專利名稱：益生菌、分泌型免疫球蛋白a和感染的制作方法
益生菌、分泌型免疫球蛋白A和感染本發(fā)明大體上涉及營養(yǎng)、健康(health)和身心健康(wellness)領(lǐng)域。具體來說， 本發(fā)明涉及益生菌和增加其有效性的途徑。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及益生菌和分泌型免 疫球蛋白A(IgA)的組合以及此組合的可能用途。感染是外來物種在宿主生物中進(jìn)行的有害建群。通常，感染生物試圖用宿主的資 源促進(jìn)其自身增殖。由此感染生物(或稱病原體)可以干擾宿主的正常功能，并導(dǎo)致更多 感染相關(guān)的疾病，所述疾病可能具有不同的嚴(yán)重性，最嚴(yán)重的情況可以導(dǎo)致死亡。如果感染生物和宿主之間存在協(xié)同作用，其中此關(guān)系對于感染生物是有利的，對 后者則是有害的，則表征為寄生現(xiàn)象。與感染相關(guān)聯(lián)的疾病種類繁多，與治療和預(yù)防感染相關(guān)的花費(fèi)也很可觀。僅美國的抗菌劑市場就擁有約260億美元。如今可通過合適的藥物治療不需要的感染。然而，選擇適當(dāng)?shù)乃幬镄枰x待處 理的感染類型。細(xì)菌感染通常使用抗菌抗生素治療。誤服錯(cuò)誤的抗菌抗生素治療特定的非 病毒感染不但不能治療感染，甚至可能是有害的。此外，此類藥物通?？赡軐?dǎo)致不需要的副 作用，并且經(jīng)常需要醫(yī)務(wù)人員的監(jiān)督。此外，廣泛使用抗生素可能致使產(chǎn)生具有抗生素抗性的傳染物種。福布斯雜志在 2006年6月聲稱被藥物抗性的感染殺死的美國人比AIDS和乳腺癌加起來還要多。因此，研發(fā)能夠降低社會(huì)對抗生素的需求的組合物是當(dāng)今的研究重點(diǎn)。因此，在本領(lǐng)域需要這樣的非抗生素組合物，即可以不具副作用，優(yōu)選每日施用， 并可安全地用于治療或預(yù)防感染，而無需事先定義致病因子的準(zhǔn)確性質(zhì)。達(dá)到此目的的一種途徑是施用包含益生菌的食物組合物。已經(jīng)知道益生菌微生物對宿主的健康和身心健康具有有益作用。在近幾十年中， 作為治療例如胃腸疾病(Isolauri E，等人，Dig Dis Scil994，39 :2595_2600)的安全和易 得形式，益生細(xì)菌的用途已經(jīng)得到相當(dāng)?shù)年P(guān)注。在此方面應(yīng)用的典型益生細(xì)菌屬于乳桿菌 屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。益生菌的有效性部分取決于其抵抗消化道條件和粘附于腸上皮的能力。并且，決 定其對宿主潛在益處的關(guān)鍵方面是益生菌和宿主環(huán)境的對話(cross-talk)和其對上皮屏 障及其功能的影響。盡管在胃腸道建群方面，一些益生菌已經(jīng)取得了非常不錯(cuò)的結(jié)果，仍然期望獲得 一種工具以進(jìn)一步改進(jìn)益生菌微生物在腸中定居的有效性。因此本發(fā)明的目的是為本領(lǐng)域提供一種組合物，所述組合物具有與對需要的受試 者施用益生菌相同的益處，但是在治療或預(yù)防感染方面比單獨(dú)使用益生菌更有效。本發(fā)明者已論述了此需要，并發(fā)現(xiàn)他們可以通過根據(jù)權(quán)利要求1的用途和根據(jù)權(quán) 利要求13的食物組合物達(dá)到此目的。因此本發(fā)明涉及包含抗體，特別是分泌型IgA和至少一種益生菌的組合物，并涉 及其治療、調(diào)節(jié)、減弱和/或預(yù)防感染的用途。抗體通常為糖蛋白，其特異性識(shí)別抗原。已描述的5類脊椎動(dòng)物免疫球蛋白類別(包括IgG、IgM, IgA、IgD和IgE)中，其在免疫系統(tǒng)中的功能均有不同。分泌型IgA(SIgA) 是腸粘膜分泌物中占主要且較穩(wěn)定的免疫球蛋白，對本發(fā)明的目的特別有效。不希望受理論限制，發(fā)明者相信SIgA和益生菌可形成復(fù)合物以增強(qiáng)益生菌和宿 主的相互作用及改進(jìn)其健康益處。所述組合和宿主腸粘膜的可能的相互作用機(jī)制展示于

圖1。益生菌和宿主的首次相互作用發(fā)生在腸粘膜的水平。選擇益生菌微生物的關(guān)鍵標(biāo) 準(zhǔn)之一是其粘附于腸粘膜的能力。此粘附似乎是阻斷病原體進(jìn)入所需要的，并且在例如調(diào)節(jié)保護(hù)性免疫功能中起作用。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中粘膜免疫系統(tǒng)最獨(dú)特的特征之一是分泌型抗體的優(yōu)勢存在， 特別是分泌型IgA(SIgA)，其是粘膜中獨(dú)有的抗體種類。多聚IgA的生物合成在粘膜固有層中進(jìn)行，通過隱窩和柱狀上皮細(xì)胞表達(dá)的多聚 Ig受體(PlgR)保證其穿過排列在粘膜表面的上皮的運(yùn)輸。在分泌過程中，plgR的大部分(稱作分泌成分(SC))保持與多聚IgA的結(jié)合，同 時(shí)釋放SIgA。SIgA至腔的釋放取決于SC的產(chǎn)生，SC的表達(dá)在出生后上調(diào)。plgR似乎在抗體的 穩(wěn)定性和粘膜錨定中起關(guān)鍵作用(Phalipon等人(2002) Secretory component :A new role in secretory IgA-mediatedimmune exclusion in vivo. Immunity 17:107-115)。幾乎檢測不到SIgA抗體的新生兒依賴經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)移的母體IgG和在母乳中充足的 外源供應(yīng)的SIgA。這共同提供了在胃腸免疫系統(tǒng)成形和成熟期對保護(hù)宿主至關(guān)重要的腸中的被動(dòng) 免疫。因此本發(fā)明的組合物對新生兒和嬰兒(最大至2歲)特別有益，因?yàn)樗麄儾划a(chǎn)生 足夠量的SIgA而依賴于外部供應(yīng)。發(fā)明者現(xiàn)在相信正是SIgA和益生菌的關(guān)聯(lián)增強(qiáng)了益生菌和宿主的相互作用，從 而改善宿主的健康益處。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)SIgA抗體能夠與共生細(xì)菌菌株結(jié)合。本發(fā)明者在體外使用了 Caco-I上皮細(xì)胞單層以研究SIgA是如何利于非病原細(xì) 菌和上皮表面的對話。作為原則證明，評估了 2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益 生菌代表菌株，即鼠李糖乳桿菌(Lactobaci 1 lusrhamnosus) NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)NCC2818(BL818)。發(fā)現(xiàn)SIgA和/或SC當(dāng)與益生菌結(jié)合時(shí)，促進(jìn)益生菌和宿主的相互作用并調(diào)節(jié)涉 及防御機(jī)制的下游過程。這在增強(qiáng)益生菌的健康益處中起作用。通過與益生菌組合，SIgA和/或SC能夠 最佳的幫助觸發(fā)有效的保護(hù)性宿主防御反應(yīng)，包括對抗各種病原體的反應(yīng)?？紤]到其體內(nèi) 穩(wěn)態(tài)作用，與益生菌組合的SIgA可幫助觸發(fā)對抗感染的免疫加強(qiáng)作用，同時(shí)預(yù)防任何潛在 的損害性炎癥過程。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含SIgA和至少一種益生菌的組合物，用于制備 治療或預(yù)防非病毒性感染的產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及包含SIgA和至少一種益生菌的組合物在制備用于治療或預(yù)防非病 毒性感染的產(chǎn)品中的用途。本發(fā)明另外涉及包含SIgA和至少一種益生菌的組合物，用于治療和/或預(yù)防非病 毒性感染。本發(fā)明擴(kuò)展至包含SIgA和至少一種益生菌的組合物，用于治療和/或預(yù)防非病毒 性感染。非病毒性感染的治療包括非病毒性感染的減弱?！耙嫔笔侵笇λ拗鹘】祷蛏硇慕】稻哂幸孀饔玫奈⑸锛?xì)胞制備物或微生物 細(xì)胞組分° (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人"Probiotics :how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999 10 107-10)。根據(jù)本發(fā)明可使用所有益生菌微生物。優(yōu)選的，它們可選自雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口酵母 屬(Saccharomyces)或其混合物，特別選自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳 雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李 H L If lif (Lactobacillus rhamnosus) > glj zF ？L If lif (Lactobacillus paracasei) > ^ 15 If lif (Lactobacillus johnsonii) > ^ If lif (Lactobacillusplantarum) > ^？LIf lif (Lactobacillus salivarius) > M lif (Enterococcus faecium) > ^iif^BJ (Saccharomyces boulardii)和羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)或其混合物，優(yōu)選的 選自約氏乳桿菌(NCC533 ；CNCM 1-1225)、長雙歧桿菌(NCC490 ；CNCM 1-2170)、長雙歧桿菌 (NCC2705 ；CNCM 1-2618)、乳雙歧桿菌(2818 ；CNCM 1-3446)、副干酪乳桿菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌(NCC4007 ；CGMCC 1. 3724)、屎腸球 菌 SF 68(NCIMB101415)，和其混合物。本發(fā)明的組合物還可包含益生素。益生素的添加是有益的，因?yàn)楫?dāng)與益生菌組合 時(shí)其可發(fā)揮在健康益處方面的協(xié)同作用。包含益生素和益生菌組合的組合物一般被稱為共 生組合物?！耙嫔亍笔侵冈谀c中促進(jìn)益生菌生長的食物成分。它們不在消化其的人胃中 和/或腸的上部被分解或在胃腸道中被吸收，但被胃腸微生物群和/或益生菌發(fā)酵。益 生素例如定義于 Glenn R. Gibson 禾P Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept of Prebiotics,J. Nutr. 1995125 1401-1412。根據(jù)本發(fā)明可使用的益生素沒有特別限制，包括所有在腸中促進(jìn)有益細(xì)菌例如雙 歧桿菌或乳桿菌，和/或益生菌生長的食物成分。優(yōu)選的，它們可選自寡糖，任選的包含果 糖、半乳糖、甘露糖；膳食纖維，特別是可溶纖維、大豆纖維；菊粉；或其混合物。優(yōu)選的益生 素為寡聚果糖(FOS)、寡聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，G0S)、寡聚異麥芽糖、寡聚 木糖、大豆寡糖、糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳果糖(LA)、寡聚異麥芽酮糖(PAO)、寡聚麥 芽糖、果膠和/或其水解產(chǎn)物。本發(fā)明的非病毒性感染可以是細(xì)菌和/或寄生蟲感染。也可是真菌感染。非病毒性感染可以是細(xì)菌感染，選自大腸桿菌感染、霍亂弧菌(Vibriocholerae) 感染、沙門氏菌感染、梭狀芽胞桿菌感染、志賀菌屬感染、寄生蟲感染，包括蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)和隱孢子蟲屬 (Cryptosporidium spp)或其混合物。可用本發(fā)明治療或預(yù)防的典型細(xì)菌感染性疾病包括沙門氏菌病、細(xì)菌性痢疾、傷 寒、細(xì)菌性腦膜炎、炭疽、食物中毒、普魯斯病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑疹傷 寒、淋病、小膿皰疹、軍團(tuán)桿菌病、麻瘋病(Hansen病)、細(xì)螺旋體病、利斯特菌病、萊姆病、類 鼻疽、風(fēng)濕熱、MRSA感染、諾卡菌病、百日咳、瘟疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡病、Q熱、洛磯山斑 疹熱(RMSF)、猩紅熱、梅毒、傷風(fēng)、沙眼、肺結(jié)核、土拉菌病、斑疹傷寒癥、和/或尿道感染?？捎帽景l(fā)明治療或預(yù)防的典型寄生蟲傳染性疾病包括非洲錐蟲病、變形蟲病、蛔 蟲病、巴貝西蟲病、美洲錐蟲病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊蟲病、裂頭絳蟲病、龍線蟲 病、包蟲病、蟯蟲病、片形吸蟲病、姜片蟲病、絲蟲病、自由生活阿米巴感染、賈第鞭毛蟲病、 腭口線蟲病、膜殼絳蟲病、等孢球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、后殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾 絲蟲病、虱咬癥、蟯蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絳蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、旋毛蟲病、旋毛蟲 病、鞭蟲病、滴蟲病、和/或錐蟲病。可用本發(fā)明治療或預(yù)防的典型真菌感染性疾病包括曲霉菌病、芽生菌病、念珠菌 病、球孢子菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、和/或腳癬。使用本發(fā)明制備的產(chǎn)品可為食物產(chǎn)品、動(dòng)物食物產(chǎn)品或藥物組合物。例如，所述產(chǎn) 品可為營養(yǎng)組合物、營養(yǎng)食品、飲料、食物添加劑或藥物。食物添加劑或藥物可為例如片劑、膠囊、錠劑或液體形式。食物添加劑或藥物優(yōu)選 以持續(xù)釋放制劑提供，使SIgA和益生菌的持續(xù)供應(yīng)維持更長的時(shí)間。產(chǎn)品優(yōu)選的選自基于奶粉的產(chǎn)品、方便飲料、可立即飲用的制劑、營養(yǎng)粉、營養(yǎng) 液、基于奶的產(chǎn)品特別是酸乳酪或冰激凌、谷物產(chǎn)品、飲料、水、咖啡、熱牛奶咖啡(cappucc ino)、麥芽飲料(malt drink)、巧克力口味飲料、烹飪產(chǎn)品、湯、片劑和/或糖漿。奶可為任意可從動(dòng)物或植物來源得到的奶，優(yōu)選的為牛奶、人奶、綿羊奶、山羊奶、 馬奶、駱駝奶、米乳(rice milk)或豆奶。除了奶以外，可使用來源于奶的蛋白質(zhì)部分或初乳。組合物可進(jìn)一步包含保護(hù)性水狀膠質(zhì)(例如樹膠、蛋白質(zhì)、變性淀粉)、粘合物、 成膜劑、成膠囊劑/材料、囊/外殼材料、基質(zhì)化合物、涂料、乳化劑、表面活性劑、加溶劑 (油、脂肪、蠟、卵磷脂等等)、吸附劑、載體、填料、共化合物(co-compound)、分散劑、濕潤 劑、加工助劑(溶劑)、流動(dòng)劑、掩味劑、增重劑、膠凝劑(jellifying agents)、膠凝劑(gel formingagents)、抗氧化劑和抗菌劑。其還可包含傳統(tǒng)藥物添加劑和佐劑、賦形劑和稀釋 劑，包括但不局限于水、任意來源的明膠、植物膠、木素磺酸鹽、滑石、糖、淀粉、阿拉伯樹膠、 植物油、聚亞烷基二醇、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖液、潤滑劑、著色劑、濕潤齊U、 填料，等等。此外，其可包含適于口或腸施用的有機(jī)或無機(jī)載體材料及維生素、微量礦物質(zhì) 元素和符合政府機(jī)關(guān)推薦的例如美國推薦的日攝食量(USRDA)的其他微量營養(yǎng)素。本發(fā)明的組合物可包含蛋白質(zhì)來源、碳水化合物來源和/或脂來源。可使用任意合適的膳食蛋白質(zhì)，例如動(dòng)物性蛋白質(zhì)(例如奶蛋白、肉蛋白和卵蛋 白)；植物性蛋白質(zhì)(例如大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游離氨基酸的混合 物；或其組合。奶蛋白例如酪蛋白和乳清和大豆蛋白是特別優(yōu)選的。如果組合物包括脂肪來源，則脂肪來源更優(yōu)選提供配方5%至40%的能量；例如20%至30%的能量。可添加DHA?？墒褂媒孀?canola)油、玉米油和高油酸向日葵油混合 物得到合適的脂肪譜。碳水化合物來源可更優(yōu)選的提供組合物的40%至80%能量?？墒褂萌我夂线m的 碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、固體玉米糖漿、麥芽糊精和其混合物。由本發(fā)明制備的產(chǎn)品可對人或動(dòng)物施用，特別是伴侶動(dòng)物、寵物或家畜。其對任何 年齡群體均具有有益作用。優(yōu)選的，產(chǎn)品計(jì)劃供嬰兒、青少年、成人或老年人使用。然而也 可對懷孕期和哺乳期的母親施用以治療嬰兒。當(dāng)益生菌和SIgA同時(shí)、一種緊接另一種施用時(shí)，在最大時(shí)間范圍少于60分鐘、優(yōu) 選的少于30分鐘、更優(yōu)選的少于15分鐘和最優(yōu)選的少于5分鐘時(shí)，和/或二者在施用前已 組合存在于食物產(chǎn)品中時(shí)，本發(fā)明的組合物有效。然而，發(fā)現(xiàn)如果SIgA和益生菌在施用前組合為復(fù)合物，益生菌和SIgA的組合特別 有效。其優(yōu)勢在于有益的復(fù)合物不需要在消耗產(chǎn)品后組成，而是已經(jīng)存在于食物產(chǎn)品中。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含SIgA和益生菌的組合物的用途，其中SIgA 分子和至少一種益生菌在組合物中至少部分結(jié)合。SIgA和至少一種益生菌優(yōu)選的作為免疫復(fù)合物存在，例如至少90%、更優(yōu)選的至 少95%、甚至更優(yōu)選的所有益生細(xì)菌均結(jié)合至少1個(gè)SIgA分子，例如至少5個(gè)SIgA分子以 免疫復(fù)合物存在。組合物還可包含至少另一種其他食品級(jí)細(xì)菌，優(yōu)選的選自乳酸細(xì)菌、雙歧桿菌、腸 球菌或其組合。這些其他食品級(jí)細(xì)菌可利于得到健康的腸微生物群，因此利于更有效的實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明還涉及包含SIgA和至少一種益生菌微生物的食物組合物。SIgA和益生菌 微生物可優(yōu)選的在食物組合物中作為復(fù)合物組合。SIgA和益生菌微生物可優(yōu)選的以至少 10 1、優(yōu)選的至少100 1、最優(yōu)選的至少2000 1至100000 1的化學(xué)計(jì)量比率存在。 SIgA飽和的上限由益生菌微生物的表面和可結(jié)合SIgA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)決定。一般的，益生菌在大范圍的量內(nèi)有效。如果細(xì)菌活著到達(dá)腸，則單個(gè)細(xì)菌就足以通 過在腸中延續(xù)并增殖達(dá)到有力的效果。然而一般而言，如果產(chǎn)品包含每日劑量102和1010 之間的細(xì)胞益生菌則是優(yōu)選的。發(fā)揮作用所需要的SIgA量同樣沒有局限。原則上一個(gè)SIgA分子與一個(gè)益生菌 微生物結(jié)合，優(yōu)選以復(fù)合物形式，即對于本發(fā)明而言有效。然而一般而言，如果產(chǎn)品包含 0. OOOlmg SIgA和IOmg SIgA之間的每日劑量則是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在不背離公開的發(fā)明范圍內(nèi)，他們可自由組合此處描述的 本發(fā)明的所有特征。具體來說，描述本發(fā)明用途的特征將應(yīng)用于本發(fā)明的組合物，例如食物 組合物，反之亦然。通過以下實(shí)施例和圖，本發(fā)明的其他優(yōu)勢和特征是顯而易見的。圖1圖解顯示了 SIgA是如何被認(rèn)為改進(jìn)共生細(xì)菌的作用的，當(dāng)SIgA與其結(jié)合時(shí) 增加了與宿主腸粘膜的相互作用。圖2顯示了代表2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益生菌菌株鼠李糖乳桿菌 NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌NCC2818 (BL818)與上皮細(xì)胞的結(jié)合性能的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù) 據(jù)以每100個(gè)Caco-2細(xì)胞的菌落形成單位(CFU)平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。
圖3顯示了代表2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益生菌菌株鼠李糖乳 桿菌NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌NCC2818 (BL818)與上皮細(xì)胞的結(jié)合性能以及分泌型 IgA(SIgA)或分泌成分(SC)的影響的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)以每100個(gè)Caco-2細(xì)胞的CFU 平均值士 SEM表示。圖4顯示了代表2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益生菌菌株鼠李糖乳桿菌 NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌NCC2818 (BL818)，單獨(dú)或與SIgA或SC組合，對測量上皮滲透 性的跨上皮電阻(TER)的影響的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)以每平方厘米的歐姆平均值士SEM表
7J\ ο圖5顯示了 LPR，與SIgA或SC組合或未組合，在Caco_2細(xì)胞單層中對NF- κ B活 化的影響的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。NF-K B結(jié)合活性的降低指示Caco-2細(xì)胞內(nèi)減弱的炎癥途徑。圖6顯示了 LPR，與SIgA或SC組合或未組合，對Caco_2細(xì)胞的福氏志賀菌 (S. flexneri)入侵的影響的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用了 2種單克隆SIgA分子識(shí)別沙門氏 菌屬表位的非特異性SIgA(SIgAnon特異性)和特異性抗福氏志賀菌SIgAC5。數(shù)據(jù)以每 Transwell濾膜的CFU平均值士 SEM表示。圖7顯示了益生菌對Caco-2單層中多聚Ig受體(plgR)表達(dá)的影響的檢測實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。(A)在16小時(shí)檢測不同的處理，包括益生菌和非特異性SIgA的組合，及福氏志賀菌 和特異性抗福氏志賀菌SIgA的組合。用蛋白質(zhì)印跡檢測plgR的存在，如同β-肌動(dòng)蛋白。 (B)plgR表達(dá)水平的半定量分析，用肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，通過對A中凝膠鑒定條帶的密度 計(jì)分析。(C)與各種制劑孵育24小時(shí)的Caco-2細(xì)胞中的plgR表達(dá)的動(dòng)力學(xué)(酶聯(lián)免疫吸 附法(ELISA))。實(shí)施例1 與上皮細(xì)胞的結(jié)合每平方厘米Transwell濾膜上接種約106CacO-2細(xì)胞。細(xì)胞和不同劑量的細(xì)菌 (如圖注中所示)在無抗生素或FCS下于37°C孵育16小時(shí)。使用LPR、BL818和大腸桿菌 (E. coli) TG-I細(xì)菌的新鮮過夜培養(yǎng)物。之后在計(jì)數(shù)前清洗細(xì)胞。通過在MRS或LB平板上 涂板計(jì)數(shù)結(jié)合的細(xì)菌。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)檢測。數(shù)據(jù)以每100個(gè)Caco-2細(xì)胞結(jié)合的 細(xì)菌的平均值士SEM表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)檢測。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，在存在遞增濃 度的SIgA或SC下(如圖3的圖注中所示)，細(xì)胞和2xl07細(xì)菌于37°C孵育16小時(shí)。之后 在計(jì)數(shù)前清洗細(xì)胞。通過在MRS或LB平板上涂板計(jì)數(shù)結(jié)合的細(xì)菌。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重 復(fù)檢測。數(shù)據(jù)以每100個(gè)Caco-2細(xì)胞結(jié)合的細(xì)菌的平均值士SEM表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)檢測。與大腸桿菌TG-I相比，觀察到LPR或BL818對極化Caco-2細(xì)胞的優(yōu)先結(jié)合。益 生菌對腸上皮細(xì)胞具有劑量依賴性的結(jié)合能力?？梢杂^察到結(jié)合性能在2種菌株之間存在差異。在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用2x107CFU的益生菌，因?yàn)榇藙┝恳环矫娌粫?huì)引起培養(yǎng)基的任 何PH改變，另一方面顯示了有效的結(jié)合比率。提高單克隆SIgA的劑量促進(jìn)了 UR和BL818 二者結(jié)合極化Caco-2細(xì)胞單層的能 力。與細(xì)菌結(jié)合時(shí)，分泌成分未展示這些性能(圖3)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中選擇Iyg劑量的 SIgA，此劑量可顯著改進(jìn)益生菌的結(jié)合能力。此劑量致使形成由約50’ 000至100’ 000單位SIgA對應(yīng)1個(gè)細(xì)菌組成的最終復(fù)合物。結(jié)果顯示于圖2和3。實(shí)施例2 極化Caco-2細(xì)胞單層的屏障功能每平方厘米Transwell濾膜上接種約106Caco_2細(xì)胞。細(xì)胞和2xl07CFU細(xì)菌在不 存在抗生素或FCS下于37°C孵育24小時(shí)。檢測單獨(dú)的細(xì)菌，或與圖4的圖注中指示濃度的 SIgA或SC組合的細(xì)菌。在3、6、9、15和24小時(shí)測量跨上皮電阻(TER)。對照包括和SIgA 和SC單獨(dú)的孵育。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)檢測。極化Caco-2細(xì)胞單層和LPR或BL818的單獨(dú)孵育導(dǎo)致跨上皮電阻(TER)的 20-25%的增加，提示益生菌增強(qiáng)了上皮的屏障功能。當(dāng)細(xì)菌和SIgA或SC組合時(shí)仍然如此 (圖4)。SIgA或SC本身不引起任何TER變化。結(jié)果顯示于圖4。實(shí)施例3 極化Caco-2細(xì)胞單層中的NF_kB活化每平方厘米Tran8well濾膜上接種約106Caco_2細(xì)胞。細(xì)胞和2xl07CFU LPR在不 存在抗生素或FCS下于37°C孵育16小時(shí)。檢測單獨(dú)的細(xì)菌，或與圖5的圖注中指示濃度的 SIgA或SC組合的細(xì)菌。使用福氏志賀菌、傷寒沙門菌(S. Typhi)和幽門螺桿菌(H. Pylori) (2x107CFU)在對照實(shí)驗(yàn)中作為前炎性病原體。制備細(xì)胞核提取物并進(jìn)行電泳遷移位移分析 (EMSA)以檢測NF-κ B與特異性DNA探針的結(jié)合。平行獲得細(xì)胞質(zhì)提取物，用蛋白質(zhì)印跡檢 測IKBa的存在，使用針對該蛋白的抗IKBa特異性單克隆抗體。與非病原菌相比，極化的Caco-2細(xì)胞單層暴露于病原菌導(dǎo)致明顯更顯著的細(xì)胞 核NF- κ B活化(圖5)。I κ B α (下圖)的消失表示導(dǎo)致NF- κ B核轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑活化。因此，雖然單獨(dú)的LPR 對NF- κ B活化具有輕微作用，LPR和SIgA或SC的組合降低了 Caco-2細(xì)胞中的NF- κ B活 化(未檢測BL818)。與預(yù)期中相同，上皮細(xì)胞和致病福氏志賀菌的孵育導(dǎo)致ΙκΒα表達(dá)的 完全消失。結(jié)果顯示于圖5。實(shí)施例4 抗致病活性每平方厘米Transwell濾膜上接種約106Caco_2細(xì)胞。細(xì)胞和2xl07CFU LPR在不 存在抗生素或FCS下于37°C孵育16小時(shí)。檢測單獨(dú)的LPR，或與0.2yg SC、lyg多克隆 SIgA或1 μ g特異性抗福氏志賀菌LPS的SIgAC5組合的LPR。與LPR孵育后清洗細(xì)胞，之 后與IO7福氏志賀菌孵育6小時(shí)，再次清洗細(xì)胞并與50mg/ml慶大霉素孵育45分鐘。最后， 裂解細(xì)胞并在LB瓊脂平板上計(jì)數(shù)細(xì)胞內(nèi)的福氏志賀菌。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)檢測。LPR的加入以劑量依賴的方式降低了福氏志賀菌對極化Caco-2細(xì)胞單層的感染。 與SIgA組合后此作用大大增強(qiáng)了。當(dāng)使用福氏志賀菌LPS特異性SIgAC5抗體時(shí)可得到對 感染的完全保護(hù)(圖6)。結(jié)果顯示于圖6。實(shí)施例5:
極化Caco-2細(xì)胞單層中的多聚Ig受體的表達(dá)每平方厘米Transwell濾膜上接種約106Caco_2細(xì)胞。細(xì)胞和2xl07CFU LPR或 BL818在不存在抗生素或FCS下于37°C孵育16小時(shí)。檢測單獨(dú)的益生菌，或與0. 2 μ g SC 或1 μ g多克隆SIgA組合的益生菌。檢測單獨(dú)的對照福氏志賀菌，或與1 μ g特異性抗福 氏志賀菌LPS的SIgAC5組合的對照福氏志賀菌。清洗后，從Transwell濾膜上直接收獲 Caco-2細(xì)胞并裂解。去除細(xì)胞核，通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞碎片和細(xì)胞質(zhì)，使用抗PlgR抗 體和人SC和肌動(dòng)蛋白的抗血清作為對照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)檢測。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，按照相同的程序孵育細(xì)胞，之后在孵育8、16和24小時(shí)后從 transwell濾膜上收獲細(xì)胞。通過ELISA在細(xì)胞碎片/細(xì)胞質(zhì)組分中進(jìn)行plgR的定量分 析。通過BCA蛋白質(zhì)法測定總蛋白質(zhì)。用蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值，數(shù)據(jù)以ng plgR/mg總蛋 白的平均值士 SEM表示。plgR在上皮細(xì)胞中的表達(dá)用β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白質(zhì)印跡(上圖) 和對各個(gè)(條帶)信號(hào)的密度計(jì)分析(下圖)顯示，與單獨(dú)益生菌相比，過夜暴露于UR或 BL818和SIgA或SC組合的極化Caco-2細(xì)胞單層中的plgR水平增加(圖7a)。特異性抗 福氏志賀菌LPS的SIgAC5阻止了病原菌和Caco-2細(xì)胞極化單層的相互作用，因此解釋了 與福氏志賀菌單獨(dú)處理相比PlgR表達(dá)的降低。結(jié)果進(jìn)一步顯示了在極化Caco-2細(xì)胞單層暴露于益生菌和SIgA或SC的組合后， 多聚Ig受體(PlgR)水平的時(shí)間依賴性增加(圖7b)。結(jié)果顯示于圖7。
權(quán)利要求
1.包含分泌型IgA和至少一種益生菌的組合物在制備用于治療、減弱或預(yù)防非病毒性 感染的產(chǎn)品中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中非病毒性感染為細(xì)菌感染、寄生蟲感染或真菌感染。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中非病毒性感染為細(xì)菌感染，選自大腸桿菌感染、 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)感染、沙門氏菌感染、梭狀芽胞桿菌感染、志賀菌屬感染，寄生 蟲感染，包括蘭伯賈第蟲(Giardialamblia)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica) 和隱孢子蟲屬(Cryptosporidium spp)或其混合物。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中益生菌選自雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、 乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口 酵母屬(Saccharomyces) 或其混合物，特別選自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌 (Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳桿 |if (Lactobacillus rhamnosus) > glj zFIf lif (Lactobacillus paracasei) > 氏 ^L If lif (Lactobacillus johnsonii) > ^ If lif (Lactobacillusplantarum)、[！I ^夜 ？L If lif (Lactobacillus salivarius) > M 1 lif (Enterococcus faecium) > ii BJ (Saccharomyces boulardii)和羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)或其混合物，優(yōu)選的 選自約氏乳桿菌(NCC533 ;CNCM 1-1225)、長雙歧桿菌(NCC490 ;CNCM 1-2170)、長雙歧桿菌 (NCC2705 ；CNCM H618)、乳雙歧桿菌 Q818 ；CNCM 1-3446)、副干酪乳桿菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌(NCC4007 ；CGMCC 1.37M)、屎腸球 菌 SF 68(NCIMB101415)，和其混合物。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中產(chǎn)品為食物產(chǎn)品或藥物組合物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中產(chǎn)品計(jì)劃供人，特別是嬰兒、青少年、成人或老 年人消耗。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中分泌型IgA和至少一種益生菌在組合物中至少 部分結(jié)合。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，用于增強(qiáng)免疫功能。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中組合物包含至少另一種其它食品級(jí)細(xì)菌，其優(yōu) 選的選自乳酸菌、雙歧桿菌、腸球菌或其混合物。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中產(chǎn)品還包含至少一種益生素，其優(yōu)選的選自寡糖。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中產(chǎn)品每日劑量包含IO2至101°個(gè)益生菌細(xì)胞。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的用途，其中產(chǎn)品每日劑量包含0.OOOlmg分泌型SIgA至 IOmg SIgA。
13.包含SIgA和至少一種益生菌微生物的食物組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的食物組合物，其中所述的至少一種益生菌微生物和SIgA相結(jié) 合。
全文摘要
本發(fā)明大體上涉及營養(yǎng)、健康和身心健康領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及益生菌和增加其有效性的途徑。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及益生菌和分泌型IgA的組合以及此組合的可能用途。例如公開了包含分泌型SIgA和至少一種益生菌的組合物在制備用于治療或預(yù)防感染的產(chǎn)品中的用途。
文檔編號(hào)A61P31/00GK102076361SQ200980124320
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者B·科特西, J·本雅各布, L·法沃爾, S·布蘭-斯佩里森 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司