專利名稱：：轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)-蛙卵核糖核酸酶(Onconase)偶聯(lián)物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：蛙卵核糖核酸酶(Onconase又稱P30protein,Ra叩irnase，簡稱One)是從豹蛙(Ranapipiens)卵母細(xì)胞和早期胚胎中分離的一種核酸酶，屬于RNaseA超家族。研究表明，0nc通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在胞漿內(nèi)選擇性地降解tRNA，抑制蛋白合成進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和引起細(xì)胞凋亡。體外實驗表明，One對多種腫瘤細(xì)胞具有抗增殖和細(xì)胞毒性作用，如人的前列腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞等。小鼠模型的體內(nèi)實驗證明，One可以抑制腫瘤生長，延長小鼠存活時間，增強(qiáng)多種抗腫瘤藥物的效果。目前，One作為一種抗惡性間質(zhì)細(xì)胞瘤的藥物已經(jīng)進(jìn)入三期臨床，可能是一種潛在的具有良好前景的抗腫瘤藥物。但由于該蛋白為非人源性蛋白，因此在人體中使用時仍會產(chǎn)生一定的免疫反應(yīng)和副反應(yīng)(如腎損傷)，同時Onc對于一些正常細(xì)胞也有一定的殺傷效果，要克服這些缺點(diǎn)就需要增強(qiáng)One對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用，提高Onc進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率。因此，仍需要提高0nc特異性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，以減少其副作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)-蛙卵核糖核酸酶(Onconase)偶聯(lián)物。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的制備方法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)-蛙卵核糖核酸酶(Onconase)偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物含有l(wèi)個轉(zhuǎn)鐵蛋白和l-5個與所述轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的(優(yōu)選的是2-4個；更優(yōu)選2-3個)蛙卵核糖核酸酶，所述偶聯(lián)物的分子量在89-137KD。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列；或者所述的蛙卵核糖核酸酶具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)物是用以下方法制得的(1)利用N-羥基琥珀酰亞胺3-P-吡啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)和2-IminothiolaneHCl(也稱為Traut試劑)將轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(2)分離獲得所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物。在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的方法，所述方法包括(1)利用N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯和2-IminothiolaneHC1將轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(2)分離獲得所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括(a)將轉(zhuǎn)鐵蛋白與N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯接觸，獲得經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白；(b)將蛙卵核糖核酸酶與2-IminothiolaneHC1接觸，獲得經(jīng)2-IminothiolaneHC1處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白；(c)將步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和歩驟(b)獲得的經(jīng)2-Iminothiolane'HCl處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白混合，從而使得轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(d)收集分子量為89-137kD的偶聯(lián)物。在另一優(yōu)選例中，經(jīng)離子交換去除游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白和Onc，從而收集分子量為89-137kD的偶聯(lián)物。在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白與N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯的摩爾比是l:(5-10)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，蛙卵核糖核酸酶與2-Iminothiolane*HC1的摩爾比是l:(5-10)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和步驟(b)獲得的經(jīng)2-IminothiolaneHC1處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白的摩爾比是l:(1-4)。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和步驟(b)獲得的經(jīng)2-Iminothiolane'HC1處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白的摩爾比約是l:3。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的用途，用于制備抑制腫瘤的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤是高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤。在本發(fā)明的第四方面，提供一種抑制腫瘤的組合物，所述的組合物含有.-(i)有效量的所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的第五方面，提供一種體外(優(yōu)選非治療性地)抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述的方法包括利用所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物處理腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖115%SDS-PAGE凝膠電泳顯示了本發(fā)明蛙卵核糖核酸酶表達(dá)純化效果蛋白凝膠圖。其中，泳道1為誘導(dǎo)前菌體總蛋白；泳道2為誘導(dǎo)2.5h后菌體總蛋白；泳道3為誘導(dǎo)后菌體包涵體；泳道4為復(fù)性并純化后Onc(上樣量2pg);泳道5為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道6為RNaseA純品(上樣量1.5貼)。圖2(a)15y。SDS-PAGE凝膠電泳顯示了轉(zhuǎn)鐵蛋白與蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)效果蛋白凝膠圖。其中，泳道1為非還原的One純品(上樣量2pg);泳道2為非還原的Tf純品(上樣量2ng);泳道3為非還原的Onc-Tf(上樣量4pg);泳道4為還原的One純品(上樣量2|ag);泳道5為還原的Tf純品(上樣量2pg);泳道6為還原的Onc-Tf(上樣量4pg);泳道7為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2(b)10%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)一步顯示了轉(zhuǎn)鐵蛋白與蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)蛋白分子量分布。其中，泳道1為非還原的Tf純品(上樣量2pg);泳道2為非還原的One-Tf(上樣量4pg);泳道3為還原的Tf純品(上樣量2pg);泳道4為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3顯示了MTT法檢測采用SPDP和2-IminothiolaneHC1作為偶聯(lián)劑獲得的Tf-0nc偶聯(lián)物和One對小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞毒性效果圖。圖4顯示了MTT法檢測單單采用SPDP作為偶聯(lián)劑獲得的Tf-0nc偶聯(lián)物和One對小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞毒性效果圖。圖5顯示了MTT法檢測采用SPDP和2-IminothiolaneHC1作為偶聯(lián)劑獲得的Tf-One偶聯(lián)物和One對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞毒性效果圖。具體實施例方式針對目前現(xiàn)有技術(shù)中蛙卵核糖核酸酶對于腫瘤細(xì)胞的特異性不高，造成殺傷一些正常細(xì)胞的缺陷，本發(fā)明人經(jīng)廣泛的研究以及反復(fù)的選擇和試驗，首次制成了一種高度純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物。在該偶聯(lián)物中，轉(zhuǎn)鐵蛋白可通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的胞體轉(zhuǎn)運(yùn)作用進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞，將蛙卵核糖核酸酶帶入腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。本發(fā)明的偶聯(lián)物中，每個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上偶聯(lián)有1-5個蛙卵核糖核酸酶，因此分子大小適中，易于穿透腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的主旨在于利用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物載體，將Onc輸送到這些腫瘤細(xì)胞的表面，可以增強(qiáng)Onc的內(nèi)吞，改善它的專一性，從而擴(kuò)大Onc治療腫瘤的范圍，增強(qiáng)藥效并減少其副作用。本發(fā)明主要基于許多腫瘤細(xì)胞代謝旺盛，高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的特點(diǎn)(通常腫瘤細(xì)胞表達(dá)10,000至100,000個TfRl，而TfRl在正常細(xì)胞上低表達(dá)或者未檢測到有表達(dá)，參見2MW6"J/7"Md力^等，7krgeteWr〃gJeh'Ke/yt力etra;7s/errj'刀receptor—ynea7atec/e/c/ocytosispat/Fra,尸/an/7acoJ/er《7_5《7,iW》，將轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)，該偶聯(lián)物兼具有兩者的生物學(xué)功能，既可通過轉(zhuǎn)鐵蛋白將該偶聯(lián)物特異性地結(jié)合到高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤細(xì)胞上，通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，該偶聯(lián)物利用蛙卵核糖核酸酶的細(xì)胞毒性作用，殺死細(xì)胞。所以該偶聯(lián)物可以特異性地結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，大大提高蛙卵核糖核酸酶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率和殺腫瘤細(xì)胞的特異性，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果、減少蛙卵核糖核酸酶的副作用。本發(fā)明的偶聯(lián)物特別適合于各種高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體類型的腫瘤的治療，例如(但不限于)腦瘤、白血病等的治療。轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,簡稱Tf)是一種分子量約為77kD，可與鐵離子結(jié)合的糖蛋白。結(jié)合了鐵離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白可特異性地與其受體(TransferrinRec印tor1，簡稱TfRl)結(jié)合，介導(dǎo)鐵離子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。TfRl在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，因而可轉(zhuǎn)運(yùn)更多的轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明中，所用的轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動物。此外，所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白。任何適合的轉(zhuǎn)鐵蛋白均可用于本發(fā)明。所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白包括全長的轉(zhuǎn)鐵蛋白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基酸序列可以與SEQIDN0:2所示的序列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。轉(zhuǎn)鐵蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。任何一種轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的轉(zhuǎn)鐵蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長轉(zhuǎn)鐵蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長轉(zhuǎn)鐵蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的轉(zhuǎn)鐵蛋白，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的轉(zhuǎn)鐵蛋白。所述經(jīng)過修飾或改良的轉(zhuǎn)鐵蛋白或者基因可以是與天然存在的轉(zhuǎn)鐵蛋白或基因雖然具有一定的不同點(diǎn)，但也能抑制腫瘤細(xì)胞，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物活性或者說是基因的生物功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是獲自商業(yè)購買的途徑，作為本發(fā)明的一個實例，所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白購自CALB10CHEM。蛙卵核糖核酸酶所述的蛙卵核糖核酸酶是一種對于抑制腫瘤細(xì)胞有用的酶，其可在胞漿內(nèi)選擇性地降解tRNA,抑制蛋白合成進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和引起細(xì)胞凋亡。在本發(fā)明中，所用的蛙卵核糖核酸酶可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動物。此外，所述的蛙卵核糖核酸酶也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組蛙卵核糖核酸酶。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的蛙卵核糖核酸酶。任何適合的蛙卵核糖核酸酶均可用于本發(fā)明。所述的蛙卵核糖核酸酶包括全長的蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列可以與SEQIDNO:4所示的序列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的蛙卵核糖核酸酶的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。蛙卵核糖核酸酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。任何一種蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，蛙卵核糖核酸酶的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的蛙卵核糖核酸酶的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長蛙卵核糖核酸酶的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長蛙卵核糖核酸酶的60%、70%、80%、90°/。、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的蛙卵核糖核酸酶，比如，可采用為了延長其半衰期、改善其穩(wěn)定性或增強(qiáng)其殺傷腫瘤細(xì)胞能力而加以修飾或改良的蛙卵核糖核酸酶。所述經(jīng)過修飾或改良的蛙卵核糖核酸酶或者基因可以是與天然存在的蛙卵核糖核酸酶或基因雖然具有一定的不同點(diǎn)，但也能殺傷腫瘤細(xì)胞，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響蛙卵核糖核酸酶的生物活性或者說是基因的生物功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的一個實例，所述的蛙卵核糖核酸酶是重組表達(dá)的，所述的蛙卵核糖核酸酶的編碼基因全長315bp，編碼104個AA的一個多肽，該基因如SEQIDNO:3所示，其編碼的蛋白如SEQIDNO:4所示。所述的蛙卵核糖核酸酶可通過常規(guī)的基因工程方法生產(chǎn)，一般來說有以下步驟(1).用含有蛙卵核糖核酸酶編碼基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。10偶聯(lián)物本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的分子量在89-137KD，并且，每個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上偶聯(lián)有l(wèi)-5個蛙卵核糖核酸酶。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞的分子必需滿足一定的大小，如果轉(zhuǎn)鐵蛋白上偶聯(lián)的蛙卵核糖核酸酶分子過多，不僅導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)過大，還會影響到轉(zhuǎn)鐵蛋白與腫瘤細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合，效果不理想；如果多個轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)一個或多個蛙卵核糖核酸酶，則導(dǎo)致分子體積過大，難以穿透血管壁而進(jìn)入到腫瘤組織內(nèi)。因此，在制備偶聯(lián)物的過程中，需要控制獲得的偶聯(lián)物含有一個轉(zhuǎn)鐵蛋白(約77KD)以及1或若干個(優(yōu)選1-5個)蛙卵核糖核酸酶(約12KD)，以使得偶聯(lián)物能夠順利地進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。考慮到偶聯(lián)物的大小以及殺傷腫瘤細(xì)胞的效力，優(yōu)選的是每個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上偶聯(lián)有2-4個蛙卵核糖核酸酶；更優(yōu)選的是每個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上偶聯(lián)有2-3個蛙卵核糖核酸酶。本發(fā)明還提供了所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的用途，用于制備抑制腫瘤(腫瘤細(xì)胞)的組合物。優(yōu)選的，所述的腫瘤是高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)水平越高，本發(fā)明的偶聯(lián)物的效果越好。偶聯(lián)物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，單采用SPDP作為偶聯(lián)劑來制備轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物，獲得的偶聯(lián)物隨機(jī)性大、結(jié)構(gòu)不一，分子量大小差別較大，不利于純化，且偶聯(lián)物進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞的比例低。本發(fā)明人進(jìn)行了長期的研究和改進(jìn)，找到了一種可制備符合要求的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的方法，所述方法包括(1)利用N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-卩比啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)和2-IminothiolaneHC1將轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(2)分離獲得所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述方法包括(a)將轉(zhuǎn)鐵蛋白與N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)接觸，獲得經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白；(b)將蛙卵核糖核酸酶與2-IminothiolaneHC1接觸，獲得經(jīng)2-IminothiolaneHC1處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白；(c)將步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和步驟(b)獲得的經(jīng)2-Iminothiolane'HCl處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白混合，從而使得轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(d)收集分子量為89-137kD的偶聯(lián)物。將轉(zhuǎn)鐵蛋白用N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理后與經(jīng)過2-Iminothiolane處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，其結(jié)果獲得的大多偶聯(lián)產(chǎn)物分子量大小在89-137KD，也即大多數(shù)的偶聯(lián)物中含有l(wèi)個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子(約77KD)和1-5個蛙卵核糖核酸酶分子(1個蛙卵核糖核酸酶分子約12KD)。該偶聯(lián)物具有良好的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力以及良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。并且，所述的偶聯(lián)物由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且分子量較集中地處于一定范圍內(nèi)，還有利于后續(xù)的純化。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，偶聯(lián)劑處理時，轉(zhuǎn)鐵蛋白與偶聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯的摩爾比是l:(5-10)，蛙卵核糖核酸酶與偶聯(lián)劑2-IminothiolaneHC1的摩爾比是1:(5-10)，按照該比例進(jìn)行處理可在最終獲得更為理想的偶聯(lián)產(chǎn)物。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(c)中，步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和步驟(b)獲得的經(jīng)2-Iminothiolane處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白的摩爾比是l:(2-4);更優(yōu)選的摩爾比約是l:3。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在采用SPDP處理轉(zhuǎn)鐵蛋白后，為了去除雜質(zhì)并保留經(jīng)處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白，可采用常規(guī)的純化方法進(jìn)行純化，所述的純化方法包括但不限于層析法、透析法。此外，在采用2-IminothiolaneHC1處理蛙卵核糖核酸酶后、或在經(jīng)偶聯(lián)劑處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白與經(jīng)偶聯(lián)劑處理的蛙卵核糖核酸酶混合并發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)后也可進(jìn)行純化以獲得較純的中間產(chǎn)物或產(chǎn)品。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(d)中，采用強(qiáng)陽離子交換層析去除游離的轉(zhuǎn)鐵蛋白和Onc，從而收集分子量為89-137kD的偶聯(lián)物。所述離子交換方法得率高、純度高。偶聯(lián)產(chǎn)物的鑒定可采用本領(lǐng)域常用的技術(shù)，例如電泳，通過觀察電泳條帶的位置和大小來判斷所獲得的偶聯(lián)物是否是所需要的。藥物組合物本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤的組合物，所述的組合物含有(i)有效量(如0.00001-50uM)的本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，"藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟矢口的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N,J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等?？蓪⑺龅慕M合物制成各種適合于哺乳動物給藥的劑型，所述劑型包括但不限于注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑。本發(fā)明的組合物可直接用于殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明的偶聯(lián)物中，轉(zhuǎn)鐵蛋白可通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用將蛙卵核糖核酸酶帶入腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)了蛙卵核糖核酸酶對于腫瘤細(xì)胞的殺傷能力和特異性。(2)本發(fā)明的偶聯(lián)物中，每個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上偶聯(lián)有l(wèi)-5個蛙卵核糖核酸酶，因此分子大小適中，易于穿透腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞。(3)本發(fā)明的偶聯(lián)物基本不混有未經(jīng)偶聯(lián)的游離轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶，保證了藥物的作用完全由本發(fā)明的偶聯(lián)物產(chǎn)生。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊O(shè)VerCoJ(/SprjV^j^LT力orZaZoraz^2TY9《51)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例10nc蛋白制備1.表達(dá)0nc質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)SEQIDNO:3所示的序列，全序列合成One蛋白的編碼序列，設(shè)計兩端引物如下5，引物為CCCAGGACTGGCTGACTTTCCA(SEQIDNO:5);3'引物為AAAGTCGACTCAGCAAGAACCAACACC(SEQIDNO:6);以前述合成的基因序列為模板，以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sail酶切后克隆到pET22b(+)載體(Novagen)的Mscl和Sail位點(diǎn)間，得到可表達(dá)One的表達(dá)質(zhì)粒。2.Onc蛋白表達(dá)將前述構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，隔夜挑單克隆于50mlLB培養(yǎng)基中，于37t:培養(yǎng)過夜。次日按l:20轉(zhuǎn)接1LTB培養(yǎng)基，于37。C培養(yǎng)至0D柳產(chǎn)2.0,力PIPTG濃度至0.5mM誘導(dǎo)3.5小時，4°C、6000rpm離心10分鐘，收集菌體，菌體用于下一步的包涵體收集和純化。3.包涵體洗滌將收集到的菌體懸浮在緩沖液SSB_A(20mMTris-HCl,10mMEDTA,pH8.0)中，用超聲波破碎儀破碎菌體；4°C，12000rpm離心10分鐘，收集包涵體；WIBB1(20mMTris-HCl，pH8.0，10mMEDTA，2%TritonX-100和2M尿素，pH8.0)溶液懸浮包涵體，振蕩洗滌，4°C，12000rpm離心IO分鐘，收集包涵體，重復(fù)該步驟三次；WIBB2(20mMTris-HCl，lOmMEDTA，pH8.0)溶液懸浮包涵體，振蕩洗滌(可用低功率超聲波助洗)，4°C、12000rpm離心10分鐘，收集包涵體；重復(fù)該步驟2-3次。4.包涵體溶解和復(fù)性將1L菌液得到的包涵體溶解于6mlDIBB(20mMTris-HCl，7M鹽酸胍，10mMDTT，10mMEDTA，pH8.0)溶液中，充氮?dú)馐覝胤胖?h;4°C、12000rpmX15min，離心收集上清，將蛋白定量至濃度為20mg/ml;將lml包涵體溶液迅速稀釋到50mlDB(20mM醋酸)溶液中，4°C，12000rpmX30min離心棄沉淀；用DB透析除去變性劑；向溶液中加入20XRB(100mMTris-AcOH，100mMNaCl，3.0niM還原型谷胱甘肽，0.6mM氧化型谷胱甘肽，pH8.0)，并調(diào)節(jié)pH=8.0，4'C，12000rpmX30min離心除去沉淀；在復(fù)性緩沖液RB溶液中4。C復(fù)性3648小時，4°C，12000轉(zhuǎn)20min除去復(fù)性過程產(chǎn)生的蛋白沉淀；上清透析去鹽后，蛋白溶液存于4'C備用。5.陽離子交換柱層析純化將復(fù)性好的蛋白溶液定量后上強(qiáng)陽離子交換柱。(1)層析柱為SPS印harose(2X2cm，Pharmacia),流動相為LB(10mM磷酸緩沖液(pH6.O))和WB(1MNaCl，10mM磷酸緩沖液(p朋.0))，流速lml/min。洗脫方法100。/。WB洗脫30個柱體積并分步收集，考馬斯亮蘭G250檢測含有蛋白的樣品。收集含有蛋白的樣品并用透析液10mM磷酸緩沖液(p服.0)去鹽后，備用。(2)將去鹽后的樣品溶液定量過強(qiáng)陽離子交換柱。層析柱為預(yù)裝柱MonoS(服5/5，lml，p力a價"'a)，流動相為LB(10mM磷酸緩沖液(p朋.O))和WB(1MNaCl，10mM磷酸緩沖液(pH6.O))，流速lml/min。洗脫方法0-100%TO洗脫20個柱體積并分步收集，收集相當(dāng)于20%左右處的蛋白峰。對制備One蛋白過程中各階段的產(chǎn)物(包括誘導(dǎo)前菌體總蛋白(泳道1)、誘導(dǎo)2.5小時后菌體總蛋白(泳道2)、誘導(dǎo)后菌體包涵體(泳道3)、復(fù)性并純化后0nc(泳道4)等)進(jìn)行常規(guī)的15%SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖l所示。實施例2轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf和核糖核酸酶One偶聯(lián)物制備A.采用SPDP和2-Iminothiolane進(jìn)行偶聯(lián)1.Tf(購自CALBIOCHEM，批號為Cat:616397，粉末狀，其氨基酸序列15如SEQIDNO:2)溶于PBS(pH7.4)使之終濃度為20mg/ml，每ml加入50W(相當(dāng)于按照摩爾比約Tf的IO倍量)50mMSPDP，快速混勻，反應(yīng)30min后，用脫鹽柱HiTrapDesalting(5X5ml，Pharmacia)分離，流動相為PBS(pH7.4)，分步收集，10y。SDS-PAGE檢測結(jié)果，留出蛋品樣品備用。2.將經(jīng)前述制備和純化的One蛋白溶于20mM磷酸緩沖液(pH6.0)使之終濃度為lmg/ml，力口入16.67W50mM2-IminothiolaneHC1(Promega，相當(dāng)于按照摩爾比約為One的IO倍量)，快速混勻，反應(yīng)1小時后，透析去除小分子。3.Onc和Tf按照摩爾數(shù)比3:l將兩者混合，4'C過夜。4.過夜后的樣品上分子篩柱S叩erdex7510/300GL(Pharmacia)，流動相為20mMNaHP04，p朋.0，分離去除小分子蛋白，留大分子蛋白混合物備用。5.大分子蛋白混合物上離子交換柱MonoS(HR5/5,lml，/^ar/rach)。MonoS用lOmM磷酸緩沖液(p朋.O)平衡，用0-lMNaCl梯度洗脫，流速lml/min，分離去除未反應(yīng)的Tf，同時洗脫偶聯(lián)物，并濃縮偶聯(lián)產(chǎn)物。6.還原與未還原處理樣品進(jìn)行15%SDS-PAGE和1(F/。SDS-PAGE鑒定以等體積比例將樣品分別和還原試劑(0.1MTris-HCL(pH6.8);20%甘油;4%SDS;0.005。/。(W/V)溴酚藍(lán)；10%2-巰基乙醇)及非還原試劑(O.1MTris-HCL(p朋.8);20%甘油；4%SDS;0.005。/。(W/V)溴酚藍(lán))混合制成蛋白電泳樣品進(jìn)行電泳鑒定。檢測結(jié)果見圖2，圖2(a)是15y。SDS-PAGE凝膠電泳，泳道1為非還原的One純品；泳道2為非還原的Tf純品；泳道3為非還原的Onc-Tf;泳道4為還原的Onc純品；泳道5為還原的Tf純品；泳道6為還原的Onc-Tf;泳道7為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2(b)是10。/。SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)一步顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白與蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)蛋白分子量分布。B.單采用SPDP進(jìn)行偶聯(lián)本實施例中，單單采用SPDP偶聯(lián)Tf和One蛋白。如前述方法，將Tf和One蛋白分別稀釋配制成濃度為20mg/ml和lmg/ml的蛋白溶液，并調(diào)pH至7.4備用。1、每個樣品lml與分別與10倍分子過量SPDP反應(yīng)，快速混勻，獲得One-PDP，室溫放置30min后透析除去小分子。2、加終濃度為2mMDTT還原Onc-PDP，室溫放置lh;用p服.0PBS透析除去DTT。3、BCA測定蛋白，按摩爾數(shù)比3:l將Onc與Tf混合，4'C過夜。對前述偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果表明，該種偶聯(lián)方法得到高聚物(即多個(多于2個)Tf分子之間，或者多個(多于2個)Tf分子與多個(多于l個)Onc之間偶聯(lián)的情況)比例較大。實施例3Onc-Tf和One對骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的細(xì)胞毒性作用比較A.采用實施例2中A項所制備的偶聯(lián)物骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(購自ATCC)培養(yǎng)于含10%小牛血清，青霉素(IOO單位/ml)，鏈霉素(IOO貼/ml)RPMI1640(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加90nl培養(yǎng)液(5X104細(xì)胞/ml)，C02(5。/。)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時后，除去培養(yǎng)液，并用預(yù)冷的PBS洗滌一次后，加入90pl無血清培養(yǎng)液(青霉素(lOO單位/ml)，鏈霉素(100pg/ml)RPMI1640)。按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(實施例2中A項所制備的Onc-Tf偶聯(lián)物)IO對照組加PBS，培養(yǎng)2小時后，補(bǔ)加等體積20%小牛血清。隨后培養(yǎng)70小時后，常規(guī)的MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖3所示，可見Onc-Tf對骨髓瘤細(xì)胞的毒性作用顯著強(qiáng)于Onc，比One高2000倍。B.采用實施例2中B項所制備的偶聯(lián)物骨髓瘤SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100pg/ml)RPMI1640(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加90pl培養(yǎng)液(5X104cells/ml)，<302(5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，除去培養(yǎng)液，并用預(yù)冷的PBS洗滌一次后，加入90nl無血清培養(yǎng)液(青霉素(100單位/ml)，鏈霉素(100Hg/ml)RPMI1640)。按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(實施例1中制備的Onc純品和實施例2中B項所制備的Onc-Tf偶聯(lián)物)10pl，對照組加PBS，培養(yǎng)2小時后，補(bǔ)加等體積20%小牛血清。隨后培養(yǎng)70h后，常規(guī)的MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖4所示，表明用B項所述方法制備的Onc-Tf偶聯(lián)物對骨髓瘤細(xì)胞的毒性作用僅比Onc高10倍左右。實施例4Onc-Tf和Onc對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y的細(xì)胞毒性作用比較神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y(ATCC)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，青霉素(IOO單位/ml)，鏈霉素(IOOpg/ml)DMEM(GIBICO)培養(yǎng)基中。96孔板培養(yǎng)，每孔加90培養(yǎng)液(5X104細(xì)胞/ml)，(302(5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，除去培養(yǎng)液，并用預(yù)冷的PBS洗滌一次后，加入90pl無血清培養(yǎng)液(青霉素(IOO單位/ml)，鏈霉素(IOO^g/ml)DMEM)。按設(shè)定的濃度梯度加蛋白樣品(實施例1中制備的One純品和實施例2中A項所制備的Onc-Tf偶聯(lián)物)IOpl，對照組加PBS，培養(yǎng)2小時后，補(bǔ)加等體積20%胎牛血清。隨后培養(yǎng)70h后，MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖5所示，可見Onc-Tf對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的毒性作用顯著強(qiáng)于Onc，至少比One高100倍。實施例5組合物將實施例2中A項獲得的Onc-Tf偶聯(lián)物lml配制于100ml的常規(guī)生理鹽水中，獲得含有Onc-Tf偶聯(lián)物的組合物。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，上海南方模式生物研究中心<120>轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物及其制法和用途<130〉074819<160〉6<170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211〉2097<212〉DNA<213〉智人(HomoSapies)<400>1atgaggctcgccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctggctgtc60ctgtg卿tggtgtgcagtgtcggagcatgaggccactaagtgcc卿gt120ttccgcgaccatatgaaaagcgtCEittccatccgatggtccc躬tgUgcttgtgtgaag1803犯gcctcctaccttgattgcatcsgggccattgcggc^acgaagcggatgctgtgaca240ctggatgcaggtttggtgtatgatgcttacctggctcccagcctgtggtg300gcagagttctcagactttctattatgctgttgctgtggtg36033gaaggatagtggcttccagatgaaccagcttcgaggcaagai3gtcctgccacacgggt420ctaggcaggtccgctgggtggaacatccccataggcttactttactgtgacttacctgag480ccacgtaaacctcttgagaaagcagtggccaatttcttctcgggcagctgtgccccttgt540gcggatgggacggacttcccccagctgtgtcaactgtg"tccagggtgtggctgctccacc600cttaaccaatacttcggctactcgg眺ccttcaagtgtctg卿gatggtgctg鵬at660gtggcctttgtcaagcactcgactatatttg柳acttggC幼3C33ggCtgacagggac720cagtatgagctgctttgcctggac犯cacccggaagccggcaaggactgc780cacttggcccaggtcccttctcataccgtcgtggcccgaagt3tgggCggC卿g3gg3C840ttgatctgggagcttctcaaccaggcccaggaacattttggcaaagacaa900ttccaactattcagctctcctcatgggaaggacctgctgtttaaggactctgcccacggg960tttttaaaagtcccccccaggatggatgcc3agatgtacctgggctatgagtatgtcact1020gccatccggaatctacgggaaggcacatgcccagaagcccatgcaagcct1080gtgaagtggtgtgcgctgagccaccacgagaggctc犯gtgtgatg3gtggagtgttaac1140aaatagagtgtgtatcagcagagaccaccgaagactgcatcgcc犯gatc1200aagctgatgcmg3gcttgg"gg鄉(xiāng)gtttgtctacatagcgggcaag1260tgtggtctggtgcctgtcttggcagaaaacgcgataattgtg鄉(xiāng)ataca1320cc鄉(xiāng)ggcagggtattttgctgtagcagtgcagcttc"tgacctcacctgg1380gac^tctg3aaggc犯g犯gtcctgccatacggc兆ttggcagaaccgctggctgg肌c1440atccccatgggcctgctctacaat犯gatcaaccactgcagat,ttgatg3atttttcagt1500g卿gttgtgcccctgggtct犯gaaagactccagtctctgt肌gctgtgtatgggctca1560ggcctaaacctgtgtgaaccacggctacacaggcgct"ttc1620ttg卿aggg卿tgtggcc"tttgtgaaacaccagac"tgt1680sctgggggaaaa犯ccctgatCC3tgggCtctatgagttg1740ctgtgccttgatggtaccagg336LCCtgtgg哪agtatgcgaactgccacctggccaga1800gccccg犯"tcacgctgtggtcacacgg肌agataagg卿cttgcgtccacaagatatta1860cgtc肌cagcagcacctattgtaactgactgctcgggc肌cttttgtttg1920ttccggtcgga幼ccaaggaCCttC"tgttCcagtatgtttggccaaactt1980catgacagaaacacatatgaaaaatacttaggagaagaatatgtcaaggctgttggtaac2040ctgagaaaatgctccacctcatcactcctggaagcctgcactttccgtagaccttaa<210〉2<211〉698<212〉PRT<213〉智人(HoraoSapies)<400〉22097MetArgLeuAlaValGlyAla15CysLeuAlaValProAspLys20HisGluAlaThrLysCysGin35lieProSerAspGlyProSer5055LeuAspCyslieArgAlalie6570LeuAspAlaGlyLeuValTyr85LysProValValAlaGluPhe100PheTyrTyrAlaValAlaVal115AsnGinLeuArgGlyLysLys130135AlaGlyTrpAsnlieProlie145150ProArgLysProLeuGluLys165CysAlaProCysAlaAspGly180CysProGlyCysGlyCysSer195GlyAlaPheLysCysLeuLys210215LysHisSerThrliePheGlu225230GinTyrGluLeuLeuCysLeu245TyrLysAspCysHisLeuAla260ArgSerMetGlyGlyLysGlu275AlaGinGluHisPheGlyLys290295SerSerProHisGlyLysAsp305310LeuLeuValCys10ThrValArgTrp25SerPheArgAsp40ValAlaCysValAlaAlaAsnGlu75AspAlaTyrLeu90TyrGlySerLys105ValLysLysAsp120SerCysHisThrGlyLeuLeuTyr155AlaValAlaAsn170ThrAspPhePro185ThrLeuAsnGin200AspGlyAlaGlyAsnLeuAlaAsn235AspAsnThrArg250GinValProSer265AspLeulieTrp280AspLysSerLysLeuLeuPheLys315AlaValLeuGlyLeu15CysAlaValSerGlu30HisMetLysSerVal45LysLysAlaSerTyr60AlaAspAlaValThr80AlaProAsnAsnLeu95GluAspProGinThr110SerGlyPheGinMet125GlyLeuGlyArgSer140CysAspLeuProGlu160PhePheSerGlySer175GinLeuCysGinLeu190TyrPheGlyTyrSer205AspValAlaPheVal220!>ysAlaAspArgAsp240LysProValAspGlu255HisThrValValAla270GluLeuLeuAsnGin285GluPheGinLeuPhe300AspSerAlaHisGly320<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula><211〉27<212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈221〉misc_feature<223〉引物<400〉6aaagtcgactcagcaagaaccaacacc2權(quán)利要求1.一種分離的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物，其特征在于，所述的偶聯(lián)物含有1個轉(zhuǎn)鐵蛋白和1-5個與所述轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)的蛙卵核糖核酸酶，所述偶聯(lián)物的分子量在89-137KD。2.如權(quán)利要求l所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或者所述的蛙卵核糖核酸酶具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求l所述的偶聯(lián)物，它是用以下方法制得的(1)利用N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯和2-IminothiolaneHC1將轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(2)分離獲得所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物。4.一種制備權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)利用N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯和2-IminothiolaneHC1將轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(2)分離獲得所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將轉(zhuǎn)鐵蛋白與N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯接觸，獲得經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白；(b)將蛙卵核糖核酸酶與2-IminothiolaneHC1接觸，獲得經(jīng)2-IminothiolaneHC1處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白；(c)將步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和步驟(b)獲得的經(jīng)2-Iminothiolane'HC1處理的蛙卵核糖核酸酶混合，從而使得轉(zhuǎn)鐵蛋白和蛙卵核糖核酸酶相偶聯(lián)；和(d)收集分子量為89-137kD的偶聯(lián)物。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白與N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯的摩爾比是l:(5-10);或者在步驟(b)中，蛙卵核糖核酸酶與2-IminothiolaneHC1的摩爾比是1:(5-10);或者在步驟(c)中，步驟(a)獲得的經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯處理的轉(zhuǎn)鐵蛋白和步驟(b)獲得的經(jīng)2-Iminothiolane'HC1處理的蛙卵核糖核酸酶蛋白的摩爾比是l:(l-4)。7.權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物的用途，其特征在于，用于制備抑制腫瘤的組合物。8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤。9.一種抑制腫瘤的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(i)有效量的權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物；和(ii)藥學(xué)上可接受的載體。10.—種體外抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，其特征在于，所述的方法包括利用權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物處理腫瘤細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，公開了一種轉(zhuǎn)鐵蛋白-蛙卵核糖核酸酶偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物含有1個轉(zhuǎn)鐵蛋白和1-5個蛙卵核糖核酸酶。本發(fā)明還公開了所述偶聯(lián)物的制備方法、用途以及含有所述偶聯(lián)物的藥物組合物。不少腫瘤細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，而且轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體結(jié)合后極易被內(nèi)吞，因而本發(fā)明的偶聯(lián)物較游離的蛙卵核糖核酸酶更易進(jìn)入細(xì)胞漿，從而具有更強(qiáng)和更專一的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。文檔編號A61K47/48GK101450214SQ20071017189公開日2009年6月10日申請日期2007年12月6日優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日發(fā)明者孫瑞林,沈如凌,王慶誠,王鑄鋼,許國峰,儉費(fèi)申請人:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司;上海南方模式生物研究中心