(duì)照品溶液(29ug/ml)連續(xù)進(jìn)樣6次(20ul定量環(huán))，結(jié)果峰面積積分值較為穩(wěn)定，RSD＜2％，見(jiàn)表1表1 黃芩苷重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明供試品中黃芩苷保留時(shí)間與對(duì)照品一致，在此條件下，與其他組分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，且系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)完全符合要求。
實(shí)驗(yàn)3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及線(xiàn)性關(guān)系的考察精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液(69.6ug/ml)2ul、4ul、8ul、12ul、16ul、20ul按上述色譜條件依法測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，黃芩苷量(ug)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)直線(xiàn)回歸得回歸議程為Y＝1525581.739X-6616.553 r＝0.99996(n＝6)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)考察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明黃芩苷對(duì)照品在0.1392ug~1.3920ug范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)4精密度試驗(yàn)精密進(jìn)樣20ul(供試液)，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見(jiàn)表3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD＝1.0％。
表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本法精密度較好。
實(shí)驗(yàn)5重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的樣品6份，按正文含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定供試品黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表4，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝1.64％。
表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明本方法重現(xiàn)性較好。
實(shí)驗(yàn)6穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，在室溫下，間隔1小時(shí)進(jìn)樣一次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5，實(shí)驗(yàn)表明，黃芩苷在所測(cè)的5小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝2.41％。
表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)7加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品(含量為2.40％)6份，分別添加黃芩苷對(duì)照品，按正文含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，平均回收率為97.57％，RSD＝1.17％。結(jié)果見(jiàn)表6，實(shí)驗(yàn)表明，本法準(zhǔn)確性較好。
表6 加樣回收率試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)8樣品測(cè)定及含量限度的確定。
按正文[含量測(cè)定]項(xiàng)下方法，對(duì)三批樣品中黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明本品含量最高值為2.41％，最低值為2.17％。按黃芩飲片的含量限度8％計(jì)算，制劑中黃芩苷的理論含量應(yīng)不低于2.4％，考慮到生產(chǎn)和貯存過(guò)程中難免有損失，因此將本品中黃芩苷的含量限度定為不得少于2.0％為宜。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量控制方法，其特征在于包括如下步驟(1)魚(yú)腥草中的甲基正壬酮檢測(cè)取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸30g，加水500ml，按揮發(fā)油測(cè)定法甲法，在測(cè)定器刻度部分加滿(mǎn)水，加入2-5ml醋酸乙酯，提取揮發(fā)油2-5小時(shí)，放冷，分取蠟酸乙酯層，作為供試品溶液，另取甲基正壬酮對(duì)照品，加醋酸乙酯到制成每ml含0.1ml的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶出液6μl，對(duì)照品溶液4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜中相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(2)黃芩中的黃芩苷檢測(cè)取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸1-3g，加溫水10-30ml，超聲10分鐘，調(diào)PH1.5～2，80℃保溫1h，離心，棄去上清液，沉淀水洗二次，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試液，另取黃芩甙對(duì)照品，加甲醇制成每ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試液1μl，對(duì)照品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；(3)連翹中的連翹苷檢測(cè)取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸30g，加水100ml，溫?zé)崛芙猓{(diào)PH1.5～2，80℃保溫1h，離心，取上清液，乙醚提取三次，母液用醋酸乙酯提取2-3次，合并醋酸乙酯提取液，蒸干，10ml水溶解，加在D101大孔樹(shù)脂柱上，用100ml水洗脫，再用25％-50％乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，繼用50％80％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，加10ml水溶解，加入中性氧化鋁適量，拌勻，減壓干燥，加入中性氧化鋁柱，50％-80％乙醇洗脫100ml，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?ml甲醇使溶解，作為供試液，另取連翹甙對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試液3μl，對(duì)照品溶液1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(4)金銀花中的綠原酸檢測(cè)取鑒別(3)下25％-50％乙醇洗脫液，水浴蒸干，甲醇溶解，定容于5ml量瓶，作為供試液，另取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試液2μl，對(duì)照品溶液2μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置365nm熒光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；(5)板藍(lán)根中的氨基酸檢測(cè)取復(fù)方魚(yú)腥草滴丸5g，加水150ml溫?zé)崛芙?，加在氫型?qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱上，加水300ml沖洗，洗至接近無(wú)色，再用0.2N-0.7N氨水400ml洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)?ml稀乙醇溶解，作為供試品溶液。另取精氨酸對(duì)照品，加稀乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試液、對(duì)照品溶液各1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量控制方法，其特征在于含黃芩以黃芩苷計(jì)不少于2.0％，五個(gè)定性鑒別均呈正反應(yīng)則判定該產(chǎn)品合格。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量控制方法，其特征在于色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為240-340nm，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2300。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量控制方法。該方法使用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方魚(yú)腥草滴丸中黃芩苷的含量、用薄層色譜法對(duì)魚(yú)腥草中的甲基正壬酮、黃芩中的黃芩苷、連翹中的連翹苷、金銀花中的綠原酸、板藍(lán)根中的精氨酸進(jìn)行定性鑒別，通過(guò)上述定性定量方法控制復(fù)方魚(yú)腥草滴丸的質(zhì)量可以使產(chǎn)品達(dá)到安全、有效、穩(wěn)定、可控的效果。
文檔編號(hào)A61P11/04GK101040951SQ20071005211
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者艾樣開(kāi), 陳科茂, 鄭俊鳳, 徐發(fā)紅 申請(qǐng)人:江西天施康中藥股份有限公司