專利名稱：抗a型流感病毒或腸病毒的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，尤其涉及一種抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物。
背景技術(shù)：
樟芝[(Antrodiacamphorate) (Zang&Su ；S. -H Wu ；Ryvaren&T. T. Chang)],又稱樟菇，屬于臺(tái)灣國(guó)寶級(jí)的珍貴藥用真菌，經(jīng)常被應(yīng)用于養(yǎng)生保健的用途。一般民間對(duì)于樟芝的稱呼為樟菰、樟內(nèi)菇、牛樟菇、牛樟芝、紅樟或紅樟芝，是臺(tái)灣特有種的菇菌類，全世界只生長(zhǎng)在臺(tái)灣山區(qū)海拔450 1500公尺間的牛樟樹(shù)干腐朽的心材內(nèi)壁或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面，非常珍貴稀少，因此又被成為“臺(tái)灣森林中的寶石”。樟芝中含有的多醇體可活化細(xì)胞、改善體質(zhì)，增進(jìn)人體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，其中另一主要有效成份-三萜類化合物，應(yīng)用于抗癌/抗發(fā)炎及保肝功能，亦已在市場(chǎng)行銷(xiāo)廣為認(rèn)可，因而樟芝有藥用真菌之王 的美譽(yù)。流行性感冒簡(jiǎn)稱為流感，是由流行性感冒病毒所引起的急性呼吸道感染疾病，常伴隨發(fā)燒、頭痛、肌肉痛、疲倦、流鼻涕、喉嚨痛以及咳嗽等癥狀，有些甚至?xí)霈F(xiàn)腹瀉、嘔吐的癥狀。相較于一般感冒，流行性感冒除了上述癥狀更為嚴(yán)重以外，對(duì)于抵抗力較弱的嬰幼兒、老年人、或原本即已患其他疾病者，容易產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡。隨著病毒的變異性越來(lái)越快，發(fā)生大規(guī)模流行的幾率越來(lái)越高，同時(shí)流感病毒對(duì)于現(xiàn)有藥物的抗藥性越來(lái)越強(qiáng)。目前為控制流感病毒感染，有抗病毒治療和疫苗可供選擇，而預(yù)防流感的疫苗則是在新病毒株出現(xiàn)之前不可能研制疫苗；通常，一個(gè)疫苗的大規(guī)模研發(fā)和制造至少需要六個(gè)月時(shí)間。因此，每年世界衛(wèi)生組織都會(huì)預(yù)測(cè)來(lái)年可能發(fā)生大規(guī)模感染的流感病毒種類，以提供藥廠提早研發(fā)和生產(chǎn)疫苗，但由于全球生產(chǎn)能力有限及生產(chǎn)設(shè)施集中在發(fā)達(dá)國(guó)家，許多沒(méi)有生產(chǎn)設(shè)施的國(guó)家在第一波流行期間將使用不到疫苗。自2009年4月中旬，美國(guó)疾管局首先鑒定出有人類感染豬源新型流感病毒A型HlNl案例以來(lái)，不到一個(gè)半月之時(shí)間，全球已有53個(gè)國(guó)家共有15510件確認(rèn)病例，其中99例死亡，死亡率為O. 64%。此豬源新型流感病毒HlNl之傳播能力強(qiáng)，已陸續(xù)在世界各地經(jīng)由旅游傳播，并有部分國(guó)家引起第二波傳染，甚至造成社區(qū)感染的現(xiàn)象。近年來(lái)，流感病毒產(chǎn)生抗原移型(Antigenic Shin)的速度增加,從1997年在香港發(fā)生的新型流感,都造成民眾以及各國(guó)衛(wèi)生單位的緊張；而且，常用的抗流感病毒藥物中，部分病毒已經(jīng)對(duì)M2抑制劑產(chǎn)生抗藥性，而最近新型流感病毒對(duì)抗流感產(chǎn)生抗藥性的案例也被WHO所證實(shí)。腸病毒(Enterovirus, EV)為一群病毒的總稱，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae),為一種正向單股RNA病毒,大小約20_30nm。依照基因序列,可分為腸病毒A、B、C、C四型。腸病毒71型(Human Enterovirus 71)被歸于人類腸病毒A型。腸病毒傳播途徑多元，主要經(jīng)由腸胃道、呼吸道傳染，也可由接觸病人分泌物傳染；腸病毒傳染力極強(qiáng)，患者在發(fā)病前幾天便可傳播病毒，潛伏期約3到5天，傳播期可達(dá)8至12周。目前腸病毒感染并無(wú)特殊用藥與疫苗，治療上多采用支持療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種抗A型流感病毒或腸病毒藥物組合物，其包含有效劑量的樟芝萃取物。
所述樟芝萃取物可為樟芝發(fā)酵液或樟芝菌絲體萃取液，所述樟芝萃取物可由水或有機(jī)溶劑進(jìn)行萃??；較佳的，由有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，所用有機(jī)溶劑可為醇類或酯類等常用的有機(jī)萃取溶劑，如乙酸乙酯。萃取步驟可為有機(jī)溶劑直接萃取，或是進(jìn)一步將有機(jī)溶劑萃取后的萃取液利用層析管柱進(jìn)行分萃。本發(fā)明所述病毒為腸病毒，例如EV71，以及A型流感病毒，例如HlNl和H3N2。進(jìn)一步地，本發(fā)明抗A型流感病毒或腸病毒藥物組合物，包含藥物上可接受的佐齊U、載體或賦形劑。所述藥物載體包含惰性成分，所述惰性成分不會(huì)與本發(fā)明化合物發(fā)生實(shí)質(zhì)反應(yīng)。所述載體為無(wú)菌水、生理食鹽水、抑菌食鹽水(包含約O. 9% mg/ml苯基醇的食鹽水)、磷酸緩沖食鹽水、漢克溶液、林格式乳糖液或其他相似載體。用于口服藥物，可依照已知方法，將其制成粉末狀、顆粒狀、錠狀、液狀、膠狀或膏狀。本發(fā)明的藥物組合物，可以食品、飲品、藥品、試劑或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品的形式提供，或是由靜脈、肌肉、上皮、腹腔、吸入、口含、口服、經(jīng)皮等途徑施用。本發(fā)明所述的有效劑量，指該化合物計(jì)量在提供給已對(duì)象后能獲得有益的效果，或者，該化合物的劑量能在體內(nèi)或體外獲得預(yù)期的活性。針對(duì)抗HlNl的有效成分，以有機(jī)溶劑(如乙酸乙酯)直接萃取的樟芝萃取物，其有效濃度為3. 125 300ug/ml，較佳為4. 688 250ug/ml，最佳為6. 25 200ug/ml。針對(duì)抗H3N2的有效成分，有效濃度為25 300ug/ml，較佳為37. 5 250ug/ml，最佳為50 200ug/ml。針對(duì)抗EV71的有效成分，有效濃度為3. 125 300ug/ml，較佳為4. 688 250ug/ml,最佳為 6. 25 200ug/ml。本發(fā)明利用深層液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)制作充分的樟芝發(fā)酵產(chǎn)品，且保留其具有生物活性的有效成分及二次代謝物質(zhì)，并完全保留原有樟芝的芳香味道及特殊有效成分。為進(jìn)一步確認(rèn)樟芝萃取物的抗病毒能力，本發(fā)明以4株樟芝發(fā)酵液(AC1-AC4)及4株樟芝菌絲體(AC1F-AC4F)在不同萃取條件下進(jìn)行H1N1、H3N2以及EV71的抗性測(cè)試。結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵液AC1-AC4未進(jìn)行任何萃取時(shí)，該4株發(fā)酵液在濃度200ug/ml時(shí)對(duì)于HlNl具有抑制活性；在濃度為100ug/ml時(shí)，對(duì)于EV71具有抑制活性；但對(duì)于H3N2則不具有任何抑制活性。在發(fā)酵液萃取后，得到ACl AC4-LPEA、AC1 AC4-LPBU及ACl AC4-LPWA等3種萃取液。其中HlNl的有效成分，ACl-LPEA在濃度100ug/ml時(shí)具有抑制活性，AC2-LPEA在濃度25ug/ml時(shí)具有抑制活性，AC3-LPEA及AC4-LPEA則在濃度50ug/ml時(shí)具有抑制活性；AC1-LPBU在濃度50 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC3-LPBU在濃度25 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2-LPBU及AC4-LPBU則在濃度200 μ g/mL時(shí)具抑制活性；AC1 AC4-LPWA皆不具抑制活性。對(duì)于H3N2部分，ACl AC4-LPEA均在濃度50 μ g/mL時(shí)具抑制活性；AC1_LPBU在濃度150 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2-LPBU AC4-LPBU則不具抑制活性；AC1 AC4-LPWA皆不具抑制活性。對(duì)于EV71部分，ACl-LPEA及AC4-LPEA在濃度6. 25 100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2-LPEA及AC3-LPEA則在濃度100 μ g/mL時(shí)具抑制活性；AC1_LPBU AC4-LPBU皆在濃度100 μ g/mL時(shí)具抑制活性；AC4-LPWA則在濃度100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，而ACl AC3-LPWA皆不具抑制活性。當(dāng)發(fā)酵液AC1-AC4直接以EA萃取，則得到萃取液ACl AC4-EA。其中對(duì)于H1N1，ACl-EA不具任何抑制活性，AC2 AC4-EA分別在濃度6. 25 μ g/mL、100 μ g/mL以及150 μ g/mL時(shí)具抑制活性。對(duì)于H3N2，ACl-EA及AC2-EA在濃度100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC3-EA及AC4-EA在濃度200 μ g/mL以及50 μ g/mL時(shí)具抑制活性。此外，對(duì)于發(fā)酵液AC2分萃后的EA層再繼續(xù)進(jìn)行粗分，得到AC2-LPEA-SI01 SI06。其中對(duì)于H1N1，AC2-LPEA-SI01 S106皆在3. 125 μ g/mL時(shí)具抑制活性。對(duì)于H3N2，AC2-LPEA-SI01 SI06 分別在 100μ g/mL、3. 125 μ g/mL,25 50μ g/mL、50 100 μ g/mL以及50 150 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2-LPEA-SI06則不具抑制活性。對(duì)于EV71，AC2-LPEA-SI01 SI05 分別在 100 150 μ g/mL,6. 25 25 μ g/mL,6. 25 50 μ g/mL、
6.25 50 μ g/mL以及100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2-LPEA-SI06僅在25 μ g/mL時(shí)具抑制活性。至于樟芝菌絲體部分，菌絲體AClF AC4F直接以EA萃取可得AClF AC4F-EA。其中對(duì)于H1N1，AClF-EA不具抑制活性，AC2F AC4F-EA分在濃度12. 5 μ g/mL,25 μ g/mL以及150 μ g/mL時(shí)具抑制活性。對(duì)于H3N2，AClF-EA及AC2F-EA在濃度100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC3F-EA不具抑制活性，AC4F-EA則在濃度150 μ g/mL時(shí)具抑制活性。對(duì)于EV71，AClF AC3F-EA 分在濃度 100 μ g/mL,50 μ g/mL 以及 6· 25 μ g/mL 時(shí)具抑制活性，AC4F-EA則不具任何抑制活性。菌絲體AC2F直接以EA萃取后(AC2F-EA)，再進(jìn)行粗分，可得到AC2F-EA-SI01 SIlOo 其中對(duì)于 H1N1，AC2F-EA-SI01、SI03、SI04、SI05、SI07 及 SI09 在濃度 3. 125 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI02在濃度6. 25 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI06及SIlO在濃度6. 25 50 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI08在濃度6. 25 100 μ g/mL時(shí)具抑制活性。對(duì)于H3N2, AC2F-EA-SI01 SI04及SI06 SI07在濃度3. 125 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI05 在濃度 100 μ g/mL 時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI08 在濃度 100 150 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI09在濃度50 100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI10不具抑制活性。對(duì)于EV71，AC2F-EA-SI01在濃度100 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI02在濃度6. 25 150 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI03僅在濃度6. 25 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI04 在濃度 6. 25 μ g/mL 時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI05 SI06 僅在濃度 12. 5 μ g/mL時(shí)具抑制活性，AC2F-EA-SI07在濃度6. 25 50 μ g/mL時(shí)具抑制活性AC2F-EA-SI08 SIlO不具任何抑制活性。因此，由本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵液及菌絲體直接以EA萃取后，在抗HlNl上具較強(qiáng)的抑制活性，其在萃取液濃度6. 25 200 μ g/mL時(shí)具有顯著的抑制病毒效果；在抗H3N2上，則濃度須提升到50 200 μ g/mL才有明顯的抑制活性；在抗EV71上，抑制活性的濃度亦為6. 25 200 μ g/mL。


圖I為本發(fā)明一種實(shí)施例ACl的萃取流程圖。圖2為本發(fā)明一種實(shí)施例AClF的萃取流程圖。圖3為本發(fā)明一種實(shí)施例AC2的萃取及分離流程圖。圖4為本發(fā)明一種實(shí)施例AC2F的萃取及分離流程圖。
具體實(shí)施例方式為更進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。一、材料 I、細(xì)胞a =Madin-Darby 犬腎細(xì)胞(MDCK 細(xì)胞)來(lái)源為 BCRC NO. 60004，接種 HlNl 與H3N2 ；b:橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD細(xì)胞)取自食品工業(yè)研究所，接種腸病毒71 ;c :培養(yǎng)液達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，BIOLOGICAL INDUSTRIES)加2mML-麩酰胺酸、I. 5g/L碳酸氫鈉、4. 5g/L葡萄糖及10%胎牛血清(Hyclone)。2、病毒a:流感病毒A(HlNl):來(lái)源為臺(tái)灣疾病管制局，此一病毒株經(jīng)定序后近似于流感病毒A/香港/470/97，其培養(yǎng)液為不含血清的DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液外加O. 2% TPCK處理的胰蛋白酶(Tosylsulfonyl Phenylalanyl Chloromethyl Ketone-treated trypsin) (Sigma) >
O.3% BSA(Sigma)及 25mM HEPES(GIBCO)；b :流感病毒A(H3N2):來(lái)源為臺(tái)灣疾病管制局，此一病毒株經(jīng)定序后近似于流感病毒A/紐約/469/2004，其培養(yǎng)液為不含血清的DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液外加O. 2% TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma) ,0. 3% BSA(Sigma)及 25mM HEPES(GIBCO)；c :腸病毒71(EV71):取自疾病管制局，其培養(yǎng)液為含2 %血清的DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液；d :流感病毒A/WSN/33 (HlNl):來(lái)源為預(yù)醫(yī)所，其培養(yǎng)液為含2%血清的DMEM標(biāo)準(zhǔn)
培養(yǎng)液。3、其它Dulbecco 氏磷酸緩沖生理食鹽水(DPBS，BIOLOGICAL STRIES)、DMS0及 96微孔盤(pán)(NunclonTMA)。二、方法I、實(shí)驗(yàn)前一天先進(jìn)行次細(xì)胞培養(yǎng)，在96微孔盤(pán)中分別種入2X IO4細(xì)胞/孔槽的MDCK細(xì)胞及4X IO4細(xì)胞/孔槽的RD細(xì)胞后，置于5%二氧化碳、37°C的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；2、隔天(約18-24小時(shí))即實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，以DPBS清洗兩次，加入100 μ L/槽的病毒培養(yǎng)液，先放置于培養(yǎng)箱中，等待測(cè)物稀釋完成后再取出進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；3、待測(cè)物先以DMSO溶解,配成濃度200mg/mL的儲(chǔ)備溶液(stock solution),再以病毒培養(yǎng)液稀釋成 200、150、100、50、25、12. 5,6. 25 及 3. 125 μ g/mL ；4、將96微孔盤(pán)取出，吸去舊的病毒培養(yǎng)液，加入50 μ L/槽稀釋好的待測(cè)物，等一個(gè)小時(shí)后再加入50 μ L/槽0. 01Μ0Ι的病毒；5、培養(yǎng)1-3天后，以顯微鏡觀察病毒，待其細(xì)胞凋亡達(dá)75%以上時(shí)才進(jìn)行細(xì)胞存活率測(cè)定(MTT assay)；6、重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次以上，求其平均。實(shí)施例I發(fā)酵液ACl與其菌絲體AClF 1、AC1分萃步驟a AC1放入燒杯中，加入20倍體積的M. Q水回溶，并將其倒入分液漏斗；b :加等體積的乙酸乙酯(EA，已經(jīng)過(guò)水飽和)進(jìn)行分萃(partition)，待分層后將上層(即EA層)取出，下層(即水層)再加入等體積的水飽和EA繼續(xù)進(jìn)行分萃，共萃取5次后，將5次的EA層合并濃縮，即得其EA層分萃物(ACl-LPEA)； c :EA分萃后的水層再繼續(xù)以等體積的正丁醇(n-BuOH，已經(jīng)過(guò)水飽和)進(jìn)行分萃，方法同b，但最后合并的正丁醇層需再以等體積的M.Q.水反萃一次，這樣即可得其正丁醇層分萃物(ACl-LPBU)；d :濃縮正丁醇分萃后的水層，即可得其水層分萃物(ACl-LPWA)；e :將AC1-LPEA、ACl-LPBU及AC1-LPWA置于防潮箱中干燥，稱重。2、ACl直接萃取步驟a :稱取ACl放入血清瓶或錐形瓶中，加入10倍體積的EA ；b :在攪拌/加熱板上，攪拌萃取(轉(zhuǎn)速5)約1-3天；c :抽氣過(guò)濾，濃縮；d :置于防潮箱中干燥，稱重，即得ACl的EA萃取物AC1-EA。3、AClF 萃取步驟a :稱取AClF放入血清瓶或錐形瓶中，加入10倍體積的EA ；b :在攪拌/加熱板上，攪拌萃取(轉(zhuǎn)速5)約1-3天；c :抽氣過(guò)濾，濃縮；d :置于防潮箱中干燥，稱重，即得AClF的EA萃取物AC1F-EA。4、抗病毒活性測(cè)試結(jié)果H1N1、H3N2及EV71a. HlNl
品 ΔΡ1ACl- ACl- ACl- * ^ * AClF-
濃ILPEA LPBU LPWA ^EA
μ^/η^\______
200++++Hl·++Hh++/-+/-
150X++++++++X+/-+/-100__+__+++__++++__+A__+A__+/-
50X+++X++/-
25X++X+/-+/-
12.5X++X+/-+/-
6.25X++X+/-+/-
3.125X+/-++X+/-+/-b. H3N2
權(quán)利要求
1.一種抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的樟芝萃取物。
2.如權(quán)利要求I所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述樟芝萃取物包含樟芝發(fā)酵液或樟芝菌絲體萃取液。
3.如權(quán)利要求I所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述樟芝萃取物以有機(jī)溶劑萃取。
4.如權(quán)利要求3所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
5.如權(quán)利要求I所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述A型病毒包含HlNl或H3N2。
6.如權(quán)利要求5所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述樟芝萃取物抗HlNl的有效濃度為3. 125ug/ml 300ug/ml。
7.如權(quán)利要求5所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述樟芝萃取物抗H3N2的有效濃度為25ug/ml 300ug/ml。
8.如權(quán)利要求I所述的抗A型流感病毒或腸病毒的藥物組合物，其特征在于所述樟芝萃取物抗腸病毒的有效濃度為3. 125ug/ml 300ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種抗病毒的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效劑量的樟芝萃取物，所述樟芝萃取物可為樟芝發(fā)酵液或樟芝菌絲體萃取液。所述樟芝萃取物由有機(jī)溶劑萃取而得。本發(fā)明所述病毒可為A型流感病毒(H1N1或H3N2)，或是腸病毒(EV71)。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102755355SQ20111010798
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者葉思見(jiàn), 賴宗賢, 鐘玉山, 黃俊智 申請(qǐng)人:麗豐實(shí)業(yè)股份有限公司