專利名稱：一種治療流感病毒感染的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療病毒感染的藥物，特別涉及用于由流感病 毒引起的感染的藥物。本發(fā)明的主題是藥物，其含有作為活性成分的泛素蛋 白酶系統(tǒng)抑制劑，尤其是蛋白酶體抑制劑。本發(fā)明中還涉及蛋白酶體抑制劑 的整體與局部用藥，特別優(yōu)選氣霧劑形式的用藥。本發(fā)明中所述的蛋白酶體 抑制劑活性成分能與至少一種其他的具有抗病毒效果的物質(zhì)一起用于預(yù)防 和/或治療流感病毒的感染。
背景技術(shù)：
1.在動(dòng)物和人體中的流感病毒感染
流感病毒的感染，即流感病原體造成的感染，對(duì)人類和動(dòng)物身體健康構(gòu) 成了巨大威脅。同時(shí)，這種感染不僅逐年地造成重大死亡，并且由于生病導(dǎo) 致喪失工作能力也帶來了巨大的宏觀經(jīng)濟(jì)損失。在每年爆發(fā)的流行病中，流 行性感冒甚至具有越來越大的威脅，因?yàn)檫^去這種全球性的流行病在世界范
圍內(nèi)的反復(fù)地暴發(fā)，曾經(jīng)奪去了數(shù)百萬人的生命。在最近幾年爆發(fā)的H5N1 亞型的高致病性禽流感事件直接預(yù)示著未來幾年爆發(fā)新一輪全球范圍的流 行病的危機(jī)。但是，迄今人們還沒有獲得相應(yīng)有效的疫苗來抗擊病毒。
流感病毒屬于正黏液病毒科家族，含有一反義的基因組片段，其編碼至 少 11種病毒蛋白(Lamb and Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395,1996)。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M) 的分子特性及血清特性，流感病毒可以分為A、 B和C三種類型。其中，A 型流感病毒對(duì)人類和某些動(dòng)物具有最強(qiáng)的致病性(Webster et al，， Microbiol Rev, 56, 152-79， 1992)。
A型流感病毒顆粒由9個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和一個(gè)源于宿主細(xì)胞的脂質(zhì)包膜組
成。病毒RNA的節(jié)段1 3編碼RNA依賴的RNA聚合酶復(fù)合物(RDRP) 的組分PB1、 PB2和PA，它們同核糖核蛋白結(jié)合，催化這些組分的轉(zhuǎn)錄和 病毒基因組的擴(kuò)增。血凝素(HA)和神經(jīng)氮酸苷酶(NA)是病毒的表面 糖蛋白，它們由vRNA的節(jié)段4和6編碼。當(dāng)前，已知有16種HA亞型和 9種NA亞型，由此將A型流感病毒劃分成不同種類。
HA型為H1、 H2和H3的病毒以及NA型為N1和N2的病毒能在人類 中傳染(Lamb and Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395,1996)。節(jié)段5編碼核蛋白(NP)，其為核糖核蛋白復(fù) 合物的主要組分。兩個(gè)最小的vRNA片段中每個(gè)都編碼兩種蛋白。vRNA的 片段7編碼基質(zhì)蛋白Ml和M2蛋白。Ml蛋白與脂質(zhì)雙層膜的內(nèi)側(cè)結(jié)合并 且由內(nèi)向外包裹住病毒；M2是第三跨膜成分，其功能為pH依賴的離子通 道。片段8的序列攜帶了核輸出蛋白NS/NEP和一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的信息。 最近，鑒定出第11個(gè)A型流感病毒蛋白(Chen et al., source after the exemplary embodiments)。它是PB1-F2蛋白，其通過PBl基因片段的開放閱 讀框在一個(gè)核苷酸周圍移動(dòng)而形成。
PB1-F2是一種線粒體蛋白，其能夠加強(qiáng)誘導(dǎo)受控細(xì)胞的死亡和細(xì)胞凋亡。
對(duì)付RNA病毒的問題在于由病毒聚合酶的高誤差率引起的病毒的高變 異性，這使得生產(chǎn)合適的疫苗以及開發(fā)抗病毒物質(zhì)變得很困難。
研究顯示，由于病毒的高變異性，使用針對(duì)病毒作用的抗病毒物質(zhì)，會(huì) 導(dǎo)致病毒快速的選擇抗性變異。例如，抗流感病毒藥三環(huán)癸胺及其衍生物， 它針對(duì)于病毒的一個(gè)跨膜蛋白，但是經(jīng)過幾代繁殖就會(huì)產(chǎn)生抗性病原體。
流感感染的新型治療劑，其抑制流感病毒表面蛋白神經(jīng)氨酸苷酶，已由 Glaxo Wellcome公司和Roche公司用商品名"RELANZA"禾卩"TAMIFLU" 在德國銷售，但是在患者體內(nèi)已出現(xiàn)了其抗性病原體(Gubareva et al J Infect
Dis 178,1257-1262,1998);目前，在人體中發(fā)現(xiàn)H5N1型禽流感病毒已對(duì) "TAMIFLU"產(chǎn)生抗藥性(Qui et al. Nature 437,1108, 2005)。因此，對(duì)這種治
療劑寄予的希望并不能實(shí)現(xiàn)。
由于大部分病毒都是小基因組，因此限制了病毒復(fù)制必需的編碼能力，
故所有的病毒很大程度上都依賴于它們的宿主細(xì)胞的功能。通過影響這些病
毒復(fù)制所必需要的細(xì)胞功能，就有可能抑制病毒在受感染細(xì)胞中的復(fù)制。 (Ludwigetal.,TrendsMol.Med. 9, 46-51,2003)。此處，病毒不可能通過適
應(yīng)取代缺失的細(xì)胞功能。此處，在選擇壓力前，通過突變避免上述問題也是 不可能的。這一點(diǎn)可由一A型流感病毒的例子得出，如，相對(duì)非特異性的抑 制劑可抑制細(xì)胞激酶和甲基轉(zhuǎn)移酶(Scholtissek and Muller, Arch Virol 119,111-118,1991)，激酶抑制劑選擇性地攻擊病毒需要的信號(hào)通道(Ludwig et al., FEBS Lett 561, 37-43， 2004)。
2.泛素/蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的功能
蛋白酶體在細(xì)胞和所有真核細(xì)胞的胞液中是主要的蛋白水解成分。它是 具有多種催化活性的酶復(fù)合物，占細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的1%左右。蛋白酶體在 細(xì)胞新陳代謝的各種功能中扮演了一個(gè)至關(guān)重要的角色，其主要功能是水解 錯(cuò)誤折疊的，不具功能的蛋白質(zhì)。它具有的另一功能是蛋白酶體對(duì)細(xì)胞或病 毒蛋白的降解，用于T細(xì)胞傳遞的免疫反應(yīng)，通過產(chǎn)生主要組織相容性I型 分子的多肽配體完成(for review see Rock and Goldberg, 1999)。通常來說， 蛋白酶體降解的耙標(biāo)都是通過吸附低聚態(tài)的泛素(Ub)進(jìn)行標(biāo)記的。泛素是 一種高度保留性，由76個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，其以共價(jià)鍵同目標(biāo)蛋白 連接。泛素化是一個(gè)可逆的過程，泛素分子可以通過一種泛素水解酶再從目 標(biāo)分子上脫離。目標(biāo)蛋白的泛素化和蛋白酶體的水解結(jié)合在一起通常稱為泛 素/蛋白酶體系統(tǒng)(UPS, ubiquitin/proteasome system) (for review see Rock and Goldberg, 1999; Hershko and Ciecha麗er, 1998)。
26S蛋白酶體是分子量為2.5MDa的多酶復(fù)合物，由大約31個(gè)亞基構(gòu)成。 蛋白酶體復(fù)合物的蛋白水解活性通過20S蛋白酶體實(shí)現(xiàn)，其為一個(gè)圓柱狀 的、分子量為700kDa的、由4個(gè)環(huán)形物彼此堆積而成的巨大的核心結(jié)構(gòu)。 20S蛋白酶體作為一種復(fù)雜的多酶復(fù)合物物，包括14個(gè)不同的蛋白，并且 是由兩個(gè)a-、兩個(gè)P-環(huán)，按照aP(3a的順序排列組合起來的。20S蛋白酶體的 底物特異性包括三種基本的活性類胰蛋白酶型，胰凝乳蛋白酶型和肽谷氨 酰胺-肽水解(PGPH)型或者甚至半胱氨酸蛋白酶型活性，其位于P-亞基 Z,Y和Z。 20S蛋白酶體在體外降解中，蛋白變性并不依賴于多泛素化；而 另一方面，20S蛋白酶體在體內(nèi)的酶活性通過連接的19S調(diào)控亞基調(diào)控，共 同形成具有活性的26S蛋白酶體顆粒。19S調(diào)控亞基與多泛素化的蛋白的識(shí) 別和目標(biāo)蛋白的非折疊有關(guān)。26S蛋白酶體的活性是依賴于ATP的，并且基 本上只降解多泛素化蛋白質(zhì)(for a review see Hershko and Ciechanover, 1998)。
3.蛋白酶體抑制劑
許多種藥物都是蛋白酶體抑制劑。例如化學(xué)修飾的肽醛，如三肽醛 N-苯甲氧甲酰-L-亮氨酰-亮氨酰-L-亮氨酸(zLLL，又名MG132)以及有效 的硼酸衍生物MG232。同zLLL類似，還有很多種修飾多肽，如乙烯基肽砜 (the peptide vinyl sulphone)也是蛋白酶體抑制劑(見Elliott和Ross的綜述， 2001)。還有一些天然物質(zhì)，如乳胞素(LC) (Fenteany等，1995)從鏈霉菌以 及環(huán)氧甲酮四肽中獲得，環(huán)氧甲酮四肽是放線菌類的天然代謝物(Meng et al., 1999a，b)。乳胞素是一種具有高效特異性，并且不具可逆效果的蛋白酶體抑 制劑，主要用于抑制26S蛋白酶體顆粒的胰凝乳蛋白酶型和類胰蛋白酶型的 活性(Fenteany等，1995)。乳胞素不含多肽的基本結(jié)構(gòu)，卻含有一個(gè)"內(nèi)酰 胺環(huán)、 一個(gè)半胱氨酸和一個(gè)羥丁基。乳胞素自身并不抑制蛋白酶體。然而， N-乙?；腚装彼釟埢谒芤褐兴?，得到一個(gè)乳胞素(3-內(nèi)酯變體，其能 穿過細(xì)胞膜。當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞后，(3-內(nèi)酯環(huán)開始攻擊細(xì)胞核，并且隨后酯交換卩-
亞基的蘇氨酰-l-羥基基團(tuán)(Fenteany et al., 1995)。
環(huán)氧甲酮四肽由于其高效性和特異性，被認(rèn)為是迄今為止最有效的天然 蛋白酶體抑制劑(Meng等，1999; a, b)。還有一類很有潛質(zhì)的人造蛋白酶體抑 制劑是硼酸-肽衍生物，尤其是被稱為"PS-341"的化合物吡喃基-苯基-亮氨 酸基-硼酸。PS-341在生理環(huán)境中非常穩(wěn)定并且在靜脈注射后具有生物可接 受性(Adams and Stein, 1996; Adams et al., 1999, US 1,448，012TW01)。
4.蛋白酶體抑制劑的臨床應(yīng)用
抑制蛋白酶體作為細(xì)胞蛋白酶的活性，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、整 細(xì)胞的蛋白水解以及MHC-I抗原途徑的改變(見CiechaiKwer酰等的綜述, 2000)。因此，對(duì)蛋白酶體的所有酶活性的持續(xù)抑制無法與細(xì)胞的存活結(jié)合， 因此無法與整個(gè)生物體的存活結(jié)合。然而，特別的，有可逆作用的蛋白酶體 抑制劑，可以選擇性地抑制26S蛋白酶體的單獨(dú)的蛋白水解活性，而不影響 其他的細(xì)胞蛋白酶。最初的對(duì)蛋白酶體抑制劑的臨床研究(Adams等，1999) 表明這種物質(zhì)種類具有巨大的藥用潛能，具有各種應(yīng)用基礎(chǔ)(見Elliot和Ross 的綜述,2001)。近年來，蛋白酶體抑制劑作為一種全新的治療理念，引起人 們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，特別是它在癌癥和炎癥病狀治療中的應(yīng)用(Emot和Ross 的綜述，2001)。由"Millennium Inc."公司(Cambridge, MA， USA)開發(fā)的蛋白酶 體抑制劑，尤其是硼酸的二肽衍生物和化合物PS-341,主要用于抗炎癥、免 疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤治療(Adams等，1999)。
抑制病毒感染的蛋白酶體抑制劑的應(yīng)用已經(jīng)討論許多。尤其是Schubert 等人(2000 a， b)將蛋白酶體抑制劑用于抑制HIV-l和HIV-2病毒的組裝、釋 放以及蛋白水解成熟等。該作用是基于HIV蛋白酶特異性地阻斷了 gag多聚 蛋白的水解途徑，而蛋白酶體抑制劑并不影響病毒蛋白本身的酶活性。與 UPS的進(jìn)一步的關(guān)系在勞氏肉瘤病毒RSV (Patnaik等，2000)、猿免疫缺陷病 毒SIV (Strack等，2000)和埃博拉病毒等的出芽(Harty等，2000)中也有報(bào)道。
后者的研究表明(Harty等，2000)，細(xì)胞泛素連接酶與埃博拉病毒的基質(zhì)蛋白 有相互的作用。
5.與蛋白酶體抑制劑相關(guān)的專利文獻(xiàn)
蛋白酶體抑制劑及其醫(yī)學(xué)用途是許多專利和專利申請(qǐng)的主題。美國專利 5,780,454A(Adams等)中記載了硼酸類化合物、酯類化物、它們的合成以及 作為蛋白酶體抑制劑的應(yīng)用。在細(xì)胞中對(duì)NF kappa B的抑制被認(rèn)為是蛋白 酶體抑制劑的機(jī)理。
國際專利申請(qǐng)WO 98/10779的主題是蛋白酶體抑制劑在治療寄生蟲感 染中的應(yīng)用。
在國際專利WO 99/15183中，其蛋白酶體抑制劑是用于自身免疫缺陷疾 病的治療。其還涉及UPS在NF-kB傳遞的HIV-1 LTR啟動(dòng)子激活中的作用， 以及細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄過程，該轉(zhuǎn)錄過程并不是HIV復(fù)制所必需的。專利并沒 有記載蛋白酶體抑制劑能阻礙HIV病毒的復(fù)制。NF-kB的途徑當(dāng)然不適合 于此。
另外還有一些其他的醫(yī)療用途治療纖維化疾病(US 2005/222043A);防 止移植排斥和感染性休克(EP 0967976A);治療血管收縮(WO 02/060341 A); 或治療內(nèi)皮損傷(WO 2004/012732A)。
還有專利記載了蛋白酶體抑制劑在心臟病適應(yīng)癥中的應(yīng)用(DE 10040742A)。
專利申請(qǐng)EP 1430903A1，即US2004/0106539A1的發(fā)明主題是蛋白酶體 抑制劑在治療病毒感染中的應(yīng)用。其中使用蛋白酶體抑制劑作為抑制逆轉(zhuǎn)錄 酶病毒釋放、成熟和復(fù)制的方法。人類免疫缺陷病毒(HIV)的例子說明，蛋 白酶體抑制劑抑制了gag蛋白的加工、病毒顆粒的釋放、被釋放的病毒顆粒 的感染以及病毒的復(fù)制。蛋白酶體可以用于逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的治療和預(yù)防人類 和動(dòng)物的引起自身免疫缺陷的晶狀病毒的感染，特別是AIDS或HIV導(dǎo)致的
癡呆，蛋白酶體還能和其他抗逆轉(zhuǎn)錄酶病毒藥物聯(lián)用。
在專利申請(qǐng)EP 1326632 Al中，提出了處理方法、治療、抑制肝炎病毒 感染的方法以及抑制與其緊密相連的肝炎發(fā)病機(jī)理和疾病。在藥物制劑中用 于抑制肝炎病毒釋放、成熟和復(fù)制的藥物，作為活性成分，具有共同的性質(zhì)， 即其抑制細(xì)胞中的26S蛋白酶體。這包括上面所述的所有蛋白酶體抑制劑， 其能夠影響泛素/蛋白酶體途徑的活性，特別是能夠影響26S和20S蛋白酶 體復(fù)合物的酶活性。因此，該發(fā)明主要用于肝炎感染的抗病毒治療，特別是 用于防止急慢性HBV-和HCV感染的發(fā)生和持續(xù)，以及防止由此引起的肝 癌。
蛋白酶體抑制劑也能用于處理、治療和抑制黃科病毒感染(WO 2003/084 Al)。在藥物制劑中用于抑制黃科病毒釋放、成熟和復(fù)制的藥物，作為活性 成分，具有共同的性質(zhì)，即抑制細(xì)胞中的26S蛋白酶體。
蛋白酶體抑制劑同樣也被用來治療病毒感染，尤其是引起SARS (嚴(yán)重 急性呼吸綜合癥)的冠狀病毒感染。
然而，泛素/蛋白酶體途徑對(duì)流感病毒復(fù)制的重要性，或者蛋白酶體抑制 劑在預(yù)防和/或治療流感病毒感染中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。
在德國專利申請(qǐng)DE 103 00 222 Al中記載了用于抑制IVA復(fù)制的活性成 份，其特異性的抑制NF-KB信號(hào)途徑中的成分。該專利說明書中除提到了多 種相關(guān)的特異性-作用的NF-kB抑制劑外，也提到了蛋白酶體抑制劑有可能 作為活性成分，但是沒有對(duì)此提供足夠詳細(xì)的任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。相反，它完全 是推測(cè)認(rèn)為蛋白酶體抑制劑同樣影響NF-kB信號(hào)傳遞途徑。德國專利DE 103 00 222A1的明顯缺陷就是它至今還錯(cuò)誤地認(rèn)為蛋白酶體抑制劑對(duì)NF-kb活 性的作用與對(duì)流感病毒的抗病毒作用有關(guān)。因此，其沒有提供生產(chǎn)制藥學(xué)上 有效的組合物的可能性，該組合物含有至少一種蛋白酶體抑制劑和/或至少一 種UPA抑制劑，并且適用于治療IAV病毒感染。德國專利DE 103 00 222 Al 中也沒有提供蛋白酶體抑制劑對(duì)流感病毒的抗病毒效果。相反地，本發(fā)明將
提供，要達(dá)到蛋白酶體抑制劑對(duì)NF-KB活性的抑制效果，蛋白酶體抑制劑的 劑量要很高，在標(biāo)準(zhǔn)給藥條件下，這種劑量在生物體內(nèi)是無法達(dá)到的；并且
由臨床實(shí)驗(yàn)可知，蛋白酶體抑制劑在此濃度時(shí)有很大的毒性，產(chǎn)生副作用，
從而不具有醫(yī)學(xué)合理性。因此，專利DE 103 00 222A1不能說明蛋白酶體抑 制劑是可以用于生產(chǎn)抗流感病毒的抗病毒藥物組合物。
國際專利WO 00/33654A1記載了 HIV-1蛋白酶抑制劑-利托那韋作為蛋 白酶體抑制劑的用途。這種蛋白酶抑制劑在濃度約為10pg時(shí)，即比特異性 蛋白酶體抑制劑的有效濃度低10000倍，對(duì)蛋白酶體具有非特異性作用。此 外，這種極高的濃度不具有生理適用性。由此可以推知，利用利托那韋永久 性抑制UPS對(duì)感染HIV的人采用高劑量的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)行治療的方法 (HAART)，由于持續(xù)缺少26S蛋白酶體，必將產(chǎn)生很大的毒副作用。而迄 今為止，都沒有向所有用利托那韋治療的病人描述這種情況。同樣地，該專 利也沒有任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支持這種純理論的，同時(shí)也已被證明確實(shí)是錯(cuò)誤的 推斷。當(dāng)然，利托那韋作為HIV的蛋白酶抑制劑，的確抑制了HIV病毒的 活性，但是，這并不是由于它非特異性的作用于蛋白酶體，而是在適當(dāng)?shù)闹?療濃度下排外地、選擇性地抑制fflV病毒的蛋白酶。利托那韋只有在治療時(shí) 不可達(dá)的高濃度下可以抑制26S蛋白酶體，并且也只有利托那韋可以達(dá)到如 此效果，迄今為止，還沒有其他的HIV蛋白酶抑制劑有此效果。基本上，利 托那韋在生物體內(nèi)對(duì)UPS有這種奇特的效果。在專利WO 00/33654 Al中， 也純理論性的提到了流感病毒，但也只是將其與提高免疫狀況聯(lián)系在一起， 特別關(guān)注CD4+T細(xì)胞的活性。而沒有提到對(duì)流感病毒的直接抗病毒作用。 此外，該專利中也沒有說明蛋白酶體抑制劑可以作為抗病毒藥物用于生產(chǎn)治 療流感病毒的具有藥用效果的藥物組合物。
國際專利申請(qǐng)WO 03/064453 A2的主題是俗稱的特洛伊病毒抑制劑，其 含有蛋白酶體抑制劑和特洛伊多肽。這種抑制劑也可以用于流感病毒的治 療。然而，在此專利中同樣缺少確鑿的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明所述的抗流感病毒的抗
病毒效果是由特洛伊病毒抑制劑產(chǎn)生的。此外，專利中也沒有說明特洛伊病 毒抑制劑的這些可能存在的效果是通過對(duì)病毒26S蛋白酶體的特異性抑制 而產(chǎn)生的。進(jìn)一歩推測(cè)，只有通過特洛伊組分，蛋白酶體抑制劑才能到達(dá)靶 細(xì)胞，然后產(chǎn)生這種特異性效果，這同樣缺乏確鑿的證據(jù)。
因此，專利WO 03/064453 A2中沒有說明使用蛋白酶體抑制劑治療流感
病毒o
泛素連接酶抑制劑是專利WO 2005/007141 A2的主題。其記載了抗病毒 組分、抗癌癥藥物和用于治療神經(jīng)分裂癥的化合物。專利中并沒有提及流感 病毒。另外，該發(fā)明和其他公共出版物都沒有表明過泛素連接酶能中斷流感 病毒的復(fù)制。
總的來說，迄今為止，在所有的蛋白酶體抑制劑的用途中都沒有提到它 們對(duì)流感病毒的作用以及它們?cè)谥委熈鞲胁《靖腥局械闹委熡猛?。同樣地?也沒有討論蛋白酶體抑制劑對(duì)治療流感病毒感染的效果。此外，也沒有測(cè)試 過蛋白酶體抑制劑是否抑制了流感病毒的組裝和釋放。同樣地，至今沒有報(bào) 道過流感病毒感染和UPS之間的聯(lián)系。在此基礎(chǔ)上，使用細(xì)胞泛素連接酶 抑制劑和泛素水解酶抑制劑都是具有新穎性的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根本的任務(wù)是制備適于治療流感病毒感染的藥物。這類藥物對(duì)人 類和動(dòng)物中的流感病毒感染有抗病毒效果。根據(jù)本發(fā)明的權(quán)利要求的特征， 通過引入U(xiǎn)PS抑制劑能達(dá)到發(fā)明目的。本發(fā)明的蛋白酶體抑制劑和泛素連 接酶或泛素水解酶抑制劑都有此作用。
根據(jù)本發(fā)明，在藥物制劑中的具有抗病毒效果的藥物含有作為活性成分 的蛋白酶體抑制劑和泛素連接酶或泛素水解酶抑制劑。本發(fā)明所述的新型藥 物可以用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染，特別是A型流感病毒感染。
本發(fā)明的特征可參見權(quán)利要求書。
此外，本發(fā)明的藥物還可以用于預(yù)防和/或處理、治療和抑制正黏液病毒 感染。在動(dòng)物模型中，使用本發(fā)明的藥物抑制了感染的擴(kuò)散和因此產(chǎn)生的體 內(nèi)疾病的發(fā)展。因此，該藥物可以防止流感病毒感染人類和動(dòng)物，或者能進(jìn) 一步治愈已有的感染。
藥物制劑有助于解決本發(fā)明的任務(wù)，藥物制劑適用于抑制流感病毒，尤 其是IAV病毒的釋放、成熟和復(fù)制。
本發(fā)明的制劑的特征在于其至少含有一種蛋白酶體抑制劑作為有效成 分。此外，這些藥物還可以含有其他的UPS成分。這涉及泛素連接酶和/或 泛素水解酶，如調(diào)控蛋白泛素化的酶。因此，本發(fā)明的目的， 一方面可通過 蛋白酶體抑制劑組合物達(dá)到，另一方面可通過泛素連接酶和/或泛素水解酶達(dá) 到。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，同樣地使用純的蛋白酶體抑制劑，其具有顯
著的高膜滲透性和對(duì)宿主細(xì)胞26S蛋白酶體的高特異性。
根據(jù)本發(fā)明一較佳實(shí)施例，抗病毒效果在IAV病毒感染的細(xì)胞中尤其
好。它先誘導(dǎo)流感病毒感染細(xì)胞的凋亡，由此生物體內(nèi)被感染的細(xì)胞率先死 亡。同時(shí)通過抑制流感病毒的組裝和成熟，從而中斷感染病毒顆粒的釋放和 制造。其總體效果就是，通過阻礙病毒的復(fù)制和移除有機(jī)體內(nèi)制造病毒的細(xì) 胞，達(dá)到治療的效果。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，傳統(tǒng)的蛋白酶體抑制劑都可以用來抗擊流感
病毒感染。為此，應(yīng)該首先使用那些只與26S蛋白酶體的P-亞基中具有催化 活性的羥基-蘇氨酸基發(fā)生相互作用的，由此只特異性的抑制蛋白酶體的抑 制劑。本發(fā)明另一實(shí)質(zhì)性要素和驚人的效果在于對(duì)UPS的抑制更好的誘
導(dǎo)流感病毒感染細(xì)胞的死亡(凋亡)。
通過引入至少一種蛋白酶體抑制劑和/或至少一種泛素連接酶或泛素水 解酶抑制劑來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果。根據(jù)本發(fā)明，開發(fā)了用于治療病毒感染的
藥物。在藥物制劑中，該藥物含作為活性成分的UPS抑制劑，用于抑制流 感病毒。根據(jù)本發(fā)明較佳的實(shí)施例，所述的物質(zhì)作為蛋白酶體抑制劑使用，
其能抑制、調(diào)控或采用別的方式影響UPS的活性。
所述的物質(zhì)作為蛋白酶體抑制劑，還可以特異性地影響完整的26S蛋白
酶體復(fù)合物的酶活性和游離的、具有催化活性的、不與調(diào)控亞基組裝的20S 蛋白酶體結(jié)構(gòu)的酶活性。這些抑制劑可以抑制26S或者甚至是20S蛋白酶體 復(fù)合物的一種、兩種或所有三種的基本的蛋白水解活性(胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶和肽谷氨?；乃饣钚?。
本發(fā)明還提供了能作為蛋白酶體抑制劑的物質(zhì)，其可以被高等真核細(xì)胞 吸收，在進(jìn)入細(xì)胞后同26S蛋白酶體的P-催化亞基作用，從而可逆或不可逆 的抑制蛋白酶體復(fù)合物中的一種或所有的蛋白水解活性。
本發(fā)明還引入了能作為特效蛋白酶體抑制劑的物質(zhì)，其被細(xì)胞吸收后， 選擇性地抑制26S蛋白酶體的單個(gè)酶活性，并且也選擇性地抑制蛋白酶體的 特殊組裝形式，如免疫蛋白酶體。免疫蛋白酶體是26S蛋白酶體的特殊組裝 形式，尤其在受到干擾素處理的剌激后組裝形成。當(dāng)與IAV感染反應(yīng)時(shí)也能 形成免疫蛋白酶體。因此，免疫蛋白酶體的特異性抑制獨(dú)特的體現(xiàn)了蛋白酶 體抑制劑在IAV感染中的抗病毒效果。因此，本發(fā)明也提供了這些可以選擇 地抑制免疫蛋白酶體所述的物質(zhì)。
本發(fā)明還涉及用于抑制泛素連接酶和/或泛素水解酶的活性的藥物。這些 也屬于細(xì)胞因子，其與單泛素或多泛素發(fā)生相互反應(yīng)。多泛素化通常被認(rèn)為 是26S蛋白酶體水解蛋白識(shí)別信號(hào)，對(duì)泛素化途徑的影響也同樣的調(diào)節(jié)蛋白 酶體的活性。
在本發(fā)明中，作為蛋白酶體抑制劑的藥物可以以各種形式攝入體內(nèi)，可 以是口服膠囊的形式、有或沒有細(xì)胞特異性輸送形式、靜脈注射、肌肉注射、 皮下注射、氣霧劑吸入的形式；或另外，由于使用特殊的給藥方式和劑量， 對(duì)特定的細(xì)胞和器官呈現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性和/或高的選擇性，并且沒有或只有 很小的副作用，和相對(duì)較高的代謝半衰期和相對(duì)小的機(jī)體清除率。
本發(fā)明與專利DE 103 00 222A1中描述的解決方法相比，其決定性差別
在于本發(fā)明顯示蛋白酶體抑制劑對(duì)IAV病毒復(fù)制的特異性效果不包括
NF-KB信號(hào)傳遞途徑，然而涉及一個(gè)完全不同的細(xì)胞途徑，即在IAV病毒感 染中釋放具感染性的子代病毒的泛素蛋白酶體途徑(UPS)。蛋白酶體抑制 劑對(duì)IAV病毒感染的抗病毒效果首次用實(shí)驗(yàn)方法和在活的有機(jī)體內(nèi)得到了 證明。因此，本發(fā)明證明蛋白酶體抑制劑能同樣的影響NF-kB信號(hào)傳遞途 徑的論斷是錯(cuò)誤的。本研究結(jié)果清楚地表明(見實(shí)施例)，當(dāng)體內(nèi)蛋白酶體 抑制劑處于有效濃度時(shí)，生物體內(nèi)病毒的NF-kB信號(hào)傳遞途徑?jīng)]有受到影
此外，作為蛋白酶體抑制劑的物質(zhì)可以是以其天然的形態(tài)，從微生物或 其他天然來源中分離得到、通過化學(xué)修飾天然物質(zhì)得到、完全是人工合成制 造得到、通過基因治療方法在體內(nèi)合成得到、或通過基因工程方法在體外或
微生物體中制造得到。這些物質(zhì)包括
① 天然的蛋白酶體抑制劑
環(huán)氧甲酮四肽(Epoxomycin )禾卩Eponemycin; 阿克拉霉素A (AclacinomycinA，又稱阿柔比星Aclarubicin); 乳胞素及其化學(xué)修飾物，特別是具有細(xì)胞膜穿透性的變異體"乳胞素(3-內(nèi)酯變體"；
② 合成制造的
化學(xué)修飾的醛基肽如N-芐氧羰基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-L-亮氨酸(又名 MG132或zLLL)，及其硼酸其衍生物MG232; N-芐氧羰基-亮氨酸-亮氨酸-正纈氨酸-H(又名MG115);N-乙?；?L-亮氨酸-L-亮氨酸-L-正亮氨酸(又名 LLnL); N-節(jié)氧羰基-異亮氨酸-谷氨酸(OBut)-丙氨酸-亮氨酸-H(又名PSI);
多肽，其c末端為環(huán)氧酮(又名Epoxomicin / Epoxomycin or Eponemycin);乙烯基砜(如節(jié)氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基 砜或4-羥基-5-碘-3-硝基苯乙?；?L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基砜, 又名NLVS);乙二醛基或硼酸殘基(如吡唑基-CONH(CHPhe)CONH(CH-異
丁基)-B(OH)2)又名"PS-431"或苯?；?Bz)-苯丙氨酸-boroLeu、苯乙?；?-亮氨酰-亮氨酰-boroLue、芐氧羰基-Phe-boraLeu;頻哪醇酯，如芐氧羰基 (Cbz)-亮氨酰-亮氨酰-boroLeu-頻哪醇酯； 和
特別合適的是C末端含有環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)的多肽和多肽衍生物，如環(huán)氧甲酮 四肽(Epoxomicin，分子式為C28H86N407)禾口 Eponemycin (分子式為 C20H36N2O5);
尤其是二肽硼酸衍生物，特別是化合物PS-296 (8-喹啉基-磺酰
-CONH-(CH-萘基)-CONH(-CH-異丁基)-B(OH)2);化合物ps-303 (nh2(ch-
萘基-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2);化合物PS-321 (嗎啉基-CONH-(CH-萘 基)-CONH-(CH-苯丙胺酰)-B(OH)2);化合物PS-334 (CH3-NH-(CH-萘基 -CO麗-(CH-異丁基)-B(OH)2);化合物PS-325 (2-苯酚-CONH-(CH-homo-苯 丙胺酰)-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2);化合物PS-352 (苯丙胺酰 -CH2-CHrCONH-(CH-苯丙胺酰)-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2);化合物 PS-383 (吡啶基-CONH-(CHpF-苯丙胺酰)-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2;這里 也包括己經(jīng)由亞當(dāng)斯等人于1999年報(bào)道過的化合物。除了 Epoxomicin和 Eponemycin,硼酸多肽衍生物也是特別合適的化合物。這些蛋白酶體抑制劑 都很有效，對(duì)蛋白酶體都具有很好的特異性，不會(huì)抑制細(xì)胞中的其他蛋白酶， 因此沒有副作用。
在本發(fā)明中，所述的作為蛋白酶體抑制劑的藥物，均具有意想不到的效
果
通過抑制流感病毒的復(fù)制，從而阻斷傳染性子代病毒的產(chǎn)生，防止流感 病毒在有機(jī)體中進(jìn)一步蔓延；
抑制受感染細(xì)胞中流感病毒的釋放； 限制急性流感病毒感染的蔓延；
抑制流感病毒新感染或反復(fù)感染而引起的病毒血癥，并增強(qiáng)自身疫系統(tǒng)
和/或使用效果相似或不同的已知藥物消除病毒的成功率。
本發(fā)明的技術(shù)特征反應(yīng)在各項(xiàng)權(quán)利和說明書中，其中單個(gè)和多個(gè)技術(shù)特 征都能結(jié)合效果實(shí)施例體現(xiàn)，為此要求保護(hù)所述的技術(shù)特征。本發(fā)明還涉及 已知元素和新元素的結(jié)合應(yīng)用——蛋白酶體抑制劑一則和泛素連接酶，二則 和泛素水解酶。
在本發(fā)明中，蛋白酶體抑制劑用于
治療人類和動(dòng)物中由流感病毒和相關(guān)負(fù)鏈RNA病毒造成的流感病毒感 染及其相關(guān)疾??；
作為用于影響、抑制或調(diào)控泛素/蛋白酶體途徑的藥物；
作為用于影響完整的26S蛋白酶體復(fù)合物的酶活性的藥物，和作為用于 影響游離的、不與調(diào)控亞基組裝的、具有催化活性的20S蛋白酶體結(jié)構(gòu)的酶 活性的藥物，以及作為選擇性抑制免疫蛋白酶體的藥物。
在本發(fā)明中，UPS抑制劑的用途還在于
防止疾病的爆發(fā)，并減少已感染人體中感染的爆發(fā)；
預(yù)防由于接觸傳染性生物樣品、被感染的人群及其附近環(huán)境而引起的系 統(tǒng)性流感病毒感染。
在本發(fā)明中，UPS抑制劑既能系統(tǒng)給藥又能局部給藥，較佳的是氣霧化 給藥。本發(fā)明的蛋白酶體抑制劑的活性成分可以聯(lián)合至少一種其他抗病毒有
效物質(zhì)用以預(yù)防和/或治療流感病毒引起的感染。


圖h蛋白酶體抑制劑的氣霧劑形式治療Balb/c小鼠
圖1A是小鼠的溫度數(shù)據(jù)圖，圖1B是小鼠的身體活性數(shù)據(jù)圖。分別采 用蛋白酶體抑制劑(紅線)和溶劑(黑線)治療小鼠，每日治療3次。圖中 的數(shù)據(jù)是6只小鼠測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值，共測(cè)量了 288次(每隔5分鐘測(cè)量一 次)。
圖2:蛋白酶體抑制劑對(duì)抑制流感病毒復(fù)制的有效性-
先將A549細(xì)胞(2xl06，圖2A、 2B)和MDCK細(xì)胞(4xl06，圖2C)在標(biāo) 示濃度的特定蛋白酶體抑制劑中預(yù)培育l小時(shí)。然后，將其感染禽流感病毒 A/FPV/Bratislava/79(H7N7)(多重感染，MOI = 0.01)。分別在感染后的8h， 24h和36h，收集培養(yǎng)基上清液，在MDCK細(xì)胞中采用空斑法測(cè)定病毒滴度。
圖3:觀察時(shí)間24小時(shí)內(nèi)，蛋白酶體抑制劑的抗病毒有效濃度條件下對(duì) MDCK細(xì)胞無毒性
(圖3A， 3B， 3C)采用一定濃度的蛋白酶體抑制劑處理MDCK細(xì)胞 (2xl0"。在此毒性試驗(yàn)中，用細(xì)胞凋亡釋放物質(zhì)星孢菌素處理MDCK(0.3 pM)
(圖中的粗黑線條)。在16h或24h后，收集貼壁細(xì)胞和上清液中細(xì)胞，用 50嗎/ml的碘化丙啶染色。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BDFACScan)分析處理。從圖 中可以看出，相對(duì)于未處理實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的存活率。
圖4:在抗病毒有效濃度范圍內(nèi)，蛋白酶體抑制劑無法防止TNFa誘導(dǎo)的IkBoi 的降解.-
將A549細(xì)胞(2xl06，圖4A、 4B)和HEK293細(xì)胞(4X 106，圖4C、 4D) 在標(biāo)示濃度的特定蛋白酶體抑制劑中預(yù)培育l小時(shí)。然后，將所有的細(xì)胞用 20 ng/ml的TNFa重組體激活15分鐘后將細(xì)胞裂解；將裂解產(chǎn)物用SDS凝 膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；用具有IkBoi特異性的兔血清(Santa Cruz Biotechnologies公司)檢測(cè)IkB(x的降解。
圖5: MG132抑制流感病毒的復(fù)制
在MG132(10iiM)存在下，用FPV(MOhl)感染A549細(xì)胞。24h后，收
集上清液，采用空斑法測(cè)定子代病毒滴度。
圖6: MG132抑制TRAIL和FasL的病毒誘導(dǎo)性誘導(dǎo)
用FPV (MOPl)感染A549細(xì)胞，在含MG132 (10)iM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 24h后，將細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，并用抗-TRAIL和抗-CD95L染色。
圖7: MG132對(duì)受感染小鼠的抗病毒效果
用FPV感染C57B1/6小鼠(10VU，滴鼻感染)，8例小鼠通過在籠中霧 化吸入MG132進(jìn)行處理(實(shí)線)，還有14例小鼠未經(jīng)處理(虛線)。對(duì)于籠中 處理，用2ml lmM的MG132 (Sigma公司)氣溶膠對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行為期5 天的治療。每天，在第一次感染時(shí)刻的前1小時(shí)開始處理，持續(xù)5天。每天 測(cè)量動(dòng)物的體重。如圖可見感染FPV的小鼠在MG132處理和未經(jīng)處理?xiàng)l件 下的存活曲線。
字母縮寫列表
DNA 脫氧核糖核酸
kDa 千道爾頓(分子量單位)
Ki 抑制常數(shù)
LC 乳胞素
MDa 百萬道爾頓
MHC 主要組織相容性復(fù)合物
NLVS 蛋白酶體抑制劑z-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸-乙烯基砜(NLVS)
PGPH 肽谷氨酰基肽水解
PI 蛋白酶體抑制劑
PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
RNA 核糖核酸
RSV 勞氏肉瘤病毒
RT 逆轉(zhuǎn)錄酶
Ub 泛素 UPS 泛素/蛋白酶體系統(tǒng) Vero-Zellen 人類永久轉(zhuǎn)化細(xì)胞株Vero VprfflV-l蛋白Vpr
zLLL 三肽醛N-芐氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸
具體實(shí)施例方式
下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在 所述的實(shí)施例范圍之中。
實(shí)施例l:用氣霧劑治療小鼠后，蛋白酶體抑制劑沒有顯示出任何有毒副作 用。
為了考察蛋白酶體抑制劑在以氣霧劑形式給藥后是否存在毒副作用，用 500 nM蛋白酶體抑制劑處理6只小鼠，每天3次，持續(xù)5天。在此，2 ml 的蛋白酶體抑制劑(500 nM)是通過一個(gè)霧化器(PARI )來達(dá)到霧化效果 的。每次治療10分鐘，治療時(shí)間分別在9: 00、 12: 00和15: 00。在實(shí)驗(yàn) 中，選6例小鼠，用溶劑(DMSO/H20)處理。為測(cè)量小鼠的體溫和身體活 性，將一個(gè)小型傳感器植入小鼠體內(nèi)。并將信號(hào)接收器板置于鼠籠的底部， 此時(shí)接收器又將接收到的信號(hào)反饋到計(jì)算機(jī)中，通過特定的數(shù)據(jù)軟件來對(duì)這 些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
傳感器植入小鼠體內(nèi)后，持續(xù)5天考察小鼠的健康狀況；然后再進(jìn)行為 期5天的蛋白酶體抑制劑治療。治療期間，分別用蛋白酶體抑制劑和溶劑治 療的小鼠，其體溫(圖1A )及身體活性(圖1B )均相等。圖中以治療的 第5天為例，顯示了第5天的測(cè)量值。測(cè)量査表明，用濃度為500 nM的蛋 白酶體抑制劑對(duì)進(jìn)行5天的治療后，小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的毒副作用。因此， 蛋白酶體抑制劑在所屬濃度范圍內(nèi)可以在小鼠模型中用來研究對(duì)流感病毒 的抗病毒活性。
實(shí)施例2:在觀察期間，蛋白酶體抑制劑以濃度依賴的方式有效地阻止流感 病毒的復(fù)制，并且在有效的抗病毒濃度范圍內(nèi)對(duì)宿主細(xì)胞沒有明顯的毒副作 用。
為考察蛋白酶體抑制劑是否抑制流感病毒的復(fù)制，選用人類的A549肺
上皮癌細(xì)胞(圖2A、 2B)或者美地那美犬腎(MDCKII)上皮癌細(xì)胞(圖2C) 與給定濃度的蛋白酶體抑制劑一起預(yù)培育1小時(shí)，然后用禽流感病毒株 (A/FPV/Bratislava/79， H7N7)(多重感染，(MOI) = 0.01)感染它們。同時(shí) 進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，將未經(jīng)處理的細(xì)胞感染，確切地說，是僅用二甲亞砜(DMSO) 處理的細(xì)胞。所用物質(zhì)為ps341(10nM和100nM)、ps273(10nM和100nM)、 乳胞素(l pM和lOiiM)以及環(huán)氧甲酮四肽(10Nm， 100nM和l(iM)。在病 毒感染開始后8h和24h (圖2A)，或8h， 24h和36h(圖2B， 2C)，收 集含病毒的培養(yǎng)基上清液，在MDCKII細(xì)胞中用空斑法測(cè)定病毒滴度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白酶體抑制劑有效的抑制了高致病性流感病毒 A/FPV/Bratislava/79的復(fù)制并且該效果具有濃度依賴性。
同時(shí)，為了考察蛋白酶體抑制劑是否是通過其細(xì)胞毒性作用來間接達(dá)到 抗病毒的作用，使用抗病毒性最好的蛋白酶體抑制劑ps341、乳胞素以及 Epoxomycin在抗病毒有效濃度條件下處理MDCKII細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)2xl06)。 作為對(duì)照，采用了高細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)凋亡的物質(zhì)星孢菌素(0.3 ^m)。分別 在處理細(xì)胞16h和24h后，收集貼壁細(xì)胞和已經(jīng)死亡、脫落的細(xì)胞，用PBS 培育，用50pg/ml的碘化丙啶(PI)處理。PI可以插入死亡細(xì)胞的DNA鏈中。 通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BectonDickinsonFACScan)進(jìn)行分析。在圖3A， 3B和 3C中描述了每組中相對(duì)于未處理的對(duì)照的死亡細(xì)胞的百分比。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24小時(shí)的觀察期間，在抗病毒有效濃度條件下，蛋 白酶體抑制劑沒有明顯的毒性作用。因此，認(rèn)為圖1中所示的蛋白酶體抑制 劑的抗病毒效果是基于對(duì)細(xì)胞的毒性作用的觀點(diǎn)可以被排除。
實(shí)施例3:蛋白酶體抑制劑對(duì)流感病毒有抗病毒效果并不依賴于NF-KB作用
為了考察蛋白酶體抑制劑的有抗病毒效果其根源是否是抑制NF-kB信 號(hào)途徑，考察了蛋白酶體抑制劑存在和不存在的兩種條件下，在抑制IkBoc 蛋白(kB的抑制劑)的降解的基礎(chǔ)上，通過Western免疫印跡分析NF-kB 的TNFa-誘導(dǎo)活性。為此，將A549細(xì)胞(2xl0"或HEK293細(xì)胞(4xl0"在不 同濃度的蛋白酶體抑制劑中預(yù)培育l小時(shí)。然后，將上述細(xì)胞用20ng/nl的 TNFa處理15分鐘來誘導(dǎo)iKBa的分解。接著這些細(xì)胞在lxPBS中培育并且裂 解。其中蛋白質(zhì)的濃度通過Bradford蛋白質(zhì)分析法(Biorad)測(cè)定，并彼此連 成一條線。用SDS凝膠電泳法將蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。并 且通過lKBa特異抗血清(Santa Cruz生物技術(shù))和辣根過氧化物酶連接的二 級(jí)試劑(Amersham)，由電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)使得lKBa-的分解產(chǎn)物具有可視性。
奇怪的是，各種蛋白酶體抑制劑的抗病毒有效濃度不能有效的抑制 TNFa-誘導(dǎo)的lKBa分解，從而抑制NF-kB的活性。例如，PS341 (100 nM) 就無法阻止A549細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中l(wèi)KBa的降解(如圖4B、 4D)。而相 同濃度的PS341在受感染的A549細(xì)胞中導(dǎo)致病毒滴度的降低(如圖2A， 8h后超過2個(gè)對(duì)數(shù)水平)；同樣的，乳胞素(l ^M)降低了病毒滴度(如圖2A)， 但沒有有效的抑制IkBoc的降解(如圖4B、 4D)。
這些都證明了蛋白酶體抑制劑是通過其他的作用機(jī)理來達(dá)到抗病毒效 果的，而不是抑制NF-kB。
實(shí)施例4:在體外和體內(nèi)，蛋白酶體藥理抑制劑MG132干擾了流感病毒誘 導(dǎo)的促凋亡基因的表達(dá)和有效抑制流感病毒的復(fù)制。
為考察蛋白酶體抑制劑MG132是否干擾流感病毒的復(fù)制，研究了人類 的肺上皮細(xì)胞株A549在不含以及含有不同濃度的蛋白酶體抑制劑MG132(1， 5, l(VM)的情況下，對(duì)高致病性禽流感病毒a/fjw/bratislava/79 (多重感染，
M0I=1)的感染。在抑制劑存在的條件下，將細(xì)胞在感染前預(yù)培育30分鐘。
當(dāng)細(xì)胞感染24小時(shí)后，用空斑法檢測(cè)細(xì)胞液中傳染性子代病毒的濃度。結(jié) 果表明，在MG132存在的條件下，其效果有濃度依賴性，病毒滴度減少了 IO倍(如圖5 )。
為了考查病毒滴度的降低是否伴隨著促凋亡配體TRAIL以及 FasL/CD95L的減少，分別在不含以及含有不同濃度的蛋白酶體抑制劑 MG132 (10pM)的條件下，將人類的肺上皮細(xì)胞株A549感染高致病性禽流感 病毒a/fpv/bratislava/79 (多重感染-l)。感染病毒24小時(shí)左右，將細(xì)胞用4% 多聚甲醛固定，并加入抗TRAIL和FasL/CD95L的特異性抗體孵育。當(dāng)該抗 體與熒光染料連接后，將細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞記數(shù)儀分析(FACS)來測(cè)定促 凋亡因子的表達(dá)。流式細(xì)胞記數(shù)儀分析譜顯示，在存在MG132的條件下， 病毒誘導(dǎo)的FasL和TRAIL的表達(dá)情況顯現(xiàn)明顯減少(如圖6 )。
為測(cè)試MG132在體內(nèi)感染模型——小鼠中的抗病毒活性，將C57BL/6 小鼠(IO周大，BFAVTiibinge的品種)進(jìn)行了適用于小鼠的104感染單位的 高致病禽流感病毒a/fpv/bratislava/79的滴鼻感染。同時(shí)將14例未經(jīng)處理的 小鼠，將其放在隔離籠中，每天5次用lmMMG132的鼻用氣溶膠(8例) 進(jìn)行為期5天的治療；在第一天感染時(shí)間的前l(fā)小時(shí)開始，每天治療一次。 測(cè)定小鼠的存活率。
結(jié)果表明，經(jīng)過MG132治療的受感染小鼠其成活率明顯比未經(jīng)治療處 理的小鼠存活率要大得多(圖7)。
實(shí)施例5:材料和方法
用蛋白酶體抑制劑治療小鼠通過呼吸系統(tǒng)來治療小鼠。為此，將6只 小鼠置于呼吸管中，呼吸管同體積為8.1 x 10—4 m3的中央缸相連，將一個(gè) PARI 的霧化機(jī)(Aerosol Nebuliser; Art. no. 73-1963)連接到中央缸。在中央 缸中在1.5bar的壓力下霧化蛋白酶體抑制劑或溶劑10min(約2ml)。BALB/c 小鼠每天治療3次，分別在9:00、 12:00和15:00，持續(xù)5天；每天檢查小鼠 健康狀況兩次并測(cè)量一次體重。
監(jiān)測(cè)小鼠采用Vital View 的軟件和硬件系統(tǒng)(MiniMitterU.S.A.)監(jiān)
測(cè)小鼠的體溫和身體活性。該系統(tǒng)能產(chǎn)生小鼠的生理參數(shù)，硬件包括一個(gè)電 子發(fā)射器/接收系統(tǒng)組成。電子發(fā)射機(jī)收集小鼠的體溫和身體活性數(shù)據(jù)，每隔 5分鐘記錄一次并傳輸?shù)絇C上。Vital Viex^軟件就對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處
理。 '
為將電子發(fā)射器植入小鼠體內(nèi)，腹膜內(nèi)注射150W的Ketamin Rompun 麻醉劑麻醉小鼠。將小鼠沿著腹白線在腹部切開一個(gè)約1.5厘米的創(chuàng)口，然 后將胃割開，放入電子發(fā)射器，傷口用傷口固定器封住(autoclip 9mm; Becton & Dickinson,德國)。將小鼠放回籠中，用Vital ^6 @檢測(cè)植入是否成功。
細(xì)胞的病毒感染將成熟的細(xì)胞加入到用感染-PBS稀釋了的病毒溶液 中(PBS加1%青霉素/鏈霉素，l%Ca2+/Mg2+， 0.6%牛血清白蛋白35%)。在 37°C，細(xì)胞與特定量的病毒在培養(yǎng)器中培育30分鐘，接著重新培養(yǎng)，以將 那些沒有結(jié)合到細(xì)胞中的病毒顆粒除去。
經(jīng)過該吸附步驟后，細(xì)胞加入感染培養(yǎng)液(1%青霉素/鏈霉素，1% Ca2+/Mg2+)中，將細(xì)胞在37'C繼續(xù)培育直到細(xì)胞收獲或是測(cè)定產(chǎn)生的新一 代子病毒。
檢測(cè)感染性子代病毒的空斑法為測(cè)定病毒溶液中感染顆粒的數(shù)量，用 MDCKII細(xì)胞進(jìn)行了空斑分析試驗(yàn)。用一系列500 pl的感染-PBS對(duì)數(shù)稀釋 的病毒溶液感染細(xì)胞。在37C下，于培養(yǎng)器中培養(yǎng)30分鐘后，將病毒溶液 去除，再將細(xì)胞置于培養(yǎng)基和瓊脂的混合物中(27 ml ddH20, 5ml的10xMEM, 0.5ml青霉素/鏈霉素，1.4 ml碳酸氫鈉，0.5 ml 1% DEAE-右旋糖苷，0.3 ml 牛血清白蛋白，15 ml 3% oxoid瓊脂；500 pi Ca2+/Mg2+)。然后將細(xì)胞放置在室 溫下，直到培養(yǎng)基/瓊脂混合物凝固，然后再將其在37。C時(shí)培育2至3天， 直到形成一個(gè)可見的溶解細(xì)胞的斑塊。在培養(yǎng)器中，該斑塊用1 ml的中性
紅PBD溶液染色1-2小時(shí)，使斑塊具有可視性。
碘化丙啶的細(xì)胞染色碘化丙啶可以滲透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜并插入的細(xì)
胞核的DNA鏈中。因此，可以用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)垂死和死亡細(xì)胞的熒 光來計(jì)算它們的數(shù)量。用一定濃度的蛋白酶體抑制劑處理MDCK細(xì)胞 (2xl06)。用釋放細(xì)胞凋亡物質(zhì)Staurosporin(0.3 pM)處理MDCK細(xì)胞，以進(jìn) 行毒性試驗(yàn)。16h或24h后，收集貼壁細(xì)胞和其余的細(xì)胞，用50)ag/ml的碘 化丙啶染色。再用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分析檢測(cè)(BD FACScan)。
SDS凝膠電泳以及Western免疫印跡:將要裂解的細(xì)胞先在PBS中培育， 隨后再按照每孔加入6孔的量，加入200 的裂解緩沖液RIPA (25 mM tris 緩沖液pH=8, 137 mM NaCl， 10%甘油，0.1% SDS, 0.5%脫氧膽酸鈉DOC, 1% NP40, 2 mM EDTA pH8,加入新配置的Pefablock 1:1000，抑肽酶 1:1000， Leupeptin 1:1000,釩酸鈉1:100, benzamidine 1:200)。細(xì)胞在4° C下振 搖30分鐘使其裂解，隨后用離心機(jī)在4。C ， 14 000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10 分鐘，以從細(xì)胞碎片中分離出蛋白質(zhì)。
裂解液中的蛋白質(zhì)濃度通過Biorad蛋白染料溶液來測(cè)定，并且使蛋白含 量相同。隨后，將樣本替換為5乂的樣品緩沖液(10%308,50%甘油，25%|3-巰基乙醇,0.01%溴酚藍(lán)，312 mMtris試劑)。卩-巰基乙醇的作用是通過減少二 硫鍵使蛋白質(zhì)變性。因此帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下向正電極方向 移動(dòng)，其中較大的蛋白質(zhì)在凝膠中的滯后效應(yīng)比較強(qiáng)烈。電泳凝膠包括5% 的結(jié)合膠(0.49 ml rotiphoresis凝膠30, 3.25 ml堆疊緩沖液(0.14 M tris pH 6.8, 0.11% temed, 0.11% SDS), 45 ^ 10%過硫酸銨)，其用來濃縮蛋白質(zhì)，和 10%的分離膠(3.375 ml rotiphoresis凝膠30, 2.5 ml運(yùn)行緩沖液(1.5 M tris pH 9, 0.4% temed, 0.4% SDS)， 4.025 ml aqua bidest， 200 jil 10% ammonium peroxodisulphate)，其按照分子量大小將蛋白質(zhì)分離。
凝膠注入兩片玻璃板之間，該兩片玻璃板通過間隔片保持一定距離，并 保持注入狀態(tài)。其中先注入分離膠。用異丙醇覆蓋，用于聚合，并且在acqua
bidest作用下培育。再在樣品室中將結(jié)合膠傾注在分離膠上面，注入時(shí)不能
有氣泡。聚合完畢后，取下樣品室，將凝膠放入含有1 x SDS-PAGE緩沖液(5 mMtris，50mM甘油，0.02% SDS)的電泳池中。將變性蛋白質(zhì)和標(biāo)記物填入 袋中。以25-40mA的直流電進(jìn)行凝膠電泳。
之后，將蛋白質(zhì)從凝膠中通過電場(chǎng)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用特異性抗 體來檢測(cè)固定在硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)。這是用一種酶聯(lián)的二抗識(shí)別的， 其中連接的蛋白質(zhì)可以通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而具有可視性。在這過程中，連接 二抗的辣根過氧化物酶氧化魯米諾底物，由此，魯米諾遷移到激發(fā)態(tài)而發(fā)光， 可在X光片上顯示。
含有分離蛋白的SDS凝膠從灌注設(shè)備上取下，置于兩張被印跡緩沖液 (3.9 mM甘氨酸，4，8 mM tris， 0.0037% SDS, 10 %甲醇)浸濕的Whatman紙 上。在加滿了印跡緩沖液的濕的印跡槽進(jìn)行激發(fā)之前，將硝酸纖維素膜放在 凝膠上，其間不能有氣泡。在400nA的直流電下作用50分鐘，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 硝酸纖維素膜上。這時(shí)，蛋白質(zhì)從陰極移向陽極。
根據(jù)該印跡程序，室溫條件下，用5%奶粉在lxTBST緩沖液(50 pM tris, 0.9% NaCl， 0.05%吐溫20， pH 7.6)抑制非特異性結(jié)合位點(diǎn)至少45分鐘， 來防止抗體和膜非特異性結(jié)合。膜隨后在一抗(IkBoc，稀釋1:1000, Santa Cruz Biotechnologies)中4。C培育晃動(dòng)過夜。然后用1 x TBST清洗3遍，每 次洗10分鐘，洗去非接合的抗體殘留物。之后，室溫下將膜在二抗中漂洗 1-2小時(shí)。
用1 x TBST再清洗三次后，將膜放入含有化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(ECL即增 強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)的環(huán)境中，通過添加化學(xué)發(fā)光基質(zhì)(250 mM魯米諾,90mM香 豆酸，1 M tris/HCl pH 8.5， 35% H202);該基質(zhì)含有的魯米諾可以用辣根過氧 化物酶來代替和二抗的鍵合。膜在此種基質(zhì)中培育1分鐘，然后干燥，放置 在X光片盒中，在這其中的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使其在X光片上顯現(xiàn)。
流式細(xì)胞記數(shù)分析TRAIL和FasL Expression是借助于細(xì)胞內(nèi)熒光染
料與抗體連接的。A549細(xì)胞感染病毒株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (MOI=5) 8小時(shí)，其中加入2)iM的莫能菌素以抑制蛋白質(zhì)的分泌。然后，將細(xì)胞置 于4"C的4X多聚甲醛溶液中固定20分鐘，然后用滲透緩沖液(0.1%皂素/1% FBS/PBS)洗凈。然后用抗TRAIL, FasL的初級(jí)抗體孵育或者進(jìn)行同位素測(cè)試 (抗體由BectonDickinson公司提供)。接著細(xì)胞用連接生物素-Sp的羊抗鼠 IgG (Dianova)和鏈酶親和素-Cy-chrome (Becton Dickinson)染色。用 FACScalibur流式細(xì)胞記數(shù)儀(Becton Dickinson)在FL3通道內(nèi)進(jìn)行熒光測(cè)定。 小鼠的感染及治療10星期大的C57BL/6小鼠(自有品種FLI, Tiibingen) 用于感染和治療實(shí)驗(yàn)。在用5x103至104 pfli濃度的A/FPV/Bratislava/79 (H7N7)病毒株鼻內(nèi)感染小鼠前1小時(shí)內(nèi)，采用吸入氣霧劑形式處理小鼠，2ml 的lmM MG132 (Sigma)稀釋液每天一次。MG132溶液氣霧化的方法是小 鼠Minivent系統(tǒng)(Hugo Sachs Electronics- Harvard Apparatus)同霧化機(jī)(Hugo Sachs Electronics- Harvard Apparatus)連接達(dá)至!j霧化作用。
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23. Webster et al., Microbiol Rev, 56, 152-79, 199權(quán)利要求
1、一種用于治療正黏液病毒感染的藥物，其特征在于所述的藥物含有至少一種蛋白酶體抑制劑和/或至少一種泛素蛋白酶體途徑(UPS)抑制劑，上述的抑制劑作為藥物制劑中的活性成分。
2、 如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所述的藥物含有蛋白酶 體抑制劑和/或泛素連接酶抑制劑和/或泛素水解酶抑制劑，上述的抑制劑作 為UPS抑制劑。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于所述的藥物對(duì)宿主細(xì)胞的26S蛋白酶體具有高特異性。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于所述的藥物只與26S 蛋白酶體的卩亞基中具有催化活性的羥基-蘇氨酸基團(tuán)發(fā)生相互反應(yīng)，并只 特異性地抑制蛋白酶體。
5、 如權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于所述的藥物在被細(xì)胞吸收后，選擇性地抑制26S蛋白酶體的單個(gè)的酶活性并且額外的選擇性地 抑制蛋白酶體的特殊組裝模式，優(yōu)選免疫蛋白酶體。
6、 如權(quán)利要求1或2所述的藥物，其特征在于所述的藥物抑制泛 素連接酶和/或泛素水解酶的活性。
7、 一種如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的藥物在制備抗病毒藥物和/或 具有抗病毒效用的藥物制劑中的應(yīng)用，其特征在于其能夠① 誘導(dǎo)流感病毒感染的細(xì)胞的凋亡，從而較佳的導(dǎo)致機(jī)體感染細(xì)胞的死亡；② 通過抑制流感病毒的組裝和成熟，中斷感染性病毒顆粒的釋放和繁殖。
8、 如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的藥物在治療流感病毒感染中的應(yīng)用。
9、 如權(quán)利要求7或8所述的用途，① 用于病毒感染的治療；② 用于影響、阻止、調(diào)節(jié)或抑制耙細(xì)胞中泛素/蛋白酶體途徑；③ 預(yù)防機(jī)體中病毒感染的爆發(fā)；④ 阻止流感病毒的釋放、成熟和復(fù)制；⑤ 誘導(dǎo)流感病毒感染細(xì)胞的調(diào)亡。
10、 如權(quán)利要求7 9中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于用于阻止流 感病毒的釋放、成熟和復(fù)制。
11、 如權(quán)利要求7~9中任一項(xiàng)所述的用途，用于抵抗或治療流感和相 關(guān)疾病，特別是人類和動(dòng)物的全世界流行的和地方流行的流感的爆發(fā)。
12、 如權(quán)利要求11所述的用途，其可以同已知的抗病毒藥物一起使用， 如利巴韋林、白介素、核苷類藥物、蛋白酶抑制劑、病毒激酶阻止劑、膜融 合和病毒侵入阻止劑，特別是流感病毒成分阻止劑，如神經(jīng)氨酸酶阻止劑或 M2離子通道IAV蛋白。
13、 如權(quán)利要求11和12所述的用途，用于預(yù)防疾病爆發(fā)和減少急性 感染了流感病毒的人類和動(dòng)物體內(nèi)感染的擴(kuò)散。
14、 如權(quán)利要求7 13中任一項(xiàng)所述的用途，用于抑制特殊靶細(xì)胞中的 泛素/蛋白酶體途徑，所述的耙細(xì)胞是指被流感病毒侵襲的宿主細(xì)胞。
15、 如權(quán)利要求7 14中任一項(xiàng)所述的用途，以其細(xì)胞機(jī)制影響靶細(xì)胞， 所述的細(xì)胞機(jī)制是細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡(凋亡)、細(xì) 胞激活、信號(hào)傳導(dǎo)或抗原處理，特別是NF-kB激活。
16、 如權(quán)利要求7所述的用途，用于制備能阻止流感病毒的釋放、成 熟和復(fù)制的的藥物，其特征在于所述的藥物含有至少一種蛋白酶體抑制劑 和/或至少一種泛素連接酶抑制劑和/或泛素水解酶抑制劑，上述的抑制劑作 為藥物制劑中的活性成分。
17、 如權(quán)利要求16所述的用途，用于治療流感病毒感染，其特征在于 作為蛋白酶體抑制劑的物質(zhì)，作為較高等的真核細(xì)胞的蛋白酶體抑制劑能被吸收，被細(xì)胞吸收后，與蛋白酶體的催化亞基反應(yīng)，從而可逆或不可逆的抑制26S或20S蛋白酶體復(fù)合物中的所有或部分蛋白酶體的蛋白水解活性——類胰蛋白酶型、類胰凝乳蛋白酶型和類肽谷氨?；男偷鞍酌感退饣钚?。
18、如權(quán)利要求16或17所述的用途，其特征在于所述的藥物制劑含有除蛋白酶體抑制劑以外的其他藥物，所述的藥物影響、調(diào)節(jié)或阻止細(xì)胞 泛素系統(tǒng)，如① 泛素連接酶的活性和/或② 泛素水解酶的活性③ 與泛素反應(yīng)的細(xì)胞因子的活性④ (1)與單泛素反應(yīng)的細(xì)胞因子的活性或(2)與多泛素反應(yīng)的細(xì)胞因子的活性。
19、如權(quán)利要求16~18中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于作為蛋白酶體抑制劑使用的物質(zhì)以各種形式攝入體內(nèi)，包括有或沒有細(xì)胞特異性輸送修 飾的口服膠囊的形式、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、吸入氣霧劑的形式、 或其他方式，由于使用特殊的給藥方式和/或劑量，所述物質(zhì)具有低細(xì)胞毒性， 因而沒有或只有很小的副作用，以及具有相對(duì)較高的代謝半衰期和相對(duì)小機(jī) 體清除率。
20、如權(quán)利要求16~19中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的物質(zhì)是① 以天然的形式從微生物或是其他天然來源中分離得到，或② 對(duì)天然物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾后得到；③ 全合成的物質(zhì)； 通過基因治療法在體內(nèi)合成； 通過基因工程法在體外制造，或 ⑥在微生物中； 所述的物質(zhì)作為蛋白酶體抑制劑物質(zhì)。
21、 如權(quán)利要求16 20中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的物質(zhì) 屬于下列物質(zhì)類型① 天然存在的蛋白酶體抑制劑C末端為環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)的多肽衍生物、 卩-內(nèi)酯衍生物、阿克拉霉素A (又稱阿柔比星)、乳胞素及其化學(xué)修飾變異體，如細(xì)胞膜滲透性變異體"乳胞素(3-內(nèi)酯變異體"-，② 合成的蛋白酶體抑制劑化學(xué)修飾的醛基肽，如N-芐氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸(又名MG132或zLLL)，及其硼酸衍生物MG232; N-芐氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-正纈氨酸-H (稱為MG115); N-乙酰基-L-亮氨酰 -L-亮氨酰-L-正亮氨酸(稱為L(zhǎng)LnL); N-芐氧羰基-異亮氨酰-谷氨酰(OBut)-丙氨酰-亮氨酸-H (又名PSI);③ 在C末端具有a，(3-環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)，優(yōu)選乙烯基砜的多肽，如 (1)芐氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基砜，或(2 ) 4-羥基-5-碘-3-硝基苯乙?；?L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-乙烯基 砜，(NLVS)④ 乙二醛基或硼酸殘基，如(1) 吡唑基-CONH(CHPhe)CONH(CH-異丁基)B(OH)2)，和(2) 二肽硼酸衍生物或 .⑤ 頻哪醇酯，如芐氧羰基(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-頻哪醇酯；上述物質(zhì)作為蛋白酶體抑制劑。
22、 如權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的用途，所述的環(huán)氧酮是環(huán)氧甲酮 四肽(epoxomycin, 分子式為C28H86N407)、禾口/或Eponemycin (eponemicin， 分子式為C2QH36N205);所述的環(huán)氧酮作為特別合適的蛋白酶體抑制劑。
23、 如權(quán)利要求11 17中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于 ①化合物PS-519，如卩-內(nèi)酯的和乳胞素的衍生物，即化合物1R-[1S，4R，5S]]-1-(1-羥基-2-甲基丙基)-4-丙基-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]庚烷 -3,7-dione，其分子式為C12H19N04-② 化合物PS-303 (NH2(CH-萘基-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2)和/或③ 化合物PS-321 (嗎啉基-CONH-(CH-萘基)-CONH-(CH-苯丙胺 酰)-B(OH)2)和/或 化合物PS-334 (CHrNH-(CH-萘基-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2)和/或⑤ 化合物PS-325 (2-苯酚-CONH-(CH-homo-苯丙胺酰)-CONH-(CH-異丁 基)-B(OH》;)禾口/或⑥ 化合物PS-352 (苯丙胺酰-CH2-CH2-CONH-(CH-苯丙胺 酰)-CONH-(CH-異丁基)-B(OH)2)和/或⑦ 化合物PS-383 (吡啶基-CONH-(CHpF-苯丙胺酰)-CONH-(CH-異丁 基)-B(OH)2是PS系列中特別適合的蛋白酶體抑制劑。
24、 如權(quán)利要求16所述的用途，用于影響完整的26S蛋白酶體復(fù)合物 和游離的、具有催化活性的、不與調(diào)控亞基組裝的20S蛋白酶體結(jié)構(gòu)的酶活 性。
25、 如權(quán)利要求7~24中任一項(xiàng)所述的用途，UPS抑制劑的給藥形式是 整體和局部給藥，較佳的是氣霧劑形式給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療病毒感染的藥物，特別是釋放流感傳染物的流感病毒所造成的感染。本發(fā)明的主題是含有作為活性成分的泛素蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑的藥物，尤其是含有蛋白酶抑制劑的藥物。此外，本發(fā)明還涉及蛋白酶體抑制劑的整體和局部給藥，較佳的是氣霧劑的形式給藥。本發(fā)明的蛋白酶體抑制劑的活性成分可與至少一種具有其他抗病毒活性的物質(zhì)連用，用于預(yù)防和/或治療由流感病毒引起的感染。
文檔編號(hào)A61P31/12GK101384301SQ200780005834
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2007年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月17日
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