專利名稱：：魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種魚精多肽成分的用途，特別涉及一種魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途。
背景技術(shù)：
：魚精蛋白(Protamine)也稱精蛋白，是一種堿性蛋白質(zhì)，主要存在于魚類(鮭魚、鯡魚、鱒魚)的成熟精子細(xì)胞中。其分子量較小，一般在10KDa左右。人們已將它作為天然防腐劑應(yīng)用于食品保鮮和儲藏。同時，魚精蛋白是目前體外循環(huán)心臟手術(shù)中唯一用于拮抗肝素的藥物，對其作用機(jī)理和手術(shù)中的不良反應(yīng)都有大量的報道。另外，發(fā)現(xiàn)魚精蛋白對腫瘤血管的形成有抑制作用，通過阻止毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移動從而影響血管形成；也能抑制血管炎癥的發(fā)生。紫外線，離子輻射，化學(xué)反應(yīng)等過程產(chǎn)生的活性氧自由基能引起一系列的病理反應(yīng)，如DNA損傷，癌變和細(xì)胞降解等。在需氧生物體內(nèi)，自由基的產(chǎn)生不可避免。其中超氧陰離子自由基和羥自由基是兩種最具代表性的自由基。它們很不穩(wěn)定，能與體內(nèi)的各種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷和死亡?？寡趸瘎┚哂星宄杂苫脱泳徶|(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生。另外，抗氧化劑也能通過保護(hù)脂質(zhì)成分的氧化降解來保留食物的質(zhì)量。因此，尋找抗氧化劑，特別是食物來源的天然氧化劑具有非常重要的意義。近些年來，來源于食物蛋白酶解產(chǎn)物的生物活性肽受到越來越多的關(guān)注。目前許多來自食物蛋白酶解產(chǎn)物的自然活性肽具有抗氧化作用。Chen等人發(fā)現(xiàn)大豆多肽能有效延緩脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且這些多肽的一級結(jié)構(gòu)與它們的活性間有重要的聯(lián)系。Li等人從豬膠原酶解產(chǎn)物中獲得了具有抗氧化和自由基清除活性的多肽序列。另外，人們從魚業(yè)加工副產(chǎn)品中提取獲得很多具有抗氧化活性的多肽，如黃鰭金槍魚魚皮明膠酶解產(chǎn)物，黃鰭金槍魚骨架蛋白酶解產(chǎn)物，阿拉斯加雪魚魚皮明膠酶解產(chǎn)物以及codframe蛋白酶解產(chǎn)物。魚精是一種主要由魚精蛋白和DNA組成的混合物，在漁業(yè)加工過程中一般作為副產(chǎn)物而丟棄。其中魚精蛋白是一種陽離子多肽，在醫(yī)學(xué)中可用作注射用胰島素的載體，肝素拮抗劑等。近來，魚精蛋白經(jīng)常被用作食品的抗菌成分。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和資源的不斷匱乏，魚精蛋白和魚精蛋白酶解產(chǎn)物受到越來越多的重視。由于魚精蛋白(Protamine)來源于魚白--這種漁業(yè)加工過程中通常被拋棄的副產(chǎn)物，被胰酶酶解后形成魚精多肽(Protaminehydrolysate)。目前，對于酶解形成的多肽及其多肽產(chǎn)品，其中大多有效成分不明確，作用機(jī)理不清楚，包括其特定的生物學(xué)功能、水解后各種多肽片斷的分子量和氨基酸殘基數(shù)等。相關(guān)的研究報道都非常少。因此，如何深入研究其機(jī)理及其新用途，用以開發(fā)新品適應(yīng)市場需求，充分利用天然資源造福于人類，是該領(lǐng)域科研技術(shù)人員不斷研究開發(fā)的新課題之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備藥物、保健品或化妝品中的新用途。實際上，本發(fā)明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能藥物中的應(yīng)用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分并配以其它輔料。涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備治療或預(yù)防性功能障礙藥物中的應(yīng)用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分并配以其它輔料。涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能保健食品中的應(yīng)用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分并配以其它輔料。還涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗衰老和美白化妝品中的應(yīng)用；可將魚精多肽中的抗氧化二肽作為主要有效成分并配以其它輔料。通過凝膠色譜、離子交換色譜和反相HPLC等色譜分離方法，將獲得的一系列抗氧化性的多肽組分，根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用和NCBI數(shù)據(jù)庫搜尋，具有最高抗氧化活性的多肽被鑒定為Pro-Arg，處于魚精蛋白序列中1-2和16-17殘基部位。這個合成的新二肽不僅具有強的清除羥自由基活性，而且能明顯降低胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，從而保護(hù)人二倍體成纖維細(xì)胞免受氧化損傷。本發(fā)明的有益效果是經(jīng)研究，魚精多肽(Protaminehydrolysate)是魚精蛋白由酶水解作用后形成的多肽片段，其氨基酸組成的最大特點就是堿性氨基酸占有較大比例，因此其堿性很強，可溶于水和稀酸，熱穩(wěn)定性較好。同時還具有低抗原性和免疫原性等特點。魚精多肽不僅具有魚精蛋白中和肝素等作用，還具有很高的營養(yǎng)價值和多種生理功能，易消化吸收，在抗氧化、抗疲勞、性功能都有明顯作用。魚精多肽不僅在體外具有較強的羥自由基、DPPH和超氧陰離子清除活性，而且也能明顯提高Wistar大鼠的抗疲勞和抗氧化能力。通過凝膠色譜、離子交換色譜和反相HPLC等色譜分離方法，我們最終獲得了一系列抗氧化性的多肽組分。根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用和NCBI數(shù)據(jù)庫搜尋，具有最高抗氧化活性的多肽被鑒定為Pro-Arg，處于魚精蛋白序列中1-2和16-17殘基部位。這個合成的新二肽不僅具有強的清除羥自由基活性，而且能明顯降低胞內(nèi)氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，從而保護(hù)人二倍體成纖維細(xì)胞免受氧化損傷。通過體內(nèi)體外抗氧化模型，篩選活性多肽有效組分或成分，揭示其作用機(jī)理。其目的意義在于(1)為開發(fā)新產(chǎn)品打下堅實的基礎(chǔ)，為開發(fā)一系列新的多肽產(chǎn)品提供思路和方法，同時為研究和開發(fā)多肽的新功效作用提供數(shù)據(jù)；(2)通過其作用機(jī)理的研究，不僅在研究理論角度揭示了活性多肽的作用機(jī)理，而且也為宣傳和推銷公司產(chǎn)品提供理論依據(jù)，將為市場營銷帶來明顯的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)；(3)也將為活性肽的研究提供數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，推動多肽產(chǎn)品的研究和開發(fā)，有助于滿足人們?nèi)找嫣岣叩纳钏叫枰Ｍㄟ^D-gal誘導(dǎo)的亞急性衰老的大鼠模型，我們研究發(fā)現(xiàn)魚精多肽除具有基本營養(yǎng)功能外，在體內(nèi)具有明顯的抗氧化活性。魚精多肽能明顯提高大鼠血清，腦和肝組織中的SOD活力，并明顯降低MDA的含量。在這項研究中，我們研究了魚精多肽在對于羥自由基，DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除活性，并通過層析方法并主要以羥自由基作為篩選指標(biāo)分離獲得具有抗氧化活性的多肽，通過液質(zhì)聯(lián)用、NCBI數(shù)據(jù)庫搜索和蛋白序列分析，對其一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和鑒定?？傊?，本發(fā)明對今后開發(fā)利用魚精多肽中的抗氧化二肽提純物質(zhì)進(jìn)行藥品、保健品及化妝品等各種產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。具體實施例方式以下結(jié)合較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施方式詳述如下實施例1本發(fā)明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備藥物、保健品或化妝品中的新用途。實際上，本發(fā)明涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能藥物中的應(yīng)用。易吸收消化性和營養(yǎng)功能蛋白質(zhì)在小腸內(nèi)經(jīng)過各種消化酶的作用形成水解產(chǎn)物包括游離氨基酸(freeaminoacid，F(xiàn)AA)和大量的寡肽(01igopeptide，OP)。寡肽進(jìn)入小腸絨毛刷狀緣，在氨基肽酶作用下以二肽、三肽(SmallPeptide,SP)的形式完整地進(jìn)入血液循環(huán)而被組織利用。Newey等研究證實了完整雙甘肽的轉(zhuǎn)運過程，并首次提出蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物中的二肽、三肽可被完整吸收的觀點。Bamba等研究發(fā)現(xiàn)小肽作為腸腔的吸收底物，不僅增加刷狀緣氨基肽酶的活性，而且提高二肽酶和氨基酸載體的活性及數(shù)目。魚精多肽是魚精蛋白的水解產(chǎn)物，是由許多寡肽和游離氨基酸組成，其氨基酸的組成幾乎完全與魚精蛋白一樣。不僅具有良好的溶解性，而且在受熱或在偏酸偏堿的條件下，都有較強的穩(wěn)定性；即使在高濃度條件下，仍有較好的流動性；并具有良好的保濕性。因此，直接補充多肽可加速體內(nèi)氨基酸的吸收、提高機(jī)體對氮的利用率，提供人體生長、發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。同時，魚精多肽具有低的抗原性和免疫原性，這一性質(zhì)不僅在臨床上有實用價值，而且可以給易引起食物過敏的人們提供一種比較安全的蛋白食品?？蛊诠δ躄oon等在實驗中發(fā)現(xiàn)男性自行車運動員運動后補充小麥蛋白水解物及其與碳水化合物(CHO)的混合物后，血液胰島素分別增加了52%和107%(與只補充CHO比較)，并發(fā)現(xiàn)血漿中可利用的氨基酸水平明顯提高。Nikawa等研究發(fā)現(xiàn)，對跑臺運動大鼠補充大豆蛋白水解物(SPI)可顯著提高運動能力，減輕肌肉蛋白降解，明顯抑制血清肌酸激酶(CK)活性的升高。我們利用Wistar大鼠D—半乳糖衰老模型來研究魚精多肽的抗疲勞功能。把Wistar大鼠分為四組(對照組、投藥組、衰老模型對照組和衰老模型保護(hù)組)，投藥組和衰老模型保護(hù)組分別用魚精多肽灌胃56天后，進(jìn)行爬桿實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠的爬桿時間投藥組是對照組的1.8倍，衰老模型保護(hù)組是衰老模型對照組的2.23倍，這說明魚精多肽能明顯提高了Wistar大鼠的抗疲勞能力。運動員在劇烈運動初期，首先消耗體內(nèi)儲存的三磷酸腺苷(ATP)和肌酸磷酸(CP)，然后分解糖原，經(jīng)苯丙酸至乳酸，在這期間還產(chǎn)生ATP又可作為能源。ATP、CP糖原在體內(nèi)的儲存量與肌肉的產(chǎn)能量成比例關(guān)系，而我們的結(jié)果也證明魚精多肽的確能明顯提高肌糖原的含量。運動員劇烈運動后，需要加強恢復(fù)，尤其需要修復(fù)運動所致的骨骼肌細(xì)胞微細(xì)損傷。這時需要將大量的氮轉(zhuǎn)運進(jìn)入肌肉細(xì)胞，而補充多肽不僅吸收快，而且保氮力強，能促進(jìn)肌肉合成代謝?？寡趸δ蹸hen等^發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物具有抗亞油酸脂質(zhì)過氧化作用，并且從中分離得到了6種抗氧化活性肽，其中分子量最小的是一個5肽(Leu-Leu-Pro-His-His)。我們以甘露醇為對照191，進(jìn)行魚精多肽對Fenton體系產(chǎn)生，OH的清除試驗，多肽在試驗濃度(l-80mg/ml)范圍內(nèi)對。H均有較強的清除作用，并隨著濃度增加清除率增大。在l-20mg/ml濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，清除率增加很快，呈劑量線性關(guān)系，其對，OH的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)值為11.79mg/ml，研究發(fā)現(xiàn)魚精多肽對OH的清除效果明顯比對照甘露醇好。魚精多肽富含供氫體，具有提供氫質(zhì)子的能力，'使具有高度氧化性的自由基還原，從而達(dá)到終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的目的。許多天然抗氧化劑的抗氧化活性與加入量不呈線性關(guān)系，加入量過大或過小之后，可能變?yōu)橹趸瘎?。如a-生育酚和Y-生育酚在濃度超過500mg/kg，S-生育酚在濃度超過1000mg/kg時，都將產(chǎn)生助氧化效果；維生素C和半胱氨酸在低濃度時也表現(xiàn)出助氧化效果。在魚精多肽所試驗的各個濃度下，均沒有出現(xiàn)助氧化作用。體外的抗氧化實驗我們進(jìn)行了魚精多肽對Fenton體系產(chǎn)生，OH的清除試驗，DPPH自由基的清除試驗，PMS-NADH體系產(chǎn)生超氧陰離子的清除試驗，結(jié)果如表6，魚精多肽在體外反應(yīng)體系均表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性；同時我們進(jìn)一步把魚精多肽這一酶解得到的不同分子片段的多肽混合物，通過凝膠柱G-35分離純化，收集得到三個組分G1、G2和G3(254nm下不同吸收峰收集)，.OH清除實驗等的結(jié)果顯示，在較低的濃度下，組分G3仍然表現(xiàn)出高的清除活性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照的清除活性。在清除羥自由基的反應(yīng)體系中以甘露醇為對照，D-甘露醇是自然界中廣泛存在的一種活性物質(zhì)，具有良好的抗氧化活性，有報道表明不同劑量的D-甘露醇對組織具有很好的保護(hù)作用。而魚精多肽粗品對OH清除作用比陽性對照甘露醇的效果好，這表明魚精多肽具有良好的抗氧化活性。許多天然抗氧化劑的抗氧化活性與加入量不呈線性關(guān)系，加入量過大或過小之后，可能變?yōu)橹趸瘎?。如a-生育酚和"生育酚在濃度超過500mg/kg，S-生育酚在濃度超過1000mg/kg時，都將產(chǎn)生助氧化效果；維生素C和半胱氨酸在低濃度時也表現(xiàn)出助氧化效果。在魚精多肽所試驗的各個濃度(l-80mg/ml范圍)下，沒有出現(xiàn)助氧化作用。正常生理條件下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，這種平衡一旦被破壞，會導(dǎo)致過量自由基產(chǎn)生。因此，造成組織細(xì)胞中生物大分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞性變化，包括損害生物膜，導(dǎo)致衰老，基因突變與癌變。魚精多肽的抗氧化機(jī)理可能類似于肌肽、大豆肽和玉米肽，富含供氫體，具有提供氫質(zhì)子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，終止自由基連鎖反應(yīng)，從而起到清除或抑制自由基的目的。本實驗采用較高劑量的多肽灌胃Wistar大鼠，以考察魚精多肽對大鼠體力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表l)，藥物組大鼠的爬桿時間是對照組的1.8倍，而且有統(tǒng)計學(xué)上的極顯著差異(戶O.001);藥物組的肌糖原含量是對照組的2倍，結(jié)果也有顯著差異；而肝糖原的含量結(jié)果表明對照組和藥物組沒有明顯差異。在運動中，機(jī)體運動能力的降低是由于體力性疲勞的出現(xiàn)所致，因而延緩體力性疲勞的出現(xiàn)有助于機(jī)體運動能力的保持。在劇烈運動初期，首先消耗體內(nèi)儲存的三磷酸苷(ATP)和肌酸磷酸(CP)，然后分解糖原，經(jīng)苯丙酸至乳酸，在這期間還產(chǎn)生ATP又可作為能源，ATP、CP糖原在體內(nèi)的儲存量與肌肉的產(chǎn)能量成正比關(guān)系，而魚精多肽被吸收進(jìn)入體內(nèi)有助于肌糖原的積累。另一方面，在劇烈運動后，需要加強恢復(fù)，尤其需要修復(fù)運動所致的骨骼肌細(xì)胞微細(xì)損傷。這時需要將大量的氮轉(zhuǎn)運進(jìn)入肌肉細(xì)胞，而快速吸收的多肽能提供大量氮源，從而促進(jìn)肌肉的合成代謝。Newey等MI的研究證實了完整雙甘肽的轉(zhuǎn)運過程，并首次提出蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物中的二肽，三肽可被完整吸收的觀點。魚精多肽不僅吸收快，而且保氮力強，吸收進(jìn)入體內(nèi)后，能促進(jìn)肌肉合成代謝，具有調(diào)整體內(nèi)代謝和快速加強體質(zhì)恢復(fù)的作用，從而延緩體力性疲勞的出現(xiàn)，增強大鼠的體能。表l.爬桿實驗數(shù)據(jù)組別爬桿時間肌糖原肝糖原(s)(mg/g)(mg/g)對照組108±80.35±0.19.6±4.4藥物組194±23"*0.70±0.1**8.1±2.6與對照組相比，*(尸<0.05)，**(尸<0.01)，***(尸<0.001)。本實驗通過考察藥物組大鼠SOD活性和MDA含量的變化，研究魚精多肽在體內(nèi)的抗氧化作用。結(jié)果如表2、表3，結(jié)果表明藥物組大鼠的血清SOD活性較對照組有明顯升高，上升了14%;而MDA含量則下降了30。/。。藥物組肝組織的SOD活力較對照組有明顯升高，約為對照組的1.5倍，而MDA含量則略有下降，這與血清SOD活力和MDA含量結(jié)果相似；藥物組腦組織的MDA含量較對照組明顯降低，而SOD活力基本沒有明顯變化。表2.血清中SOD活力和MDA含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與對照組相比，*(尸<0.05)，**(尸O.Ol)，***(尸O.OOl)。大鼠在補充魚精多肽后，血清、腦組織和肝組織MDA含量都明顯降低，丙二醛(MDA)作為一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它的高低反應(yīng)了機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反應(yīng)了細(xì)胞受損傷的程度。這說明魚精多肽在體內(nèi)能有效的抵抗自由基對于機(jī)體的損傷，而SOD活力的升高也可能是防止機(jī)體損傷的一個重要原因。魚精多肽富含精氨酸…NO的前體物，大量的精氨酸的吸收易導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)NO水平的升高；同時，我們測定了血清中NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物組的NO含量和NOS活性明顯高于對照組。而NO作為體內(nèi)傳遞信息的第二信使，廣泛地參與各種免疫反應(yīng)，可通過與細(xì)胞內(nèi)外的靶部位結(jié)合，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。NO不僅可激活多種保護(hù)性蛋白的作用；也可抑制中性粒細(xì)胞的超氧陰離子產(chǎn)生，并與其結(jié)合形成無毒的代謝產(chǎn)物N03，從而使機(jī)體避免反應(yīng)性氧中間產(chǎn)物的損害。實施例2涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備治療或預(yù)防性功能障礙藥物中的應(yīng)用。*通過分析迄今發(fā)現(xiàn)的各類魚精多肽的氨基酸序列，精氨酸一般占三分之二以上，這是一種堿性非必需氨基酸，是Kossel最早在1896年從魚精蛋白的水解液中發(fā)現(xiàn)的。魚精多肽在體內(nèi)起生理作用的主要是L-精氨酸，精氨酸在人體多個器官系統(tǒng)中都具有重要作用。W44年Holt和Albanesi證實了精氨酸的缺乏和睪丸功能的損傷有關(guān)，精氨酸不僅提高附睪精子的發(fā)生，并以磷酸精氨酸的形式作為精子運動的能源。Patel等通過對精氨酸刺激山羊附睪精子糖酵解的NMR研究，探討了精氨酸在精子代謝活動中的機(jī)制，證實其具有催化劑的作用。在對比實驗中，精氨酸在適宜濃度下使代謝率提高了23倍。同時，精氨酸不僅能提高精子的發(fā)生和代謝，而且也能提高ATP水平，這對精子的運動是必須的。Funahashi對精氨酸和一氧化氮合酶誘導(dǎo)公豬精子獲能和頂體反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)精氨酸可誘導(dǎo)精子獲能和頂體反應(yīng)，并提高細(xì)胞外的一氧化氮(NO)的量。精氨酸在治療男性不育癥方面的臨床應(yīng)用在國外嘗試較多。Aydin等用精氨酸、消炎痛、激肽釋放酶治療45例少精子癥和弱精子癥者，其中15例接受精氨酸治療，連續(xù)服用3個月。結(jié)果證實這些藥均可在一定程度上提高精子的數(shù)目和運動性。我們的實驗結(jié)果顯示，用魚精多肽灌胃大鼠(56天)，其組織和血清中的NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性比對照生理鹽水組都有明顯的提高。這都說明魚精多肽對性保健方面有一定的作用。精氨酸參與精子的形成，也是精子各種核蛋白的基本成分在精子形成階段伴隨著核的濃集和核蛋白類型的轉(zhuǎn)變，即從賴氨酸型的組蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼嵝偷聂~精蛋白。精氨酸與男性不育的關(guān)系主要是與魚精蛋白發(fā)生異常有關(guān)聯(lián)，當(dāng)富含賴氨酸的組蛋白轉(zhuǎn)型變成富含精氨酸的魚精蛋白時，出現(xiàn)的轉(zhuǎn)換異?；蛉毕菥梢鹉行圆挥?。人體內(nèi)精氨酸缺乏或體內(nèi)含量不足時可以引起精子蛋白質(zhì)的改變，使DNA不穩(wěn)定，不易受精或造成早期胚胎發(fā)育終止。精氨酸可逆轉(zhuǎn)糖酵解抑制劑對細(xì)胞的影響，保持細(xì)胞ATP的正常水平，提高精子的發(fā)生和代謝。精氨酸延緩精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，維持胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和通透性，使精子具有良好的活動力。NO是在NOS的作用下，由精氨酸和分子氧反應(yīng)產(chǎn)生的，NO在體內(nèi)生成后直接擴(kuò)散進(jìn)入鄰近細(xì)胞，與鳥苷酸環(huán)化酶中亞鐵血紅素分子的鐵離子結(jié)合并激活該酶，致使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)生成增加。cGMP作為體內(nèi)重要的第二信使之一，激活多種cGMP特異依賴性蛋白激酶而發(fā)揮各種生理功能，包括對平滑肌舒張調(diào)節(jié)和前列腺分泌的調(diào)節(jié)，從而對男性的生殖系統(tǒng)具有重要作用。交配實驗和性激素都是性功能主要評價指標(biāo)，實驗結(jié)果如表4和表5。結(jié)果顯示，雄性大鼠在交配過程中對照組和藥物組沒有表現(xiàn)顯著差異，而血清中睪酮含量略有下降，但也沒有顯著差異，這和行為實驗的結(jié)果基本一致。這說明魚精多肽在性功能方面沒有明顯作用。然而魚精蛋白以含大量精氨基的堿性蛋白，其酶解產(chǎn)物中的大量精氨酸是精子形成的重要成分，大量研究結(jié)果也表明了精氨酸在性功能特別是在男性不育癥和弱精癥等方面有明顯作用；同時我們研究顯示魚精多肽在抗疲勞抗氧化方面表現(xiàn)出明顯的作用，而交配能力和抗疲勞能力緊密相關(guān)。因此，魚精多肽可能在性功能的某一些方面有一定作用，而不僅僅局限于交配能力方面。表4.血清中睪酮和雌二醇的含量組別睪酮(ng/ml)雌二醇(pg/ml)對照組2.28±1.518.37±2.4藥物組1.36±0.816.06±1.7與對照組相比，*(尸<0.05)表5.交配實驗數(shù)據(jù)組別捕捉潛伏期(S)捕捉次數(shù)(20min)對照組137.5±16.315.5±2.5藥物組166.5±24.513.6±2.4與對照組相比，*(尸<0.05)實施例3.涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能保健食品中的應(yīng)用。應(yīng)用機(jī)理同實施例l。實施例4還涉及魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能化妝品中的應(yīng)用。應(yīng)用機(jī)理同實施例l?？傊?，通過體內(nèi)、體外實驗研究表明，魚精多肽具有較強的抗氧化活性，也能明顯提高Wistar大鼠的抗疲勞能力。魚精多肽不僅是一種具有較強的抗氧化活性的物質(zhì)，而且可加速體內(nèi)氨基酸的吸收、提高機(jī)體對氮的利用率，提供肌體生長、發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。合成的新的二肽在體外不僅有明顯的清除羥自由基活性，而且明顯降低MRC-5胞內(nèi)自由基的含量，從而保護(hù)細(xì)胞避免氧化損傷。因此我們正進(jìn)一步從魚精多肽中分離具有較強活性的功效成分，系統(tǒng)地研究其作用機(jī)理，為魚精多肽的廣泛應(yīng)用打下基礎(chǔ)。體內(nèi)和體外研究都證明魚精多肽都具有明顯的抗氧化活性，因此我們基于抗氧化功能，進(jìn)行進(jìn)一步分離純化的研究。自由基的存在可以破壞有機(jī)體內(nèi)細(xì)胞膜、DNA、酶和蛋白的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致一些疾病。氧化應(yīng)激反應(yīng)在許多衰老疾病中具有重要作用，如動脈粥樣硬化等，造成這些疾病的因素包括脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及氧化反應(yīng)后期產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)。從大豆、雞蛋清蛋白和魚蛋白酶解產(chǎn)物中得到的天然抗氧化劑不僅具有豐富的營養(yǎng)功能，而且能有效抑制和清除體內(nèi)的自由棊。這些天然抗氧化劑目前正成為食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。，我們的研究表明，來源于魚業(yè)副產(chǎn)品的魚精蛋白酶解產(chǎn)物(Protaminehydrolysate)，在體內(nèi)和體外都具有良好的抗氧化活性。這項研究為魚精多肽在食品和保健食品中應(yīng)用提供了科學(xué)而詳細(xì)的證據(jù)，也為魚精的廣泛利用提供了支持。增殖細(xì)胞如人二倍體成纖維細(xì)胞(HDFs)，通常表現(xiàn)典型的復(fù)制衰老(replicativesenescence,RS)。自1961年Haylick提出人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)有限增殖實驗，可以作為研究細(xì)胞衰老的模型以來，細(xì)胞衰老研究多采用人二倍體成纖維細(xì)胞。而且，人二倍體成纖維細(xì)胞(HDFs)如MRC-5，在遭遇各種不到致死量的脅迫如氧化脅迫等，表現(xiàn)出脅迫誘導(dǎo)的過早衰老特征(stress-inducedprematuresenescence,SIPS)，SIPS通常和RS的表型一致。許多研究表明二倍體成纖維細(xì)胞在過氧化氫誘導(dǎo)的氧化脅迫下，顯示出衰老、RS的典型變化和氧化損傷。因此我們采用人二倍體成纖維細(xì)胞來研究藥物的抗衰老和抗氧化功能。魚精多肽對自由基的清除試驗結(jié)果如表6，多肽在試驗濃度(l-80mg/ml)范圍內(nèi)對-OH均有較強的清除作用，并隨著濃度增加清除率增大。在l-20mg/ml濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，清除率增加很快，呈劑量線性關(guān)系；但魚精多肽在高濃度(20-80mg/mO的情況下，隨濃度的增大，清除率上升趨勢緩慢，這可能是魚精多肽已趨于飽和的原因。同時，不同濃度點的魚精多肽對OH的清除效果都明顯比對照甘露醇好，魚精多肽對'OH的半數(shù)抑制濃度(IC50)值為11.79mg/ml，而甘露醇的ICs。值為20.48mg/ml。而魚精多肽對DPPH自由基的清除活性在6mg/ml范圍內(nèi)，其清除率具有明顯的劑量依賴性。超過6mg/ml后，清除率不隨劑量增加而升高，其lCso值為2.79mg/ml。但是，研究發(fā)現(xiàn)甘露醇在DPPH系統(tǒng)基本沒有清除率，即使在高濃度，也未表現(xiàn)任何清除率。因此，甘露醇不適合DPPH系統(tǒng)；而VitaminC作為對照，則表現(xiàn)出高清除活性，ICso值為0.0127mg/ml。在PMS-NADH體系中，魚精多肽對超氧陰離子的清除活性明顯比對照VitaminC高，在5mg/ml時其清除活性是VitaminC的2.11倍。因此，多肽在不同反應(yīng)體系中活性表現(xiàn)并不完全一致，但總的說來魚精多肽表現(xiàn)出明顯清除自由基的能力。表6.魚精多肽和分離組分在反應(yīng)體系中清除自由基的抗氧化活性^1羥自由DPPH自由超氧陰離子樣品(mg/ml)基的清除率基清除率的清除率(%)(%)(%)Protemins16.42±0.8225.41±2.3010.38±0.85hydrolysate211.32±1.8742.78±0.4423.59±1.9931.45±2.0566.61±1.7629.88±1.58Gl0.513.95±0.3718.31±1.8224.20±0.63124.47±1.8621.21±3.4328.10±2.80G20.51^.68±1.112.74±1.6117.83±1.40132.11±2.9812.77±1.8722.07±0.14G30.533.95±0.379.75±0.9320.99±1.54153.95±1.8638.47±4.2639.04±3.81Mamiitol11.12±0.3120.17±1.510.75±0.221039.84±1.111.36±0.49VitaminC198.12±0.779.10±0.4798.72±1.0214.11±0.311021.21±0.55注protaminehydrolysate,Gl,G2，G3組分和甘露醇清除羥自由基的IC5o值分別為11.79,2.3,3.47,0.86and20.48mg/ml，而PHP的IC5q值為91.35pg/ml。對合成二肽清除羥自由基的活性分析基于篩選的新的二肽具有較強的抗氧化性，根據(jù)其多肽序列合成了二肽，進(jìn)一步研究其體外的抗氧化活性，結(jié)果如表7。在20ug/ml的低濃度下，合成二肽的羥自由基的清除活性達(dá)到37.29%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于篩選二肽在20ug/ml時的清除活性21.04%，甚至在5ug/ml非常低的濃度時，也表現(xiàn)出較高的清除活性。這一結(jié)果不僅表明篩選和分離純化得到抗氧化性的活性多肽是成功的，所得到的組分在抗氧化活性組分中起著重要作用；而且預(yù)示篩選得到的新的二肽在抗氧化方面包括抗氧化機(jī)理、抗氧化疾病和抗氧化產(chǎn)品等研究，可能將發(fā)揮一定的作用。表7.合成二肽清除羥自由基的活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>對合成多肽清除胞內(nèi)自由基的活性分析胞內(nèi)氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)是有氧代謝過程中不可避免的副產(chǎn)物，在化學(xué)和生物系統(tǒng)中可以通過各種途徑而產(chǎn)生，一般來說是通過鍵的斷裂反應(yīng)或是電子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)而產(chǎn)生，如果機(jī)體暴露于能量即UV和y射線下主要發(fā)生鍵的斷裂反應(yīng)，正常情況下生物系統(tǒng)中還是以電子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)占主導(dǎo)地位。《和NO是最早生成的自由基，接著它們在線粒體內(nèi)生成穩(wěn)定的非自由基形式的活性氧h202和ONOCT，最終又均裂為HO，再經(jīng)過自由基傳遞反應(yīng)，生成了ROO禾p102。ROS包括羥基自由基(HO)、超氧自由基陰離子(02:)、一氧化氮(NO)、過氧化物自由基(ROO)、過氧化氮自由基(ONOCT)、單氧(102)、次氯酸(HOCl)、過氧化氫(11202)。ROS不僅參與脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)修飾變性及影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)，也可以直接損傷DNA分子的嘌呤、嘧啶堿基及脫氧核糖的作用，造成DNA分子單鏈或雙鏈斷裂和堿基缺失，從而改變抑制或觸發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)。近年來，抗氧化劑特別是食品來源的天然抗氧化劑越來越收到關(guān)注，L-肌肽(P-丙氨酸-L-組氨酸)不僅有強的抗氧化抗衰老的作用，而且有神經(jīng)保護(hù)劑、抗癌等作用。McFarland和Holliday首次研究了L-肌肽對胎兒肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)和其它細(xì)胞系生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肽使細(xì)胞的實際群體倍增數(shù)(PD)顯著升高，細(xì)胞的壽命也顯著延長；肌肽培養(yǎng)的細(xì)胞即使進(jìn)入老年，也未出現(xiàn)衰老表型，而且更換肌肽培養(yǎng)基培養(yǎng)衰老細(xì)胞能使其年輕化。在這個實驗中，我們利用DCFH-DA作為細(xì)胞內(nèi)的氧化狀態(tài)的指示劑，進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酶的作用，加水分解為非膜通透性的DCFH，該物質(zhì)被氧化后變?yōu)镈CF會發(fā)出熒光，從而檢測細(xì)胞內(nèi)的自由基變化；同時建立MRC-5的過氧化氫(H202)氧化損傷模型，研究合成的新的二肽對胞內(nèi)氧自由基清除作用。結(jié)果顯示，無論在100uMH2O2組或300uMH2O2組，隨著二肽濃度的增加，胞內(nèi)ROS含量都明顯降低。當(dāng)二肽濃度達(dá)到250ug/ml時和不加二肽組(Oug/ml二肽組)相比，胞內(nèi)ROS含量明顯降低，并出現(xiàn)極顯著差異，其含量幾乎和不加11202的對照組相當(dāng)。而不加H202的對照組和不加二肽組相比較，胞內(nèi)ROS含量明顯降低，也說明實驗?zāi)Ｐ褪浅晒Φ?；同時300uM&02組比100uMH202組的ROS含量普遍高，也說明H202誘導(dǎo)產(chǎn)生胞內(nèi)ROS，模型非常成功。合成多肽在細(xì)胞周期方面的作用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry,FCM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對細(xì)胞的物理性質(zhì)及化學(xué)性質(zhì)，如細(xì)胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進(jìn)行快速測定并可分類收集的技術(shù)。我們通過PI標(biāo)記DNA，由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出Go/Gi期^、S期%、G2/M期X，以判斷細(xì)胞周期狀態(tài)的指標(biāo)，結(jié)果如表8。我們用300uMH202分別作用MRC-53h和6h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞8期％由28.07%變?yōu)?3.49%和41.17%，相對的G2/M期細(xì)胞比例下降，說明H202作用后細(xì)胞周期被明顯阻斷在S期。通過二肽25ug/ml、125ug/ml作用24h后，細(xì)胞S期％由模型組41.17%下降為37.72%和30.57%，而G2/M期細(xì)胞則有所上升，并有明顯的劑量效應(yīng)，這結(jié)果和空白對照組非常接近，說明二肽有明顯的氧化保護(hù)作用。從細(xì)胞周期的代謝過程看，細(xì)胞周期各時相的DNA含量不同，Gi期為DNA合成前期，此期為過渡至S期做準(zhǔn)備，S期為DNA合成期，S期。/?？煞从臣?xì)胞的分裂活力，增值旺盛的細(xì)胞處于S期的比例較高；G2為DNA合成后期，M期為有絲分裂期，(S+G2M)。/。為增殖指數(shù)PI，代表了該細(xì)胞群體中增殖期細(xì)胞的數(shù)量，在一定程度上可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，這個實驗中(S+G2M)。/。沒有明顯的變化，可能表示二肽沒有明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。表8:合成二肽對細(xì)胞周期的作用細(xì)胞周期中不同時期細(xì)胞比例(％)G。/G!SG2/MNon6H2O2(300uM)H202(300uM)+dipeptide(25ug/ml)45.79±1.0643.23±1.2544.49±1.4128.07±1.0741.17±0.8"37.72±0.77*'26.14±2.1417.79±1.04*H202(300uM)+dipeptide(125ug/ml)46.18±0.9230.57±0.38#23.25±0.57*'#與對照組(None)相比，*尸<0.05;與模型組H2O2(300uM)相比，#尸<0.05合成的新的二肽在體外不僅有明顯的清除羥自由基活性，而且明顯降低MRC-5胞內(nèi)自由基的含量，從而保護(hù)細(xì)胞避免氧化損傷。上述參照實施例對該魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能藥物中的應(yīng)用。2、魚精多肽中的抗氧化二肽在制備治療或預(yù)防性功能障礙藥物中的應(yīng)用。3、魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能保健食品中的應(yīng)用。4、魚精多肽中的抗氧化二肽在制備抗氧化、抗衰老和美白化妝品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種魚精多肽中的抗氧化二肽的新用途，深入拓展其在制備抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能等藥物、保健品或化妝品中的新用途，用以開發(fā)新品適應(yīng)市場需求，充分利用天然資源造福于人類。通過凝膠色譜、離子交換色譜和反相HPLC等色譜分離方法，將獲得的一系列抗氧化性的多肽組分，根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用和NCBI數(shù)據(jù)庫搜尋，具有最高抗氧化活性的多肽被鑒定為Pro-Arg，處于魚精蛋白序列中1-2和16-17殘基部位。這個合成的新二肽不僅具有強的清除羥自由基活性，而且能明顯降低胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，從而保護(hù)人二倍體成纖維細(xì)胞免受氧化損傷。這些結(jié)果為魚精多肽作為藥品、保健食品及化妝品原料提供理論基礎(chǔ)，同時也為廣泛利用魚白提供科學(xué)依據(jù)。文檔編號A61K8/64GK101371918SQ20071005927公開日2009年2月25日申請日期2007年8月24日優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日發(fā)明者吳巧玲,朱鋒榮,王勇剛,王賀瑤,韓福森申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司