專利名稱：：制備和提純9-硝基-20-喜樹堿的方法以及9-硝基-20-喜樹堿及其組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于制備和提純9-硝基-20-喜樹堿(9NC)的方法以及9-硝基-20-喜樹;成及其組合物。
背景技術(shù)：
：9-硝基-20(S)-喜樹堿在治療某些類型的癌癥中已顯示出大有前景。對(duì)這種水不溶的9-硝基-20(S)-喜樹堿已進(jìn)行了體內(nèi)和體外研究并將9-硝基-20(S)-喜樹堿用于某些癌癥的臨床試驗(yàn)中。日本公開的專利申請(qǐng)59-51288號(hào)提供一種用稍微過(guò)量的濃硝酸在濃硫酸中處理喜樹堿來(lái)制備9-硝基喜樹堿的方法。但是，使用該方法時(shí)，得到可用于醫(yī)藥用途的9NC產(chǎn)物的收率僅約3%-約7%。另外，該方法產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物，例如無(wú)活性的異構(gòu)體，12-硝基喜樹堿(12NC),其中9NC與12NC的比例約1-3。下面的反應(yīng)式表示使用硝酸和硫酸的反應(yīng)。+副產(chǎn)品但在此反應(yīng)，不需要的12NC是主要產(chǎn)物，占收率的約60%。因?yàn)?NC收率低且有許多副產(chǎn)物，分離和提純9NC的方法耗費(fèi)時(shí)間和費(fèi)用大，還可能進(jìn)一步降低9NC的收率。因此，需要有一種提高9NC收率的方法并最好沒(méi)有以前制備9NC的方法所產(chǎn)生的許多副產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供制備9-硝基喜樹堿的方法，該方法能得到高的9-硝基喜樹堿收率。本發(fā)明的另一目的是提供一種純化9-硝基喜樹堿的改進(jìn)的提純方法。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)有部分在下面說(shuō)明書中說(shuō)明，有部分可從說(shuō)明書清楚地反映出來(lái)。本發(fā)明的這些目的和其他優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求中特別指出的各個(gè)要點(diǎn)及其組合來(lái)實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。為了達(dá)到這些和其他優(yōu)點(diǎn)并根據(jù)本發(fā)明的目的，正如在這里具體和概括說(shuō)明的，本發(fā)明是關(guān)于制備9-硝基喜樹堿的方法。該方法的步驟包括20-喜樹堿與至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽反應(yīng)并用一種對(duì)催化生成硝鐨離子有效的酸。該反應(yīng)在足以生成9-硝基喜樹石威的溫度和時(shí)間下。本發(fā)明也是關(guān)于用柱色譜提純9-硝基喜樹^4的方法，優(yōu)選使用含四氫呋喃和二氯曱烷的洗脫液。具體地，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案1.制備9-硝基喜樹堿的方法，包括在足以生成所述9-硝基喜樹堿的溫度和時(shí)間下，將20-喜樹堿與至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽和至少一種對(duì)催化生成硝镎離子有效的酸反應(yīng)。2.項(xiàng)1的方法，其中所述20-喜樹堿是外消旋的20-喜樹堿或20(S)-喜樹堿。3.項(xiàng)2的方法，其中所述20-喜樹堿是20(S)-喜樹堿，且所述9-硝基喜樹堿是9-硝基-20(S)-喜樹堿。4.項(xiàng)1的方法，其中所述酸是濃硫酸、三氟乙酸或三氟乙酐。5.項(xiàng)1的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽是KN03;NH4N03;LiN03;AgN03;T1N03;BiON03;Cu(N03)2.2.5H20;Hg(N03)2.H20;Ca(N03)24H20;Ba(N03)2;Zn(N03)26H20;Mg(N03)2.6H20;Co(N03)26H20;Sr(N03)2;Pb(N03)2;A1(N03)3.9H20;Fe(N03)3犯20;Cr(N03)3.9H20;La(N03)3'6H20;或其混合物。6.項(xiàng)1的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽是至少兩種無(wú)機(jī)硝酸鹽的混合物。7.項(xiàng)6的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽包括KN03和至少一種其他無(wú)機(jī)硝酸鹽。8.項(xiàng)6的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽包括KN03和Cu(N03)2■2.5H20;KNCM口T1N03;KN03和Hg(N03)2.H20;KN03和Ca(N03)2.4H20;KN03和Ba(N03)2;KN03和Zn(N03)26H20;KN03和Sr(N03)2;KN03和Pb(N03)2;KN03和A1(N03)3'KN03和Fe(N03)3LiN03和Hg(N03)2LiN03和Cu(N03)2LiN03和Co(N03)29H20;9H20;H20;2.5H20;6H20;AgN03和Cr(N03)39H20;Cu(N03)22.5H20和Fe(N03)39H20;Hg(N03)2H20和Fe(N03)39H20;NH4N03和Cu(N03)22.5H20;KN03、T1N03和Cu(N03)22.5H20;KN03、T1N03和Zn(N03)2.6H20;KN〇3、T1N03和Pb(N03)2;KN03、Cu(N03)22.5H20和Fe(N03)3.9H20;KN03、LiN03、Cu(N03)2'2.5恥、Hg(N03)2.恥和Zn(N03)2.6H20;KN03、LiN03、Cu(N03)2'2.5&0、Hg(N03)2.2.5H20和Fe(N03);.9H20;KN03、LiN03、AgN03、Cu(N03)22.5H20、Hg(N03)2H2()和Fe(N03)3■9H20;KN03、LiN03、Zn(N03)2■6H20、Cu(N03)2■2.5H20、Hg(N03)2.H20和Fe(N03)39H20;或KN03、Zn(N03)2.6H20、Cu(N03)2■2.5H20、Hg(N03)2H20和Fe(N03)3'9H20。9.項(xiàng)1的方法，還包括用柱色譜提純9-硝基喜樹堿的步驟。10.項(xiàng)9的方法，其中所述柱色語(yǔ)用含有四氫呋喃和二氯曱烷的洗脫液進(jìn)行。11.項(xiàng)1的方法，還包括用從乙醇中再沉淀提純9-硝基喜樹堿。12.9-硝基喜樹堿，其熔點(diǎn)為268。C,其中該9-硝基喜樹堿具有如下特征1)'H畫R:1.05(3H，t，J=7.40Hz，C19-曱基質(zhì)子)，1.92(2H,m,C18-亞曱基質(zhì)子)，3.82(1H,s,C20-OH),5.40(2H，s，C5-亞曱基質(zhì)子)，5.55(2H,dd，J=14.21Hz,14.21Hz，C17-亞曱基質(zhì)子)，7.70(1H,s,C14-H)，7.92(1H,t,J=8.40Hz,Cll-H),8.48(1H,d,J=8.35Hz,C10-H),8.55(1H,d,風(fēng)35Hz,C12-H),9.36(1H,s,C7-H);2)質(zhì)譜m/e(相對(duì)強(qiáng)度):393(M+,100%),364(M-C2H5,35%)，349(48%)，334(25%)，320(25%),293(35%)，274(8%),262(8%),246(15%),234(6%),218(20%)，205(8%),190(9%)，177(5%),164(3%),151(30/0),137(5%),123(4%),109(5%),95(5%),75(3%),60(23%);精密質(zhì)譜393.096(實(shí)驗(yàn)值)，393.096(C2。H,5N306計(jì)算值)。13.含項(xiàng)12的9-硝基喜樹堿的組合物。14.項(xiàng)13的組合物，其中所述9-硝基喜樹堿是由乙醇作為起始溶劑的純化過(guò)程形成的。15.項(xiàng)13的組合物，該組合物是用于治療癌癥的組合物。16.項(xiàng)12的9-硝基喜樹堿的純化方法，包括用乙醇作為起始溶劑使9-硝基喜樹堿進(jìn)行純化過(guò)程，所形成的9-硝基喜樹堿的熔點(diǎn)為268°C。當(dāng)然，上面一般說(shuō)聽和下面的詳細(xì)說(shuō)明僅是示例性的和說(shuō)明性的，旨在進(jìn)一步解釋要求保護(hù)的本發(fā)明。具體實(shí)施例方式一般，制備9-硝基喜樹堿的方法包括將20-喜樹堿與至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽和對(duì)催化由硝酸鹽形成硝錯(cuò)離子有效的酸反應(yīng)。該反應(yīng)在足以生成9-硝基喜樹堿的溫度和時(shí)間下進(jìn)行。關(guān)于原料，所述喜樹堿可以是任何20-喜樹堿。優(yōu)選的喜樹堿是外消旋的20-喜樹堿(即20(R,S)-喜樹堿)或20(S)-喜樹堿。更優(yōu)選的20-喜樹堿是20(S)-喜樹堿。所述喜樹堿在市場(chǎng)上可以從中國(guó)北京京濤(Jintao)科技開發(fā)公司買到。可使用任何純度的喜樹堿，但20-喜樹堿純度優(yōu)選約85%-約99%，更優(yōu)選至少約92%。與至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽和一種催化生成硝镎離子有效的酸反應(yīng)的20-喜樹堿的量可以是任何量，只要存在足夠量的剩余組分即可。無(wú)機(jī)硝酸鹽可以是能夠生成硝錯(cuò)離子的任何鹽，所述硝鐿離子最后生成連接在喜樹堿9-位上的硝基取代基。無(wú)機(jī)硝酸鹽的例子包括但不限于KN03;NH4N03;LiN03;AgN03;T1N03;BiON03;Cu(N03)22.5H20;Hg(N03)2H20;Ca(N03)2.4H20;Ba(N03)2;Zn(N03)2.6H20;Mg(N03)2.6H20;Co(N03)2.6H20;Sr(N03)2;Pb(N03)2;A1(N03)3■9H20;Fe(N03)3■9H20;Cr(N03)39H20和La(N03)36H20。在本發(fā)明的方法中，至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽用于反應(yīng)中。也可以使用多種無(wú)機(jī)硝酸鹽，例如，兩種或三種或更多種不同的無(wú)機(jī)硝酸鹽可以用于該反應(yīng)中。某些無(wú)機(jī)硝酸鹽的組合物改進(jìn)了9-硝基喜樹堿收率的百分?jǐn)?shù)并使9-硝基喜樹堿收率百分?jǐn)?shù)與12-硝基喜樹堿收率百分?jǐn)?shù)有更理想的比例，以及使硝化的總百分?jǐn)?shù)更高和/或反應(yīng)副產(chǎn)物的百分?jǐn)?shù)更低。無(wú)機(jī)硝酸鹽組合物的具體例子包括但不限于KN03和Cu(N03)2.2.5H20;KN03和T1N03;KN03和Hg(N03)2H20;KN02和Ca(N03)2.4H20;KN03和Ba(N03)2;KN03和Zn(N03)2.6H20;KN03和Sr(N03)2;KN03和Pb(N03)2;KN03和A1(N03)39H20;KN03和Fe(N03)3.9H20;LiN03和Hg(N03)2H20;LiN03和Cu(N03)2,2.5H20;LiN03和Co(N03)2.6H20;AgNCb和Cr(N03)3,9H20;Cu(N03)2.2.5H20和Fe(N03)3.9H20;Hg(N03)2.H20;和Fe(N03)3.9H20;NH4N03和Cu(N03)2.2.5H20;KN03,T1N03,和Cu(N03)2,2.5H20;KN03,T1N03,和Zn(N03)26H20;KN03,T1N03，和Pb(N03)2;KN03,Cu(N03)2.2.5H20,和Fe(N03)39H20;KN03，LiN03,Cu(N03)22.5H20,Hg(N03)2H20,和Fe(N03)3'9H20;Zn(N03)2,0;KN03,LiN03,AgN03,Cu(N。3)22.5H20'Hg(N03)2H20,和Fe(N03)39H20;KN03,LiN03，Cu(N03)22.5H2()，Hg(N03)2H20和Zn(N03)26H20;KN〇3,LiN03,Zn(N03)26H20，Cu(N03)2.2.5H20，Hg(N03)2H20,和Fe(N03)3.9H20;和KN03，Zn(N03)26H20，Cu(N03)2.2.5H20,Hg(N03)2H20,和Fe(N03)3.9H20。在反應(yīng)中存在的無(wú)機(jī)硝酸鹽的量(與反應(yīng)中使用的喜樹堿量比較)超過(guò)使用的喜樹堿量，更優(yōu)選是大于喜樹堿量約2倍-約3倍(摩爾)。無(wú)機(jī)硝酸鹽可/人市場(chǎng)上例如AldrichChemicalCo.,Milwaukee,WI買到。本發(fā)明方法中使用的酸在催化生成硝镎離子中是有效的。酸的例子包括但不限于濃硫酸、三氟乙酸或三氟乙酐。使用的術(shù)語(yǔ)"濃的"指的是硫酸的濃度至少約95%,更優(yōu)選約％%-約98%。在反應(yīng)中使的酸量應(yīng)是50ml-120ml/g20-CPD,更優(yōu)選100ml/g20-CPT。在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，原料一般可以任何順序加入反應(yīng)容器中，混合在一起直到生成9-硝基喜樹堿。原料加入反應(yīng)器中的順序不是嚴(yán)格的，但優(yōu)選首先將酸加入裝有磁性攪拌器的反應(yīng)容器中，然后加入喜樹堿和無(wú)機(jī)硝酸鹽?；旌衔镌谑覝叵聰嚢鑳?yōu)選至少約72小時(shí)，更優(yōu)選約72-約96小時(shí)。在混合物攪拌足夠時(shí)間后，可將混合物分批倒入冰水中同時(shí)攪拌以避免過(guò)熱。生成的懸浮液用溶劑例如二氯曱烷萃取，萃取液可以用例如碌b酸鈉干燥幾小時(shí)。如同表1所示，該反應(yīng)式表示喜樹堿1用無(wú)積工賄酸鹽硝化得到9-硝基喜樹堿4、12-硝基喜樹堿5、和其他副產(chǎn)物。優(yōu)選的硝化反應(yīng)是得到合適比例的9—硝基喜樹堿和12-硝基喜樹堿以及較高的總硝化收率和低的副產(chǎn)物收率(百分?jǐn)?shù))。表2概要地說(shuō)明在濃石克酸中喜樹堿與常用的無(wú)機(jī)鹽的硝化反應(yīng)。從結(jié)果可以看出，根據(jù)9-硝基喜樹堿的收率和/或得到的9-硝基喜樹堿與12-硝基喜樹堿的比例，T1N03和KN03是優(yōu)選的無(wú)機(jī)硝酸鹽。表3提供的數(shù)據(jù)表示在反應(yīng)中使用兩個(gè)不同無(wú)片/U肖酸鹽的幾種組合物生成9-硝基喜樹堿。3可以看出得到此結(jié)果優(yōu)選使用KN03/T1N03;KN03/Zn(N03)2;和KN03/Sr(N03)2。例如，KN03/T1N03的組合物，與單獨(dú)用硝酸鉀或硝酸鉈作為硝化劑反應(yīng)得到的結(jié)果比較，提供了改進(jìn)的9-硝基喜樹堿和12-硝基喜樹堿的比例1:1.4以及較高的9-硝基喜樹堿收率29%。KN03和Hg(N03)2的組合物也顯示改進(jìn)的9-硝基喜樹堿和12-硝基喜樹堿的比例1:1.2。表4概述了使用三種或更多種無(wú)4/L硝酸鹽作為硝化劑并表示這些組合物是可以使用的。表5概述用不同比例的硝酸鉀和硝酸鉈在濃硫酸中的組合物硝化喜樹堿的結(jié)果。從表5中可以看出在優(yōu)選的無(wú)機(jī)硝酸鹽組合物是1.4/1.0-1.0/1.5比例的KNO/TlN03時(shí)，得到較高百分收率的9-硝基喜樹堿以及改進(jìn)的9-硝基喜樹堿和12-硝基喜樹堿的比例。更優(yōu)選使用1.3/1.0-1.0/1.0'的KN03/T1N03。用上述比例可以得到純的9-硝基喜樹堿的穩(wěn)定的收率20±1%，而一般方法得到的收率最多5±2%。下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例只是舉例性的。實(shí)施例在下列實(shí)施例中，所有玻璃儀器在使用以前都在70土10。C下烘干至少2小時(shí)。熔點(diǎn)用MEL-TEMP熔點(diǎn)儀得到，不校正。約10。/。(w/v)CDCl3溶液的'HNMR用JEOLGX-270WBNMR波i普儀在270.05MHz下得到?；瘜W(xué)位移以每百萬(wàn)中的份數(shù)記錄(5標(biāo)度)，用四曱基硅烷作內(nèi)標(biāo)。在記錄NMR數(shù)據(jù)時(shí)，我們使用下列縮寫以赫茲表示的偶合常數(shù)(J),單峰(S),二重峰(d)，三重峰(t)，寬峰(bs)，多重峰(m)，等等。質(zhì)譜用分辨率10000的VGZAB-SEQ質(zhì)語(yǔ)儀(英國(guó)VGAnalgticalCo.)記錄。常規(guī)使用的溶劑例如氯仿和二氯曱烷經(jīng)干燥和新蒸餾的。柱色譜的硅膠(230-400目，Aldrich)用于所有產(chǎn)物的分離。在薄層色譜(TLC)中使用Eastman色譜板(含有聚乙烯的螢光指示劑的硅膠)。在NMR數(shù)據(jù)中使用的數(shù)字在表1的結(jié)構(gòu)1中表示。20(S)-喜樹堿從中華人民共和國(guó)北京京濤科技開發(fā)公司購(gòu)買，買來(lái)就用。所有其他無(wú)機(jī)硝酸鹽從AldrichChemicalCo.(Milwaukee，WI)購(gòu)買，也是買來(lái)就用。濃硫酸濃度96%,由Fisher得到，得到就使用。實(shí)施例1—在乙酸中喜樹堿與KN03的反應(yīng)將0.50g(0.0014mol)20(S)-喜樹堿和0.50gKNO3(0.0050mol)加入在100ml裝有磁性攪拌器的圓底燒瓶中的30ml乙酸中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?4小時(shí)，并在攪拌下分幾份倒入500ml冰水中。懸浮液用每次200mi二氯甲烷(200mlx3)萃取3次。合并的萃取液用20g無(wú)水硫酸鈉干燥6小時(shí)。在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離二氯甲烷后，剩余物在石油醚中回流4小時(shí)。在過(guò)濾和在空氣中干燥4小時(shí)后得到的產(chǎn)物是灰白色粉末。HPLC分析表示在乙酸中無(wú)喜樹堿與KN03硝化的指示。起始的喜樹堿100。/?；厥?表1)實(shí)施例2在乙酐中喜樹堿與KN03的反應(yīng)用與實(shí)施例1中的反應(yīng)相同的方法將喜樹堿硝化和處理。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析表明起始的喜樹堿100%回收。實(shí)施例3在三氟乙酐中喜樹堿與KN03的反應(yīng)用與實(shí)施例1相同的方法將喜樹堿硝化和處理。反應(yīng)混合物的HPLC分析數(shù)據(jù)在表1中所示。實(shí)施例4在濃硫酸中喜樹堿用KN03的硝化將0.50g(0.0014mol)喜樹堿和(0.50g,0.0050mol)KNO3同時(shí)加入在100ml裝有磁性攪拌器的圓底燒瓶中的30ml濃硫酸中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?天，并在攪拌下緩慢地倒入500ml冰水中。黃色的懸浮液用每次200ml二氯曱烷(200mlx3)萃取3次。合并的萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥1天。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離二氯曱烷，剩余物在石油醚中回流4小時(shí)。在冷卻至室溫后混合物經(jīng)過(guò)濾和得到的黃色粉末在空氣中干燥1天。反應(yīng)混合物(黃色粉末)的HPLC分析在表1中所示。實(shí)施例5在硫酸中喜樹堿用各種硝酸鹽的硝化將喜樹堿(0.50g,0.0014mol)和硝酸銨(0.56g，0.0070mol)加入在100ml裝有磁性攪拌器的圓底燒瓶中的20ml濃硫酸中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?2小時(shí)，然后在攪拌下倒入500ml水水中，用每次200mi二氯曱烷(200mlx3)萃取3次。合并的萃取液用每次100ml水(100mlx2)洗滌2次。將2次的洗滌液合并，用每次100ml二氯曱烷(200mlx2)萃取2次。將所有萃取液(-600ml+200ml)合并，干燥(Na2S04,20g)4小時(shí)，然后蒸發(fā)得到白色粉末狀粗反應(yīng)產(chǎn)物，含有9NC(19%)，12NC(41%),未反應(yīng)的喜樹堿(25%)，和其他副產(chǎn)物(15%)。所有這些反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果在表2中所示。實(shí)施例6在硫酸中喜樹堿用兩種不同硝酸鹽組合物的硝化將喜樹堿(4.0g,0.0115mol)加入在250ml三口燒瓶中的100ml濃硫酸中。懸浮液用磁性攪拌器攪拌直到大多數(shù)喜樹堿進(jìn)入溶液中(約15-30分鐘)。將KN03(2.32g,0.0230mol)和Cu(N03)2'2.5I"bO(2.67g,0.0115mol)同時(shí)加入該溶液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?2小時(shí)，在攪拌下倒入1500ml冰水中。在水中的黃色懸浮液用每次500ml二氯曱烷(500mlx4)萃取4次。合并的萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥8小時(shí)。用過(guò)濾分離硫酸鈉。在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離二氯曱烷后，得到黃色粉末狀的粗反應(yīng)產(chǎn)物，含有9NC(24。/。)，12NC(50%),未反應(yīng)的喜樹堿(6%),和其他副產(chǎn)物(20%)。所有這些硝化反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果在表3中所示。實(shí)施例7在硫酸中喜樹堿用三種或更多種無(wú)機(jī)硝酸鹽組合物的硝化將喜樹堿(4.0g,0.0115mol)懸浮于在250ml裝有磁性攪拌器的圓底燒瓶中的100ml濃硫酸中。在攪拌約30分鐘(直到喜樹堿幾乎溶解)后，同時(shí)加入KN03(1.16g,0.0115mol)，TlNO3(3.0g,0.0116mol)和Cu(N03)22.5H20(2.67g,0.0115mol)的組合物?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?2小時(shí)，在攪拌下倒入1500ml冰水中。黃色懸浮液用每次500ml二氯曱烷(500mlx4)萃取4次。合并的萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，和蒸發(fā)。得到黃色粉末狀的粗反應(yīng)產(chǎn)物，含有9NC(25。/。)，12NC(44%),未反應(yīng)的喜樹堿(10%)，和其他副產(chǎn)物(21%)。所有這些硝化反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果在表4中所示。實(shí)施例8在硫酸中喜樹堿用不同比例的KN03和T1N03組合物的硝化將喜樹堿(6.0g,0.0172mol)加入在250ml裝有磁性攪拌器的三口燒瓶中的100ml濃碌b酸中。在室溫下攪拌約30分鐘后，同時(shí)加入KN03(1.74g,0.0172mol)和TlN03(4.58g，0.0172mol)的組合物。混合物在室溫下攪拌72小時(shí)，在攪拌下倒入1500ml冰水中。黃色懸浮液用每次500ml二氯曱烷(500mlx4)萃取4次。合并的萃取液用無(wú)水Na2S04干燥8小時(shí)。在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離二氯曱烷后，得到黃色粉末狀的粗反應(yīng)產(chǎn)物，含有9NC(26%),12NC(49%)，未反應(yīng)的喜樹堿(11%),和其他副產(chǎn)物(14%)。所有這些反應(yīng)的HPLC分析結(jié)果在表5中所示。實(shí)施例9在不同體積的硫酸中喜樹堿用KN03和T1N03(比例1.0/1.3)的組合物的硝化按照實(shí)施例8的一般方法，只是KNOs和T1N03與表6所示的不同體積硫酸一起使用。結(jié)果也在表6中所示。實(shí)施例10制備9-硝基喜樹堿的方法將喜樹堿(4.0g，0.0115mol)加入在1000ml三口燒瓶中的300ml濃硫酸中。在攪拌約15分鐘后，同時(shí)加入KNO3(2.0g，0.0198mol)和TlNO3(5.0g,0.0188mol)。混合物在室溫下攪拌72小時(shí)后在攪拌下倒入3500ml冰水中。黃色懸浮液用總量3300ml二氯曱烷(1500mlx1;和900mlx2)萃取3次。合并的萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥8小時(shí)。在過(guò)濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器分離溶劑。剩余物用色譜法分離。將粗的9-硝基喜樹堿在無(wú)水乙醇中回流2-4小時(shí)。用從乙醇中再沉淀得到的純產(chǎn)物(9NC)是淺黃色粉末，(mp268。C,收率20%)NMR:1.05(3H,t,J二7.40Hz,C19-甲基質(zhì)子)，1.92(2H,m,C18-亞曱基質(zhì)子)，3.82(1H,s,C20-OH),5.40(2H,s，C5-亞甲基質(zhì)子)，5.55(2H,dd,J=14.21Hz,14.21Hz,C17-亞曱基質(zhì)子)，7.70(1H,s,C14-H)，7.92(1H,t，J=8.40Hz,Cll鄰,8.48(1H,d,風(fēng)35Hz,C10-H),8.55(1H，d,J=8.35Hz,C12-H),9.36(1H，s,C7-H);massm/e(相對(duì)強(qiáng)度)393(M+,100%),364(M-C2H5,35%),349(48%)，334(25%),320(25%),293(35%),274(8%),262(8%),246(15%)，234(6%),218(20%)，205(8%),190(9%),177(5%),164(3%),151(3%),137(5%),123(4%),109(5%),95(5%)，75(3%),60(23%);精密質(zhì)i普393.096(實(shí)驗(yàn)值)，393.096(C2。H,sN306計(jì)算值)。實(shí)施例119一硝基喜樹堿的HPLC的純度分析儀器由貝克曼控制器組成的HPLC系統(tǒng)，所述控制器有兩個(gè)110A泵和2ml定量注射管。UV檢測(cè)器是SPD-110AV型檢測(cè)器(Shimadzu,Kyoto,日本)。HPLC檢測(cè)器用于監(jiān)測(cè)在220nm的UV吸收。分析用的集中軟件是EZCChrome(Shimadzu,日本)和FLO-ONe/beta(Ra-diomaticInserumenes,Meridian,CT)。C-8Microsorb來(lái)自RaininInserument(Woburn,MA)。HPLC分析試樣的反相HPLC分析用乙腈-乙酸乙酯-水流動(dòng)相體系進(jìn)行。分析在室溫下以流速lml/min進(jìn)行。9NC濃度約O.lmg/ml乙腈溶液用將其溶于所述溶劑中制備。取出一份上述溶液300ia1,加入700|110.1%乙酸水溶液中。在振動(dòng)約10秒后，通過(guò)2ml管將上述溶液注入柱中，用70%含有0.1%乙酸的水和30%乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行色:^普分析第一個(gè)5分鐘。然后流動(dòng)相梯度在4分鐘周期內(nèi)按程序升至100%乙腈。在15分鐘內(nèi)得到完全的HPLC譜圖。9NC純度通過(guò)測(cè)定在254nm的UV峰面積和計(jì)算與9NC峰有關(guān)的百分?jǐn)?shù)決定。9NC純度至少96%。在這些條件下9-硝基喜樹堿的保留時(shí)間約6.5分鐘。表1.在不同溶劑中喜樹堿用KN03的硝化a<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a.喜才對(duì)石咸0.5g,;肖酉臾確甲0.5g,;容劑30ml,反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)，反應(yīng)溫度二!ll溫cb.TFAA表示三氟乙酐。c.%CPT表示喜樹堿％回收率和CPT表示喜樹堿。d.9NC表示9-硝基喜樹堿和12NC表示12-硝基喜樹石成。表2.在硫酸中喜樹堿用各種硝酸鹽的硝化<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>BiON〇3111748241/1.528Cu(N03)22.5H2022531241/2.475Hg(N03)2H2022431351/2.065Ca(N03)24H2020491301/2.569Ba(N03)217543201/3.271Zn(N03)26H20214419161Z2.165Mg(N03)26H2023459231/2.068Co(N03)26H2021410381/2.062Sr(N03)222361411/1.658Pb(N03)2185013191/2.868A1(N03)39H2017461361/2.763Fe(N03)39H2023510261/2.274Cr(N03)39H20132846131/2.241La(N03)36H2011342541/3.145a.對(duì)每個(gè)反應(yīng)喜樹堿0.5g(0.0014mo1),H2SO4:20ml,硝酸鹽0.0070mol.72小時(shí)，和室溫。表3.在硫酸中喜樹堿用兩種不同硝酸鹽組合物的硝化<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a.對(duì)每個(gè)反應(yīng)喜樹堿4.0g(0.0115mol),硫酸lOOml，72小時(shí)、和室溫。b.A(N03)m與B(N03)n的摩爾比2.0:1.0。c.K/Cu表示相應(yīng)的KN03/Cu(N〇3)22.5H20，同樣用于其他組合物。表4在硫酸中喜樹堿用三個(gè)或更多個(gè)硝酸鹽組合物的硝化<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a.對(duì)每個(gè)反應(yīng)喜樹堿4.0g(0.0115mol)，硫酸100ml,72小時(shí)，和室溫。b.在試劑的組合物中所有硝酸鹽的摩爾比是1:1:1。c.K/TI/Cu表示相應(yīng)的KN03/TlN03/Cu(N03)22.5H20，同樣用于其他試劑。表5.在硫酸中喜樹堿用不同比例的KN03和TION03組合物的硝化a<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a.喜斗對(duì)石威4.0g,硝酸鉀2.0g,石肖酸鉈4.0g，反應(yīng)時(shí)間72小時(shí)，反應(yīng)溫二室溫o當(dāng)然，前面的一般說(shuō)明和后面的詳細(xì)說(shuō)明僅是示例性的和說(shuō)明性的和用來(lái)提供要求保護(hù)的本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明。權(quán)利要求1.制備9-硝基喜樹堿的方法，包括在足以生成所述9-硝基喜樹堿的溫度和時(shí)間下，將20-喜樹堿與至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽和至少一種對(duì)催化生成硝離子有效的酸反應(yīng)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述20-喜樹堿是外消旋的20-喜樹堿或20(S)-喜樹堿。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述20-喜樹石成是20(S)-喜樹堿，且所述9-硝基喜樹堿是9-硝基-20(S)-喜樹堿。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述酸是硫酸、三氟乙酸或三氟乙酐。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽是KN03;NH4N03;LiN03;AgN03;T1N03;BiON03;Cu(N03)2.2.5H20;Hg(N03)2'H20;Ca(N03)2.4H20;Ba(N03)2;Zn(N03)2.6H20;Mg(N03)2,6H20;Co(N03)26H20;Sr(N03)2;Pb(N03)2;A1(N03)39H20;Fe(N03)3奶20;Cr(N03)3"9H20;La(N03)3.6H20;或其混合物。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽是至少兩種無(wú)機(jī)硝酸鹽的混合物。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽包括KNO3和至少一種其他無(wú)機(jī)硝酸鹽。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述無(wú)機(jī)硝酸鹽包括KN03和Cu(N03)2.2.5H20;KN03和HN03;KN03和Hg(N03)2.H20;KN03和Ca(N03)24H20;KN03和Ba(N03)2;KN03和Zn(N03)26H20;KN03和Sr(N03)2;KN。3和Pb(N03)2;KN03和A1(N03)3.9H20;KN03和Fe(N03)39H20;LiN03和Hg(N03)2.H20;LiN03和Cu(N03)22.5H20;LiN〇3和Co(N03)26H20;AgN03和Cr(N03)39H20;Cu(N03)2.2.5H2〇和Fe(N03)3.9H20;Hg(N03)2H20和Fe(N03)3.9H20;NH4N03和Cu(N03)2.2.5H20;KN03、頂03和Cu(N03)22.5H20;KN03、T1N03和Zn(N03)2'6H20;KN03、T1N〇3和Pb(N03)2;KN03、Cu(N03)2.2.5H20和Fe(N03)3.9H20;KN03、LiN03、Cu(N03)2'2.5H20、Hg(N03)2.H20和Zn(N03)2,0;KN03、LiN03、Cu(N03)2'2.5恥、Hg(N03)2'H20和Fe(N03)39H20;KN03、LiN03、AgN03、Cu(N03)2■2.5H20、Hg(N03)2H20和Fe(N03)3■9H20;KN03、LiN03、Zn(N03)2.6H20、Cu(N03)2■2.5H20、Hg(N〇3)2H20和Fe(N03)39H20;或KN03、Zn(N03)2.6H20、Cu(N03)2■2.5H20、Hg(N03)2.H20和Fe(N03)39H20。9.權(quán)利要求l的方法，還包括用柱色譜提純9-硝基喜樹堿的步驟。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述柱色譜用含有四氫呋喃和二氯曱烷的洗脫液進(jìn)4亍。11.權(quán)利要求l的方法，還包括用從乙醇中再沉淀提純9-硝基喜樹堿。12.9-硝基喜樹堿，其熔點(diǎn)為268。C,其中該9-硝基喜樹堿具有如下特征1)'HNMR:1.05(3H,t,J=7.40Hz,C19-曱基質(zhì)子)，1.92(2H，m,C18-亞曱基質(zhì)子)，3.82(1H,s,C20-OH),5.40(2H,s,C5-亞曱基質(zhì)子)，5.55(2H,dd,J=14.21Hz,14.21Hz,C17-亞曱基質(zhì)子),7.70(1H,s,C14鄰,7.92(1H，t,J=8.40Hz,Cll-H),8.48(1H,d,J=8.35Hz，C10-H),8.55(1H，d,J=8.35Hz,C12鄰，9.36(1H,s,C7-H);2)質(zhì)譜m/e(相對(duì)強(qiáng)度)393(MT",100%),364(M-C2H5，35%),349(48%)，334(25%),320(25%)，293(35%),274(8%),262(8%)，246(15%),234(6%),218(20%),205(8%),190(9%),177(5。/。)，164(3%),151(3%),137(5%),123(線)，109(5%),95(5%)，75(3%),60(23%);精密質(zhì)譜:393.096(實(shí)驗(yàn)值),393.096(C2。H!5N306計(jì)算值)。13.含權(quán)利要求12的9-硝基喜樹堿的組合物。14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述9-硝基喜樹堿是由乙醇作為起始溶劑的純化過(guò)程形成的。15.權(quán)利要求13的組合物，該組合物是用于治療癌癥的組合物。16.權(quán)利要求12的9-硝基喜樹堿的純化方法，包括用乙醇作為起始溶劑使9-硝基喜樹堿進(jìn)行純化過(guò)程，所形成的9-硝基喜樹堿的熔點(diǎn)為268。C。全文摘要本發(fā)明公開了制備9-硝基喜樹堿的方法，包括20-喜樹堿與至少一種無(wú)機(jī)硝酸鹽反應(yīng)并用至少一種對(duì)催化生成硝離子有效的酸，其中反應(yīng)在足以生成9-硝基喜樹堿的溫度和時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明還公開了用柱色譜或再沉淀提純9-硝基喜樹堿的方法。文檔編號(hào)A61K31/4375GK101186609SQ20071016259公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期1998年7月10日優(yōu)先權(quán)日1997年8月5日發(fā)明者曹志松申請(qǐng)人:斯特林癌癥研究基金會(huì)