專利名稱：靜脈注射人乙型肝炎免疫球蛋白制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是從經(jīng)乙肝疫苗免疫的獻(xiàn)血員的血漿中分離的一種含有高活性抗乙 肝病毒抗體的藥物。具體為靜脈注射乙型肝炎免疫球蛋白制備方法。
背景技術(shù)：
"靜脈注射用人乙型肝炎免疫球蛋白"這一藥物由于含有高活性的抗乙肝 病毒抗體，臨床上是一種專門針對(duì)乙肝的治療藥品，在國(guó)內(nèi)還沒有生產(chǎn)，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上 僅有一種供肌肉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白，該類產(chǎn)品有兩方面缺點(diǎn) 一方面活性低一 只有IOO、 200、 400IU/只，另一方面其純度低一人抗體免疫球蛋白的純度只有90%，雜質(zhì) 含量高而不能用于靜脈注射用，由于以上缺點(diǎn)這種肌肉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白主要 用于乙肝的預(yù)防上，因此國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上就需要一種純度更高的可以進(jìn)行靜脈注射的高活性的 人乙型肝炎免疫球蛋白制劑，目前多家生產(chǎn)和研發(fā)單位都在進(jìn)行工藝開發(fā)，開發(fā)的重點(diǎn)和 難點(diǎn)主要集中在
1、 如何提高產(chǎn)品的純度和活性，產(chǎn)品純度的提高意味著雜質(zhì)更少，臨床副反應(yīng)也就 更少。
2、 選擇合適的保護(hù)劑，使產(chǎn)品具有更長(zhǎng)的穩(wěn)定期。
3、 選擇合適的病毒滅活方法，充分保證產(chǎn)品的生物安全性目前，根據(jù)國(guó)家藥典要求，免疫球蛋白類藥品中人抗體免疫球蛋白純度達(dá)到95%就滿 足靜脈注射要求。在國(guó)際上血液制品的生產(chǎn)研發(fā)主要集中在歐洲、美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，"靜脈注 射用人乙型肝炎免疫球蛋白"作為一種血液制品，上市的產(chǎn)品多采用全層析的方法進(jìn)行生 產(chǎn)，如美國(guó)百特和紐約血液中心，即用層析的方法直接從血漿中分離，此方法的缺點(diǎn)是生 產(chǎn)成本高。發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的在于提供一種成本低廉、人抗體免疫球蛋白純度可達(dá)98%以上 的靜脈注射乙型肝炎免疫球蛋白制備方法。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 第一步、融化血漿將抗-HBs抗體效價(jià)> 8IU/ml的原料血漿經(jīng)75%酒精和注射用水消 毒外袋后，割袋混合后置于帶夾層的不銹鋼反應(yīng)罐中水浴融化，控制血漿溫度在1. 0°C ~ 3. 0 'C之間；第二步、pH調(diào)節(jié)用pH4. 0醋酸緩沖液加入到血漿中，調(diào)節(jié)pH值到5. 80 - 6.00反應(yīng)， 30分鐘；第三步、20%—25°/。乙醇反應(yīng)繼上一步，加95%乙醇，使乙醇濃度達(dá)20 % _25°/ ( V/V ); 加酒精過(guò)程中逐漸降溫，加完后，降溫到-3. 01C ~-5. 0TC，反應(yīng)30分鐘；第四步、壓濾繼上一步，向制品中加入1.0% (W/W)硅藻土助濾劑，攪拌30分鐘進(jìn) 行壓濾，壓濾時(shí)控制前壓<1. 5Kg/cm2，上清回收到反應(yīng)罐，從壓濾機(jī)回收沉淀進(jìn)行下步；第五步、沉淀的溶解繼上一步，稱量上步沉淀，置不銹鋼反應(yīng)罐中，加入3—5倍量
預(yù)冷到0. (TC ~ 2. OIC的注射用水，攪拌3小時(shí)以上，制冷反應(yīng)液溫度至0. (TC ~ 2. 0X:，攪 拌至溶解；第六步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，加入pH4. 0醋酸緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值在5. 05 -5. 25范圍，反應(yīng)30分鐘；第七步、16%—18%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，佳反應(yīng)液的乙醇濃度 達(dá)lW—in，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液，最終溫度達(dá)-4. 51C ~-5. 5'C,繼續(xù)攪拌l 小時(shí)即可壓濾；第八步、壓濾繼上一步，由壓濾;f幾壓濾，壓濾時(shí)控制前壓《1.5Kg/cm2,上清回收到 反應(yīng)罐進(jìn)行下步，壓濾機(jī)的沉淀?xiàng)壸鏊?；第九步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，將上步的濾液緩慢加入lmol/L碳酸氫鈉緩沖液，調(diào)節(jié) 反應(yīng)液pH值在7. 20~7. 60范圍，反應(yīng)30分鐘，；第十步、25%—28°/。乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃 度達(dá)到25°/。_28%,在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液最終溫度達(dá)-7. (TC ~-10. 0X:,靜止1小 時(shí)以上，即可壓濾；第十一步、壓濾繼上一步，由壓濾才幾壓濾，進(jìn)4亍壓濾前調(diào)節(jié)制品溫度為-10. 0X: ~-12. 0 。C，壓濾時(shí)控制前壓《1. 5Kg/cm2，從壓濾機(jī)上回收沉淀，稱量沉淀備用；第十二步、沉淀溶解繼上一步，將上一步備用的沉淀用6—8倍量注射用水溶解，溫 度是O. 0°C ~2. 0'C;第十三步、調(diào)節(jié)pH:繼上一步，加入鹽酸，調(diào)節(jié)溶解液pH在6. 5~6. 8之間，繼續(xù)攪 拌反應(yīng)15min;第十四步、層析繼上一步，將溶脹好的凝膠用0. 015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6. 5-6, 8后，上樣蛋白液收集流穿之蛋白峰，上樣結(jié)束后，用0. 015M磷酸緩沖液沖洗凝膠上的 殘余蛋白，合并上述兩項(xiàng)蛋白液稱重；第十五步、酸處理繼上一步，緩慢加入3。/nHCl調(diào)節(jié)蛋白液pH至3.5-4. 0，繼續(xù)攪拌 30minj第十六步、.超濾繼上一步，將調(diào)整好的蛋白液抽至清潔的超濾桶中，啟動(dòng)超濾器， 開始預(yù)濃縮，待蛋白濃度達(dá)50 g/L左右，結(jié)束預(yù)濃縮稱重，加入2。C 10。C注射用水，稀 釋蛋白濃度至20~50g/L,透析6—8倍水，透析結(jié)束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度 達(dá)80g/L以上，抽入潔凈不銹鋼桶內(nèi)稱量；第十七步、配制用3訓(xùn)C1調(diào)整濃縮后蛋白液的pH是3. 8-4. 4，加入麥芽糖后，補(bǔ)加 注射用水，使制品最終含免疫球蛋白50g/L、麥芽糖100g/L,取樣復(fù)測(cè)pH、 pH是3. 8 ~ 4. 4， 稱重；第十八步、繼上一步，將制品從壓力桶經(jīng)除菌濾器除菌分裝于玻璃瓶中，蓋好膠塞，記 錄除菌后制品量；第十九步、繼上一步，低pH病毒滅活將除菌后制品置于21'C-25TC庫(kù)放置21天， 逐曰記錄庫(kù)溫，滅活后的制品應(yīng)及時(shí)移至2 °C ~ 8 。C庫(kù)保存；
第二十步、繼上一步，納米膜過(guò)濾除病毒經(jīng)低pH病毒滅活后的制品，再經(jīng)由納米膜 過(guò)濾器過(guò)濾于罐中；第二十一步、繼上一步，可分裝不同規(guī)格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、繼上一步，成品檢定合格后包裝。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明提供一種可以靜脈注射的人乙型肝炎免疫球蛋白，其所含的 人抗體免疫球蛋白純度可達(dá)98%以上，雜質(zhì)更少，副反應(yīng)更低。此工藝條件溫和，對(duì)產(chǎn)品 沒有損傷，而且病毒滅活效果好，優(yōu)于其他單位采用的巴氏滅活法或單一的低PH孵育法。 本發(fā)明采用的是一種低溫乙醇分離法與層析法和超濾法相結(jié)合的方法，使生產(chǎn)成本大大降 低。
具體實(shí)施例方式第一步、融化血漿將抗-HBs抗體效價(jià)> 8IU/ml的原料血漿經(jīng)75%酒精和注射用水消 毒外袋后，割袋混合后置于帶夾層的不銹鋼反應(yīng)罐中水浴融化，控制血漿溫度在1. (TC ~ 3. 0 'C之間；第二步、pH調(diào)節(jié)用pH4. 0醋酸緩沖液加入到血漿中，調(diào)節(jié)pH值到5. 80~ 6. 00反應(yīng)， 30分鐘;第三步、20%—25 /。乙醇反應(yīng)繼上一步，加95%乙醇，使乙醇濃度達(dá)20 %—25% ( V/V ); 加酒精過(guò)程中逐漸降溫，加完后，降溫到-3. (TC ~-5. (TC，反應(yīng)30分鐘；第四步、壓濾繼上一步，向制品中加入1.(W (W/W)硅藻土助濾劑，攪拌30分鐘進(jìn) 行壓濾，壓濾時(shí)控制前壓<1. 5Kg/cm2，上清回收到反應(yīng)罐，從壓濾機(jī)回收沉淀進(jìn)行下步；第五步、沉淀的溶解繼上一步，稱量上步沉淀，置不銹鋼反應(yīng)罐中，加入3—5倍量 預(yù)冷到0. (TC ~ 2. (TC的注射用水，攪拌3小時(shí)以上，制冷反應(yīng)液溫度至0. 0°C ~ 2. (TC ,攪 拌至溶解；第六步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，加入pH4. 0醋酸緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值在5. 05~ 5. 25范圍，反應(yīng)30分鐘；第七步、16%—18°/。乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，佳反應(yīng)液的乙醇濃度 達(dá)16%—18%,在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液，最終溫度達(dá)-4. 5°C ~-5. 5'C，繼續(xù)攪拌1 小時(shí)即可壓濾；第八步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，壓濾時(shí)控制前壓<1. 5Kg/cm2,上清回收到 反應(yīng)罐進(jìn)行下步，壓濾機(jī)的沉淀?xiàng)壸鏊?；第九步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，將上步的濾液緩慢加入lmol/L碳酸氫鈉緩沖液，調(diào)節(jié) 反應(yīng)液pH值在7. 20- 7.60范圍，反應(yīng)30分鐘，；第十步、25%—28%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃 度達(dá)到25°/。_28°/。，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液最終溫度達(dá)-7. Oi: ~-10. (TC，靜止1小 時(shí)以上，即可壓濾；
第十一步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，進(jìn)行壓濾前調(diào)節(jié)制品溫度為-10. 0°C ~-12. 0 t:，壓濾時(shí)控制前壓《1. 5Kg/cm2,從壓濾機(jī)上回收沉淀，稱量沉淀備用；第十二步、沉淀溶解繼上一步，將上一步備用的沉淀用6—8倍量注射用水溶解，溫度是o. ot; -2. or;第十三步、調(diào)節(jié)pH:繼上一步，加入鹽酸，調(diào)節(jié)溶解液pH在6. 5~6. 8之間，繼續(xù)攪 拌反應(yīng)15min;第十四步、層析繼上一步，將溶脹好的凝膠用0. 015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6. 5~ 6.8后，上樣蛋白液收集流穿之蛋白峰，上樣結(jié)束后，用0. 015M磷酸緩沖液沖洗凝膠上的 殘余蛋白，合并上述兩項(xiàng)蛋白液稱重；第十五步、酸處理繼上一步，緩慢加入3y。HCl調(diào)節(jié)蛋白液pH至3.5-4.0，繼續(xù)攪拌 30min;第十六步、.超濾繼上一步，將調(diào)整好的蛋白液抽至清潔的超濾桶中，啟動(dòng)超濾器， 開始預(yù)濃縮，待蛋白濃度達(dá)50 g/L左右，結(jié)束預(yù)濃縮稱重，加入2。C-1(TC注射用水，稀 釋蛋白濃度至20~50g/L,透析6 — 8倍水，透析結(jié)束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度 達(dá)80g/L以上，抽入潔凈不銹鋼桶內(nèi)稱量；第十七步、配制用3'/。HCl調(diào)整濃縮后蛋白液的pH是3. 8~4. 4，加入麥芽糖后，補(bǔ)加 注射用水，使制品最終含免疫球蛋白50g/L、麥芽糖100g/L,取樣復(fù)測(cè)pH、 pH是3. 8 ~ 4. 4，稱重；第十八步、繼上一步，將制品從壓力桶經(jīng)除菌濾器除菌分裝于玻璃瓶中，蓋好膠塞，記 錄除菌后制品量；第十九步、繼上一步，低pH病毒滅活將除菌后制品置于21。C-25。C庫(kù)放置21天， 逐日記錄庫(kù)溫，滅活后的制品應(yīng)及時(shí)移至2 'C ~ 8 。C庫(kù)保存；第二十步、繼上一步，納米膜過(guò)濾除病毒經(jīng)低pH病毒滅活后的制品，再經(jīng)由納米膜 過(guò)濾器過(guò)濾于罐中；第二十一步、繼上一步，可分裝不同規(guī)格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、繼上一步，成品檢定合格后包裝。 下面舉例進(jìn)一步詳述本發(fā)明的技術(shù)方案。例1、第一步、融化血漿將抗-HBs抗體效價(jià)8IU/ml的原料血漿經(jīng)75%酒精和注射 用水消毒外袋后，割袋混合后置于帶夾層的不銹鋼反應(yīng)罐中水浴融化，控制血漿溫度在1. 0 。C;第二步、pH調(diào)節(jié)用pH4. 0醋酸緩沖液加入到血漿中，調(diào)節(jié)pH值到5. 80,反應(yīng)30 分鐘；第三步、2(W乙醇反應(yīng)繼上一步，加95%乙醇，使乙醇濃度達(dá)20% (V/V)加酒精 過(guò)程中逐漸降溫，加完后，降溫到-3.0X:，反應(yīng)30分鐘；第四步、壓濾繼上一步，向制品中加入1. 0% (W/W)硅藻土助濾劑，攪拌30分鐘進(jìn)
行壓濾，壓濾時(shí)控制前壓1. 5Kg/cm2,上清回收到反應(yīng)罐，經(jīng)壓濾機(jī)回收沉淀；第五步、沉淀的溶解繼上一步，稱量上步沉淀，置不銹鋼反應(yīng)罐中，加入3倍量預(yù)冷到0. (TC的注射用水，攪拌3小時(shí)，制冷反應(yīng)液溫度至O.(TC，攪拌至溶解；第六步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，加入pH4. 0醋酸緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值5. 05，反應(yīng)30分鐘；第七步、16%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度達(dá) 16%,在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液，最終溫度達(dá)-4. 5。C,繼續(xù)攪拌l小時(shí)即可壓濾；第八步、壓濾繼上一步，由壓濾4幾壓濾，壓濾時(shí)控制前壓1. 5Kg/cm2,上清回收到 反應(yīng)罐，壓濾機(jī)的沉淀?xiàng)壸鏊?；第九步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，將上步的濾液緩慢加入lmol/L碳酸氬鈉緩沖液，調(diào) 節(jié)反應(yīng)液pH值達(dá)7. 20，反應(yīng)30分鐘；第十步、25°/。一28%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃 度是25%,在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液最終溫度達(dá)-7. 0C，靜止l小時(shí)，即可壓濾；第十一步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，進(jìn)行壓濾前調(diào)節(jié)制品溫度為-10.0'C， 壓濾時(shí)控制前壓1. 5Kg/cm2,從壓濾機(jī)上回收沉淀，稱量沉淀備用；第十二步、沉淀溶解繼上一步，將上一步備用的沉淀用6倍量注射用水溶解，溫度 是O. OTC;第十三步、調(diào)節(jié)pH:繼上一步，加入鹽酸，調(diào)節(jié)溶解液pH6. 5,繼續(xù)攪拌反應(yīng)15min;第十四步、層析繼上一步，將溶脹好的凝膠用0. 015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6. 5 后，上樣蛋白液收集流穿之蛋白峰，上樣結(jié)束后，用0. 015M磷酸緩沖液沖洗凝膠上的殘 余蛋白，合并上述兩項(xiàng)蛋白液稱重；第十五步、酸處理繼上一步，緩慢加入3仰C1調(diào)節(jié)蛋白液pH3. 5，繼續(xù)攪拌30ndn;第十六步、.超濾繼上一步，將調(diào)整好的蛋白液抽至清潔的超濾桶中，啟動(dòng)超濾器， 開始預(yù)濃縮待蛋白濃度達(dá)50g/L左右，結(jié)束預(yù)濃縮稱重，加入2。C注射用水稀釋蛋白濃度 至20g/L,透析6倍水，透析結(jié)束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達(dá)80g/L,抽入潔 凈不銹鋼桶內(nèi)稱量；第十七步、配制用3仰C1調(diào)整濃縮后蛋白液的pH是3. 8,加入麥芽糖后，補(bǔ)加注射 用水，使制品最終含免疫球蛋白50g/L、麥芽糖100g/L，取樣復(fù)測(cè)pH、 pH是3. 8，稱重；第十八步、繼上一步，將制品從壓力桶經(jīng)除菌濾器除菌分裝于玻璃瓶中，蓋好膠塞， 記錄除菌后制品量；第十九步、繼上一步，低pH病毒滅活將除菌后制品置于21'C庫(kù)放置21天，逐日記 錄庫(kù)溫，滅活后的制品應(yīng)及時(shí)移至2iC庫(kù)保存；第二十步、繼上一步，納米膜過(guò)濾除病毒經(jīng)低pH病毒滅活后的制品，再經(jīng)由納米 膜過(guò)濾器過(guò)濾于罐中；第二十一步、繼上一步，可分裝不同規(guī)格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶； 第二十二步、繼上一步，成品檢定合格后包裝。例2、第一步、融化血漿將抗-HBs抗體效價(jià)10IU/ml的原料血漿經(jīng)75%酒精和注射 用水消毒外袋后，割袋混合后置于帶夾層的不銹鋼反應(yīng)罐中水浴融化，控制血漿溫度3. 0第二步、pH調(diào)節(jié)用pH4. O醋酸緩沖液放入到血漿中，調(diào)節(jié)pH值到6. 00，反應(yīng)30 分鐘；第三步、25°/。乙醇反應(yīng)繼上一步，加入95%乙醇，使乙醇濃度達(dá)到25% (V/V),加酒精過(guò)程中逐漸降溫，加完后，降溫到-5. 0'C,反應(yīng)30分鐘；第四步、壓濾繼上一步，向制品中加入l. 0% (W/W)硅藻土助濾劑，攪拌30分鐘進(jìn)行壓濾，壓濾時(shí)控制前壓1. 0Kg/cm2,上清回收到反應(yīng)罐，經(jīng)壓濾機(jī)回收沉淀；第五步、沉淀的溶解繼上一步，稱量上步沉淀，置不銹鋼反應(yīng)罐中，加入5倍量預(yù)冷到2.(TC的注射用水，攪拌4小時(shí)，制冷反應(yīng)液溫度至2.0X:，攪拌至溶解；第六步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，加入pH4. 0醋酸緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值5. 25,反應(yīng)30分4中；第七步、18%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度達(dá) 1W，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液，最終溫度達(dá)-5. 51C,繼續(xù)攪拌l小時(shí)即可壓濾；第八步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，壓濾時(shí)控制前壓1. 3Kg/cm2，上清回收到 反應(yīng)罐，壓濾機(jī)的沉淀?xiàng)壸鏊?；第九步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，將上步的濾液緩慢加入lmol/L碳酸氫鈉緩沖液，反 應(yīng)30分鐘，反應(yīng)液pH值在7. 6;第十步、28%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度達(dá)到 28%，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液最終溫度達(dá)-10. 0X:，靜止l. 5小時(shí)，即可壓濾；第十一步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，進(jìn)行壓濾前調(diào)節(jié)制品溫度為-12. (TC， 壓濾時(shí)控制前壓1. 3Kg/cm2，從壓濾才幾上回收沉淀，稱量沉淀備用；第十二步、沉淀溶解繼上一步，將上一步備用的沉淀用8倍量注射用水溶解，溫度 是2, 0°C;第十三步、調(diào)節(jié)pH:繼上一步，加入鹽酸，調(diào)節(jié)溶解液pH6. 8,繼續(xù)攪拌反應(yīng)15min;第十四步、層析繼上一步，將溶脹好的凝膠用0. 015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6. 8 后，上樣蛋白液收集流穿之蛋白峰，上樣結(jié)束后，用0. 015M磷酸緩沖液沖洗凝膠上的殘 余蛋白，合并上述兩項(xiàng)蛋白液稱重；第十五步、酸處理繼上一步，緩慢加入3W1C1調(diào)節(jié)蛋白液pH4. 0，繼續(xù)攪拌30min;第十六步、.超濾繼上一步，將調(diào)整好的蛋白液抽至清潔的超濾桶中，啟動(dòng)超濾器， 開始預(yù)濃縮待蛋白濃度達(dá)50 g/L左右，結(jié)束預(yù)濃縮稱重，加入10。C注射用水，稀釋蛋白 濃度至50g/L,透析8倍水，透析結(jié)束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達(dá)90g/L，抽 入潔凈不銹鋼桶內(nèi)稱量；第十七步、配制用3仰C1調(diào)整濃縮后蛋白液的pH是4. 4，加入麥芽糖后，補(bǔ)加注射
用水，使制品最終含免疫球蛋白50g/L、麥芽糖100g/L,取樣復(fù)測(cè)pH、 pH是4.4,稱重； 第十八步、繼上一步，將制品從壓力桶經(jīng)除菌濾器除菌分裝于玻璃瓶中，蓋好膠塞， 記錄除菌后制品量；第十九步、繼上一步，低pH病毒滅活將除菌后制品置于25X:庫(kù)放置21天，逐曰記 錄庫(kù)溫，滅活后的制品應(yīng)及時(shí)移至8。C庫(kù)保存；第二十步、繼上一步，納米膜過(guò)濾除病毒經(jīng)低pH病毒滅活后的制品，再經(jīng)由納米 膜過(guò)濾器過(guò)濾于罐中；第二H~—步、繼上一步，可分裝不同規(guī)格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、繼上一步，成品檢定合格后包裝。例3、第一步、融化血漿將抗-HBs抗體效價(jià)8IU/ml的原料血漿經(jīng)75%酒精和注射 用水消毒外袋后，割袋混合后置于帶夾層的不銹鋼反應(yīng)罐中水浴融化，控制血漿溫度2. 0 。C;第二步、pH調(diào)節(jié)用pH4. 0醋酸緩沖&故入到血漿中，調(diào)節(jié)pH值到5.90，反應(yīng)30 分鐘；第三步、23%乙醇反應(yīng)繼上一步，加95%乙醇，使乙醇濃度達(dá)到23% (V/V),加酒 精過(guò)程中逐漸降溫，加完后，降溫到-4. (TC，反應(yīng)30分鐘；第四步、壓濾繼上一步，向制品中加入l. 0% (W/W)硅藻土助濾劑，攪拌30分鐘進(jìn) 行壓濾，壓濾時(shí)控制前壓1. 1Kg/cm2，上清回收到反應(yīng)罐，經(jīng)壓濾機(jī)回收沉淀；第五步、沉淀的溶解繼上一步，稱量上步沉淀，置不銹鋼反應(yīng)罐中，加入4倍量預(yù) 冷到1. Ot:的注射用水，攪拌3.5小時(shí)，制冷反應(yīng)液溫度至1. ox:，攪拌至溶解；第六步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，加入pH4. 0醋酸緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值5. 15，反 應(yīng)30分4中；第七步、l /。乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95%乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度達(dá) 17°/ ,在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液，最終溫度達(dá)-5. 0'C,繼續(xù)攪拌l小時(shí)即可壓濾；第八步、壓濾繼上一步，由壓濾;f幾壓濾，壓濾時(shí)控制前壓1. 1Kg/cm2,上清回收到 反應(yīng)罐，壓濾機(jī)的沉淀?xiàng)壸鏊茫坏诰挪?、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，將上步的濾液緩慢加入lmol/L碳酸氫鈉緩沖液，調(diào) 節(jié)反應(yīng)液pH值在7. 30，反應(yīng)30分鐘；第十步、26%乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95°/。乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度是 26%，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液最終溫度達(dá)-8.0X:,靜止1.5小時(shí)，即可壓濾；第十一步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，進(jìn)行壓濾前調(diào)節(jié)制品溫度為-11. (TC， 壓濾時(shí)控制前壓1. 1Kg/cm2，從壓濾機(jī)上回收沉淀，稱量沉淀備用；第十二步、沉淀溶解繼上一步，將上一步備用的沉淀用7倍量注射用水溶解，溫度是o. rc;第十三步、調(diào)節(jié)pH:繼上一步，加入鹽酸，調(diào)節(jié)溶解液pH在6. 6,繼續(xù)攪拌反應(yīng)15min;
第十四步、層析繼上一步，將溶脹好的凝膠用0. 015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6. 6 后，上樣蛋白液收集流穿之蛋白峰，上樣結(jié)束后，用0. 015M磷酸緩沖液沖洗凝膠上的殘 余蛋白，合并上述兩項(xiàng)蛋白液稱重；第十五步、酸處理繼上一步，緩慢加入3WIC1調(diào)節(jié)蛋白液pH至3. 6，繼續(xù)攪拌30min;第十六步、.超濾繼上一步，將調(diào)整好的蛋白液抽至清潔的超濾桶中，啟動(dòng)超濾器， 開始預(yù)濃縮待蛋白濃度達(dá)SOg/L左右，結(jié)束預(yù)濃縮稱重，加入4E注射用水稀釋蛋白濃度 至30g/L,透析7倍水，透析結(jié)束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達(dá)90g/L，抽入潔 凈不銹鋼桶內(nèi)稱量；第十七步、配制用3%HC1調(diào)整濃縮后蛋白液的pH是4. 0，加入麥芽糖后，補(bǔ)加注射 用水，使制品最終含免疫球蛋白50g/L、麥芽糖100g/L，取樣復(fù)測(cè)pH、 pH是4. 0，稱重；第十八步、繼上一步，將制品從壓力桶經(jīng)除菌濾器除菌分裝于玻璃瓶中，蓋好膠塞， 記錄除菌后制品量；第十九步、繼上一步，低pH病毒滅活將除菌后制品置于22"C庫(kù)放置21天，逐日記 錄庫(kù)溫，滅活后的制品應(yīng)及時(shí)移至3'C庫(kù)保存；第二十步、繼上一步，納米膜過(guò)濾除病毒經(jīng)低pH病毒滅活后的制品，再經(jīng)由納米 膜過(guò)濾器過(guò)濾于罐中；第二十一步、繼上一步，可分裝不同規(guī)格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、繼上一步，成品檢定合格后包裝。
權(quán)利要求
1、一種靜脈注射人乙型肝炎免疫球蛋白制備方法，其特征在于第一步、融化血漿將抗-HBs抗體效價(jià)≥8IU/ml的原料血漿經(jīng)75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于帶夾層的不銹鋼反應(yīng)罐中水浴融化，控制血漿溫度在1.0℃～3.0℃之間；第二步、pH調(diào)節(jié)用pH4.0醋酸緩沖液加入到血漿中，調(diào)節(jié)pH值到5.80～6.00反應(yīng)，30分鐘；第三步、20％-25％乙醇反應(yīng)繼上一步，加95％乙醇，使乙醇濃度達(dá)20％-25％(V/V)；加酒精過(guò)程中逐漸降溫，加完后，降溫到-3.0℃～-5.0℃，反應(yīng)30分鐘；第四步、壓濾繼上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助濾劑，攪拌30分鐘進(jìn)行壓濾，壓濾時(shí)控制前壓≤1.5Kg/cm2，上清回收到反應(yīng)罐，從壓濾機(jī)回收沉淀進(jìn)行下步；第五步、沉淀的溶解繼上一步，稱量上步沉淀，置不銹鋼反應(yīng)罐中，加入3-5倍量預(yù)冷到0.0℃～2.0℃的注射用水，攪拌3小時(shí)以上，制冷反應(yīng)液溫度至0.0℃～2.0℃，攪拌至溶解；第六步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，加入pH4.0醋酸緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值在5.05～5.25范圍，反應(yīng)30分鐘；第七步、16％-18％乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95％乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度達(dá)16％-18％，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液，最終溫度達(dá)-4.5℃～-5.5℃，繼續(xù)攪拌1小時(shí)即可壓濾；第八步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，壓濾時(shí)控制前壓≤1.5Kg/cm2，上清回收到反應(yīng)罐進(jìn)行下步，壓濾機(jī)的沉淀?xiàng)壸鏊?；第九步、調(diào)節(jié)pH值繼上一步，將上步的濾液緩慢加入1mol/L碳酸氫鈉緩沖液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值在7.20～7.60范圍，反應(yīng)30分鐘，；第十步、25％-28％乙醇反應(yīng)繼上一步，向反應(yīng)液加入95％乙醇，使反應(yīng)液的乙醇濃度達(dá)到25％-28％，在加入乙醇過(guò)程中，冷卻反應(yīng)液最終溫度達(dá)-7.0℃～-10.0℃，靜止1小時(shí)以上，即可壓濾；第十一步、壓濾繼上一步，由壓濾機(jī)壓濾，進(jìn)行壓濾前調(diào)節(jié)制品溫度為-10.0℃～-12.0℃，壓濾時(shí)控制前壓≤1.5Kg/cm2，從壓濾機(jī)上回收沉淀，稱量沉淀備用；第十二步、沉淀溶解繼上一步，將上一步備用的沉淀用6-8倍量注射用水溶解，溫度是0.0℃～2.0℃；第十三步、調(diào)節(jié)pH繼上一步，加入鹽酸，調(diào)節(jié)溶解液pH在6.5～6.8之間，繼續(xù)攪拌反應(yīng)15min；第十四步、層析繼上一步，將溶脹好的凝膠用0.015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6.5～6.8后，上樣蛋白液收集流穿之蛋白峰，上樣結(jié)束后，用0.015M磷酸緩沖液沖洗凝膠上的殘余蛋白，合并上述兩項(xiàng)蛋白液稱重；第十五步、酸處理繼上一步，緩慢加入3％HCl調(diào)節(jié)蛋白液pH至3.5～4.0，繼續(xù)攪拌30min；第十六步、.超濾繼上一步，將調(diào)整好的蛋白液抽至清潔的超濾桶中，啟動(dòng)超濾器，開始預(yù)濃縮，待蛋白濃度達(dá)50g/L左右，結(jié)束預(yù)濃縮稱重，加入2℃～10℃注射用水，稀釋蛋白濃度至20～50g/L，透析6-8倍水，透析結(jié)束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達(dá)80g/L以上，抽入潔凈不銹鋼桶內(nèi)稱量；第十七步、配制用3％HCl調(diào)整濃縮后蛋白液的pH是3.8～4.4，加入麥芽糖后，補(bǔ)加注射用水，使制品最終含免疫球蛋白50g/L、麥芽糖100g/L，取樣復(fù)測(cè)pH、pH是3.8～4.4，稱重；第十八步、繼上一步，將制品從壓力桶經(jīng)除菌濾器除菌分裝于玻璃瓶中，蓋好膠塞，記錄除菌后制品量；第十九步、繼上一步，低pH病毒滅活將除菌后制品置于21℃～25℃庫(kù)放置21天，逐日記錄庫(kù)溫，滅活后的制品應(yīng)及時(shí)移至2℃～8℃庫(kù)保存；第二十步、繼上一步，納米膜過(guò)濾除病毒經(jīng)低pH病毒滅活后的制品，再經(jīng)由納米膜過(guò)濾器過(guò)濾于罐中；第二十一步、繼上一步，可分裝不同規(guī)格500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；第二十二步、繼上一步，成品檢定合格后包裝。
全文摘要
本發(fā)明是從經(jīng)乙肝疫苗免疫的獻(xiàn)血員的血漿中分離的一種含有高活性抗乙肝病毒抗體的藥物。具體為靜脈注射人乙型肝炎免疫球蛋白制備方法。其特點(diǎn)是經(jīng)過(guò)融化血漿、pH調(diào)節(jié)、20％-25％乙醇反應(yīng)、壓濾、沉淀的溶解、調(diào)節(jié)pH值、乙醇反應(yīng)、壓濾、調(diào)節(jié)pH值、25％-28％乙醇反應(yīng)、壓濾、沉淀溶解、調(diào)節(jié)pH、層析、超濾、分裝、低pH病毒滅活、納米膜過(guò)濾除病毒、分裝、成品檢定合格后包裝。二十二個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)人抗體免疫球蛋白純度可達(dá)98％以上，雜質(zhì)更少，副反應(yīng)更低。此工藝條件溫和，對(duì)產(chǎn)品沒有損傷，而且病毒滅活效果好，優(yōu)于其他單位采用的巴氏滅活法或單一的低pH孵育法。本發(fā)明采用的是一種低溫乙醇分離法與層析法和超濾法相結(jié)合的方法，使生產(chǎn)成本大大降低。
文檔編號(hào)A61K9/00GK101161232SQ20071014463
公開日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2007年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日
發(fā)明者付紹蘭, 孫曉東, 李常祿, 楊金平, 波 趙, 趙德龍, 晶 郭, 陳鳳珠 申請(qǐng)人:哈爾濱世亨生物工程藥業(yè)股份有限公司