專利名稱：：人乳腺癌組織抗原及其編碼基因、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種腫瘤相關(guān)抗原，尤其涉及人乳腺癌組織抗原及其編碼基因，本發(fā)明還涉及表達(dá)該人乳腺癌組織抗原的重組表達(dá)載體、含有該重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞和重組抗原的分離和純化方法、該重組抗原在早期診斷或治療乳腺癌中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
：乳腺癌是女性最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌而位居第二位，且發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)。在我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)，尤其在京、津、滬三大城市的部分地區(qū)中，乳腺癌發(fā)病率已居于女性惡性腫瘤的首位；西歐和北美經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的婦女中，乳腺癌是一種主要的死亡原因。乳腺癌的自然病程以臨床前期最長(zhǎng)，約占疾病全程的2/3。早期癌中多數(shù)尚未出現(xiàn)明顯包塊或腫塊較小，此時(shí)治療效果較好。有研究表明，乳腺癌原發(fā)灶越小，預(yù)后越好。T4、T3、T2、T1期乳腺癌的10年生存率分別為19.7%、46.0%、62.6%、87.8%。直徑小于lcm的微小癌，其10年總體生存率在90%99%。由此可見(jiàn)，早期診斷和早期治療是降低乳腺癌死亡率的關(guān)鍵。目前臨床常用的早期診斷乳腺癌的方法主要有乳房鉬靶X射線攝影、超聲診斷、近紅外線掃描、CT及MRI等。這些常規(guī)影像學(xué)方法只能發(fā)現(xiàn)直徑^lcm的結(jié)節(jié)(約lg)，相當(dāng)于109個(gè)腫瘤細(xì)胞。乳腺癌從單細(xì)胞發(fā)展到臨床能檢出的lcm小腫塊，其生長(zhǎng)期一般已逾3年，此時(shí)常常已出現(xiàn)其它系統(tǒng)或器官的轉(zhuǎn)移。既往研究業(yè)已證明生物化學(xué)標(biāo)志物最低檢測(cè)限為108個(gè)腫瘤細(xì)胞，因此能在亞臨床期較早的發(fā)現(xiàn)乳腺癌，從而更加有利于早期診斷及早期治療乳腺癌，降低其死亡率。目前常用的檢測(cè)乳腺癌的標(biāo)志物有CEA、MUC-1、CK-19等，但這些指標(biāo)均缺乏特異性，因而缺乏診斷價(jià)值，限制了它們的臨床應(yīng)用。因此，研究和發(fā)現(xiàn)乳腺癌的特異性標(biāo)志物，建立經(jīng)濟(jì)、更適合早期診斷乳腺癌的檢測(cè)方法，對(duì)乳腺癌防治工作無(wú)疑將起到極大促進(jìn)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的特異性高的人乳腺癌組織抗原(HumanGalactophoretissueantigen，hGTA)，該抗原可準(zhǔn)確的診斷或檢測(cè)出早期乳腺癌。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種人乳腺癌組織抗原(hGTA)，其是以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有所述抗原活性的蛋白衍生物。優(yōu)選的，本發(fā)明人乳腺癌組織抗原(hGTA)為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種編碼上述人乳腺癌組織抗原的基因。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種編碼人乳腺癌組織抗原的基因，該基因是以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列,且該核苷酸序列編碼具有所述人乳腺癌組織抗原活性的蛋白；或(c)編碼SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有所述人乳腺癌組織抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過(guò)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。優(yōu)選的，本發(fā)明編碼人乳腺癌組織抗原的基因(hGTA)是SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，該基因編碼大約36kD的分泌性糖蛋白，定位于染色體llql2.8密集基因簇內(nèi)，該基因僅在乳腺癌中表達(dá)，是繼乳腺珠蛋白之后發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)具有乳腺器官特異性的腫瘤標(biāo)志物，在一系列的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該抗原在乳腺癌的早期診斷、治療、監(jiān)測(cè)病程轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后等方面都具有重要意義。在49%原發(fā)性的I期乳腺癌腫瘤中，hGTA過(guò)度表達(dá)。這表明hGTA基因的失調(diào)多發(fā)于乳腺癌的早期。所述的"多個(gè)"通常意味著2~60個(gè)，優(yōu)選為2~15個(gè)，這些取決于乳腺癌組織特異蛋白的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸序列的改變，其中分別缺少一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸序列的改變，相對(duì)天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。所述的"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針將雜交到核酸的復(fù)合混合物中的其目標(biāo)子序列上，但并不雜交到復(fù)合混合物中的其它序列上。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中將有所不同。嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件其中在pH7.0到8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子濃度，通常為約O.Ol到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短探針(包括(但不限于)10到50個(gè)核苷酸)而言為至少約3(TC，而對(duì)于長(zhǎng)探針(包括(但不限于)大于50個(gè)核苷酸)而言為至少約6(TC。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過(guò)加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。一種例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下50%甲酰胺，5xSSC和P/。SDS，在42"C下培養(yǎng)；或5xSSC，1%SDS，在65"C下培養(yǎng)，在0.2xSSC中洗滌和在65。C下于0.1%SDS中洗滌。所述洗滌可進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是構(gòu)建含有SEQIDNO.l所示核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒及獲取含有該重組表達(dá)載體的重組菌株。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的重組表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將SEQIDNO.l所示的核苷酸序列插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使SEQIDNO:1所示的核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將SEQIDNO:l所示的核苷酸序列插入到質(zhì)粒pQE上的EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-hGTA。本發(fā)明選擇JM109作為擴(kuò)增菌，將重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-hGTA轉(zhuǎn)化入JM109中擴(kuò)增，擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)化入M15[pREP4]表達(dá)菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，M15[pREP4]工程菌成功表達(dá)了目的蛋白。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備所述的重組乳腺癌組織特異蛋白的方法。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的優(yōu)選的，一種制備重組乳腺癌組織特異蛋白的方法，包括以下步驟構(gòu)建含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒；培養(yǎng)用該重組表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組乳腺癌組織特異蛋白的表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組抗原。上述制備重組抗原的方法中，優(yōu)選的，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是pQE-hGTA;所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌M15[pREP4]。所述的回收并純化重組乳腺癌組織特異蛋白的方法如下冰浴超聲破菌法裂解轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pQE-hGTA的細(xì)菌；收集包涵體并將其溶解；收集變性蛋白，用N產(chǎn)鰲合親和層析純化變性蛋白，復(fù)性純化后的變性蛋白離子，得粗復(fù)性蛋白，用陰離子交換層析純化復(fù)性蛋白。本發(fā)明最優(yōu)選的整體技術(shù)方案詳細(xì)描述本發(fā)明主要涉及鑒定新的在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)的基因，本發(fā)明自乳腺癌組織提取總RNA，以其為模板，經(jīng)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出hGTA的cDNA。為了獲得高質(zhì)量的RNA，本發(fā)明采用新鮮切除的乳腺癌組織，在液氮中運(yùn)輸，并盡快提取RNA，避免反復(fù)凍融，提取的乳腺癌組織標(biāo)本中總RNA用紫外核酸蛋白儀檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增hGTA基因編碼序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體中，DNA測(cè)序鑒定后，用限制性內(nèi)切酶切下目的基因，經(jīng)鑒定，所表達(dá)的蛋白是一種新的乳房特異性分泌蛋白即hGTA，該cDNA是純化及分離形式的，其核苷酸序列經(jīng)鑒定為SEQIDNo:1，基因全長(zhǎng)1159個(gè)核苷酸，編碼321個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白，即乳腺癌組織特異抗原h(huán)GTA，是純化及分離形式的，其氨基酸序列經(jīng)鑒定為SEQIDNO:2。根據(jù)已獲取的hGTAcDNA序列，用primer軟件設(shè)計(jì)特異引物，并在其上下游引入不同的酶切位點(diǎn)和特異的保護(hù)堿基，降低載體的自連率，提高連接成功率。以乳腺癌組織RNA為模板擴(kuò)增出的hGTAcDNA經(jīng)AB13730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序，與預(yù)期的序列完全一致，共1159bp。該cDNA序列的45bp上游不包含其它框內(nèi)甲硫氨酸或翻譯終點(diǎn)，所編碼多肽的前36個(gè)殘基可能是一段疏水肽信號(hào)序列，殘基53-55和68-70是共有的N糖基化位點(diǎn)，這說(shuō)明hGTA蛋白是分泌糖蛋白，因此可以在外周血中檢測(cè)到該標(biāo)志物。在基因庫(kù)(Genebank)中査找與hGTAcDNA相似的DNA序列沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯同源的DNA序列，說(shuō)明hGTAcDNA是一段新的、迄今未知的DNA序列。表達(dá)載體的選擇要考慮多種因素，如要表達(dá)蛋白的大小、蛋白的需要量、表達(dá)蛋白是否要純化，純化產(chǎn)物是否具有良好的生物學(xué)活性等。pQE表達(dá)載體屬于PDS質(zhì)粒家族，是一種原核高效表達(dá)載體，具有以下幾個(gè)特點(diǎn)首先該表達(dá)載體含有噬菌體TS啟動(dòng)子和兩個(gè)乳糖操縱序列構(gòu)成的最適啟動(dòng)子-操縱子成分。當(dāng)有誘導(dǎo)物IPTG存在時(shí)，誘導(dǎo)物與Lac阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白失活，與LacO解離，使RNA聚合酶能夠進(jìn)入結(jié)構(gòu)基因，轉(zhuǎn)錄處于開(kāi)放狀態(tài)；其次，該載體有合成的核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBSII確保高轉(zhuǎn)錄效率，有/3-內(nèi)酰氨酶基因利于氨芐青霉素的抗性篩選；有轉(zhuǎn)錄終止只密碼可保證轉(zhuǎn)錄的及時(shí)終止；此外，在多克隆位點(diǎn)上游還含有6個(gè)組氨酸的編碼序列(6xffistag)。重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，6XHistag-nJ-以和外源插入片段共同表達(dá)。6xHistag為短肽，免疫原性很弱，并且對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)、折疊及生物學(xué)活性均無(wú)影響，因此表達(dá)后可不必用蛋白酶切割去除而自接用于免疫動(dòng)物；6xHistag的存在對(duì)于重組蛋白的純化也非常重要，使重組蛋白通過(guò)鎳柱親和技術(shù)得以有效純化，從而為制備重組hGTA抗原及制備診斷抗體的研制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明選擇JM109作為擴(kuò)增菌，將重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-hGTA轉(zhuǎn)化入JM109中擴(kuò)增，擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)化入M15[pREP4]表達(dá)菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，M15[pREP4]工程菌表達(dá)到了目的蛋白。表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等。其中大腸桿菌具有繁殖快、營(yíng)養(yǎng)要求低、轉(zhuǎn)化和表達(dá)效率高、遺傳背景清楚、易發(fā)酵，并且易于操作并可以快速大量生產(chǎn)重組蛋白等特點(diǎn)，仍是許多外源蛋白首選的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明所選用的大腸桿菌M15中含有質(zhì)粒pREP4，能翻譯Lac抑制子，并具有卡那霉素抗性，可嚴(yán)格調(diào)控外源重組蛋白在IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)而不致產(chǎn)生細(xì)胞毒性。基于這些因素，本發(fā)明應(yīng)用分子克隆的方法成功的構(gòu)建了pQE-hGTA重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定與預(yù)期的結(jié)果完全相符。通過(guò)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，將其導(dǎo)入大腸桿菌M15[pREP4]中，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。本發(fā)明中重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后實(shí)現(xiàn)了在E.coliM15[pREP4]中的高效融合表達(dá)，表達(dá)量最高達(dá)27.4%。然而同大多數(shù)原核表達(dá)產(chǎn)物一樣，其表達(dá)形式為包涵體，這可能是由于分子的二硫鍵不能正確配對(duì)的原因所致。本發(fā)明的另一目的是提供一種純化重組hGTA的方法。本發(fā)明采用了冰浴超聲破菌(表達(dá)大腸桿菌)法，鏡下觀察破碎后的細(xì)菌裂解完全。由于本發(fā)明表達(dá)的產(chǎn)物是包涵體蛋白，包涵體中主要含有重組蛋白，但也含有一些其他的雜質(zhì)成分，這些雜質(zhì)成分在包涵體的溶解和復(fù)性過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的降解，因此，包涵體的洗滌處理非常重要，本發(fā)明中采用了1%左右的中性去垢劑洗滌包涵體，并在洗滌劑中加入了1%的TritonX-100，2mol/L的尿素，并在pH8.2條件下進(jìn)行，通過(guò)該方法洗漆的包涵體基本上未影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。由于該表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的包涵體不溶于水，本發(fā)明采用濃度5mol/L的尿素溶解包涵體，盡管尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70%-90%，但由于用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀并可選用多種色譜法純化等優(yōu)點(diǎn)，因此本發(fā)明采用尿素溶解包涵體。本發(fā)明所表達(dá)的目的蛋白以不溶性包涵體形式存在，尿素經(jīng)洗滌后而溶解于尿素溶液中，由于在其氨基端含有6個(gè)連續(xù)的組氨酸。而組氨酸具有與多種二價(jià)金屬離子，如Nit+、Zn2+、012+等結(jié)合的能力，因此，本發(fā)明利用金屬鰲合層析方法純化該包涵體。金屬鰲合親和層析利用共價(jià)結(jié)合在層析載體上的二價(jià)金屬離子鰲合劑能與表面富含組氨酸殘基的蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，使其留在層析柱上，而不帶有組氨酸殘基的其他蛋白質(zhì)則不能結(jié)合，再以洗脫溶液洗脫就可以獲得高純度的重組蛋白，然后用較低pH值的洗脫緩沖液洗脫，對(duì)親和層析純化后的目的蛋白行SDS-PAGE分析顯示，雜蛋白條帶明顯減少，說(shuō)明目的蛋白己被有效的初步純化。包涵體的復(fù)性是目前基因工程蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的難點(diǎn)問(wèn)題，本發(fā)明采用分步稀釋，逐漸降低變性劑濃度的方法，以有效的降低蛋白質(zhì)分子多聚體的產(chǎn)生，從而提高活性蛋白質(zhì)的回收率，最終取得了較好的復(fù)性結(jié)果。為了獲得高純度的hGTA蛋白，本發(fā)明對(duì)復(fù)性的目的蛋白利用陰離子交換層析進(jìn)行了再次純化。離子交換層析純化蛋白的效果與離子交換條件的選擇及梯度的選擇有密切關(guān)系。陰離子交換要求平衡液和樣品的pH值應(yīng)高于目的蛋白pl值1個(gè)單位以上，而且鹽濃度最好在20mmol-5Ommol/L之間。本發(fā)明中的目蛋白hGTA經(jīng)DNAsis分析其pI值為5.5。因此，本發(fā)明平衡液采用25mmol/LTris，pH8.0緩沖液。在此條件下，目的蛋白可以很好地與離子交換柱上的正性基團(tuán)結(jié)合。梯度洗脫常用的有鹽梯度和pH梯度或二者一并使用，由于鹽梯度容易操作，且更為常用，所以本發(fā)明選擇了鹽梯度洗脫，洗脫液中的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示純化效果較好，純度在93%左右，最后再用截流分子量為10000的超濾膜進(jìn)行超濾，純化的hGTA蛋白濃度為0.79mg/ml，1L菌液所得的包涵體蛋白最終獲得了27.4mg純度為98.4X的hGTA腫瘤相關(guān)抗原。本發(fā)明獲得hGTA重組蛋白與從乳腺組織中分離得到的hGTA蛋白具有完全相同的結(jié)構(gòu)和功能，證明為同一種蛋白，臨床試驗(yàn)表明，該蛋白可以用于乳腺癌的早期診斷。圖lRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄后的瓊脂糖圖譜；其中M為DNAmarker;1為陰性對(duì)照；2為PCR產(chǎn)物。圖2pQE-hGTA酶切鑒定結(jié)果；其中M為DNAmarker;1為pQE-hGTA質(zhì)粒；2，3為雙酶切結(jié)果。圖3hGTA基因的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；其中M為proteinmarker;1為M15(pQE)未誘導(dǎo)；2為M15(pQE)誘導(dǎo)6小時(shí)；3為M15(pQE-hGTA)未誘導(dǎo)；4，5為M15(pQE-hGTA)誘導(dǎo)6小時(shí)。圖4用離子交換純化hGTA重組蛋白結(jié)果；其中M為proteinmarker;1為M15(pQE-hGTA)未誘導(dǎo)；2為M15(pQE-hGTA)誘導(dǎo)6小時(shí)；3，4，5為蛋白質(zhì)洗脫峰。以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明的制備方法及有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1人hGTAcDNA的逆轉(zhuǎn)錄及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建①乳腺癌細(xì)胞總RNA提取將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB453(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺中心)培養(yǎng)于完全RPMI1640培養(yǎng)基，在37"，5%(:02、飽和濕度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)細(xì)胞則消化、吹打細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，2000r/min，棄去培養(yǎng)液，吸取細(xì)胞(5-10><106)于lmLTRIZOLReagent中裂解室溫放置5min,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離，12000r/min離心5min,取上清，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無(wú)Rnase的離心管中，加0.3ml氯仿，劇烈振蕩20秒，室溫放置5min，13000r/min離心5min，樣品會(huì)分成三層，將含有RNA的水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作，緩慢加入1倍體積的70%乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱中，10000g離心30秒，棄掉收集管中的廢液，加0.5ml去蛋白緩沖液，10000g離心30秒，棄廢液，加0.8ml漂洗液，10000g離心30秒，棄廢液，加0.5ml漂洗液，10000g離心5min，小心去除多余的液體，將離心柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新離心管中，力卩30-50jnl無(wú)Rnase水，室溫放置3min,10000g離心3min，取適量提取的RNA溶液，紫外分光光度定量，計(jì)算A26()/28()為1.94，說(shuō)明提取的總RNA純度較高。②人hGTAcDNA合成總RNA1.0/zg，01igo(dT)15primer1^1冰上結(jié)合，70。C5min，立即冰浴10min，再加入5xReactionBuffer5/il，10mmol/LdNTP1.25^1，RNA酶抑制劑0.55/il，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1/xl，加入無(wú)核酸酶的ddH20補(bǔ)足總體積至25/tl，混勻后按如下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄:42'C1.5-2hr,95'C變性5min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一部分進(jìn)行PCR擴(kuò)增，余下的部分-20°(:保存。根據(jù)hGTAcDNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物上游弓l物:5'-GCTGAATTCCCGGTTCGTCGGTTATCCGCGCCGCTC-3'EcoRI下游弓l物:5'-CGGAAGCTTTCGGATGGTGGGGCTACCCACCAGCC-3'HindIII逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNAlul，上下游引物各ljid，10xReactionBuffer5川，25mmol/LMgCl24/il，10mmol/LdNTP2/il，TaqDNA聚合酵(5U/m1，加入無(wú)菌水至總體積50/4混勻后進(jìn)行擴(kuò)增，條件為:94。C預(yù)變性90s，然后94。C60s，58°C60s，72。C90s,35個(gè)循環(huán)，最后72T:延伸7min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5pdPCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定(圖1)。③感受態(tài)細(xì)菌的制備從瓊脂平板上接種一單菌落(M15)于3mL菌培養(yǎng)液中，37'C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，向2個(gè)內(nèi)裝30mL細(xì)菌培養(yǎng)液三角燒瓶中分別加入0.2mL與O.SmL過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌于37t:振搖培養(yǎng)2-3小時(shí)。無(wú)菌條件下選取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到6個(gè)無(wú)菌一次性的以冰預(yù)冷的5mL離心管中，5mL/管，冰上置5min，40°C8000r/min離心2-3min，倒出培養(yǎng)液并倒置1min使盡量流盡，移液器小心吸盡，冰預(yù)冷0.1mol/LCaCl23mL/管重懸，冰浴5min，40°C8000r/min2-3min，棄上清液，以0.2mL/管含20。/o甘油的0.1mol/LCaCL2溶液重懸，-20匸保存。④pQE質(zhì)粒(上海生物工程研究所)的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒的提取冷凍的感受態(tài)細(xì)菌取出后置于冰上解凍，lng-10ng質(zhì)粒DNA與復(fù)融感受態(tài)細(xì)菌混合，輕彈管壁混勻，冰上放置30min，42。C熱休克90s，再置冰上2min,加800/il預(yù)置室溫下的細(xì)菌培養(yǎng)液，37"C200r/min振搖l小時(shí)，分別將50j^、200pl和余下細(xì)菌(離心收集)涂于相應(yīng)抗生素瓊脂平板，37'C過(guò)夜培養(yǎng)。挑陽(yáng)性單菌落于20ml培養(yǎng)液中，37"C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，14000r/min離心2min收集3ml菌液的沉淀，棄上清，力B150/d質(zhì)粒抽提試劑SolutinI(10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，2%TritonX-100，8%蔗糖)，重懸細(xì)菌，加300/ilSolutinll(0.2mol/LNaOH)，顛倒混勻，加150plSolutinlll(3mol/LNaAC(pH4.8))，顛倒混勻，力Q150pilSolutinIV(lmol/LTris)，顛倒混勻。14000r/min離心10min，吸取上層水相移至新管，力B2/d10mg/mlRnaseA,55。C水浴育10min，加400^1酚和氯仿，然后14000r/min離心10min，吸取上層水相移至新管，加60(^1異丙醇，顛倒混勻，14000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2遍，14000r/min離心8min，吸干乙醇，室溫干燥，每管加30/il無(wú)菌純水溶解質(zhì)粒，紫外吸收法測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，-20°(:貯存?zhèn)溆?。⑤雙酶切及酶切產(chǎn)物的回收EcoRl/HindIII分步雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，37"反應(yīng)2-3h，用膠回收試劑盒回收酶切片段。小心從瓊脂糖凝膠上切下DNA片段膠條，放入離心管中稱重，加入3倍體積的Buffer,5(TC水浴lOmin，至膠條完全融化，檢查顏色為黃色，加入等膠條體積的100%異丙醇，顛倒幾次混勻，將柱放入2ml收集管中，將全部樣品移入柱內(nèi)，13000r/min離心lmin，倒出流過(guò)柱子的液體，將柱放回同一收集管中，加500/ilBuffer于柱內(nèi)，13000r/min離心lmin，倒出流過(guò)柱子的液體，將柱放回同一收集管中，加750/ilBuffer于柱內(nèi)洗滌，放置5min后，13000r/min離心lmin，倒出流過(guò)柱子的液體后，13000r/min離心lmin，將柱放入一個(gè)干凈的離心管仲，加10^1Buffer于柱上的膜中心，洗脫DNA，柱子自立lmin后，BOOOr/min離心lmin。⑥pQE-hGTA表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序pQE質(zhì)粒的制備將pQE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，常規(guī)搖菌進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，經(jīng)電泳鑒定后-20'C保存?zhèn)溆?；目的片斷的制備hGTA克隆產(chǎn)物pGEM-T/hGTA以EcoRI/HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收電泳槽回收純化DNA片段。載體的制備:將pQE以EcoRI/HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收電泳槽回收純化DNA片段。連接反應(yīng):將酶切并回收的目的片段和載體以T4DNA連接酶連接，4'C反應(yīng)過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue中，離心收集細(xì)菌鋪板，37'C培養(yǎng)過(guò)夜后，無(wú)菌條件下挑取單克隆菌落，常規(guī)搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，EcoRl/HindIII雙酶切對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定(圖2)。人乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的hGTAcDNA測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQIDNo:1，共1159bp。⑦h(yuǎn)GTA基因融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果(圖3)顯示，與pQE空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌相比，誘導(dǎo)后pQE-hGTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在36KDa左右出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期的hGTA蛋白分子量相符。應(yīng)用DNAssist軟件對(duì)hGTA蛋白進(jìn)行分析，該蛋白由321個(gè)氨基酸組成，其中極性氨基酸188個(gè)，疏水性性氨基酸133個(gè)。該蛋白含有5對(duì)二硫鍵，等電點(diǎn)位為5.5，分子量為36kDa實(shí)施例2hGTA重組蛋白的純化①轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌的裂解及表達(dá)包涵體的溶解取出實(shí)施例1所制備的冰凍菌體，稱重，每克細(xì)菌加入10ml預(yù)冷破菌液，冰上待融，冰浴超聲破菌，將菌液于4。C，10000g，離心25min棄去上清，加入與破菌液等體積的包涵體洗滌液I(0.2MNaCL，0.08%Triton-100，20mM，Tris1Murea,pH9.0)，冰上攪拌30min，4°C，lOOOOg，離心25min，棄上清，用包涵體洗滌液II(0.2MNaCL,0.08%Triton-100，20mMTris，2Murea，ph9.0)再次洗滌包涵體。加入二分之一破菌液體積的包涵體溶解液(50mMTris,8Murea，pH9.2)，冰上攪拌1小時(shí)，4°C，10000g，離心25min，取上清，加入三倍包涵體溶解液體積的去離子水，補(bǔ)加NaCI至終濃度為0.3M，混勻，用lMHCl調(diào)pH至顆粒狀沉淀產(chǎn)生，置于4°C過(guò)夜，使沉淀完全；4°C10000g，離心25min，棄上清。②N產(chǎn)鰲合親和層析純化變性蛋白將經(jīng)預(yù)處理的N產(chǎn)鰲合親和層析柱，接入AKTAExplorer,用BufferA(購(gòu)自南京博士德生物工程公司)平衡200ml，將溶解后的包涵體用系統(tǒng)泵上樣，流速10.0ml/min，用BufferA平衡至A280曲線呈水平，分別用BufferB(購(gòu)自南京博士德生物工程公司)，BufferC(購(gòu)自南京博士德生物工程公司)洗脫雜蛋白及目的蛋白，收集目的洗脫峰。③復(fù)性目的蛋白將經(jīng)N產(chǎn)鰲合親和層析粗純化的目的蛋白倒入透析袋中，放入盛有1L復(fù)性液I(4mol/LUrea,GSH2mmol/L，GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L，Tris-鹽酸20mmol/L，pH8.2)的燒杯中，4。C透析過(guò)夜；次日，取出透析袋放入盛有L復(fù)性液n(3mol/LUrea,GSH2mmol/L，GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L,Tris-鹽酸20mmol/L，pH8.2)的燒杯中進(jìn)行透析；每隔4h依次換復(fù)性液III(2mol/LUrea，GSH2mmol/L，GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L，Tris陽(yáng)鹽酸20mmol/L，pH8.2)、復(fù)性液IV(lmol/LUrea，GSH2mmol/L，GSSGlmmol/L，EDTA5mmol/L,Tris-鹽酸20mmol/L，pH8.2)，換到復(fù)性液V(EDTA5mmol/L，Tris-鹽酸20mmol/L，pH8.2)時(shí)4i:透析過(guò)夜；透析結(jié)束后，4°C15000r/min離心20min，上清即為可溶性復(fù)性蛋白。④離子交換層析純化復(fù)性蛋白將裝好DEAESepharoseFastFlow填料的柱子接入AKTAExplorer,用BufferD(購(gòu)自南京博士德生物工程公司)平衡；將復(fù)性的蛋白用系統(tǒng)泵上樣，流速10.0ml/min;用BufferD平衡至A280曲線呈水平；分別用BufferE(購(gòu)自南京博士德生物工程公司)，BufferF(購(gòu)自南京博士德生物工程公司)洗脫雜蛋白及目的蛋白，流速200ml，流速10.0ml/min;收集各洗脫峰。本發(fā)明最終從1L的細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、超聲裂解、尿素變性、Ni2+鰲合親和層析、透析復(fù)性、離子交換層析的系列過(guò)程，最終獲得了24.6mg的hGTA的重組蛋白，經(jīng)高效液相分析，純度為98.4%。實(shí)施例3抗hGTA單克隆抗體的制備一)ALB抗原的單克隆抗體制備1、試驗(yàn)材料141)、hGTA抗原實(shí)施例2所純化的重組hGTA抗原。2)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物六周齡BALB/c小鼠購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；3)、DMEM告糖培養(yǎng)基Hyclone公司.4)、其它試劑福氏完全佐劑(購(gòu)自SIGMA公司)。2、制備方法1)免疫動(dòng)物用人hGTA與福氏完全佐劑等體積混合腹腔注射免疫8周齡的雌性BALB/C小鼠，每周一次，劑量為100ug/只，每只小鼠腹腔注射0.5ml。而后間隔l周連續(xù)免疫2次，劑量及免疫方式相同，佐劑改為不完全佐劑，在融合前三天用PBS稀釋抗原，經(jīng)小鼠尾靜脈注射進(jìn)行沖擊免疫。免疫2-3次后，用間接法ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到4000以上時(shí)，便可準(zhǔn)備分離脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。2)細(xì)胞融合及HT篩選將免疫后的小鼠，經(jīng)眼睚放血，分離血清供檢測(cè)抗體用；將經(jīng)免疫的小鼠處死后，局部消毒剖腹，無(wú)菌條件下取脾，制備成脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)，取108個(gè)脾細(xì)胞懸液備用。融合前2-3天，將每瓶Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞傳至4瓶細(xì)胞，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于融合。將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后，按7:1的比例加入50ml離心管中混合均勻，離心10分鐘，倒盡上清液，使兩種細(xì)胞混勻成糊狀，加入37t預(yù)溫的50。/。PEG(分子量4000)，邊滴加邊攪拌；融合后的細(xì)胞用含20%小牛血清的HAT培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，分劃于192孔細(xì)胞培養(yǎng)板(2板)中進(jìn)行選擇培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后，其他細(xì)胞逐漸消失，只有融合的雜交瘤成簇生長(zhǎng)，形成小的細(xì)胞集落，8天后，停止使用HAT培養(yǎng)液，改用HT培養(yǎng)液，一周后換用含10。/。牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔底部的1/3時(shí),這時(shí)吸取培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選。用間接酶聯(lián)吸附法(ELISA)進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)，選擇分泌抗hGTA抗原的雜交瘤細(xì)胞。3)雜交瘤篩選及有限稀釋以人hGTA為包被抗原(包被量0.4ug/孔)，用間接ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照，以Sp2/0細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為空白對(duì)照，以細(xì)胞培養(yǎng)板中未長(zhǎng)出克隆的培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。選取對(duì)hGTA抗原陽(yáng)性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞集落，以有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底約1/3時(shí)，測(cè)定各孔中培養(yǎng)液的特異性抗體的活性，選擇抗體效價(jià)高，呈單個(gè)克隆生長(zhǎng)，形態(tài)良好的細(xì)胞L，繼續(xù)按有限稀釋法進(jìn)行2次克隆和擴(kuò)大培養(yǎng)。最終獲3株能穩(wěn)定分泌抗hGTA抗原的雜交瘤細(xì)胞株，這三株細(xì)胞的編號(hào)為hGTA2C4，hGTA3B5，hGTA4F11。當(dāng)克隆至陽(yáng)性率達(dá)到100%時(shí)，及時(shí)將分泌抗單克隆抗體的單株細(xì)胞凍存于液氮中，留存種子細(xì)胞庫(kù)。4)單克隆抗體的制備及純化在同系的BALB/c(6周齡)腹腔注射液體石蠟，約第8天將克隆后分泌特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞注入腹腔(1-2><106細(xì)胞/鼠)，待小鼠腹部開(kāi)始增大后，收集腹水。一只小鼠收集腹水2-3次后，殺死小鼠一次性取腹水，離心除去腹水中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，加入等體積的飽和硫酸銨到上清液中，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)，使蛋白質(zhì)充分沉淀，將沉淀物溶于少量的PBS中，用10mmol/LPBS(Ph7.4)在4'C透析24小時(shí)。然后通過(guò)DEAE-SephadexA52層析柱，收集并合并洗脫液中含蛋白的部分，濃縮后即得抗hGTA單克隆抗體，將所篩選到的合格單克隆抗體保存?zhèn)溆?。表l雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目、單克隆抗體的亞型以及單克隆抗體的親和常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4抗hGTA單克隆抗體的酶標(biāo)記稱取2mgHRP溶解于1ml超純水中，加入30ul新配的0.1MNal04溶液，將上述溶液裝入攔截分子量為8000的透析袋中，對(duì)2mMPH4.4的醋酸鈉緩沖液透析過(guò)夜；加30/d0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，調(diào)醛化HRP的PH升高到9.09.5，立即加入0.5ml抗hGTA抗體，室溫避光在脫色搖床上輕輕振搖2小時(shí)；加40ul新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4。C2小時(shí)。上述液裝入分子量為8000的透析袋中，對(duì)0.01MPH8.2磷酸鹽緩沖液透析過(guò)夜，用硫酸銨法純化即得。實(shí)施例4乳腺癌早期檢測(cè)標(biāo)志物hGTA試劑盒的制備1、試驗(yàn)材料1)hGTA抗原實(shí)施例2所純化的重組hGTA抗原2)抗hGTA單克隆抗體l，2:實(shí)施例3所制備。3)所用的試劑3.1包被緩沖液碳酸鈉0.75g，碳酸氫鈉1.45g，硫柳汞O.lg，氯化鈣，0.2g，對(duì)羥基水楊酸0.02g，加雙蒸水至1000ml調(diào)PH9.6，滅菌備用。3.2、封閉液氯化鈉4.0g，磷酸二氫鉀O.lg，磷酸氫二鈉1.45g，氯化鉀O.lg，硫柳汞0.08g，去免疫球蛋白牛血清白蛋白15g，加雙蒸水至500ml，調(diào)pH7.2，高壓滅菌即可。3.3、終止液20ml硫酸加雙蒸水至184ml3.4稀釋液的配制氯化鈉4.0g，磷酸二氫鉀O.lg，磷酸氫二鈉1.45g，氯化鉀O.lg，硫柳汞0.08g，加雙蒸水至500ml，調(diào)PH7.2，高壓滅菌即可。3.5酶底物液的制備A液磷酸氫二鈉14.60g以酸鈉9.33g0.75%過(guò)氧化氫尿素20ml加雙蒸水至IOOO，調(diào)PH值5.0B液TMB20mgDMF28ml雙蒸水60ml3.6、洗滌液的配制氯化鈉4.0g，磷酸二氫鉀O.lg磷酸氫二鈉1.45g氯化鉀O.lg硫柳汞0.08g吐溫201.0ml加雙蒸水至1000ml:調(diào)pH值7.2。表2試劑盒的組成:酶標(biāo)板96孔酶標(biāo)抗體1瓶(5ml)底物A液l瓶(5ml)標(biāo)準(zhǔn)品5支(5ug/支)底物B液l瓶(5ml)樣品稀釋液(10x)1瓶(10ml)終止液1瓶(5ml)洗滌液(20x)1瓶(12.5ml)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)一份。3.8、本發(fā)明試劑盒保存及有效期2-8°C、密閉、避光保存，有效期12個(gè)月。3.9操作方法包被用包被緩沖液將hGTA抗體稀釋成2/ig-8/ig/ml工作濃度，每孔加入工作濃度抗體100/xL，共包被96孔，蓋好酶標(biāo)板，置于4"C冰箱中過(guò)夜；洗滌棄去包被液，用PBS-T洗滌液滿孔洗滌3次，每次3分鐘，最后一次扣干；封閉用封閉液加滿各反應(yīng)孔，去除加樣時(shí)產(chǎn)生的貼壁氣泡，蓋好酶標(biāo)板，于37"C水浴箱中孵育30分鐘。洗滌棄去包被液，用PBS-T洗滌液滿孔洗滌3次，每次3分鐘，最后一次拍千。于37。C干燥20分鐘，然后真空包裝于鋁箔袋中保存?zhèn)溆谩９嘌b(1)灌裝濃縮洗滌液調(diào)整分裝器灌裝量至12.5ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過(guò)濾后洗滌液通過(guò)自動(dòng)灌裝機(jī)將洗滌液灌裝于15ml白色的塑料瓶中，隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶塞。(2)灌裝濃縮樣品稀釋液調(diào)整分裝器灌裝量至lO.Oml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過(guò)濾后樣品稀釋液通過(guò)自動(dòng)灌裝機(jī)將樣品稀釋液灌裝于15ml白色的塑料瓶中，隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶塞。(3)灌裝酶標(biāo)抗體工作液調(diào)整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過(guò)濾后酶標(biāo)抗體工作液通過(guò)自動(dòng)灌裝機(jī)將酶標(biāo)抗體工作液灌裝于8.0ml白色塑料瓶中，隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶塞。(4)灌裝底物A液調(diào)整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過(guò)濾后底物A液通過(guò)自動(dòng)灌裝機(jī)將底物A液灌裝于8.0ml白色塑料瓶中，隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶塞。(5)灌裝底物B液調(diào)整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，使除菌過(guò)濾后底物A液通過(guò)自動(dòng)灌裝機(jī)將底物A液灌裝于8.0ml黑色塑料瓶中，隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶塞o(6)灌裝終止液調(diào)整分裝器灌裝量至5.0ml，將分裝器管道中的水放掉，通過(guò)自動(dòng)灌裝機(jī)將終止液灌裝于8.0ml白色塑料瓶中，隨灌裝進(jìn)行及時(shí)旋上瓶塞。(7)包裝將每支塑料瓶插入泡沫墊各個(gè)孔中，將泡沬墊裝入中紙盒中，在上面放上經(jīng)真空包裝的酶標(biāo)板，然后放上兩張不干膠片，放入一張說(shuō)明書(shū)即得。實(shí)施例5本發(fā)明試劑盒的使用方法一、樣品的采集和試劑的準(zhǔn)備1)待檢樣品的采集取病人靜脈血，離心分離得血清備用2)、試劑準(zhǔn)備1)將10x稀釋液用前置于37'C水浴15分鐘，然后用蒸餾水做10倍稀釋；2)將20x洗滌液用前置于37'C水浴15分鐘，然后用蒸餾水做20倍稀釋；3)將0.2叫標(biāo)準(zhǔn)品用500ul稀釋液準(zhǔn)確復(fù)溶(0.2ug/ml)。取出200ul用稀釋液作五次倍比稀釋，得濃度200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。二、操作步驟1、加樣將酶標(biāo)孔每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品100ul，每個(gè)濃度加一個(gè)孔，繪制回歸曲線；加入待測(cè)血清樣本100Ul，每個(gè)樣本加復(fù)孔；陰性對(duì)照血清加兩個(gè)復(fù)孔，輕輕振蕩混勻，37'C水浴40分鐘；2、洗滌棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3分鐘，甩干，反復(fù)3次后拍干；3、加酶標(biāo)抗體每孔加入酶標(biāo)抗體100ul，輕輕振蕩混勻，37。C水浴40分鐘；4、洗滌棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置3分鐘，甩干，反復(fù)3次后拍干；5、顯色臨用前把底物A、B溶液按體積比l:l混合均勻。每孔加底物液IOOul，37"C水浴15分鐘；6、終止比色每孔加入50ul終止液，輕輕混勻30秒，在酶標(biāo)儀450nm處，以底物空白孔調(diào)零，測(cè)各孔的吸光值。三、數(shù)據(jù)處理以hGTA標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，待測(cè)標(biāo)本含量(ng/ml)可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出，然后乘以稀釋倍數(shù)即可。四、評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)1)陰性<5.0ng/ml。2)陽(yáng)性>10.0ng/ml。3)臨界值5-10ng/ml，若檢測(cè)結(jié)果為臨界值，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍為臨界值判為陰性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)以后者結(jié)果為準(zhǔn)。試驗(yàn)例1本發(fā)明試劑盒臨床應(yīng)用觀察試驗(yàn)于2005年1月10日到2005年8月10日在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行臨床考核80例，其中陰性病人30例，陽(yáng)性病人50例，以影像檢測(cè)法為進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)，將考核人群分為四個(gè)組正常，i期乳腺癌，n期乳腺癌，in期乳腺癌，臨床考核結(jié)果見(jiàn)表3:表3本發(fā)明試劑盒臨床應(yīng)用觀察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>569099495HY-F0056女36正常2.13正常57，531HY-F0057女28正常1.35正常589099504HY-F0058女5丄正常2.36正常596084160HY-F0059女37正常3.45正常609119732HY-國(guó)0女25II期乳腺癌135.69n期乳腺癌619119741HY-F0061女38II期乳腺癌124.56n期乳腺癌629119725HY-F0062女46正常7.25可疑636084712HY-F0063女49正常4.45止常649114358HY-F0064女37正常1.56正常655486915HY-F0065女32II期乳腺癌135.78n期乳腺癌666115740hy-f0066女26ii期乳腺癌142.48ii期乳腺癌676105255HY-F0067女36正常3.45正常686140205HY-F0068女29I期乳腺癌23.47i期乳腺癌695373805HY-F0069女34I期乳腺癌23.58i期乳腺癌709114576HY-F0070女39正常4.25正常716116085HY-F0071女26II期乳腺癌26.45n期乳腺癌726092254HY-F0072女34II期乳腺癌30.25n期乳腺癌739114947HY-F0O73女46I期乳腺癌44.59i期乳腺癌749114970HY-F0074女37正常4.12正常759134052HY-F0075女31正常3.25正常768984117HY-F0076女36正常6.15可疑774414078HY-F0077女35正常6,48可疑789149490HY-F0078女35n期乳腺癌164.58n期乳腺癌799149805HY-F0079女42n期乳腺癌125.48n期乳腺癌806102275HY-F0080女37i期乳腺癌66.47i期乳腺癌應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例所制備的hGTA酶聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒，對(duì)50例患有各期乳腺癌病人及對(duì)30例無(wú)乳腺癌疾患的健康人檢測(cè)，結(jié)果顯示在乳腺癌各期中hGTA陽(yáng)性率為1期78%，11期98%，111期100%。并且在對(duì)本法檢測(cè)可疑的病人其中有4例最終進(jìn)展為乳腺癌，說(shuō)明本法診斷乳腺癌具有比影像檢測(cè)更早的特點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明hGTA酶聯(lián)定量檢測(cè)試劑盒對(duì)早期發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)乳腺癌有極好的臨床意義，可適用于婦女早期乳腺癌的篩査檢測(cè)。O10>〈120>〈130><160><170><210><211><212〉<213〉序列表北京關(guān)康生物技術(shù)研究中心人乳腺^組織抗原及U:編碼樣W、Jt制各方法和應(yīng)用P0882PatentInversion3.311158DNA智人(Homosapiens)<220><221>CDS〈222>(97)..(1059)<400〉1gccaagggtccaggctccttg3gctacaacttccggactgcctactaaccgcaattggct60caagttaaccgccttaccttcttaggctgccctgaaggccaagcagccaacggc114GIyGinAlaAlaAsnGlv15cgcggcgtgaactggctgegggccctgtgcgagsacgetcagctgggc162ArgGlvValAsnTrpLeuArgAlaLeuCysGluAsnAlaGinLeuGly101520agaaccegggccttcgetgccaccgetgetgacgtcagaagegggccc210ArgThrArgAlaPheAlaAlaThrAlaAlaAspValArgSerGlyPro253035ateatgctggccgagagstgcteacagtgcctgggctecgacgcctea258lieMetLeuAlaGluArgCysSerGinCysLeuGlvSerAspAlaSer40450ctggagacgacctggctgcacgaggetaagagetgcaataccgtcggt306LeuGluThrThrTrpLeuHisGluAlsLysSerCysAsnThrValGlv55606570agaaacccacacgaaaccaggcctggagetctgggacacetcgccggc354ArgAsnProHisGluThrArgProGlyAlaLeuGlyHisLeuAlaGly758085atetttgacagetecgacggceggageeggatectggccaacgaggcc402liePheAspSerSerAspGlvArgSerArglieLeuAlaAsnGluAla9095100ccgaaggagctgctgactggcaataccgtgcccgtcgatagegetgtc450ProLvsGluLeuLeuThrGlvAsnThrValProValAspSerAlaVal105110115atgagtaggctttacteccgaattaccctgtacUcetctgtteaaag498MetSerArgLeuTyrSerArglieThrLeuTvrPheLeuCvsSerLys120125130t"、gccgggagg"('asggtctegtattgcctg('agtacageetcUt546PheAlaGlvArgPheLvsValSerTvrCysLeuGinTvrSerLeuPhe135145150gccetcccccagct.gtgcccctegcaggaccccctggacgcctatgca594A]aLeuProGinLeuCvsProSerGinAspProLeuAspAlaTvr人la155160gtggccacagccgggctgctgaagetccagttcgcctgggggttcgcc642ValAiaThrAlaGlvLeuLetiLysLeuGinPheAlaTrpGlyPheAla170175腦ttggcctggcc(:agtcccacaaticgagtgggacct.g(、aactgcc('aggfi90LeuAlaTrpProSerProThrAsnGluTrpAspLeuGinLeuProArggtgcccValPro200gagaccGluThr215etcgagLeuGlu33gctgLysLeutac333TyrLysagttttSerPhe280ctgtatLeuTyr295'gtgtecValSer185ageSerG]ictgLeuProetcLeuC3gGin3CCThr265gccAlatecSerttcPhetttPhegccAla250Pro3gtSergggGlycgcArgtecSer235ctgLeutegSergacAsp3tClie220ctgLeutscTyrThrcgtArg205GluC3gGing33GlutacTyr190gggGlytggTrptggTrpctgLeutggTrpttgLeugtcVal315LysLys300TyrGin285g3CAspetcLeuGluetcLeuttcPheattlie270gesAlaestHiscctPro8CtThr255eggArg3gtSerThrgecAlat.t.tPhe240gtgValProgtggccValAla210gagcat.GluHis225tggageTrpSerttccagPheGin33gt3CLysTyr195ctgttgLeuHisttgLeutggTrp3ggArgProGingtcaasValLysCC33CtProThr305Thr275t3tTyrcagGinLeusagLysGluctgLeu260gatAspAlaatgMetttcPhe245gccAlaThrctgLeuatgMet230C3gGineggArgAsptctSerSerg3tAsp33gLysgtcValaggArg3107387868348829309781026ProThratelie320cagagctgcaacctcgagctccc1079Gintgtcctgctcaccaagtcttgcttcacctgtgacgcccagcttggtcaactgatctaatg1139accttcaacaaegtaatec1158<210〉2<211>321<212〉PRT<213〉智人<400〉2(Homosapiens)GlyGinAlaAlaAsnGlyArgGlyValAsnTrpLeuArgAlaLeuCys151015GluAsnAlaGinLeuGlvArgThrArgAlaPheAlaAlaThrAlaAla202530AspValArgSerGlyProlieMetLeuAlaGluArgCysSerGinCys354045LeuGlySerAspAlaSerLeuGluThrThrTrpLeuHisGluAlaLys505560SerCysAsnThrValGlyArgAsnProHisGl_uThrArgProGyAla65707580LeuGlvHisI,euAlaGlyliePheAspSerSerAspGlvArgSerArg859095HeLpiiAlaAsn(;hiAlaProLvsGI11UniI.euThrGlvAsnThrVa100105110ProVhIAspSe]'AlaVaMelSerArgLeuTyrSerArglieThrLeu25115120125TyrPheLeuCysSerLysPheAlaGlyArgPheLysValSe]'Ty]'Cys130135140LeuGinTyrSerLeuPheAlaUuProGinLeuCysProSerGinAsp145150155160ProLeuAspAlaTyrAlaValAlaThrAlaGlyLeuLeuLysLeuGin165170175PheAlaTrpGlyPheAlaLeuAlaTrpProSerProThrAsnGluTrp180185190AspLeuGinLeuProArgValProSerGinLeuAspArgGlyTrpThr195200205ValAlaLeuLeuAlaLeuGluThrProPheArglieGluGluHisAla210215220GluHisLeuLysMetMet.LeuGluLeuPheSerLeuGinLeuProPhe225230235240TrpSerHisGluPheGinLysLeuGinAlaLeuTyrGluPheThrVal245250255PheGinLeuLeuAlaArgTvrLysThrProSerThrTvrlieArgPro260265270LysTyrThrAspThrAspSerPheAlaSerTrpLysGinAlaSerTrp275280285ValLysTvrSerAspValLeuTyrSerG1yLeuLysAspArgProGin290295300ProThrGinSerLysArgValSerTrpLeuValTyrLeuProThrlie305310315320Gin權(quán)利要求1.一種人乳腺癌組織抗原，其特征在于是以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQIDNO2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO2所示的氨基酸序列通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有該抗原活性的蛋白衍生物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的人乳腺癌組織抗原，其特征在于其是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.—種編碼權(quán)利要求1所述人乳腺癌組織抗原的基因，其特征在于是以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有該抗原活性的蛋白；或(c)編碼SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)編碼具有所述抗原功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物通過(guò)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得。4.按照權(quán)利要求3的基因，其特征在于其是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。6.按照權(quán)利要求5的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征是所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是pQE國(guó)hGTA。7.含有權(quán)利要求5或6所述重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株。8.—種制備權(quán)利要求1人乳腺癌組織抗原的方法，包括以下步驟構(gòu)建含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒；培養(yǎng)用該重組表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組乳腺癌組織特異蛋白的表達(dá)，回收并純化所表達(dá)的重組蛋白。9.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是所述的重組表達(dá)質(zhì)粒是pQE-hGTA;所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌M15[pREP4]。10.按照權(quán)利要求8的方法，其特征是所述的回收并純化重組蛋白的方法包括以下步驟冰浴超聲破菌法裂解表達(dá)重組質(zhì)粒pQE-hGTA的大腸桿菌Ml5[pREP4];收集包涵體并將其溶解，收集變性蛋白；用N產(chǎn)鰲合親和層析純化變性蛋白；復(fù)性純化后的變性蛋白離子，得粗復(fù)性蛋白；將粗復(fù)性蛋白用陰離子交換層析純化，即得。ll.權(quán)利要求1的人乳腺癌組織抗原在制備診斷或治療乳腺癌藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種用于乳腺癌早期診斷的癌抗原(HumanGalactophoretissueantigen，hGTA)及其編碼基因，含有該編碼基因的重組質(zhì)粒和含有該重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還公開(kāi)了該重組抗原的制備和純化方法以及該重組抗原在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用。hGTA是一種只在乳腺組織表達(dá)，在原發(fā)性乳腺癌及乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)顯著增加的蛋白，其cDNA編碼大約36kD的分泌性糖蛋白。hGTA乳腺組織特異性和分泌性蛋白的特點(diǎn)，使其在乳腺癌臨床早期診斷上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其腫瘤相關(guān)抗原的特性，使其可作為腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)應(yīng)用于乳腺癌免疫治療。文檔編號(hào)A61P35/00GK101260153SQ200710064199公開(kāi)日2008年9月10日申請(qǐng)日期2007年3月6日優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日發(fā)明者路戴,軍杜,王文雅,鑫金申請(qǐng)人:北京美康生物技術(shù)研究中心