專利名稱：：小牛血去蛋白提取物制備方法及其凍干粉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生化藥物領(lǐng)域，具體地說(shuō)為一種小牛血去蛋白提取物制備方法及其凍干粉。
背景技術(shù)：
：小牛血去蛋白提取物(血活素)自1955年由瑞士素高藥廠開發(fā)研制成功五十年以來(lái)，巳經(jīng)在世界各國(guó)推廣使用。它是118個(gè)月的幼牛血清經(jīng)除蛋白后得到的小分子生物活性物質(zhì)，其注射液每毫升含有40±5毫克小牛血去蛋白提取物的總固體，其中30%為氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸及相對(duì)分子量為25003000的寡肽類物質(zhì)，70%為無(wú)機(jī)物(K+、Na+、Cr、C^等)，它們能增加組織細(xì)胞對(duì)氧的攝入和利用，促進(jìn)葡萄糖向腦組織運(yùn)轉(zhuǎn)，并能促進(jìn)葡萄糖在腦內(nèi)進(jìn)行有氧代謝，尤其在缺血、缺氧的條件下，小牛血去蛋白提取物能使腦組織產(chǎn)生更多的高能化合物(ATP)，以維護(hù)腦組織的正常生理功能。它主要用于1改善腦部血液循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病引起的神經(jīng)功能缺損，用于缺血缺氧腦血管疾病、顱腦外傷如腦梗塞、腦出血、腦炎、腦動(dòng)脈硬化、老年癡呆、促?gòu)?fù)蘇等；2作為能量合劑治療心肌炎、冠心病等；3末梢動(dòng)、靜脈循環(huán)障礙及其引起的動(dòng)脈血管病，腿部潰瘍及周圍神經(jīng)病變；4消化性漬瘍、萎縮性胃炎；5放射所致皮膚、粘膜損傷；6減輕肝細(xì)胞損傷，用于各種肝炎、肝硬化等。具有良好療效且無(wú)毒耐受性好。目前，本領(lǐng)域中常用的小牛血去蛋白提取技術(shù)主要為離心、乙醇除蛋白、酸解酶解除蛋白、超濾除大分子物質(zhì)等過(guò)程。但目前公知技術(shù)中很難最大程度的去除蛋白和保留活性物質(zhì)。例如在專利CN200410013643中采用將血清堿性、酸性(PH6.57.5，并7090。C熱處理)離心除蛋白，608(TC減壓濃縮，再超濾截留5000-10000道爾頓的分子，然后加入水、滲透壓調(diào)節(jié)液和活性炭加熱，過(guò)濾，最后加入水配得小牛血去蛋白提取物注射液。其技術(shù)難度小，易于生產(chǎn)，但很難將雜質(zhì)，特別是蛋白完全去除，影響了產(chǎn)品純度，從而危害患者健康甚至生命。在申請(qǐng)專利CN200610080520中公開了另一種小牛血去蛋白提取技術(shù)將小牛血清先用兩倍體積的96%乙醇除蛋白，再在37。C、1個(gè)大氣壓下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除乙醇，然后酶水解24小時(shí)，離心(1000rpm，4'C，30min)，再用葡聚糖G15凝膠層析脫鹽和DEAE-S印hadex-50凝膠層析分離，最后膜濾除高分子物質(zhì)并紫外線滅菌。該方法所用酶水解除蛋白條件劇烈，破壞了更多的活性物質(zhì)，使得產(chǎn)品生物活性降低。在專利CN200410062657中公開了一種制備小牛血去蛋白眼膏的技術(shù)，其中涉及一種小牛血去蛋白提取物的提取技術(shù)將小牛血液離心(2000-4000r卿、10-20分鐘)得到紅細(xì)胞，加入2-6倍水在-20-10。C下凍溶20-30小時(shí)，離心(10000-15000rmp、10-30分鐘)，然后50-7(TC下巴氏消毒6-15小時(shí)，再超濾除高分子物、脫鹽，濃縮后用活性炭脫色(90-ll(TC，10-60分鐘)。其采用從紅細(xì)胞中提取，加大了制備難度，增加了成本，但效果并沒有實(shí)質(zhì)提高。另外他釆用50-7(TC溫度下進(jìn)行消毒，不能消滅大部分致病細(xì)菌，而他進(jìn)行活性炭脫色時(shí)采用90-110'C高溫又破壞了血液中的有效成分，所得產(chǎn)品效果低。專利CN200410013509中公開了一種小牛血去蛋白提取物凍干粉的制備方法，先在—45-4(TC下預(yù)凍，然后抽真空至1~10帕，升溫至-20-5'C，再第二次升溫至3035'C，然后保溫干燥至合格。該專利沒有給出預(yù)凍和兩個(gè)干燥階段的具體時(shí)間，而我們知道對(duì)于凍干工藝來(lái)說(shuō)，凍干時(shí)間是非常關(guān)鍵的，時(shí)間過(guò)短會(huì)干燥不徹底，造成外觀塌陷、出泡坑，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)破壞細(xì)胞膜，滅活有效成份。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種小牛血去蛋白提取物制備方法，該方法過(guò)程簡(jiǎn)便，易于大批量生產(chǎn)，得到的提取物生物活性高，產(chǎn)品純度好。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采取如下方法制備小牛血去蛋白提取物(1)將小牛血攪拌、離心得到血清；(2)將離心得到的血清加熱去除蛋白，過(guò)濾后濃縮濾液；(3)向濃縮后的濾液中加入乙醇進(jìn)行醇沉，過(guò)濾去除沉淀出的蛋白，濾液濃縮回收乙醇，得到醇沉后的濾液；(4)向醇沉后的濾液中加入酸調(diào)節(jié)PH值為酸性，加入活性炭并加熱進(jìn)行脫色和水解，過(guò)濾收集濾液；(5)將收集的濾液用堿調(diào)節(jié)PH至6.88，冷凍除蛋白，過(guò)濾得到濾液，再冷凍、過(guò)濾，反復(fù)25次，所述冷凍溫度為-500'C，時(shí)間為1272小時(shí)；(6)將冷凍除蛋白后得到的濾液用纖維膜超濾除高分子物質(zhì)，得到小牛血去蛋白提取物，所述纖維膜為截留分子量500030000道爾頓。上述制備方法中，步驟(1)中如果將血液只進(jìn)行離心分離血清，會(huì)由于纖維蛋白原存在造成血漿凝固，使得提取的血清質(zhì)量很差，嚴(yán)重影響后面提取過(guò)程，所以我們先將血液用攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度60200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌時(shí)間520分鐘；其后進(jìn)行離心，離心速度為8002000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為2040分鐘，這里我們將離心時(shí)間進(jìn)行延長(zhǎng)同樣也可以提高所得血清質(zhì)量。上述制備方法中，步驟(2)中采取了先進(jìn)行加熱除蛋白的方法，通過(guò)高溫使蛋白凝固變質(zhì)來(lái)去除蛋白，同時(shí)較高溫度又可以殺死血清中的各種細(xì)菌，提高了產(chǎn)品的安全性，所述加熱溫度為6090°C，加熱時(shí)間510分鐘，其溫度范圍不會(huì)對(duì)血清中有效成分造成破壞；過(guò)濾掉沉淀后減壓濃縮，至剩余原體積的1/41/12，如果剩余體積太小則濃度過(guò)大，降低了后面醇沉除蛋白的效果，如果剩余體積過(guò)大則使后面操作困難，并影響產(chǎn)品活力。上述制備方法中，步驟(3)中所述乙醇加入量為所述濃縮后濾液體積的210倍，乙醇濃度為5095%，醇沉?xí)r間為2472小時(shí)，我們將醇沉?xí)r間延長(zhǎng)，也可以提高蛋白的清除效果，同時(shí)不會(huì)影響有效成分。上述制備方法中，步驟(4)中如果采用水解酶進(jìn)行水解，勢(shì)必會(huì)對(duì)血清有效成分造成破壞，為了得到更高效的提取物，我們采用了酸調(diào)解的方法，調(diào)解過(guò)程中同時(shí)加入活性炭脫色吸附雜質(zhì)，減少了提取步驟，簡(jiǎn)化了工藝，其中所述酸為鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸；所述ra值為3.56.5;所述加熱溫度為6090°C，時(shí)間1060分鐘；步驟(5)中根據(jù)蛋白和其他一些雜質(zhì)在低溫下會(huì)在溶液中析出的原理，我們用堿調(diào)節(jié)溶液ra值后采用了低溫冷凍的新方法，很大效率的提高了蛋白等雜質(zhì)的去除率，清除了其他現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法清除的蛋白和細(xì)小雜質(zhì)，其中所述堿為NaOH、KOH或碳酸氫鈉；所述PH值77.5。上述制備方法中，步驟(5)所述冷凍溫度為-40-l(TC，時(shí)間為2448小時(shí)。上述制備方法中，步驟(5)所述冷凍溫度為-30-2(TC，時(shí)間為3040小時(shí)。上述制備方法中，步驟(6)中我們用三種規(guī)格的中空纖維膜依次進(jìn)行超濾，能夠有效的將大分子物去除，避免了注射后大分子物引起的免疫反應(yīng)。其中所述纖維膜超濾為順序用30000、10000、5000道爾頓分子量的中空纖維膜超濾。上述制備方法中，所述制備方法得到的小牛血去蛋白提取物呼吸活力810.02/(mg*h),刺激指數(shù)35。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述方法制備的小牛血去蛋白提取物的注射用凍干粉，所述注射用凍干粉制備包括如下步驟。一種含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用凍干粉，所述注射用凍干粉制備步驟包含稱取小牛血去蛋白提取物溶液，加入可藥用賦形劑，攪拌溶解，加入注射用水至規(guī)定體積，分別用0.45titn、0.22ym超濾膜過(guò)濾除菌，按一定規(guī)格灌裝，壓半蓋，-60"-301:下預(yù)凍25小時(shí)，然后抽真空，真空度39帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間816小時(shí)，保持-10'C真空干燥26小時(shí)，再緩慢升溫至10°C，升溫時(shí)間48小時(shí)，再升溫至2035。C干燥，升溫時(shí)間36小時(shí)，最后保溫干燥3090分鐘，壓全蓋，成品完成。本發(fā)明中，經(jīng)過(guò)摸索采用了梯度升溫方法，該方法更適合于小牛血去蛋白提取物的凍干干燥，可以更徹底的去除水分，所得產(chǎn)品形態(tài)飽滿細(xì)膩，色澤均勻，結(jié)構(gòu)牢固，溶解速度快，殘余水分低，生物活性基本不變。一種含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用凍干粉，所述注射用凍干粉制備步驟包含稱取小牛血去蛋白提取物溶液，加入甘露醇或右旋糖酐，攪拌溶解，加入注射用水至規(guī)定體積，分別用0.45um、0.22um超濾膜過(guò)濾除菌，按400mg/支或800mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，-5(TC-40'C下預(yù)凍3小時(shí)，然后抽真空，真空度57帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間12小時(shí)，保持-1CTC真空干燥4小時(shí)，再緩慢升溫至10'C，升溫時(shí)間6小時(shí)，再升溫至2532。C干燥，升溫時(shí)間5小時(shí)，最后保溫干燥5080分鐘，壓全蓋，成品完成。一種含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用凍干粉，所述注射用凍干粉制備步驟更具體為將4000g小牛血去蛋白提取物，加入301500g甘露醇，攪拌溶解，加入30000ml注射用水，分別用0.45ym、0.22um超濾膜過(guò)濾除菌，按400mg/支或800mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，-50匸-401:下預(yù)凍3小時(shí)，然后抽真空，真空度57帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間12小時(shí)，保持-l(TC真空干燥4小時(shí)，再緩慢升溫至1(TC，升溫時(shí)間6小時(shí)，再升溫至2532'C干燥，升溫時(shí)間5小時(shí)，最后保溫干燥5080分鐘，壓全蓋，成品完成。本發(fā)明提供的小牛血去蛋白提取物及其制備方法優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供的小牛血去蛋白提取液中每亳升含有游離氨基酸11.5mg，總固體含量160170mg，pH6.57.5，呼吸活力為810W02/(mgh)，剌激指數(shù)(2)本發(fā)明過(guò)程簡(jiǎn)便易行，將水解和活性炭脫色兩步操作合并為一步進(jìn)行，提高了生產(chǎn)效率；本發(fā)明同樣避免了復(fù)雜繁瑣的柱層析技術(shù)，所使用各種材料均為廉價(jià)易得的工業(yè)產(chǎn)品，便于工業(yè)化生產(chǎn)，能夠安全有效的生產(chǎn)出更強(qiáng)活性的小牛血去蛋白提取物。(3)現(xiàn)有技術(shù)中單一的通過(guò)醇沉或加熱、水解去除蛋白方法效率低下，得到產(chǎn)品往往雜質(zhì)多，質(zhì)量差，影響了臨床用藥效果。本發(fā)明通過(guò)加熱、醇沉、酸水解的聯(lián)合應(yīng)用保證了對(duì)蛋白的徹底消除，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。廉價(jià)無(wú)機(jī)酸的應(yīng)用避免了昂貴的水解酶，同時(shí)減少了對(duì)有效活性成分的破壞并提高了蛋白去除效果。(4)牛血中含有多種致病菌，嚴(yán)重危害著患者用藥安全?，F(xiàn)有技術(shù)中要么步驟(2)中比其他現(xiàn)有技術(shù)更高溫度的應(yīng)用，確保了對(duì)產(chǎn)品中各種致病細(xì)菌的滅活，保證了患者的用藥安全。同時(shí)該溫度范圍又不會(huì)對(duì)血清中的有效成分造成影響。(5)步驟(6)中運(yùn)用低溫冷凍方法，使得經(jīng)過(guò)醇沉、加熱、水解后殘存的蛋白和其他雜質(zhì)在低溫中析出，更進(jìn)一步提高了產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)低溫不會(huì)對(duì)產(chǎn)品的有效成分造成破壞。(6)凍干干燥過(guò)程采取梯度升溫過(guò)程，更有效的除去吸附水和結(jié)合水，且不對(duì)提取物有效成份造成破壞，圖1為小牛血去蛋白提取物制備工藝流程圖圖2為小牛血去蛋白提取物凍干粉制備工藝流程圖具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作更具體的解釋，但本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例，同樣這些實(shí)施例也不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1小牛血采集經(jīng)檢驗(yàn)健康的1.5歲以下小牛的血，用攪拌器以150轉(zhuǎn)/分鐘攪拌20分鐘，去除血漿纖維蛋白原，然后用離心機(jī)以800轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，倒入清潔的桶內(nèi)，4(TC速凍后于-2(TC冷藏備用。提取將冷藏小牛血清取出，室溫融化后放入減壓濃縮罐，加熱至60'C使蛋白質(zhì)凝固、變性，過(guò)濾，濾液加熱至7(TC，減壓濃縮至原體積1/4,冷卻至室溫，加入5倍體積55%乙醇，醇沉30小時(shí)，過(guò)濾，回收乙醇，得到半成品。脫色、除冷蛋白取上步產(chǎn)品放入水解罐，加入HC1至PH為3.5，加熱至7CTC，用10%活性炭脫色50分鐘，過(guò)濾，濾液放入罐中，用NaOH調(diào)節(jié)PH為6.9，水冷卻，取樣檢測(cè)，總固體含量〉130mg/ml，-80'C冷凍24小時(shí)，解凍，過(guò)濾，濾液再冷凍24小時(shí)，反復(fù)3次。分子量篩選、細(xì)菌內(nèi)毒素去除、除高分子物質(zhì)順序使用30000、10000、5000道爾頓分子量的中空纖維膜超濾，得到精制小牛血去蛋白提取物，檢測(cè)，總固體含量H40mg/ml，-20°0冷凍備用。實(shí)施例2小牛血采集經(jīng)檢驗(yàn)健康的1.5歲以下小牛的血，用攪拌器以100轉(zhuǎn)/分鐘速度攪拌6分鐘，去除血漿纖維蛋白原，然后用離心機(jī)以2000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心30分鐘，取上清液，倒入清潔的桶內(nèi)，-40°〇速凍后于-2CTC冷藏備用。提取將冷藏小牛血清取出，室溫融化后放入減壓濃縮罐，加熱至70'C使蛋白質(zhì)凝固、變性，過(guò)濾，濾液加熱至80'C，減壓濃縮至原體積1/8，冷卻至室溫，加入2倍70%乙醇，醇沉24小時(shí)，過(guò)濾，回收乙醇，得到半成品。脫色、除冷蛋白取上步產(chǎn)品放入水解罐，加入hci至ra為6.5，加熱至6CTC，用5%活性炭脫色15分鐘，過(guò)濾，濾液放入罐中，用NaOH調(diào)節(jié)PH為8.0，水冷卻，取樣檢測(cè)，總固體含量〉130mg/ml，-20。C冷凍24小時(shí)，解凍，過(guò)濾，濾液再冷凍24小時(shí)，反復(fù)5次。分子量篩選、細(xì)菌內(nèi)毒素去除、除高分子物質(zhì)順序使用30000、10000、5000道爾頓分子量的中空纖維膜超濾，得到精制小牛血去蛋白提取物，檢測(cè)，總固體含量〉140mg/ml，-2(TC冷凍備用。實(shí)施例3小牛血采集經(jīng)檢驗(yàn)健康的1.5歲以下小牛的血，用攪拌器以60轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行攪拌，攪拌12分鐘，去除血漿纖維蛋白原，然后用離心機(jī)以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清液，倒入清潔的桶內(nèi)，-40°。速凍后于-2(TC冷藏備用。提取將冷藏小牛血清取出，室溫融化后放入減壓濃縮罐，加熱至卯。C使蛋白質(zhì)凝固、變性，過(guò)濾，濾液加熱至90。C，減壓濃縮至原體積1A1，冷卻至室溫，加入94%乙醇10倍，醇沉68小時(shí)，過(guò)濾，回收乙醇，得到半成品。脫色、除冷蛋白取上步產(chǎn)品放入水解罐，加入HC1至PH為5.5,加熱至9(TC，用1%活性炭脫色30分鐘，過(guò)濾，濾液放入罐中，用NaOH調(diào)節(jié)ra為8.0,水冷卻，取樣檢測(cè)，總固體含量〉130mg/ml，-45'C冷凍24小時(shí)，解凍，過(guò)濾，濾液再冷凍24小時(shí)，反復(fù)2次。分子量篩選、細(xì)菌內(nèi)毒素去除、除高分子物質(zhì)順序使用30000、10000、5000道爾頓分子量的中空纖維膜超濾，得到精制小牛血去蛋白提取物，檢測(cè)，總固體含量M40mg/ml，-2(TC冷凍備用。本發(fā)明實(shí)施例所得產(chǎn)品參數(shù)見表1表1.三批小牛血去蛋白提取物參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例4將4000g小牛血去蛋白提取物，加入30g甘露醇，攪拌溶解，加入30000ml注射用水，分別用0.45ixm和0.22um超濾膜超濾，按400mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，放入凍干柜，-6(TC預(yù)凍2小時(shí)，抽真空，真空度9帕，緩慢升溫至-10'C，升溫時(shí)間16小時(shí)，保持-l(TC真空干燥6小時(shí)，再緩慢升溫至1(TC,升溫時(shí)間8小時(shí)，再升溫至2(TC，升溫時(shí)間3小時(shí)，最后保持2(TC真空干燥90分鐘，壓全蓋，成品完成。實(shí)施例5將4000g小牛血去蛋白提取物，加入150g甘露醇，攪拌溶解，加入30000ml注射用水，分別用0.45um和0.22um超濾膜超濾，按400mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，放入凍干柜，-45。C預(yù)凍3小時(shí)，抽真空，真空度6帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間12小時(shí)，保持-1(TC真空干燥4小時(shí)，再緩慢升溫至1(TC，升溫時(shí)間6小時(shí)，再升溫至29'C，升溫時(shí)間5小時(shí)，最后保持29'C真空干燥65分鐘，壓全蓋，成品完成。實(shí)施例6將4000g小牛血去蛋白提取物，加入300g甘露醇，攪拌溶解，加入30000ml注射用水，分別用0.45iim和0.22um超濾膜超濾，按400mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，放入凍干柜，-3CTC預(yù)凍5小時(shí)，抽真空，真空度3帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間8小時(shí)，保持-l(TC真空干燥2小時(shí)，再緩慢升溫至1(TC，升溫時(shí)間4小時(shí)，再升溫至35'C，升溫時(shí)間6小時(shí)，最后保持35r真空干燥30分鐘，壓全蓋，成品完成。實(shí)施例7將4000g小牛血去蛋白提取物，加入900g甘露醇，攪拌溶解，加入30000ml注射用水，分別用0.45ixra和0.22ym超濾膜超濾，按400mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，放入凍干柜，-5(TC預(yù)凍3小時(shí)，抽真空，真空度7帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間12小時(shí)，保持-10'C真空干燥4小時(shí)，再緩慢升溫至10'C，升溫時(shí)間6小時(shí)，再升溫至25'C，升溫時(shí)間5小時(shí)，最后保持25'C真空干燥80分鐘，壓全蓋，成品完成。實(shí)施例8將4000g小牛血去蛋白提取物，加入1500g甘露醇，攪拌溶解，加入30000ml注射用水，分別用0.45Um和0.22!im超濾膜超濾，按400mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，放入凍干柜，-4(TC預(yù)凍3小時(shí)，抽真空，真空度5帕，緩慢升溫至-10。C,升溫時(shí)間12小時(shí)，保持-10'C真空干燥4小時(shí)，再緩慢升溫至10'C，升溫時(shí)間6小時(shí)，再升溫至32。C，升溫時(shí)間5小時(shí)，最后保持32t:真空干燥50分鐘，壓全蓋，成品完成。試驗(yàn)例1小牛血去蛋白提取物呼吸活性測(cè)定本法系用瓦氏呼吸檢壓儀測(cè)定豚鼠肝勻漿的呼吸活力，從測(cè)得的耗氧量計(jì)算出呼吸活力Q02OI02/(mg'h)]和刺激指數(shù)(SI)。儀器瓦氏呼吸檢壓儀，勾漿器，定時(shí)器。試劑10%氫氧化鈉溶液取氫氧化鈉10g，加水溶解并稀釋至100ml。Soerensen緩沖液(PH7.4):取磷酸氫二鈉(Na2HP04)9.72g和磷酸二氫鉀1.65g，加水溶解并稀釋至1000ml。Brodie測(cè)壓液取氯化鈉23g，牛膽酸鈉5g，伊文氏蘭100mg，加水溶解并稀釋至500ml。相對(duì)密度為1.033g/ml。肝勻漿液取體重200300g的雄性豚鼠一只，頸部打擊處死(處死前需禁食至少24小時(shí)),立即切斷頸動(dòng)脈放血，打開腹腔取出肝臟，置冰水浴中的Soerensen緩沖液中(注意不得損傷膽囊或膽管)。稱取5.5g的肝臟，并切割為大小相同的7塊，每塊用7ml的Soerensen緩沖液勻漿(注意以上操作必須在冰水浴中進(jìn)行)。測(cè)定法(1)預(yù)先把測(cè)壓計(jì)反應(yīng)瓶洗凈并干燥，備用。(2)裝好測(cè)壓液于測(cè)壓管內(nèi)，調(diào)節(jié)液面至150mm。(3)反應(yīng)瓶中先加入Soerensen緩沖液l.lml，加供試品小牛血去蛋白提取物0.2ml，然后加肝勻漿液1.0ml。(4)加10。/。氫氧化鈉溶液0.2ml于具一小濾紙條的反應(yīng)瓶中間小杯。(5)由于肝勻漿本身有耗氧作用，故實(shí)驗(yàn)時(shí)以Soerensen緩沖液0.2ml代替供試品，其余試劑同樣品管，作為空白管。(6)將裝好的反應(yīng)瓶按管號(hào)與測(cè)壓計(jì)相連(注意密閉，勿使漏氣)，置37'C恒溫水浴中。(7)開動(dòng)振蕩器振搖10分鐘(75次/分)使反應(yīng)瓶?jī)?nèi)外溫度一致。將測(cè)壓計(jì)右側(cè)柱液面調(diào)至150mm，記下左側(cè)液面初讀數(shù)(A)，然后關(guān)閉三向活塞，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)30分鐘記后將測(cè)壓計(jì)右側(cè)柱液面再調(diào)至150mm，記下左側(cè)液面初讀數(shù)(B)。打開三向活塞，重復(fù)上述過(guò)程，進(jìn)行下一個(gè)30分鐘的反應(yīng)并記下左側(cè)液面初讀數(shù)(C)及30分鐘后的液面讀數(shù)(D)。(8)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須附加一套供校正用的溫壓計(jì)，在反應(yīng)瓶中加2.5ml的Soerensen緩沖液，使其在與試驗(yàn)管完全相同的條件下試驗(yàn)，觀察其壓力的變化(AC),以消除試驗(yàn)過(guò)程中溫度及大氣壓的影響。(9)取2.0ml肝勻漿，置恒重的裝有海沙的稱量瓶中，ll(TC干燥至恒重，計(jì)算兩次的重量差異厶W(mg)。按下式計(jì)算Q02|>102/(mg'h)]=[(A-B+C陽(yáng)D)XKi-ACXK2]/GXI式中-&_空白或樣品的反應(yīng)瓶常數(shù)；K2—溫壓計(jì)的反應(yīng)瓶常數(shù)；(3~每lml肝勻漿的干重，mg'AG=W/2-9.2，9.3為Soerensen緩沖液的干重，mg;I一反應(yīng)時(shí)間，小時(shí)。剌激指數(shù)(SI)=供試品Q(V空白Q02試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)滿足以下條件，否則無(wú)效1.對(duì)照品的QO2》4.0W02/(mgh),并且SI>Q02;2.空白的Q02》1.0W02/(mgh)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1試驗(yàn)例2小牛血去蛋白提取物過(guò)敏試驗(yàn)本法系將一定劑量的供試品小牛血去蛋白提取物溶液注入豚鼠腹腔和靜脈，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)情況，以判斷供試品是否符合規(guī)定的一種方法。供試動(dòng)物健康豚鼠，雌雄均可，體重250350g，試驗(yàn)前及試驗(yàn)的觀察期內(nèi)，均應(yīng)按正常飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)，做過(guò)本試驗(yàn)的動(dòng)物不得重復(fù)使用。供試溶液的配制除另有規(guī)定外，用氯化鈉注射液按各藥品項(xiàng)下規(guī)定濃度制成供試品溶液。檢査法取上述豚鼠6只，間日腹腔注射供試品溶液0.5ml，連續(xù)3次，然后分成兩組，每組3只，分別在第一次注射后第14日及第21日靜脈注射供試品溶液1.0ml。結(jié)果判斷靜脈注射后15分鐘內(nèi)均不得出現(xiàn)過(guò)敏性反應(yīng)，如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、千嘔或咳嗽3聲等現(xiàn)象中的兩種以上者；或羅音、抽搐、虛脫或死亡現(xiàn)象之一者應(yīng)判為陽(yáng)性。甘T7士口FR八QO/工審每乂"rh踏奴c^:短1—1rhx^六Mra/Jr—納處J^、、^誠(chéng)仕n\^f、BR,rnu'7/o乂Lv困求、Tui:ni^i《千MXi丐r廠rt'b,\s、u=uv"fnOiug口'j^v^nt很，rv^法測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l。試驗(yàn)例3小牛血去蛋白提取物中游離氨基酸含量測(cè)定取本品及標(biāo)準(zhǔn)氨基酸適量，用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析，其游離氨基酸含量應(yīng)為每400mg中含8.012.0mg。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1試驗(yàn)例4小牛血去蛋白提取物中總固體含量測(cè)定精密量取本品lg，置稱量瓶中在(53±2)T:下真空干燥至恒重(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VDIL)，計(jì)算，所得結(jié)果減去賦形劑量，賦形劑檢測(cè)方法見藥典附錄三。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l。試驗(yàn)例5小牛血去蛋白提取物中髙分子物質(zhì)測(cè)定照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VD)測(cè)定。用凝膠色譜柱(如PharmarciaSuperdexPeptide或TSK-s2000swxl柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40:0.1:60)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。對(duì)照品溶液制備稱取胰島素(分子量5800)適量，加流動(dòng)相制成每lml中含2.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。測(cè)定法取對(duì)照溶液及供試品溶液(本品加水制成每lml中含有總固體40mg的供試溶液)各20^1分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，將先于胰島素峰保留時(shí)間的峰視為高分子量物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算，含高分子量物質(zhì)的量不得過(guò)2.0%。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l。試驗(yàn)例6小牛血去蛋白提取物中細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定取本品，依法檢査(中國(guó)藥典2000年版二部附錄XIE)，每lmg中含細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.025EU)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。權(quán)利要求1、一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括如下步驟(1)將小牛血攪拌、離心得到血清；(2)將離心得到的血清加熱去除蛋白，過(guò)濾后濃縮濾液；(3)向濃縮后的濾液中加入乙醇進(jìn)行醇沉，過(guò)濾去除沉淀出的蛋白，濾液濃縮回收乙醇，得到醇沉后的濾液；(4)向醇沉后的濾液中加入酸調(diào)節(jié)PH值為酸性，加入活性炭并加熱進(jìn)行脫色和水解，過(guò)濾收集濾液；(5)將收集的濾液用堿調(diào)節(jié)PH至6.8～8，冷凍除蛋白，過(guò)濾得到濾液，再冷凍、過(guò)濾，反復(fù)2～5次，所述冷凍溫度為-50～0℃，時(shí)間為12～72小時(shí)；(6)將冷凍除蛋白后得到的濾液用纖維膜超濾除高分子物質(zhì)，得到小牛血去蛋白提取物，所述纖維膜為截留分子量5000～30000道爾頓。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述濃縮為濃縮至原體積的1/41/12;所述加熱溫度為6090°C，加熱時(shí)間510分鐘。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述乙醇加入量為步驟(3)所述濃縮后的濾液的210倍，乙醇濃度為5095%，醇沉?xí)r間為2472小時(shí)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述酸為鹽酸、硫酸、硝酸、或磷酸；所述PH值為3.56.5;所述加熱溫度為609(TC,時(shí)間1060分鐘；步驟(5)所述堿為NaOH、K0H、或碳酸氫鈉；所述PH值77.5。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述冷凍溫度為-40-10°C，所述時(shí)間為2448小時(shí)。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述冷凍溫度為-30-20°C，所述時(shí)間為3040小時(shí)。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(6)所述纖維膜超濾為順序用30000、10000、5000道爾頓分子量的中空纖維膜超濾。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法得到的小牛血去蛋白提取物呼吸活力810.1^102/(mgh)，刺激指數(shù)35。9、一種含有按權(quán)利要求1所述方法制備的小牛血去蛋白提取物的注射用凍干粉，其特征在于，所述的注射用凍干粉的制備步驟包括稱取小牛血去蛋白提取物溶液，加入可藥用賦形劑，攪拌溶解，加入注射用水至規(guī)定體積，分別用0.45um、0.22um超濾膜過(guò)濾除菌，按一定規(guī)格灌裝，壓半蓋，-6CTC-30'C下預(yù)凍25小時(shí)，然后抽真空，真空度39帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間816小時(shí)，保持-10'C真空干燥26小時(shí)，再緩慢升溫至l(TC，升溫時(shí)間48小時(shí)，再升溫至2035t:干燥，升溫時(shí)間36小時(shí)，最后保溫干燥3090分鐘，壓全蓋，成品完成。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述注射用凍干粉，其特征在于，制備步驟包括稱取小牛血去蛋白提取物溶液，加入甘露醇或右旋糖酐，攪拌溶解，加入注射用水至規(guī)定體積，分別用0.45um、0.22um超濾膜過(guò)濾除菌，按400mg/支或800mg/支規(guī)格灌裝，壓半蓋，_50°C-40°C下預(yù)凍3小時(shí)，然后抽真空，真空度57帕，緩慢升溫至-l(TC，升溫時(shí)間12小時(shí)，保持-l(TC真空干燥4小時(shí)，再緩慢升溫至l(TC，升溫時(shí)間6小時(shí)，再升溫至2532'C干燥，升溫時(shí)間5小時(shí)，最后保溫干燥5080分鐘，壓全蓋，成品完成。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種小牛血去蛋白提取物制備方法及其凍干粉，該方法過(guò)程簡(jiǎn)便，易于大批量生產(chǎn)，得到的提取物生物活性高，產(chǎn)品純度好，凍干粉采用梯度升溫干燥，成品外觀好，易于溶解。小牛血去蛋白提取物通過(guò)如下方法制得將采集的血清加熱除蛋白，過(guò)濾后濾液濃縮，乙醇除蛋白，然后加入活性炭和酸進(jìn)行水解脫色，過(guò)濾后調(diào)節(jié)pH值至合適范圍，冷凍除蛋白并反復(fù)操作，最后用纖維膜超濾除高分子物質(zhì)，得到小牛血去蛋白提取物，然后加入賦形劑和注射用水，預(yù)凍，再梯度升溫真空干燥，得到成品。文檔編號(hào)A61P9/14GK101433553SQ200710194950公開日2009年5月20日申請(qǐng)日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者宋治國(guó)申請(qǐng)人:吉林康乃爾藥業(yè)有限公司