專利名稱：：重組人微小纖溶酶原在制備防、治眼科疾病藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領域：
，具體涉及重組人微小纖溶酶原的藥物新用途，更具體地，本發(fā)明涉及重組人微小纖溶酶原在制備防、治眼科疾病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
：正常人眼玻璃體是由99%的水和1%的大分子構(gòu)成的凝膠狀透明結(jié)締組織，這些大分子包括膠原纖維、透明質(zhì)酸、可溶性糖蛋白交織成網(wǎng)狀，起到支撐眼球的作用。玻璃體的后部(即玻璃體后皮質(zhì))主要是通過I型、IV型膠原蛋白、糖蛋白(層粘連蛋白、纖維連接蛋白)及其它糖耦化合物與視網(wǎng)膜內(nèi)表面(即視網(wǎng)膜內(nèi)界膜)直接相連，在玻璃體基底部、視盤周圍、視網(wǎng)膜內(nèi)表面大血管處，連接尤其牢固。隨著年齡的增長，玻璃體逐漸由凝膠狀轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)，并收縮、與視網(wǎng)膜內(nèi)界膜分離，這個過程稱為玻璃體后脫離(posteriorvitreousdetachment,PVD)，通常發(fā)生在40歲以上人群。然而，對于近視眼患者，玻璃體后脫離可能會提前發(fā)生；某些疾病如糖尿病、Eale's病、也可導致玻璃體變性、玻璃體后脫離。一般情況下，玻璃體會與視網(wǎng)膜完全分開，但有時，玻璃體與視網(wǎng)膜在某些位點上依然緊緊黏附在一起。這些黏附位點直接介導玻璃體對視網(wǎng)膜的牽引，導致視網(wǎng)膜馬蹄形撕裂。除非撕裂的視網(wǎng)膜被修復，否則玻璃體液通過撕裂處滲入視網(wǎng)膜下，引起視網(wǎng)膜脫離，嚴重威脅患者視力。同時，黏附還可導致視網(wǎng)膜血管破裂、出血并滲入玻璃體內(nèi)，引起玻璃體混濁。不完全性玻璃體后脫離對許多玻璃體視網(wǎng)膜疾病都產(chǎn)生重要的影響，如玻璃體黃斑牽引綜合癥、玻璃體出血、黃斑裂孔、黃斑水腫、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病黃斑病變、視網(wǎng)膜脫離。因此，玻璃體手術(shù)的一個重要目的就是將玻璃體從視網(wǎng)膜上剝離下來，防止玻璃體對視網(wǎng)膜的牽引。為了去除玻璃體，通常要實施玻璃體切割術(shù)的顯微外科手術(shù)通過顯微器械將玻璃體從眼球中去除，同時置換入生理鹽水以防止眼球塌陷。這種方法完全依靠操作者經(jīng)驗，也很難將玻璃體后皮質(zhì)徹底清除干凈，而且?guī)в泻芨叩娘L險性，如引起視網(wǎng)膜瘢痕、撕裂和其它損傷，影響術(shù)后視力的恢復。因此，采用新的方法從視網(wǎng)膜上去除玻璃體成為近年來關(guān)注的焦點，其中運用化學物質(zhì)或酶促進玻璃體液化或誘導玻璃體后脫離，即"藥物玻璃體切除術(shù)"得到廣泛的研究。這些藥物包括一些蛋白水解酶，如a-糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、細菌來源的膠原蛋白酶、擴散酶、軟骨素酶等。然而，現(xiàn)有技術(shù)通過動物或臨床實驗研究證實，上述酶中，大部份都不能誘導完全性的玻璃體后脫離或防止并發(fā)癥的產(chǎn)生。相反，其中的一些方法導致了嚴重的副作用，例如將細菌來源的蛋白酶用于哺乳動物系統(tǒng)引起強烈的免疫反應，導致視網(wǎng)膜增殖性病變，從而產(chǎn)生了視網(wǎng)膜重復脫離；膠原蛋白酶，據(jù)報道可液化玻璃體，但同時也顯示可破壞視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)；a-糜蛋白酶可導致視盤周圍和玻璃體出血;擴散酶在注入眼內(nèi)15分鐘后即產(chǎn)生對視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)的毒性效應。基于細菌來源的蛋白酶所產(chǎn)生的免疫反應和毒副作用，采用人源性蛋白酶也許更具有實用價值。纖溶酶是來源于纖溶酶原的一種絲氨酸蛋白酶。纖溶酶原是哺乳動物血液中的一種重要成分。人纖溶酶原是一種由791個氨基酸殘基構(gòu)成的糖蛋白，分子量92kDa。從肝細胞生成的纖溶酶原帶有谷氨酸氨基末端，稱為Glu-Plasminogen,經(jīng)纖溶酶限制性降解Arg68-Met冊、Lys77-Lys78或Lys78-Val79位點上的肽鍵，生成廣泛定義的Lys-Plasminogen。纖溶酶激活劑如尿激酶(u-PA)、組織型纖溶酶激活劑(t-PA)通過切割纖溶酶原Arg561-Val562位的肽鍵，將其轉(zhuǎn)化為具有酶活性、雙鏈結(jié)構(gòu)形式的纖溶酶。纖溶酶由重鏈A、輕鏈B兩條肽鏈組成，兩者通過兩個二硫鍵相連；B鏈含有絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。纖溶酶的絲氨酸蛋白酶催化活性在體內(nèi)溶解血栓過程中發(fā)揮重要的作用。患者自體的纖溶酶被臨床用作玻璃體切割手術(shù)的輔助藥物或單獨用于藥物玻璃體切除術(shù)。然而，使用纖溶酶存在以下弊端首先，目前臨床使用的纖溶酶都來自于患者自體血漿，分離纖溶酶是一個非常耗時、費力的過程，包括抽血、分離、激活、純化、熱源測試等，價格不菲，去除致病性微生物也使這個過程復雜化；其次，纖溶酶非常容易降解，不能長期存放，只能臨時配制；纖溶酶的另一個弊端是它的大分子量65kDa-82kDa。因此，像如此大的分子從注射至玻璃體內(nèi)的位置擴散至玻璃體視網(wǎng)膜界面顯然要比小分子要慢的多。視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RetinalVeinOcclusion,RV0)是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜血管疾病，可引起視力喪失，人群中發(fā)病率為0.7%-1.6%。該病病因復雜，臨床并發(fā)癥多樣，治療棘手，為眼科疑難病癥之一。RVO的危害主要包括兩個方面一是視網(wǎng)膜缺血缺氧，導致感光細胞和神經(jīng)細胞的死亡。二是視網(wǎng)膜循環(huán)障礙，導致黃斑水腫與血管新生等并發(fā)癥的產(chǎn)生。目前的系統(tǒng)溶栓療法雖有一定的治療效果，但易引起廣泛的出血，不易推廣。獲得FDA批準進入臨床使用的溶栓藥物都為纖溶酶原激活劑，如組織型纖溶酶原激活劑、鏈激酶、尿激酶及其突變體等。其本身不能溶解血栓，需激活纖溶酶原(Plasminogen,Pig)為纖溶酶后才能發(fā)揮溶栓作用。由于栓塞局部血流阻斷，纖溶酶原無法得到補充，因此用溶栓藥物治療血管再通率不高，并有初始灌注延遲、再栓塞等缺陷。按組織液向靜脈回流的規(guī)律，玻璃體內(nèi)注射rh-Wlm將會進入視網(wǎng)膜靜脈，使靜脈血栓溶解，血管再通，從而達到治療效果。因此，需要采用新的方法來克服纖溶酶用于藥物玻璃體切除術(shù)，視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及其它眼科疾病、疾病并發(fā)癥中的弊端。特別是運用一種比纖溶酶分子量小、擴散快、易于大批量制備、可長期貯存，并可避免交叉污染的藥物用于治療或預防眼科疾病以及疾病并發(fā)癥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供重組人微小纖溶酶原的藥物新用途，更具體地，提供重組人微小纖溶酶原在制備防、治眼科疾病藥物中的應用。本發(fā)明的重組人微小纖溶酶原具有序列1的cDNA、氨基酸殘基序列。本發(fā)明主要是將t-PA激活重組人微小纖溶酶原形成微小纖溶酶后，通過動物實驗，將微小纖溶酶用于玻璃體腔內(nèi)，治療或預防眼科疾病，所述的眼科疾病，涉及各種原因引起的玻璃體出血、玻璃體內(nèi)纖維蛋白滲出、不完全性玻璃體后脫離、視網(wǎng)膜靜脈阻塞，以及由此引起的視網(wǎng)膜脫離、血管增生、黃斑裂孔、水腫、阻塞性青光眼等并發(fā)癥。微小纖溶酶快速擴散至玻璃體視網(wǎng)膜界面或視網(wǎng)膜血管內(nèi)，降解玻璃體后皮質(zhì)與視網(wǎng)膜內(nèi)界膜連接處的纖維連接蛋白、層粘蛋白或溶解血栓。本發(fā)明的技術(shù)方案通過下述方法和步驟實現(xiàn)1.制備微小纖溶酶重組人微小纖溶酶原、t-PA(Genentech，SouthSanFrancisco,California,USA)按所需濃度溶于林格氏液，并以摩爾比200:1比例進行混合，37°C水浴1小時，還原性SDS-PAGE觀察微小纖溶酶原激活比例，并以混合血漿提取的纖溶酶(Sigma,Missouri,USA)為標準，通過底物S239。發(fā)色法測定微小纖溶酶活性。2.動物實驗于實驗動物角鞏緣1mm處用注射器穿剌前房放液，以防止注入藥物后導致眼內(nèi)壓升高，然后于顳下方距角鞏緣后2mm處進針，緩慢注入藥物，濕棉簽按壓注射點1分鐘，防止藥液外流，隨即用裂隙燈和間接眼底鏡觀察有無相關(guān)并發(fā)癥。3.觀察指標分別于注藥前、注藥后1天、7天，通過B超、眼部CT、視網(wǎng)膜電圖觀察玻璃體后脫離、視網(wǎng)膜功能改變。同時將部分動物注射過量戊巴比妥鈉處置，取眼球，進行巨體檢查，并將球后全層組織固定、制半薄或超薄切片，分別用于HE染色、掃描電鏡、透射電鏡檢測，兩個不同觀察者單獨判斷視網(wǎng)膜內(nèi)表面玻璃體皮質(zhì)殘留情況及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有無改變。4.采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。本發(fā)明實驗結(jié)果證實，所述的重組人微小纖溶酶原可誘導實驗動物新西蘭白兔完全性玻璃體后脫離，形成光滑的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜表面，并對視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生明顯的影響。圖1.還原性SDS-PAGE顯示t-PA激活重組人微小纖溶酶原圖2.SD大鼠眼掃描電鏡結(jié)果2A對照眼視網(wǎng)膜內(nèi)表面覆蓋致密膠原纖維；2B不完全玻璃體后脫離兔眼，內(nèi)表面有散在的膠原纖維；2C完全性玻璃體脫離兔眼，顯示光滑的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜。圖3.SD大鼠眼視網(wǎng)膜全層組織切片HE染色5A、5B分別為對照眼、1.5IU微小纖溶酶治療眼，兩者視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)無明顯差別。圖4.SD大鼠眼透射電鏡結(jié)果:6A對照眼視網(wǎng)膜前玻璃體后皮質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);6B不完全脫離兔眼視網(wǎng)膜前存在少量絮狀膠原纖維；6C1.5IU微小纖溶酶誘導完全性玻璃體皮質(zhì)后脫離；6D1.5IU微小纖溶酶治療后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞無明顯異常。圖5.SD大鼠免疫熒光組織化學結(jié)果5A對照眼玻璃體視網(wǎng)膜交界面，纖維連接蛋白(綠色熒光)嵌入含層粘連蛋白(紅色熒光)的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜中；5B經(jīng)掃描電鏡證實為完全性玻璃體后脫離的大鼠眼，玻璃體視網(wǎng)膜界面無纖維連接蛋白，而層粘連蛋白依然可見。圖6.兔眼巨檢結(jié)果1A對照眼視網(wǎng)膜內(nèi)表面布滿絮狀沉積(箭頭所指)，用PBS無法沖洗下來；IB不完全性玻璃體脫離兔眼視網(wǎng)膜內(nèi)表面，局部有絮狀沉積(箭頭所指)，用PBS無法沖洗下來；1C完全性玻璃體脫離視網(wǎng)膜內(nèi)表面光滑、無絮狀沉積。圖7.兔眼掃描電鏡結(jié)果2A對照眼視網(wǎng)膜內(nèi)表面覆蓋致密膠原纖維；2B不完全玻璃體后脫離兔眼，內(nèi)表面有散在的膠原纖維；2C完全性玻璃體脫離兔眼，顯示光滑的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜。圖8.兔眼部B超結(jié)果3A對照眼視網(wǎng)膜至晶狀體后界面空間無明顯的回聲帶；3B不完全玻璃體后脫離兔眼，視網(wǎng)膜前可見部分脫離的回聲帶(箭頭所指)；3C完全性玻璃體脫離兔眼，可見一條與視網(wǎng)膜脫離并與視網(wǎng)膜平行的光帶，并隨眼球運動而前后擺動。圖9.兔眼部CT結(jié)果4A-4C,分別顯示未脫離、不完全脫離、完全脫離的玻璃體后皮質(zhì)。圖IO.兔眼視網(wǎng)膜全層組織切片HE染色5A、5B分別為對照眼、1.5IU微小纖溶酶治療眼，兩者視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)無明顯差別。圖11.SD大鼠視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型眼底及造影圖11A-12B正常SD大鼠眼底及造影；11C-11D造模后l小時眼底及造影；11E-11F造模后1天眼底及造影；黑色箭頭指激光照射處形成血栓；白色箭頭指視網(wǎng)膜血管滲漏處。圖12.造模后視網(wǎng)膜鋪片(ADP酶法)12A正常SD大鼠；12B造模后l天；白色箭頭指視網(wǎng)膜靜脈；黑色箭頭指視網(wǎng)膜動脈。圖13.造模后組織化學圖片13A正常SD大鼠HE染色；13B-13C造模后1天HE染色；13D造模后1天PTAH染色；黑色箭頭指阻塞的靜脈；白色箭頭指神經(jīng)節(jié)細胞。圖14.治療后7天眼底造影14A對照眼；14B玻璃體內(nèi)注射0.03ugrt-PA;14C玻璃體內(nèi)注射0.04Urh-Wnm;白色箭頭指視網(wǎng)膜靜脈；黑色箭頭指再通的視網(wǎng)膜靜脈。圖15.藥物處理后7天各組血管再通比率。圖16.治療后7天組織化學16A玻璃體內(nèi)注射0.03ug;16B玻璃體內(nèi)注射0.04Urh-I^Plm;白色箭頭指神經(jīng)節(jié)細胞；黑色箭頭指視網(wǎng)膜靜脈；紅色箭頭指玻璃體的后界膜。圖17.治療后7天視網(wǎng)膜鋪片(ADP酶法)17A對照眼；17B玻璃體內(nèi)注射0.04Urh-PPlm;白色箭頭指增殖的血管；黑色箭頭指側(cè)支循環(huán)。圖18.SD大鼠視網(wǎng)膜透射電鏡18A正常SD大鼠；18B造模后1天；18CBSS治療后7天；18D0.04Urh-^Plm治療后7天；A指視網(wǎng)膜雙極細胞；*指神經(jīng)節(jié)細胞。具體實施例方式通過下述實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述實施例l重組人微小纖溶酶誘導SD大鼠完全性玻璃體后脫離的實驗研究1.微小纖溶酶的制備采用畢赤酵母菌株(Invityogen公司)表達重組人微小纖溶酶原，表達產(chǎn)物經(jīng)純化、透析、分裝至無熱源安培瓶中，冷凍干燥，-20'C保存。臨用前適量林格氏液溶解，并以摩爾比200:1比例與組織型纖溶酶原激活劑進行混合，37'C水浴激活1小時，還原性SDS-PAGE觀察微小纖溶酶原激活比例，并以混合血漿提取的纖溶酶(Sigma，Missouri,USA)為標準，通過底物S239。發(fā)色法測定微小纖溶酶活性。2.實驗動物選擇成年Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重200g300g,雌雄不拘，隨機分到3個組中，每組20只。所有SD大鼠，統(tǒng)一以左眼用于藥物治療，右眼注射等量林格氏液作為陰性對照。術(shù)前30分鐘起，2%戊巴比妥鈉腹腔注射(40mg/kg)麻醉，1%阿托品滴眼液滴眼，10分鐘一次共3次。間接眼底鏡檢査眼底和玻璃體，排除己有的異常病變后方入選。3.SD大鼠實驗于角鞏緣后lmra處用皮試針穿刺前房放液10u1，以防止注入藥物后導致眼內(nèi)壓升高。然后于顳下方距角鞏緣后2mm處進針，穿刺方向朝向視乳頭，當瞳孔區(qū)見到針頭后停止進針，緩慢注入藥物10iU，針尖開口朝向后極部。注藥完畢拔出針頭，濕棉簽按壓注射點1分鐘，防止藥液外流。隨即用裂隙燈和間接眼底鏡觀察有無相關(guān)并發(fā)癥。1、2、3組分別注射O.OIIU、0.02IU、0.03IU微小纖溶酶。4.觀測指標分別于注藥后1天、7天，每組隨機抽10只SD大鼠，腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，迅速取出眼球，將球后全層組織固定、制半薄或超薄切片，分別用于HE染色、免疫組織化學、掃描電鏡、透射電鏡檢測。兩個不同觀察者分別判斷視網(wǎng)膜內(nèi)表面玻璃體皮質(zhì)殘留情況及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有無改變。4.1.HE染色摘除的眼球標本以0.02mol/l磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，在上方角鞏緣12點處用逢線做方向標記，在鞏膜四個方向切口，迅速浸入固定液(含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛)中，4。C冰箱內(nèi)固定18小時后，沿角鞏緣后3mm小心去除角膜和晶體，用切片刀沿水平方向?qū)⒀矍蛞环譃槎?，將其中半個眼球切成長條狀全層組織作掃描電鏡，再分別留取后極部、基底部，切成2mmX2mm小塊作透射電鏡，其余部份作HE染色、免疫熒光組織化學。4.2.抗體準備第一抗體包括小鼠抗大鼠層粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)單克隆抗體(博士德公司，武漢)、兔抗大鼠纖維連接蛋白(lamina,LN)多克隆抗體(博士德公司，武漢)，第二抗體包括羊抗小鼠FITC標記IgG、羊抗兔Cy3標記IgG(Sigma,St.Louis,Missouri,USA)，均用0.05mol/L磷酸緩沖液(含1%牛血清白蛋白、0.2%疊氮化鈉)1:500倍稀釋。4.3.免疫熒光組織化學將全層視網(wǎng)膜組織0.02mol/l磷酸鹽緩沖液漂洗三次，梯度庶糖脫水過夜，Epon812(SakuraFinetek，Torrance,U.S.A)包埋，切取6um切片，加入混合第一抗體(包括小鼠抗大鼠層粘連蛋白(fibronectin,FN)單克隆抗體和兔抗大鼠纖維連接蛋白(lamina,LN)多克隆抗體，均1:500稀釋)，4°C冰箱內(nèi)孵育18小時，恢復至室溫，0.02mol/l磷酸鹽緩沖液漂洗三次，加入混合第二抗體(包括FITC標記羊抗小鼠IgG和Cy3標記羊抗兔IgG)，37'C孵育1小時。0.02mo1/1磷酸鹽緩沖液漂洗三次，熒光顯微鏡(OLYMP-US-BX61,Tokyo,Japan)觀察，拍照。4.4.掃描電鏡檢査樣品經(jīng)1%餓酸固定液固定2小時，乙醇和醋酸正戊醇梯度脫水，HCP-2臨界點干燥儀中干燥2小時，1B-3型離子濺射儀噴鍍樣品，掃描電鏡(HitachiS-520，Tokyo,Japan)觀察、拍片。兩個不同觀察者單獨判斷視網(wǎng)膜內(nèi)表面玻璃體皮質(zhì)殘留情況及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有無改變。4.5.透射電鏡檢查樣品經(jīng)1%餓酸固定液固定2小時，梯度丙酮脫水，Epon618(SakuraFinetek,Torrance,U.S.A)浸透包埋。LKB-1型超薄切片機上切取厚約0.5-1的半薄切片，高碘酸液洗去鋨酸，1%甲苯胺藍和1%天青I溶液預染，銅網(wǎng)附貼切片。醋酸鈾及構(gòu)椽酸鉛染色，透射電鏡(JEM-1200EX)觀察，拍照。4.6.統(tǒng)計處理，采用SPSS12.0軟件進行Pearson's卡方檢驗，方差不齊時，采用確切概率法。5.藥效學研究結(jié)果5.1.還原性SDS-PAGE顯示經(jīng)t-PA37。C水浴1小時后，90°/。以上微小纖溶酶原激活為微小纖溶酶。5.2.經(jīng)掃描電鏡檢測顯示各治療組玻璃體后皮質(zhì)殘留與對照組比較，都有顯著性差異(代0.01);0.03IU微小纖溶酶組與0.01IU微小纖溶酶組相比存在顯著的劑量效應關(guān)系(代0.05);各組在注藥后7天時完全性玻璃體后脫離的眼球皆比注藥后1天時增多，但無顯著性差別；0.02IU微小纖溶酶注藥后1天可誘導60%(6/10)眼球完全性玻璃體后脫離，7天可誘導90%(9/10)眼球完全性玻璃體后脫離；劑量增加至0.03IU未明顯增強治療效果(^0.05)。5.3.組織化學HE染色和透射電鏡結(jié)果表明與對照眼相比，各劑量微小纖溶酶均未造成視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的明顯改變，內(nèi)界膜保存完好。5.4.免疫熒光組織化學顯示經(jīng)掃描電鏡證實為完全性玻璃體后脫離的大鼠眼，玻璃體視網(wǎng)膜界面無纖維連接蛋白，而構(gòu)成視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的主要成分層粘連蛋白保持完好，說明內(nèi)界膜未受到損傷。表1為對照組、治療組玻璃體后皮質(zhì)殘留情況比較，其中，*"++"為未發(fā)生玻璃體后脫離，視網(wǎng)膜內(nèi)表面覆蓋致密膠原纖維；"+"為不完全性玻璃體后脫離，視網(wǎng)膜內(nèi)表面有零星膠原纖維；"一"為完全性玻璃體后脫離，呈現(xiàn)光滑的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜；t各治療組與對照組玻璃體后皮質(zhì)殘留情況比較。表l_^_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2重組人微小纖溶酶誘導新西蘭白兔完全性玻璃體后脫離實驗研究1.制備微小纖溶酶同SD大鼠。2.實驗動物選擇成年雄性新西蘭白兔48只，體重2.5kg3.0kg，隨機分到3個組中，每組16只。所有動物，統(tǒng)一以左眼用于藥物治療，右眼注射等量林格氏液為陰性對照。術(shù)前30分鐘起，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(25-30mg/kg)全身麻醉，1%阿托品滴眼液滴眼，10分鐘一次共3次。間接眼底鏡檢査眼底與玻璃體，排除已有的異常病變后方入選。3.新西蘭白兔眼球內(nèi)注射注藥方法同SD大鼠，所有新西蘭白兔，統(tǒng)一眼前房放液100lU后，左眼注射藥物100ul，右眼注射等體積林格氏液。1、2、3組分別注射0.5IU、l.OIU、1.5IU微小纖溶酶。4.藥效學研究分別于注藥后1天、7天，每組隨機抽8只新西蘭白兔通過眼部B超、CT觀察玻璃體后脫離，然后耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死，迅速取出眼球，將球后全層組織固定、制半薄或超薄切片，分別用于HE染色、掃描電鏡、透射電鏡檢測。兩個不同觀察者分別判斷視網(wǎng)膜內(nèi)表面玻璃體皮質(zhì)殘留情況及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有無改變。4.1.石蠟切片HE染色、掃描電鏡、透射電鏡檢測方法同SD大鼠。4.2.眼球巨檢摘除的眼球標本以0.02mol/l磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，在上方角鞏緣12點處用逢線做方向標記，在鞏膜四個方向切口，迅速浸入固定液(含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛)中，用切片刀沿水平方向?qū)⒀矍蛞环譃槎?，將其中半個眼球用于巨檢0.02mol/LPBS預先沖洗二至三遍，半個眼球開口朝上，均勻滴加5滴(30p1/滴)曲安奈德至整個視網(wǎng)膜內(nèi)表面，室溫放置20分鐘，0.02mol/LPBS沖洗五遍后，觀察、拍照。5.藥效學研究結(jié)果5.1.經(jīng)掃描電鏡檢測顯示各治療組玻璃體后皮質(zhì)殘留與對照組比較，都有顯著性差異(代0.01);1.0IU微小纖溶酶組與0.5IU微小纖溶酶組相比存在顯著的時間、劑量效應關(guān)系(代0.05);1.0IU微小纖溶酶注藥后1天可誘導75%(6/8)眼球完全性玻璃體后脫離，7天可誘導100%(10/10)眼球完全性玻璃體后脫離；劑量增加至1.5IU未明顯增強治療效果(AO.05)。新西蘭白兔眼球巨檢、B超檢測、掃描電鏡檢測結(jié)果彼此無顯著差別(》0.05)，而與CT結(jié)果皆存在顯蓍差別(代O.05)。5.2.組織化學及透射電鏡結(jié)果顯示與對照眼相比，各劑量微小纖溶酶均未造成視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的明顯改變，內(nèi)界膜保存完好。表2.為對照組、治療組玻璃體后皮質(zhì)殘留情況比較，其中，*"++"為視網(wǎng)膜內(nèi)表面覆蓋致密膠原纖維；"+"為不完全性玻璃體后脫離，視網(wǎng)膜內(nèi)表面有零星膠原纖維；"一"為完全性玻璃體后脫離，呈現(xiàn)光滑的視網(wǎng)膜內(nèi)界膜；t各治療組與對照組玻璃體后皮質(zhì)殘留情況比較。表3.為四種檢測玻璃體皮質(zhì)后脫離方法的比較，其中，*部分兔眼注射藥物1天后，降解的膠原纖維使玻璃體混濁，無法清晰觀察眼底，絕大多數(shù)7天后眼底可見；對于脫離太遠的玻璃體后皮質(zhì)也無法準確判斷。表2觀察時間眼球數(shù)玻璃體后皮質(zhì)殘留*分組用藥劑量沃)(只)—+++準t對照林格氏液12424(右眼)242410.5IU微小纖溶酶18224〈0.0178431<0.0121.0IU微小纖溶酶1862<0.0188〈0.0131.5IU微小纖溶酶1871<0.01788<0.01.表3.__玻璃體后皮質(zhì)殘留_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例3重組人微小纖溶酶治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞1.制備微小纖溶酶采用所構(gòu)建的壁赤酵母菌株表達重組人微小纖溶酶原，中試研究所得的rh-Wlg純品經(jīng)透析、除菌、分裝至無熱源安培瓶中，冷凍干燥，-2(TC保存。臨用前適量BSS溶解，并以摩爾比200:1比例與rt-PA進行混合，37°C水浴激活，還原性SDS-PAGE確定rh,Plg最適激活時間，并以纖溶酶(Sigma，Missouri,USA)為標準，通過底物S239。發(fā)色法測定微小纖溶酶活性，調(diào)節(jié)rh-PPlg使其激活后的微小纖溶酶濃度分別為2.o、4.ou*mr。2.實驗動物選擇雄性SD大鼠，體重250-300克，購自復旦大學上海醫(yī)學院動物實驗中心，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(240mg，kg—'體重)麻醉，美多麗滴眼液(0.5%托比卡胺，0.5%鹽酸去氧腎上腺素)充分散瞳，倍諾喜(0.4%鹽酸奧布卡因)表面麻醉，10分鐘一次共3次。裂隙燈、間接檢眼鏡檢查眼底和玻璃體，排除已有的異常病變后方可入選。3.視網(wǎng)膜靜脈阻塞動物模型:利用孟加拉玫瑰紅聯(lián)合氬激光制備視網(wǎng)膜靜脈阻塞模型。照射前3分鐘，將孟加拉玫瑰紅溶液(40mg，kg—'體重)經(jīng)大鼠尾靜脈注入體內(nèi)。隨后，應用氬激光照射視網(wǎng)膜靜脈，在距視盤1-3個視盤距離(PD)范圍內(nèi)，從視網(wǎng)膜靜脈遠端開始激光，光斑連續(xù)排列。激光波長532nm;能量100mW;光斑直徑50Mm;時間0.5秒。大鼠有6個視網(wǎng)膜靜脈，完全阻塞3個，分布在三個象限內(nèi)。每處血管平均照射25-30點，直至血流中斷，形成一段約1PD的.靜脈血栓。照射后5分鐘，將10%熒光素鈉注入大鼠腹腔內(nèi)(50mg，kg—'體重)，行眼底熒光造影確認視網(wǎng)膜靜脈的阻塞情況，激發(fā)光675mn，490nm觀察。每只SD大鼠均左眼進行氬激光照射，如果造影顯示視網(wǎng)膜靜脈不完全阻塞，或者出現(xiàn)玻璃體出血以及嚴重的視網(wǎng)膜脫離，則排除本實驗，造影顯示造模成功的SD大鼠避光飼養(yǎng)12小時。4.大鼠眼球內(nèi)注射SD大鼠造模成功后1天，3%戊巴比妥鈉常規(guī)全身麻醉，美多麗滴眼液(0.5%托比卡胺，0.5%鹽酸去氧腎上腺素)充分散瞳，倍諾喜(0.4%鹽酸奧布卡因)表面麻醉同前。間接眼底鏡、眼底熒光造影確認視網(wǎng)膜靜脈未發(fā)生再通，并記錄、拍照注藥前眼底情況。將造模成功的SD大鼠40只隨機分為4組，每組10只大鼠。每只SD大鼠左眼注射藥物10ul，右眼不進行處理。注藥前于角鞏緣處穿刺放液10!il，以防止注入藥物后導致眼內(nèi)壓升高。然后于顳下方距角鞏緣后lram處以自制30gauge針頭的注射器進行穿剌，穿刺方向朝向視乳頭，當瞳孔區(qū)見到針頭后停止進針，緩慢注入10ul藥物，針尖開口朝向后極部。注藥完畢停留10秒后再拔出針頭，濕棉簽按壓注射點1分鐘，防止藥液外流。第1組SD大鼠注射平衡鹽溶液(BSS);第2組注射0.03iigrt-PA;第3組注射0.015Pgrt-PA激活的微小纖維蛋白溶酶0.02U;第4組注射0.03ygrt-PA激活的uPlm0.04U。5.觀測指標(a)眼科常規(guī)檢查及熒光造影注藥后隨即用裂隙燈和眼底鏡檢查眼部情況，排除注藥引起的眼部損傷。此后1天、7天再各進行一次眼部檢查。所有大鼠于注藥后7天，進行眼底血管熒光造影，觀察視網(wǎng)膜靜脈再通及眼底變化情況。(b)組織化學檢查于注藥前、注藥后7天，每組各隨機取1只大鼠，3%戊巴比妥鈉常規(guī)全身麻醉，打開鼠胸腔，暴露心臟，用灌注針頭刺入左心室同時用顯微剪刀剪開右心房先用生理鹽水灌注約2-3分鐘，然后灌注4%多聚甲醛溶液約5分鐘。迅速摘除眼球，0.02MPBS漂洗，在上方角鞏緣12點處用逢線做方向標記,清理眼球表面組織后，在鞏膜四個方向切口，迅速浸入固定液(4%多聚甲醛)中，4°C冰箱內(nèi)固定20小時后，沿睫狀體扁平部剪除角膜，晶體，去除玻璃體，選擇后極部及周邊部視網(wǎng)膜及血管組織、視網(wǎng)膜靜脈血栓處，切成4mmx5mm的材料，0.02MPBS漂洗，制5um切片，分別進行HE、PTAH染色。(c)視網(wǎng)膜鋪片(ADP酶染色法)同樣于注藥前和注藥后7天，每組各隨機取1只大鼠。3%戊巴比妥鈉常規(guī)全身麻醉、心臟灌注同前。摘除眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，4'C過夜。在鼠眼球的角膜緣后約1mm沿角膜緣環(huán)行剪開，去除角膜，取出晶狀體，以視乳頭為中心作4-5個放射狀切開，去除鞏膜、脈絡膜，用毛筆掃除視網(wǎng)膜外層的色素上皮。用濃度為0.05M、pH為7.2的Tris-馬來酸緩沖液沖洗5次，每次15分鐘。于37°C反應液(0.2M、Hi為7.2的Tris-馬來酸緩沖液中加入3mmolI/1硝酸鉛、6mmolL—1氯化鎂、1mgm1/1ADP)中孵育15分鐘后，0.05M、PH為7.2的Tris-馬來酸緩沖液沖洗5次，每次15分鐘。0.2%硫化銨反應1分鐘。0.05M、PH為7.2的Tris-馬來酸緩沖液沖洗3次，每次5分鐘后甘油明膠封片。(d)透射電鏡觀察在組織化學檢測査樣本處理的同時，留取阻塞血管周邊視網(wǎng)膜組織進行透射電鏡檢查。(e)統(tǒng)計處理采用SPSS12.0軟件進行Pearson卡方檢驗，單格樣本數(shù)不足時，采用Fisher確切概率法。6.藥效學研究結(jié)果6.1SD大鼠視網(wǎng)膜靜脈阻塞動物模型的建立6.1.1眼底觀察及視網(wǎng)膜血管造影眼底觀察可見正常SD大鼠視網(wǎng)膜血管清晰，動脈細而直，靜脈粗稍有彎曲(圖11A)。所有血管血液暢通，血管造影顯示造影劑灌注正常(圖11B)。通過大鼠尾靜脈注射孟加拉玫瑰紅，氬激光照射視網(wǎng)膜靜脈，至照射部位發(fā)白、血液中斷。于造模后1小時，眼底鏡及視網(wǎng)膜血管造影觀察到視網(wǎng)膜靜脈有1-2DP長度的血液阻斷(圖IIC，IID)。1天后阻塞部位遠端血管痙攣、扭曲，周邊組織視網(wǎng)膜水腫混濁，.有明顯的視網(wǎng)膜出血(圖1E)。血管造影顯示熒光造影劑在阻塞處突然中斷或灌注延遲，在該處管壁有熒光滲漏(圖11F)。6.1.2視網(wǎng)膜鋪片(ADP酶法)將視網(wǎng)膜剝離后鋪片，采用ADP酶法對SD大鼠視網(wǎng)膜血管進行顯影，視網(wǎng)膜動脈細而直，呈樹枝狀，靜脈稍粗，分支少，著色較淺(圖12A)。與正常SD大鼠視網(wǎng)膜相比，視網(wǎng)膜靜脈阻塞1天后無明顯的血管增生(圖12B)。6.1.3組織化學檢測與正常SD大鼠視網(wǎng)膜(圖13A)相比，視網(wǎng)膜靜脈阻塞SD大鼠造模后1天，可見靜脈血管內(nèi)血栓形成，其中包含較多的紅細胞、血小板以及網(wǎng)狀纖維，經(jīng)PTAH特殊染色后證實血栓中含有較高纖維蛋白成份。阻塞血管周邊的節(jié)細胞層結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)節(jié)細胞與內(nèi)板層相脫離而與內(nèi)界膜相連。分析原因為靜脈阻塞后導致視網(wǎng)膜水腫，缺血、缺氧后周邊組織自溶(圖13B-13D)。6.2微小纖溶酶溶栓效果6.2.1眼底觀察和視網(wǎng)膜血管造影造模后1天的SD大鼠玻璃體內(nèi)注射BSS7天時，87.5%眼視網(wǎng)膜血管未發(fā)生再通，眼底觀察有大面積的視網(wǎng)膜出血，其中4眼發(fā)生了視網(wǎng)膜脫離，3眼并發(fā)了增生性青光眼。造影顯示阻塞靜脈無熒光灌注，而周邊血管受血流增加的影響有明顯的增粗、扭曲、側(cè)支循環(huán)形成、血管通透性增高，熒光滲漏嚴重(圖14A)。0.03ugrt-PA治療眼有75%眼未發(fā)生再通，其中2眼發(fā)生了視網(wǎng)膜脫離，3眼并發(fā)了增生性青光眼。眼底觀察視網(wǎng)膜出血均較治療前明顯增加，但較對照眼少，熒光滲漏也較少(圖14B)。0.02U、0.04UPPlm治療組的再通率分別為37.5%、75%，與對照組相比，三者具有量效關(guān)系(P〈0.05)(圖15)，此外也有1眼并發(fā)青光眼。造影顯示阻塞的血管有熒光灌注，部分血管灌注延遲，熒光滲漏明顯較少(圖14C)。6.2.2組織化學檢測玻璃體內(nèi)注射BSS后7天，SD大鼠視網(wǎng)膜血管無明顯的再通，阻塞血管周圍組織自溶，節(jié)細胞層嚴重破壞，并與內(nèi)板層脫離。神經(jīng)節(jié)細胞脫落，并通過崩解的內(nèi)界膜進入到玻璃體腔內(nèi)，視網(wǎng)膜內(nèi)層組組織結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定(圖16A)。而注射玻璃體內(nèi)注射0.04U^Plm后7天，再通后的血管周邊組織水腫消失，節(jié)細胞復位，并可見與視網(wǎng)膜脫離的玻璃體后界膜(圖16B)。6.2.3視網(wǎng)膜鋪片(ADP酶法)對照眼在注藥后7天，阻塞視網(wǎng)膜靜脈有血管新生，并與視網(wǎng)膜動脈相連，動靜脈吻合，形成側(cè)支循環(huán)(圖17A)。0.04UMlm治療眼阻塞血管周邊新生血管較少(圖17B)。6.2.4透射電鏡觀察對正常及造模后1天的SD大鼠阻塞血管周邊的視網(wǎng)膜內(nèi)層細胞結(jié)構(gòu)進行透16射電鏡觀察后發(fā)現(xiàn)造模后1天后，雙極細胞、神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生自溶，胞槳內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞，但細胞膜、核膜較完整，未發(fā)生核濃縮(圖18A,18B)。治療后7天，對照組神經(jīng)節(jié)細胞胞漿自溶，出現(xiàn)大面積空區(qū)，0.02U^Plm治療組神經(jīng)節(jié)細胞也有部分自溶，但稍輕(圖18C,18D)。SEQUENCELISTING〈110〉復旦大學〈120〉重組人微小纖溶酶原在制備防、治眼科疾病藥物中的應用〈130>0651-1-C10809〈140〉〈141〉〈160>2〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>786<212>DNA,〈213〉重組人微小纖溶酶原(recombinanthumanmicroplasminogen)〈220〉〈221>CDS<222>(1)..(786)<400>1aaactttacgactactgtgatgtccctcagtgtgcggcccctteattt48LysLeuTyrAspTyrCysAspValProGinCysAlaAlaProSerPhe151015gattgtgggaagcctcaagtggagccgaagaaatgtcctggaagggtt96AspCysGlyLysProGinValGluProLysLysCysProGlyArgVal202530gtgggggggtgtgtggcccacccacattectggccctggcaagtcagt144ValGlyGlyCysValAlaHisProHisSerTrpProTrpGinValSer354045Ctt3g3192aggtttggaatgcacttc第1tgtggaggcaccttgatatec頁LeuArgThrArgPheGlyMetHisPheCysGlyGlyThrLeulieSer505560cca240Pro65gagGlutggTrpgtgValttgLeuactThr70getAlagccAlacacHistgcCysttgLeu75gagGluaagLystecSercca_Pro站gArg80cct288ProteaSertecSertacTyr卿Lys85gtcValateliectgLeuggtGlygcaAla90cacHisc犯GingaaGlugtgVal犯tAsn95etcLeug肌336GluccgProcatHisgttVal100cagGing犯Glu3taliegaaGlugtgVal105tctSer鄉(xiāng)ArgctgLeuttcPhettgLeu110gagGlucccProaca384ThrcgaArgaaaLys115gatAspattliegccAlattgLeuetaLeu120aagLysetaLeuageSeragtSercctPro125gccAlagtcValatelieact432ThrgacAsp130LysgtaValatelieccaProgetAla135tgtCysctgLeuCC￡lProtecSerccaPro140犯tAsntatTyrgtgValgtcValget480Ala145gacAspeggArg6LCCThrGlutgtCys150UcPheatelieactThrggcGlytggTrp155ggaGlyg犯GluThracttttggagetggccttetcaaggaagcccagetccct528c肌GinggtGly160gtgattgagThrPheGlyAlaGlyLeuLeuLysGluAlaGinLeuProVallieGlu165170175sat576Asnace624Thrggt672Glytta720Leu225cct768ProaaaLysGlugtg786ValgtgValgacAsp210c犯GinetcLeu195agtSertgcCys180tgtCysggaGlyggtGlyatgMet卿ArgggaGlygtcValgtcVal犯tAsntat丁yrAsn260gttVal245AsncgcArggetAlagggGlyggtGlycctProactThrtatTyrcatHistctSer230cgtArgt犯gagGluctgLeu215tggTrpttgLeu200gttValggtGlygttValtttPhe185gccAlatgcCyscttLeuteaSeraggctgLeuggcGly犯tAsnggaGlyggcGlyttcPheg恥GlutttPhe250ggaGlyactThrtgtCys235gttValagaArg肌gLys220gcaAlaAsp205gacAspgtcVal190agtSercgcArgactThrLyscccProtggTrpC6L3GintgcCystacTyr犯tAsnattlietecSercagGinattliegagGlu255卿Lys240ggaGly〈210〉2第3頁〈211〉261<212>PRT,、〈213〉重組人微小纖溶酶原(recombinanthumanmicroplasminogen)〈400〉2LysLeuTyrAspTyrCysAspValProGinCysAlaAlaProSerPhe151015AspCysGlyLysProGinValGluProLysLysCysProGlyArgVal202530ValGlyGlyCysValAlaHisProHisSerTrpProTrpGinValSer354045LeuArgThrArgPheGlyMetHisPheCysGlyGlyThrLeulieSer505560ProGluTrpValLeuThrAlaAlaHisCysLeuGluLysSerProArg65707580ProSerSerTyrLysVallieLeuGlyAlaHisGinGluValAsnLeu859095GluProHisValGinGlulieGluValSerArgLeuPheLeuGluPro100105110ThrArgLysAsplieAlaLeuLeuLysLeuSerSerProAlaVallie115120125ThrAspLysVallieProAlaCysLeuProSerProAsnTyrValVal130135140AlaAspArgThrGluCysPhelieThrGlyTrpGlyGluThrGinGly145150155160ThrPheGlyAlaGlyLeuLeuLysGluAlaGinUuProVallieGlu165170175第4頁AsnLysValCysAsnArgTyrGluPheLeuAsnGlyArgValGinSer180185190ThrGluLeuCysAlaGlyHisLeuAlaGlyGlyThrAspSerCysGin195200205GlyAspSerGlyGlyProLeuValCysPheGluLysAspLysTyrlie210215220LeuGinGlyValThrSerTrpGlyLeuGlyCysAlaArgProAsnLys225230235240ProGlyValTyrValArgValSerArgPheValThrTrplieGluGly245250255ValMetArgAsnAsn260權(quán)利要求1.重組人微小纖溶酶原在制備治療眼科疾病藥物中的應用。2、重組人微小纖溶酶原在制備預防眼科疾病藥物中的應用。3、按權(quán)利要求1或2的應用，其中所述的眼科疾病包括各種原因引起的玻璃體出血玻璃體內(nèi)纖維蛋白滲出、不完全性玻璃體后脫離、視網(wǎng)膜靜脈阻塞，以及由此引起的視網(wǎng)膜脫離、血管增生、黃斑裂孔、水腫或阻塞性青光眼及并發(fā)癥。4、按權(quán)利要求1或2的應用，其中所述的重組人微小纖溶酶原具有序列1的重組人微小纖溶酶原cDNA、氨基酸殘基序列。5、按權(quán)利要求1或2的應用，其中所述的治療或預防方式，是將t-PA激活重組人微小纖溶酶原形成微小纖溶酶后，用于玻璃體腔內(nèi)，治療或預防眼科疾病。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領域：
，涉及重組人微小纖溶酶原的藥物新用途，具體涉及重組人微小纖溶酶原在制備防、治眼科疾病藥物中的應用。本發(fā)明將t-PA激活重組人微小纖溶酶原形成微小纖溶酶后，將微小纖溶酶微量用于實驗動物玻璃體腔內(nèi)，實驗結(jié)果表明經(jīng)t-PA激活的微小纖溶酶能誘導完全性的玻璃體后脫離，并保持視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)的完整性。本發(fā)明的重組人微小纖溶酶原可制備治療或預防眼科疾病的藥物。文檔編號A61K38/49GK101204579SQ200710109339公開日2008年6月25日申請日期2007年5月23日優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日發(fā)明者宋后燕,歐陽艷玲,王文吉,煒莫,武陳,欣黃申請人:復旦大學