本發(fā)明涉及一種活性肽，特別涉及一種雙齒圍沙蠶抗凝血肽及其用途。

背景技術(shù)：

血栓形成是缺血性心臟病、缺血性中風(fēng)及靜脈栓塞常見的病理學(xué)基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康且近年來還有漸增之勢。抑制血小板的聚集與釋放、抑制凝血酶系統(tǒng)、激活抗凝血酶及纖溶酶系統(tǒng)均可抑制血栓的形成。血栓的形成是缺血性心腦血管疾病及血栓栓塞性疾病的主要病理過程，與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制血小板聚集、抑制血栓的形成對心腦血管系統(tǒng)疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治均有重要意義。

雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)隸屬于動物界，環(huán)節(jié)動物門，多毛綱，游行多毛目，沙蠶科，俗稱海蜈蚣，與陸地生物蚯蚓具有很近的親緣關(guān)系。從蚯蚓體內(nèi)獲得的蚯激酶已被證明能夠有效溶解血栓，改善微循環(huán)，加強(qiáng)心、腦血管側(cè)支循環(huán)，蚯激酶的成功開發(fā)使科研工作者將目光轉(zhuǎn)向沙蠶。通過酶解的方法從沙蠶體內(nèi)提取抗凝血成分以抑制體內(nèi)血栓，未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶抗凝血肽，抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

本發(fā)明還提供了雙齒圍沙蠶抗凝血肽的用途，雙齒圍沙蠶抗凝血肽作為制備抗血栓藥物的應(yīng)用、雙齒圍沙蠶抗凝血肽作為制備抗血栓保健食品的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種雙齒圍沙蠶抗凝血肽，其氨基酸序列為：Pro-Val-Glu-Arg-Lys。本發(fā)明從雙齒圍沙蠶中提取獲得活性肽，并進(jìn)行了分離純化，首次報道了所提取的寡肽具有抗凝血活性，具有抗血栓作用。

作為優(yōu)選，雙齒圍沙蠶抗凝血肽的分子結(jié)構(gòu)式為：

一種雙齒圍沙蠶抗凝血肽的用途，所述雙齒圍沙蠶抗凝血肽作為制備抗血栓藥物的應(yīng)用。

一種雙齒圍沙蠶抗凝血肽的用途，所述雙齒圍沙蠶抗凝血肽作為制備抗血栓保健食品的應(yīng)用。

上述雙齒圍沙蠶抗凝血肽的制備方法，步驟如下：

(1)樣品預(yù)處理：新鮮雙齒圍沙蠶經(jīng)預(yù)處理后得組織勻漿；

(2)酶解：按照每克組織勻漿加3mL純凈水的配比，將組織勻漿與純凈水混勻，調(diào)節(jié)pH＝10，加入堿性蛋白酶酶解后得酶解液；

(3)超濾：酶解液滅活，離心，取上清液，經(jīng)超濾獲得分子量小于3kd的活性組分；

(4)陰離子交換層析：分子量小于3kd的活性組分經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，梯度洗脫，于280nm波長下檢測，收集所得洗脫峰，冷凍干燥，篩選抗凝血活性最高的洗脫峰作為陰離子交換層析產(chǎn)物用于下一步分離純化；

(5)葡聚糖凝膠G25層析：將抗凝血活性最高的陰離子交換層析產(chǎn)物采用葡聚糖凝膠G25層析繼續(xù)分離純化，蒸餾水洗脫，于280nm波長下檢測，收集所得洗脫峰，冷凍干燥后作為葡聚糖凝膠G25層析產(chǎn)物；

(6)反相高效液相色譜分離純化：對葡聚糖凝膠G25層析產(chǎn)物采用反相高效液相色譜法分離純化，最終獲得雙齒圍沙蠶抗凝血肽。

本發(fā)明首次通過酶解的方法從沙蠶體內(nèi)提取抗凝血成分，獲得具有抗凝血活性的沙蠶寡肽，具有抗血栓作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

步驟(1)樣品預(yù)處理具體為：將新鮮雙齒圍沙蠶用清水清洗干凈，瀝干后稱重，組織搗碎機(jī)勻漿，加勻漿3倍體積的預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，4℃靜置2h以上，離心，收集上清，上清液用醫(yī)用脫脂棉過濾。所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02mol/L，pH 7.0。步驟(2)按照每克組織勻漿加1500U的加酶量加入堿性蛋白酶，45℃酶解5小時得酶解液。步驟(4)洗脫的流速為1.5mL/min，預(yù)先用pH7.4，0.02mol/L Tris-HCl平衡緩沖液充分平衡DEAE柱3-5個柱體積，然后上樣。步驟(5)的蒸餾水的洗脫速度為1.1mL/min。

本發(fā)明的有益效果是：抗凝血活性好，具有抗血栓作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1不同酶解液的超濾截留組分抗凝活性的比較(注：與生理鹽水相比，*P＜0.05)。

圖2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析洗脫曲線。

圖3離子交換層析洗脫峰抗凝血活性的比較(注：與生理鹽水相比，，*P＜0.05)。

圖4 Sephadex G-25洗脫曲線。

圖5反相高效液相分離純化圖。

圖6 PAAP的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖7 PAAP對大鼠TXB2的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

圖8 PAAP對大鼠6-keto-PGF1α的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

圖9 PAAP對大鼠T-PA的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

圖10 PAAP對大鼠PAI-1的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

圖11 PAAP對大鼠t-pa/PAI-1的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

圖12 PAAP對大鼠PLG的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ: 與模型組相比，P<0.05。

圖13 PAAP對大鼠AT-Ⅲ的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

圖14 PAAP對大鼠PC的影響*:與正常組相比，p<0.05Δ:與模型組相比，P<0.05。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

雙齒圍沙蠶抗凝血肽(Anticoagulant Peptides from Perinereis aibuhitensis，PAAP)。

實施例：

1材料與方法

1.1動物、材料與試劑

健康雄性清潔級ICR小鼠，體質(zhì)量(20±2)g；健康雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(140±10)g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001。

雙齒圍沙蠶購買自浙江舟山朱家尖，并由浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授進(jìn)行種類鑒定。

胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶中國亞太恒信公司；纖維蛋白原、凝血酶、角叉菜膠、ADP美國sigma公司；阿司匹林林腸溶片拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Cogent u Scale超濾系統(tǒng)默克密理博；ApurifierUPC100快速蛋白液相色譜系統(tǒng)GE Healthcare；ALPHA1-4冷凍干燥機(jī)德國Christ公司；

Agilent-1260高效液相色譜儀美國安捷倫公司；752FC紫外分光光度計上海光譜儀器有限公司；CF16RXII日立低溫離心機(jī)日本日立公司；

LG-PABER-1半自動凝血分析儀北京世帝科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品的制備

1.3.1.1原料制備

將新鮮雙齒圍沙蠶用清水清洗干凈，瀝干后稱重，高速組織搗碎機(jī)勻漿,加3倍體積的預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L PBS,pH 7.0),4℃靜置2h以上。8000r/m in離心15min,收集上清。上清液用醫(yī)用脫脂棉過濾出去脂肪組織及其它不溶物得組織勻漿，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?，此為PAAP原料。

1.3.1.2最佳酶種選擇

將組織勻漿按濕重3倍加水。選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶作供選酶，按照蛋白酶各自的最適作用溫度和pH值(見表1)，加酶量1500U/g，反應(yīng)5h，料液比1:3，酶解PAAP原料。依據(jù)抗凝活性篩選出最佳酶種。酶解完畢后，100℃滅酶10min，過濾后冷凍干燥，備用。

表1不同酶的最適溫度和pH

1.3.1.3抗凝血活性的測定

依據(jù)《中國藥典》2010版，具體方法為：精密取樣品粉末(過三號篩)1g，精密加入0.9％氯化鈉溶液5mL，充分?jǐn)嚢?，浸?0分鐘，并時時振搖，10000r/min離心，精密量取上清液100μL，置試管(8mm×38mm)中，加入含0.5％牛纖維蛋白原的Tris-HCl緩沖液200μL，搖勻，置水浴中(37℃士0.5℃)溫浸5分鐘，滴加12U/mL的凝血酶溶液(每1分鐘滴加1次，每次5μL，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，按照下列公式計算抗凝血活性：

式中：U為抗凝血活性U/g；C₁為凝血酶濃度U/ml；C₂為樣品液濃度g/mL；V₁為消耗凝血酶體積μL；V₂為樣品液體積μL。

1.3.2 PAAP的分離純化

1.3.2.1超濾分離

取最佳酶種在最優(yōu)酶解條件下酶解的上清液，用截留分子量分別為8kDa、5kDa、3kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，將各分子段超濾酶解液冷凍干燥后進(jìn)行抗凝血活性測定，篩選出對抗凝血活性最高分子段的超濾組分凍干備用。

1.3.2.2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析分離純化

上柱樣品:經(jīng)過超濾系統(tǒng)得到的抗凝血活性最優(yōu)組分，過濾后上樣。洗脫過程:流速1.5mL/min，預(yù)先用pH7.4,0.02M Tris-HCl平衡緩沖液充分平衡DEAE柱3-5個柱體積，然后上樣，上樣后用平衡緩沖液將穿透峰洗到接近基線，采用線性梯度洗脫方式洗脫，即使用0.02M Tris-HCl緩沖液且其中的NaCl濃度由0-1M的線性梯度上升方法，按峰收集流出液的液體。檢測波長為280nm，將各個洗脫峰凍干后備用。

1.3.2.3葡聚糖凝膠G-25層析分離純化

上柱樣品:經(jīng)過離子交換層析得到的抗凝血活性最優(yōu)組分，用蒸餾水配制為0.1g/ml，過濾后上樣。洗脫過程:以蒸餾水作為洗脫液，將凝膠柱進(jìn)行平衡洗脫；調(diào)節(jié)恒流泵流速為1.1mL/min，每管收集3.5min，收集各峰的洗脫液，280nm下檢測其吸光度。將各個洗脫峰凍干后備用。

1.3.2.4高效液相純化

上樣樣品為經(jīng)G-25層析得到的樣品，運(yùn)用反向高效液相色譜法純化，條件如下：系統(tǒng)為Agilent 1260HPLC；色譜柱為Zorbax SB-C18(4.6×250mm，5μm)；進(jìn)樣體積為100μL；平衡緩沖液為0.06％TFA(A液)；洗脫緩沖液為含0.05％TFA的乙腈(B液)；洗脫梯度為0％–0％B液洗脫4 分鐘,0％-100％B液洗脫25分鐘,100％-100％B液；洗脫時間6分鐘；流速為0.8ml/min；紫外檢測波長280nm。

1.3.2.5目標(biāo)肽的氨基酸序列測定

采用N末端降解檢測方法，氨基酸測序儀進(jìn)行測定。

1.3.2.6 PAAP的抗凝活性測定

方法同1.3.1.3

1.3.3 PAAP的急性毒理學(xué)實驗

1.3.3.1預(yù)實驗

雄性ICR小鼠4只，體重20±2g，24h禁食不禁水，PAAP用純水配成最大濃度550mg/mL(不堵塞過濾器為準(zhǔn))，按0.2ml/10g BW灌胃7d，每天一次。觀察小鼠日常行為、精神狀態(tài)及死亡率。

1.3.3.2最大給藥劑量實驗

雄性ICR小鼠9只，體重20±2g，24h禁食不禁水，對照組(純水)和PAAP低劑量組(5.5g/kg BW)、高劑量組(11g/kg BW)，每組3只，按照預(yù)試驗方法操作，觀察小鼠日常行為，7d后稱重處死，解剖觀察。

1.3.4 PAAP對小鼠尾部血栓形成的影響

1.3.4.1小鼠分組及造模

40只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為模型組、阿司匹林陽性對照組、PAAP低劑量組(50mg/kg)、中劑量(100mg/kg)、高劑量組(200mg/kg)。小鼠預(yù)防性灌胃給藥14d，模型組給予等量生理鹽水，造模前24h禁食不禁水，在第14d末，給藥1h后參考文獻(xiàn)方法造模[1]，腹腔注射0.2％角叉菜膠(由生理鹽水配制)，15℃室溫過夜。72h后眼球取血，血液迅速裝入混有109mmol/l枸櫞酸納(9:1)抗凝管，3000r/min離心10min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2小鼠血栓長度的計算

用游標(biāo)卡尺分別在注射角叉菜膠24h、48h、72h測定小鼠的尾部血栓總長及為形成血栓的長度，小鼠血栓形成長度＝小鼠尾部總長-未形成血栓長度。

1.3.4.3指標(biāo)測定

半自動血凝儀檢測APTT、TT、PT、FIB，按試劑盒說明書操作。

1.3.4.4數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理，實驗結(jié)果以表示，且以P＜0.05表示差異有顯著性。

1.3.5 PAAP對大鼠頸動脈血栓形成的影響

1.3.5.1大鼠頸動脈血栓模型的建立

雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為模型組、阿司匹林陽性對照組、PAAP低劑量組(50mg/kg)、中劑量(100mg/kg)、高劑量組(200mg/kg)。預(yù)防性灌胃給藥14d，模型組給予等量生理鹽水，造模前24h禁食不禁水，于末次給藥1h后，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，參照Kurz法^[10]改良制作頸總動脈血栓模型，滅菌器材沿頸中線縱向切開頸部皮膚，鈍性分離左側(cè)頸動脈1cm，在頸動脈與周圍組織間放一塑料保鮮膜，用于保護(hù)血管周圍組織，將吸有35％FeCl₃溶液20μL的濾紙片(1cm*1 cm)環(huán)形包裹頸動脈，假手術(shù)組用等量生理鹽水濾紙包裹，30min后去除濾紙片。分離右側(cè)頸動脈穿線備用。去除紙片90min后，右側(cè)頸動脈采血，轉(zhuǎn)入裝有抗凝劑的采血管中，3000r/min離心15min，取上層血漿，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2血栓質(zhì)量及其抑制率

大鼠取血后，精確截取濾紙環(huán)抱處血管，吸干血管中殘留血液，電子天平稱其質(zhì)量，取出血栓后再稱血管質(zhì)量，前后相剪即為1cm血管段內(nèi)血栓質(zhì)量。按以下公式計算各組抑制率：

抑制率＝[(模型組測定值-實驗組測定值)÷模型組測定值]×100％。

1.3.5.3指標(biāo)測定

6-酮-前列腺素Flα(6-Keto-PGFlα)、大鼠血栓素B2(txb2)、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、蛋白C(PC)、組織型纖溶酶原活化劑(T-PA)、纖溶酶原(PLG)、纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)應(yīng)用酶聯(lián)免疫法按試劑盒說明書操作。

1.3.5.4數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理，實驗結(jié)果以表示，且以P＜0.05表示差異有顯著性。

1.3.6對大鼠體內(nèi)血小板聚集率的影響

雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為對照組、阿司匹林陽性組、PAAP低劑量組(50mg/kg)、中劑量(100mg/kg)、高劑量組(200mg/kg)。預(yù)防性灌胃給藥14d，模型組給予等量生理鹽水，造模前24h禁食不禁水，于末次給藥1h后，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血。轉(zhuǎn)入裝有抗凝劑(枸櫞酸納1:9)的采血管中，1000r/10min離心，取上清為PRP(富血小板血漿)。余下血液3500r/15min繼續(xù)離心，取上清即為PPP(貧血小板血漿)。使用半自動凝血儀測定血小板聚集率。

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理，實驗結(jié)果以表示，且以P＜0.05表示差異有顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1最佳酶種的選擇

五種蛋白酶酶解液的抗凝活性比較見下表，在各自最適酶解條件下，堿性蛋白酶的酶解效果最好，抗凝活性達(dá)到了69±2.3U/g，胃蛋白酶次之。故選定堿性蛋白酶為本實驗最佳酶種。酶解在其最適條件下完成，即料液比為1:3，pH值為10.0，加酶量為1500U/g，溫度為45.0℃，酶解時間是5h。

表2五種蛋白酶酶解液的抗凝活性

2.2 PAAP的分離純化

2.2.1超濾分離

取各個不同分子段凍干樣品測定抗凝活性，結(jié)果如圖1所示。分子量在<3kDa的酶解液抗凝活性最高，為84.0±2.3u/g。故選定<3kDa分子段酶解液進(jìn)行下步分離純化。

2.2.2 DEAE-Sepharose FF離子交換層析分離

取分子量<3kDa的酶解液進(jìn)一步分離純化，于280nm處出現(xiàn)三個峰，即峰1、峰2、峰3，見圖2，收集各峰組分，冷凍干燥后測定抗凝血活性。結(jié)果如圖3所示，峰3具有最高的抗凝血活性，為900±51U/g。故選擇峰3進(jìn)行下一步分離純化。

2.2.3 Sephadex G-25層析分離

取2.2.2中峰3凍干樣品進(jìn)行G25層析分離，280nm處檢測吸光值，結(jié)果如圖4所示，為一單峰，收集此峰凍干備用。

2.2.4反相高效液相分離純化及氨基酸序列測定

G-25洗脫峰經(jīng)RP-HPLC色譜柱洗脫純化，得到1個單峰，如圖5所示，收集此峰，并將其命名為PAAP。經(jīng)檢測該目標(biāo)肽的氨基酸序列為Pro-Val-Glu-Arg-Lys(SEQ ID No.1)，分子量為627.7Da。化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖6。

2.2.5PAAP的抗凝血活性

經(jīng)測定，PAAP的抗凝血活性為1320±20.3U/g。

2.3急性毒理學(xué)實驗結(jié)果

通過預(yù)實驗及最大給藥量實驗，測得PAAP的最大給藥量為11.0g/kg.d。實驗中各組小鼠活動正常，精神狀態(tài)良好且未出現(xiàn)死亡及異常情況。解剖后發(fā)現(xiàn)，心、肺、肝、腎、胃和腸等器官肉眼觀察均無異常。實驗期間，PAAP實驗各組體重和對照組相比較，高劑量組體重漲幅相對明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。提示該樣品使用安全，基本無毒。

表3急性毒理學(xué)實驗小鼠體重變化

注：*與對照組相比，p<0.05。

2.4PAAP對體內(nèi)血栓的影響

2.4.1 PAAP對不同時間角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠黑尾長度的影響

小鼠注射角叉菜膠后，各組均形成明顯黑尾，隨著時間的延長，各組的黑尾長度均有不同程度的縮短。造模24h時，高、中劑量組與模型對照組差異顯著，黑尾長度明顯較短(p<0.05)。48h及72h時，PAAP各組均與模型對照組有顯著差異(p<0.05)。阿司匹林各組與模型組差異不顯著(p>0.05)。表4結(jié)果表明PAAP可有效減輕小鼠尾部血栓的形成，不但可以抑制血栓發(fā)展，同時對已形成的血栓有一定的溶解作用，且有量效關(guān)系。

表4實驗小鼠造模24、48和72h黑尾長度

*與模型組比p<0.05，有顯著性差異。

2.4.2PAAP對FeCl₃誘導(dǎo)頸動脈血栓的影響

阿司匹林組與PAAP組均可減輕血栓重量。與模型組相比，PAAP中、高劑量大鼠的血栓質(zhì)量顯著減輕(p＜0.05)。與阿司匹林組相比，PAAP高劑量大鼠的血栓質(zhì)量也有所減輕(表5)。表明沙蠶能夠降低血栓重量且有量效關(guān)系。

表5 PAAP對FeCl₃誘導(dǎo)的大鼠頸動脈血栓生成量的影響

*與模型組比p＜0.05，有顯著性差異。

2.5PAAP對ADP誘導(dǎo)的體內(nèi)血小板聚集率的影響

大鼠應(yīng)用阿司匹林后，與正常對照組相比，對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有非常顯著的抑制作用(p<0.05)。PAAP各劑量組對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集具有明顯的抑制作用(p<0.05)，而且隨著給藥劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)(表6)。

表6 PAAP對ADP誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)血小板聚集的影響

*與模型組比p<0.05，有顯著性差異。

2.6雙齒圍沙蠶多肽對小鼠凝血時間及FIB的影響

采用凝血儀測定雙齒圍沙蠶多肽對小鼠血漿APTT、TT、PT、FIB的影響，表7結(jié)果顯示，與模型組相比，雙齒圍沙蠶多肽低、中、高劑量組均能顯著延長APTT，并呈一定的劑量依賴關(guān)系。雙齒圍沙蠶多肽低、中、高劑量能延長TT、PT，但差異不顯著。與模型組相比，高劑量組顯著降低FIB含量，低、中劑量組降低FIB含量，但差異不顯著。本實驗結(jié)果表明，雙齒圍沙蠶多肽能顯著延長小鼠APTT,降低FIB含量。

表7 PAAP對小鼠APTT、TT、PT及FIB的影響

*與模型組比p＜0.05，有顯著性差異。

2.7各組大鼠血漿中TXB₂、6-keto-PGF1_α含量的變化

如圖7、圖8所示，與正常對照組比較，模型組血漿TXB2含量升高(P<0.05)，而6-keto-PGF1，含量降低(P<0.05)。陽性藥物組TXB₂濃度低于模型組(P<0.05)而6-keto-PGF1α較模型組升高(P<0.05)。與模型組比較，PAAP各組均能顯著降低TXB2(P<0.05)并同時升高6-keto-PGF1α(P<0.05)。

2.8各組大鼠血漿中T-PA、PAI-1、PLG含量

如圖9-12所示，與正常對照組組比較，模型t-PA活性降低(P<0.05)，PAI-1活性升高(P>0.05)，t-PA/PAI-1比值降低(P<0.05),PLG活性升高(P<0.05)，提示模型組纖溶活性降低。與模型組比較，阿司匹林組t-PA活性、PAI-1活性、PLG活性及t-PA/PAI-1比值無變化(P>0.05)，與模型組比較，不同劑量的雙齒圍沙蠶多肽組t-PA活性均升高(P<0.05)，同時PAI-1和PLG活性降低(P<0.05)；t-PA/PAI-1比值升高(P<0.05)。

2.9各組大鼠血漿中AT-Ⅲ、PC含量

如圖13-14所示，與正常對照組比較，模型組的ATⅢ、PC的含量均明顯降低(P<0.05)，提示模型組抗凝系統(tǒng)活性降低。與模型組相比，阿司匹林組ATⅢ、PC的含量無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，雙齒圍沙蠶多肽各組的ATⅢ含量降低(P>0.05)而PC含量升高(P>0.05)

3討論

本研究以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作為供選酶酶解雙齒圍沙蠶，以體外抗凝活性為檢測指標(biāo)，篩選出最優(yōu)酶種(堿性蛋白酶)對沙蠶進(jìn)行酶解，在此酶解基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。首先，酶解液經(jīng)超濾截留具有最高抗凝活性的分子段(<3kDa)，接著利用DEAE-SepharoseFF離子交換層析篩選出活性最高組分(峰3)并利用凝膠過濾對峰3進(jìn)行純化獲得單一峰，收集此峰并利用反相高效液相進(jìn)行分離純化。最后，將純化后的樣品進(jìn)行氨基酸序列測定，其氨基酸序列為Pro-Val-Glu-Arg-Lys并將該寡肽命名為PAAP。

角叉菜膠是從紅藻類海草中提煉出來的親水性膠體，是一種較強(qiáng)的致炎因子^]可用于制備多種組織炎癥模型。胡三覺等^[1]發(fā)現(xiàn)可用其制作小鼠尾部血栓形成模型，此種靜脈血栓形成是由局部炎癥與內(nèi)皮細(xì)胞的損壞所引起的混合型血栓，可依據(jù)皮膚顏色的顯著變化，從體表直接測量血栓的形成范圍與程度，觀察其發(fā)展全過程具有簡便、直觀、無創(chuàng)傷等優(yōu)點。實驗中發(fā)現(xiàn)，注射角叉菜膠后期部分小鼠會出現(xiàn)斷尾現(xiàn)象，為準(zhǔn)確測量黑尾長度，在實驗過程中選擇測量未形成血栓的部份，再已尾部總長度減去這部分長度，即為小鼠的黑尾長度。PAAP能夠顯著降低小鼠尾部形成的血栓長度，對角叉菜膠所致的小鼠尾部血栓具有一定的抑制作用。

Lockyer^[2]等發(fā)現(xiàn)利用FeCl₃外敷可使血管內(nèi)膜損傷，膠原暴露，引起血小板黏附、聚集和釋放活化等，導(dǎo)致內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活，在動脈損傷的區(qū)域形成復(fù)合性血栓，與人類血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制相似且制作方法簡單、容易控制、重復(fù)性好^[3]，因而在國內(nèi)外研究中被廣泛使用^[4-7]，本發(fā)明選用此模型來評價PAAP抑制血栓形成的作用。本研究結(jié)果顯示，PAAP各劑量組均能延長FeCl₃誘導(dǎo)的大鼠頸總動脈血栓形成時間，表明PAAP具有抑制動脈血栓形成的作用。

血小板聚集誘導(dǎo)劑主要包括二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶、膠原、血栓烷A₂(TXA₂)、腎上腺素和血清素等。各種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板活化的能力不盡相同，凝血酶、膠原和TXA₂都是強(qiáng)誘導(dǎo)劑，ADP屬中等強(qiáng)度的血小板聚集誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)的血小板活化的信號通路是血小板聚集過程中最為重要的信號通路，因此本實驗選擇ADP誘導(dǎo)的血小板聚集進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，PAAP能夠有效的抑制由ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集。

綜上所述，本發(fā)明使用堿性蛋白酶酶解雙齒圍沙蠶，經(jīng)分離純化后，所獲得的寡肽(PAAP)的抗凝活性達(dá)到1320±20.3U/g。急性毒性實驗顯示，PAAP的最大給藥量為11.0g/kg.d，實驗中未出現(xiàn)小鼠異常及死亡現(xiàn)象，提示該樣品使用安全。PAAP可明顯抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓及Fecl₃引起的大鼠頸動脈血栓，同時對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集也具有抑制作用。PAAP的抗血栓機(jī)制可能與降低TXB2、PAI-1、PLG、FIB，升高6-keto-PGF1α、T-PA、t-pa/PAI-1有關(guān)。

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以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大學(xué)

<120> 一種雙齒圍沙蠶抗凝血肽及其用途

<130> 2016.11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 雙齒圍沙蠶

<400> 1

Pro Val Glu Arg Lys

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