專利名稱：一種靜注人免疫球蛋白的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靜注人免疫球蛋白的制備工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
靜注人免疫球蛋白的活性成份為蛋白質(zhì)，其中95%以上為免疫球蛋白。由健康人血漿，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法或辛酸沉淀法分離純化，去除抗補(bǔ)體活性并經(jīng)病毒滅活處理制成。通常生產(chǎn)方法為低溫乙醇離心(壓濾)法和辛酸沉淀法，產(chǎn)品得率低，穩(wěn)定性不好?，F(xiàn)有的低溫乙醇法靜注人免疫球蛋白工藝采用低溫乙醇處理組分II + III沉淀，該工藝在制備過程通過對(duì)乙醇濃度、PH值等參數(shù)控制分離出組分III沉淀，再進(jìn)行一步層析工藝。該方法在分離出組分III沉淀過程中使靜注人免疫球蛋白析出到III沉淀中的量較大，產(chǎn)品得率只能夠達(dá)到每升血漿5. 5克左右，純度只能夠達(dá)到96%以上。現(xiàn)有的辛酸沉淀法靜注人免疫球蛋白工藝?yán)眯了崮軌虺恋泶蟛糠址敲庖咔蝾惖鞍?，從而達(dá)到去除雜蛋白的目的。但該方法對(duì)去除凝血因子類物質(zhì)效果不是恨明顯，使產(chǎn)品純度受到一定的影響。產(chǎn)品得率只能夠達(dá)到每升血漿6. 3克左右，純度只能夠達(dá)到98% 以上。為了使靜注人免疫球蛋白的產(chǎn)品得率及純度進(jìn)一步提高，開發(fā)出一種產(chǎn)品生物活性、產(chǎn)品得率和產(chǎn)品純度更高的靜注人免疫球蛋白的制備工藝顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用辛酸與氯化鈣沉淀法處理組分II + III沉淀，再進(jìn)行兩步層析工藝，產(chǎn)品得率可達(dá)每升血漿7克以上，產(chǎn)品純度達(dá)到99. 5%以上的靜注人免疫球蛋白的制備工藝。本發(fā)明的技術(shù)方案
它采用辛酸及氯化鈣沉淀法去除雜蛋白及凝血因子類物質(zhì)，再進(jìn)行兩步層析工藝，其制備工藝如下
(1)、將檢疫期檢疫合格的人血漿經(jīng)離心，離心時(shí)，離心速度不大于4L/min/臺(tái)，出液溫度控制在O 4°C ;分離冷沉淀，冷沉淀用于VDI因子生產(chǎn)，將離心上清蛋白液輸送至蛋白分離反應(yīng)罐，使蛋白液的溫度控制在I 3°C之間，按不超過I. OL/min的流速加入pH 4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)蛋白液PH值為6. 80 7. 00 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇，流速不超過I. 5L/ min，使乙醇體積比終濃度至8%，溫度控制在一 I 一 3°C，加完乙醇后pH值為6. 80 7. 20 ；
(2)、將步驟(I)的制得物攪拌30min以上，進(jìn)行離心，離心過程中出液流速不超過4L/ min/臺(tái)，出液溫度控制在一 I 一 3°C，離心得組分I沉淀和組分I上清蛋白液；組分I沉淀存放于冷庫(kù)或直接用于纖維蛋白原生產(chǎn)；
(3)、將步驟⑵的制得物組分I上清蛋白液加入pH4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為
6.60 6. 65 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇至乙醇體積比濃度為22%，溫度控制在一 4 一6°C ;攪拌120min以上后,靜置60min以上,再開啟攪拌,按每升反應(yīng)液加入18±0. 5g娃藻土，進(jìn)行壓濾，進(jìn)液壓力最高不超過O. 20Mpa,壓濾得組分II + III沉淀和組分II + III上清液， 組分II +III上清液用于人血白蛋白生產(chǎn)；
(4)、將步驟(3)的制得物組分II+III沉淀，加入8±2°C的10 12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化鈣，使溶解液鈣離子濃度為O. 2±0. 01mol/L ;加完攪拌30±5min ;然后在攪拌過程中緩慢加入pH4.0醋酸緩沖液到反應(yīng)液中，調(diào)整pH為 4. 5±0. 2，緩慢加入辛酸，按每升溶解液中加入濃度為98. 5%辛酸40±1毫升，加完攪拌 60±5min后進(jìn)行壓縮過濾，過濾壓力不超過O. 2 Mpa,收集壓濾液；
(5)、再進(jìn)行兩步層析工藝，兩步層析工藝為
①對(duì)步驟(4)的制得物壓濾液進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5%以上，用5±0.5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至3% 6%，用pH4. O醋酸緩沖液調(diào)pH至 4. O 4. 5，然后加磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 21 s / m O. 25s / m,所述的磷酸一 NaOH緩沖液中磷酸與NaOH均為lmol/L,調(diào)節(jié)好后用Macrocap-Q離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第一步流穿液；
②將收集第一步流穿液再進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5%以上，用5±0.5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至3% 6%，用O. 5±0. lmol/L的NaOH調(diào)pH至
6.8 7.0，然后加所述的磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 15 s / m
O.17s / m，調(diào)節(jié)好后用DEAE-FF離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第二步流穿液；
(6)、用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)步驟(5)的制得物第二步流穿液，pH為3.8 4. O,開啟超濾機(jī)將流穿液蛋白濃度調(diào)整至5%以上，用5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析，然后將蛋白液濃縮至6%以上，將麥芽糖加入蛋白液內(nèi)，用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，使麥芽糖含量 10%±1%，pH 為 3. 8 4. 4，蛋白含量 5. 5+0. 5% ；
(7)、步驟(6)的制得物經(jīng)0.2μπι除菌濾芯過濾，放置在孵放室，經(jīng)24°C±1°C孵放21 天；孵放結(jié)束后用DV20濾芯除病毒過濾；0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝，分裝后的制品送檢、燈檢，檢驗(yàn)合格后包裝、入庫(kù)；
所述的百分?jǐn)?shù)除有限定之外，其余為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。所述pH 4.0醋酸緩沖液是由乙酸鈉與冰乙酸組成的水溶液，每升水中添加 244. 9ml質(zhì)量濃度為99%冰乙酸和65. 6g乙酸鈉。組分I上清液，組分I沉淀，組分II + III沉淀，組分II + III上清液為所屬技術(shù)領(lǐng)域的通用分類方法；在本發(fā)明中是也是按通用分類方法分類后物質(zhì)的名稱，并不是指單純的序號(hào)。通過人血漿經(jīng)離心分離冷沉淀，分離后的離心上清蛋白液通過調(diào)節(jié)pH及溫度，添加乙醇再離心得組分I沉淀和組分I上清蛋白液；
通過對(duì)組分I上清蛋白液調(diào)節(jié)pH值及溫度，添加乙醇再壓濾得組分II +III沉淀和組分 II + III上清液；
組分I沉淀主要含有纖原、FV III、Ciq、Clr、Cls、和纖維結(jié)合蛋白等；
組分I上清蛋白液主要含有白蛋白、IgG、IgA、IgM、F II、VII、IX、X、a、β球蛋白、銅藍(lán)蛋白、α I —抗胰蛋白酶、IgM、AT-III補(bǔ)體成分、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等；
組分II +III沉淀主要含有IgG、IgA、IgM、F II、VII、IX、X、a、β球蛋白、和銅藍(lán)蛋白等；組分II +III上清液主要含有白蛋白、a、0球蛋白、銅藍(lán)蛋白、α I —抗胰蛋白酶、IgM、 AT-III補(bǔ)體成分、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等。本發(fā)明具有積極的意義
本發(fā)明方法采用辛酸與氯化鈣沉淀法處理組分II +III沉淀，再進(jìn)行兩步層析工藝。此外本發(fā)明方法在處理組分II +III工藝過程中，沒有添加乙醇，乙醇會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)易造成蛋白發(fā)生變性，從而使蛋白活性降低。具體為
I、采用辛酸及氯化鈣沉淀法去除組分II +III沉淀中的雜蛋白及凝血因子類物質(zhì)，避免傳統(tǒng)低溫乙醇法制備過程中乙醇對(duì)基于PH4的靜注人免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)活性片段的不利影響，采用辛酸及氯化鈣沉淀法能夠使靜注人免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)活性片段完全得到保護(hù)，提聞廣品生物活性，廣品質(zhì)量能夠得到進(jìn)一步提聞。2、相比通常辛酸沉淀法，本發(fā)明增加了氯化鈣對(duì)組分II + III沉淀溶解液進(jìn)行了處理，能夠顯著提高去除凝血因子類雜質(zhì)效果，提高了產(chǎn)品純度。同時(shí)在溶解液中加入適量鈣離子又利用提高免疫球蛋白穩(wěn)定性，使球蛋白更加不易與辛酸發(fā)生沉淀，能夠顯著提高產(chǎn)品得率，產(chǎn)品得率可達(dá)每升血漿7克以上，常規(guī)的辛酸沉淀法方法得率只能夠達(dá)到每升血漿6. 3克左右，比傳統(tǒng)方法產(chǎn)品得率提高11-14%。3、采用先進(jìn)二步層析法，用2種不同離子交換柱及層析技術(shù)進(jìn)行上柱層析純化; 能夠有效地去除雜蛋白，能夠顯著提高產(chǎn)品純度，產(chǎn)品純度達(dá)到99. 5%以上，一般低溫乙醇法為96%以上，通用的辛酸沉淀法也只能達(dá)99%以上。4、在制備工藝中采用用DV20濾芯除病毒，能夠有效去除B19細(xì)小病毒，傳統(tǒng)方法采用DV50濾芯除病毒不能夠有效去除B19細(xì)小病毒，按此工藝制備出的產(chǎn)品臨床使用安全性有顯著提高。


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I是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第一組100升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。 2是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第一組200升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。 3是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第一組500升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。 4是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第一組1000升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。 5是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第二組100升人血漿為原料制備出產(chǎn)品純度掃描圖譜。
6是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第二組200升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。 7是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第三組500升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。 8是本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)第四組1000升人血漿為原料制備出產(chǎn)品的純度掃描圖譜。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例I :制備工藝如下
(I)、將檢疫期檢疫合格的人血漿經(jīng)離心，離心時(shí)，離心速度不大于4L/min/臺(tái)，出液溫度控制在O 4°C ;分離冷沉淀，冷沉淀用于VDI因子生產(chǎn)，將離心上清蛋白液輸送至蛋白分離反應(yīng)罐，使蛋白液的溫度控制在I 3°C之間，按不超過I. OL/min的流速加入pH 4. O醋
6酸緩沖液調(diào)節(jié)蛋白液PH值為6. 80 7. 00 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇，流速不超過I. 5L/ min，使乙醇體積比終濃度至8%，溫度控制在一 I 一 3°C，加完乙醇后pH值為6. 80
7.20 ;所述pH4. O緩沖液是由乙酸鈉與冰乙酸組成的水溶液，每升水中添加244. 9ml濃度為 99%冰乙酸和65. 6g乙酸鈉。(2)、將步驟(I)的制得物攪拌30min以上，進(jìn)行離心，離心過程中出液流速不超過 4L/min/臺(tái)，出液溫度控制在一 I 一 3°C，離心得組分I沉淀和組分I上清蛋白液；組分I 沉淀存放于冷庫(kù)或直接用于纖維蛋白原生產(chǎn)。(3)、將步驟(2)的制得物組分I上清蛋白液加入pH 4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為
6.60 6. 65 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇至乙醇體積比濃度為22%，溫度控制在一 4 一 6°C ;攪拌120min以上后，靜置60min以上，再開啟攪拌，按每升反應(yīng)液加入18g硅藻土，進(jìn)行壓濾，進(jìn)液壓力最高不超過O. 20Mpa，壓濾得組分II +III沉淀和組分II +III上清液，組分 II +III上清液用于人血白蛋白生產(chǎn)。(4)、將步驟(3)的制得物組分II + III沉淀，加入8±2°C的10 12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化鈣，使溶解液鈣離子濃度為O. 2±0. 01mol/L ;加完攪拌 30±5min。然后在攪拌過程中緩慢加入pH4. O醋酸緩沖液到反應(yīng)液中，調(diào)整pH為4. 5±0. 2， 緩慢加入辛酸，按每升溶解液中加入濃度為98. 5%辛酸40± I毫升，加完攪拌60±5min后進(jìn)行壓縮過濾，過濾壓力不超過O. 2 Mpa，收集壓濾液。(5)、再進(jìn)行兩步層析工藝，兩步層析工藝為
①對(duì)步驟(4)的制得物壓濾液進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5%以上，用5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至3% 6%，用pH4. O醋酸緩沖液調(diào)pH至4. O 4. 5，然后加磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 21 s / m O. 25s / m，所述的磷酸一 NaOH緩沖液中磷酸與NaOH均為lmol/L,調(diào)節(jié)好后用Macrocap-Q離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第一步流穿液。②將收集第一步流穿液再進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5%以上，用5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至3% 6%，用O. 5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 8
7.0，然后加所述的磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 15 s / m O. 17s / m，調(diào)節(jié)好后用DEAE-FF離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第二步流穿液。(6)、用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)步驟(5)的制得物第二步流穿液，pH為3. 8 4. 0，開啟超濾機(jī)將流穿液蛋白濃度調(diào)整至5%以上，用5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析，然后將蛋白液濃縮至6%以上，將麥芽糖加入蛋白液內(nèi)，用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，使麥芽糖含量 10%±1%，pH 為 3. 8 4. 4，蛋白含量 5. 5+0. 5%0(7)、步驟(6)的制得物經(jīng)0. 2μπι除菌濾芯過濾，放置在孵放室，經(jīng)24°C ±1°C孵放21天；孵放結(jié)束后用DV20濾芯除病毒過濾；0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝，分裝后的制品送檢、燈檢，檢驗(yàn)合格后包裝、入庫(kù)。所述的百分?jǐn)?shù)除有限定之外，其余為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。對(duì)比實(shí)驗(yàn)分兩組，第一組為本發(fā)明，第二組為通用的辛酸沉淀法
一、產(chǎn)品得率對(duì)比
第一組分別取100升、200升、500升和1000升檢疫期檢疫合格的人血漿，采用本發(fā)明制備。
以100升人血漿為例，具體實(shí)驗(yàn)方法如下
(I)、將檢疫期檢疫合格的100升人血漿經(jīng)離心，離心時(shí)，離心速度為3L/min/臺(tái)，出液溫度控制在2°C ;分離冷沉淀，將離心上清蛋白液輸送至蛋白分離反應(yīng)罐，蛋白液的溫度為 2°C，按0.8L/min的流速加入pH 4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)蛋白液pH值為6. 90 ;加一 18°C 95% 乙醇，流速為1.2L/min，使乙醇體積比終濃度至8%，溫度控制在一 2°C，混合液pH值為
·7.05。(2)、將步驟(I)的制得物攪拌40min以上，進(jìn)行離心，離心出液流速為3L/min/ 臺(tái)，出液溫度控制在一 2°C，離心得組分I沉淀和組分I上清蛋白液；組分I沉淀存放于冷庫(kù)。(3)、將步驟(2)的制得物組分I上清蛋白液加入pH 4.0醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6. 62 ;加一 18°C乙醇至乙醇體積比濃度為22%，溫度控制在一 5°C ;攪拌150min，靜置 80min，再開啟攪拌，按每升反應(yīng)液加入18g硅藻土，進(jìn)行壓濾，進(jìn)液壓力為O. 15Mpa，壓濾得組分II +III沉淀和組分II +III上清液，組分II +III上清液用于人血白蛋白生產(chǎn)。(4)、將步驟(3)的制得物組分II +III沉淀9. 5公斤，加入8°C的11倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化鈣，使溶解液鈣離子濃度為O. 2mol/L ;加完攪拌30min ;然后在攪拌過程中緩慢加入PH4. O醋酸緩沖液到反應(yīng)液中，調(diào)整pH為4. 6，緩慢加入辛酸， 按每升溶解液中加入濃度為98. 5%辛酸40毫升，加完攪拌62min后壓縮過濾，過濾壓力為 O. 15Mpa，收集壓濾液。(5)、再進(jìn)行兩步層析工藝，兩步層析工藝為
①對(duì)步驟(4)的制得物壓濾液110公斤進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至6%，用5倍體積 5°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至4%，用pH4. O醋酸緩沖液調(diào)pH至4. 3，然后加磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 22 s / m，所述的磷酸一 NaOH緩沖液中磷酸與NaOH均為lmol/L,調(diào)節(jié)好后用Macrocap-Q離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化,收集第一步流穿液。②將收集第一步流穿液50公斤再進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5. 5%，用5倍體積 5°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至4%，用O. 5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 9，然后加所述的磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 16s / m，調(diào)節(jié)好后用DEAE-FF離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第二步流穿液40公斤。(6)、用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)步驟(5)的制得物第二步流穿液，pH為3. 85，開啟超濾機(jī)將流穿液蛋白濃度調(diào)整至5. 5%,用5倍體積5°C注射用水進(jìn)行透析，然后將蛋白液濃縮至6. 5%，將麥芽糖加入蛋白液內(nèi)，用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，最終蛋白溶液中麥芽糖含量為10. 5%，pH為3. 9，蛋白含量5. 01%，溶液重量為14. 2公斤。(7)、步驟(6)的制得物14.2公斤經(jīng)0.2μπι除菌濾芯過濾，放置在孵放室，經(jīng) 240C ± 1°C孵放21天；孵放結(jié)束后用DV20濾芯除病毒過濾；0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝。分裝裝量為每瓶50ml。根據(jù)以上試驗(yàn)可以看出，100升人血漿可得到14. 2公斤蛋白濃度為5. 01%的靜注人免疫球蛋白產(chǎn)品，產(chǎn)品得率為每升血漿7. 11克。第一組產(chǎn)品得率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
IlOO 升 |200 升 |500 升 |1000 升產(chǎn)品得率7. 117. 157. 137. 16
產(chǎn)品得率單位克/升
第二組分別取100升、200升、500升和、1000升檢疫期檢疫合格的人血漿，采用通用的辛酸沉淀法，即在辛酸沉淀前，不放入氯化鈣；采用一步層析工藝；
以100升人血漿為例，具體實(shí)驗(yàn)方法如下
(I)、將檢疫期檢疫合格的100升人血漿經(jīng)離心，離心時(shí)，離心速度為3L/min/臺(tái)，出液溫度控制在2°C ;分離冷沉淀，將離心上清蛋白液輸送至蛋白分離反應(yīng)罐，蛋白液的溫度為 2°C，按0.8L/min的流速加入pH 4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)蛋白液pH值為6. 90 ;加一 18°C 95% 乙醇，流速為1.2L/min，使乙醇體積比終濃度至8%，溫度控制在一 2°C，混合液pH值為
7.05。(2)、將步驟⑴的制得物攪拌40min以上，進(jìn)行離心，離心出液流速為3L/min/ 臺(tái)，出液溫度控制在一 2°C，離心得組分I沉淀和組分I上清蛋白液；組分I沉淀存放于冷庫(kù)。(3)、將步驟(2)的制得物組分I上清蛋白液加入pH 4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6. 62 ;加一 18°C乙醇至乙醇體積比濃度為22%，溫度控制在一 5°C ;攪拌150min，靜置 80min，再開啟攪拌，按每升反應(yīng)液加入18g硅藻土，進(jìn)行壓濾，進(jìn)液壓力為O. 15Mpa，壓濾得組分II +III沉淀和組分II +III上清液，組分II +III上清液用于人血白蛋白生產(chǎn)。(4)、將步驟(3)的制得物組分II +III沉淀9. 5公斤，加入8°C的11倍量的注射用水溶解，然后在攪拌過程中緩慢加入PH4. O醋酸緩沖液到反應(yīng)液中，調(diào)整pH為4. 6，緩慢加入辛酸，按每升溶解液中加入濃度為98. 5%辛酸40毫升，加完攪拌62min后壓縮過濾，過濾壓力為O. 15Mpa，收集壓濾液。(5)、對(duì)步驟(4)的制得物壓濾液110公斤進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5. 7%，用5 倍體積4°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至4. 5%，用O. 5mol/L的NaOH調(diào)pH至6. 7， 然后加所述的磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 16s / m，調(diào)節(jié)好后用 DEAE-FF離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集流穿液40公斤。(6)、用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)步驟(5)的制得的流穿液，pH為3. 85，開啟超濾機(jī)將流穿液蛋白濃度調(diào)整至5. 6%,用5倍體積5°C注射用水進(jìn)行透析，然后將蛋白液濃縮至6. 6%， 將麥芽糖加入蛋白液內(nèi)，用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，最終蛋白溶液中麥芽糖含量為10. 5%， pH為3. 9，蛋白含量5. 02%，溶液重量為12.6公斤。(7)、步驟(6)的制得物12.6公斤經(jīng)0.2μπι除菌濾芯過濾，放置在孵放室，經(jīng) 240C ± 1°C孵放21天；孵放結(jié)束后用DV20濾芯除病毒過濾；0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝。分裝裝量為每瓶50ml。根據(jù)以上試驗(yàn)可以看出，100升人血漿可得到12. 6公斤蛋白濃度為5. 02%的靜注
人免疫球蛋白產(chǎn)品，產(chǎn)品得率為每升血漿6. 33克。第二組產(chǎn)品得率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
100升200升500升1000 升產(chǎn)品得率6. 336. 326. 376. 35
產(chǎn)品得率單位克/升二、純度對(duì)比純度檢測(cè)方法為Cl)在英特雷勃GENIO S全自動(dòng)電泳儀的樣品盤上相應(yīng)處加入一張吸水紙(72 X 24 mm), Iml超純水，加入的試制的靜注人免疫球蛋白樣品30 μ 1，同時(shí)以新鮮人血清作對(duì)照， 加樣器放入儀器相應(yīng)位置。(2)在試劑并放置于儀器中相應(yīng)的位置。
3號(hào)位一一透明液加入55ml，液面位于上線。
4號(hào)位一一吸水紙2張(88Χ48_)5號(hào)位脫色液加入55ml，液面位于上線。
6 7位脫色液加入55ml，液面位于上線。
7號(hào)位一脫色液加入55ml，液面位于上線。
8號(hào)位一脫色液加入55ml，液面位于上線。
9號(hào)位一染色液加入50ml，液面位于下線。
10號(hào)位一緩沖液加入55ml，液面位于上線。
11號(hào)位一一吸水紙2張(88 X 48mm)
(3)在電泳槽的兩側(cè)邊各放入一張紙電極，向槽內(nèi)加入電泳緩沖液，加到剛好兩條紅線之間的位置即可，蓋上電泳槽蓋子，并放置于儀器中相應(yīng)的位置。(4)將膜片毛面朝上，側(cè)對(duì)著膜片固定器把膜片固定在膜片器上，并放置于儀器中相應(yīng)的位置。(5)進(jìn)入電泳軟件操作系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行操作，并打印出如下純度掃描圖譜。第一組純度檢測(cè)結(jié)果根據(jù)靜注人免疫球蛋白純度掃描圖譜得到產(chǎn)品純度如下
權(quán)利要求
1.一種靜注人免疫球蛋白制備工藝，它采用辛酸及氯化鈣沉淀法去除雜蛋白及凝血因子類物質(zhì)，再進(jìn)行兩步層析工藝，其特征在于制備工藝如下(1)、將檢疫期檢疫合格的人血漿經(jīng)離心，離心時(shí)，離心速度不大于4L/min/臺(tái)，出液溫度控制在O 4°C ;分離冷沉淀，冷沉淀用于VDI因子生產(chǎn)，將離心上清蛋白液輸送至蛋白分離反應(yīng)罐，使蛋白液的溫度控制在I 3°C之間，按不超過I. OL/min的流速加入pH 4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)蛋白液PH值為6. 80 7. 00 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇，流速不超過I. 5L/ min，使乙醇體積比終濃度至8%，溫度控制在一 I 一 3°C，加完乙醇后pH值為6. 80 7.20 ；(2)、將步驟(I)的制得物攪拌30min以上，進(jìn)行離心，離心過程中出液流速不超過4L/ min/臺(tái)，出液溫度控制在一 I 一 3°C，離心得組分I沉淀和組分I上清蛋白液；組分I沉淀存放于冷庫(kù)或直接用于纖維蛋白原生產(chǎn)；(3)、將步驟(2)的制得物組分I上清蛋白液加入pH4. O醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為 6. 60 6. 65 ;加一 15°C或更冷的95%乙醇至乙醇體積比濃度為22%，溫度控制在一 4 一 6°C ;攪拌120min以上后,靜置60min以上,再開啟攪拌,按每升反應(yīng)液加入18±0. 5g娃藻土，進(jìn)行壓濾，進(jìn)液壓力最高不超過O. 20Mpa,壓濾得組分II + III沉淀和組分II + III上清液， 組分II +III上清液用于人血白蛋白生產(chǎn)；(4)、將步驟(3)的制得物組分II+III沉淀，加入8±2°C的10 12倍量的注射用水溶解，再向溶解液中加入氯化鈣，使溶解液鈣離子濃度為O. 2±0. 01mol/L ;加完攪拌30±5min ;然后在攪拌過程中緩慢加入pH4.0醋酸緩沖液到反應(yīng)液中，調(diào)整pH為 4. 5±0. 2，緩慢加入辛酸，按每升溶解液中加入濃度為98. 5%辛酸40± I毫升，加完攪拌 60±5min后進(jìn)行壓縮過濾，過濾壓力不超過O. 2 Mpa，收集壓濾液；(5)、再進(jìn)行兩步層析工藝，兩步層析工藝為①對(duì)步驟(4)的制得物壓濾液進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5%以上，用5±0.5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至3% 6%，用pH4. O醋酸緩沖液調(diào)pH至4.O 4. 5，然后加磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為O. 21 s / m O. 25s / m,所述的磷酸一 NaOH緩沖液中磷酸與NaOH均為lmol/L,調(diào)節(jié)好后用Macrocap-Q離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第一步流穿液；②將收集第一步流穿液再進(jìn)行超濾，將蛋白含量濃縮至5%以上，用5±0.5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析；將蛋白濃度調(diào)整至3% 6%，用O. 5±0. lmol/L的NaOH調(diào)pH至 6. 8 7. 0，然后加所述的磷酸一 NaOH緩沖液調(diào)節(jié)電導(dǎo)率在T=19°C時(shí)測(cè)為0. 15 s / m 0.17s / m，調(diào)節(jié)好后用DEAE-FF離子交換柱進(jìn)行上柱層析純化，收集第二步流穿液；(6)、用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)步驟(5)的制得物第二步流穿液，pH為3.8 4. O,開啟超濾機(jī)將流穿液蛋白濃度調(diào)整至5%以上，用5倍體積2 8°C注射用水進(jìn)行透析，然后將蛋白液濃縮至6%以上，將麥芽糖加入蛋白液內(nèi)，用lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值，使麥芽糖含量 10%±1%，pH 為 3. 8 4. 4，蛋白含量 5. 5+0. 5% ；(7)、步驟(6)的制得物經(jīng)0.2μπι除菌濾芯過濾，放置在孵放室，經(jīng)24°C±1°C孵放21 天；孵放結(jié)束后用DV20濾芯除病毒過濾；0. 2 μ m除菌濾芯過濾分裝，分裝后的制品送檢、燈檢，檢驗(yàn)合格后包裝、入庫(kù)；所述的百分?jǐn)?shù)除有限定之外，其余為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靜注人免疫球蛋白制備工藝，其特征在于所述pH 4.0 醋酸緩沖液是由乙酸鈉與冰乙酸組成的水溶液，每升水中添加244. 9ml質(zhì)量濃度為99%冰乙酸和65. 6g乙酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靜注人免疫球蛋白的制備工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域。在靜注人免疫球蛋白制備工藝過程中，采用辛酸及氯化鈣沉淀法處理靜注人免疫球蛋白制備工藝中的組分Ⅱ+Ⅲ沉淀，去除組分Ⅱ+Ⅲ沉淀中的雜蛋白，再進(jìn)行兩步層析工藝。本發(fā)明與通常辛酸沉淀法相比，加入了氯化鈣有效地去除了組分Ⅱ+Ⅲ沉淀溶解液中的各種凝血因子，同時(shí)提高了免疫球蛋白的穩(wěn)定性，產(chǎn)品得率顯著提高，可至每升血漿7克以上；采用2種不同離子交換柱及層析技術(shù)進(jìn)行上柱層析純化，能夠有效地去除雜蛋白，產(chǎn)品純度達(dá)到99.5%以上。此外加入辛酸及采用DV20濾芯除病毒過濾，能夠顯著提高去除病毒的效果，提高臨床用藥的安全性。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102584934SQ20121007169
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者何淑琴, 劉敏亮, 梁小明, 鄧志華 申請(qǐng)人:江西博雅生物制藥股份有限公司