專利名稱：：用于牙齒美白的過水解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0001本發(fā)明提供使用過水解酶(perhydrolase)美白牙齒的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：0002大多數(shù)人希望擁有明亮、潔白的牙齒，因為牙齒和笑容是臉部整體形象的重要部分。相反，嚴(yán)重變色的牙齒顯示不健康和/或甚至令人厭惡。更潔白的牙齒傾向于與美麗和健康的生活方式相關(guān)。大體上，具有更燦爛笑容的人傾向于笑得更多且經(jīng)常較不忸怩。而且，更熱情的笑容可以幫助最小化面部皺紋的出現(xiàn)，提供更加年輕和活力的外貌。而且，更熱情的笑容可以傾向于表現(xiàn)出更友善的外貌。0003因此，牙齒美白非常有意義。多年來，很少方法被用于漂白牙齒。假齒冠和假牙長久被認(rèn)為是用于避免由于暴露于抗菌劑(例如四環(huán)素)、咖啡、酒、茶和煙而引起的變色的唯一方法。實際上，盡管牙齒漂白自從十九世紀(jì)70年代已經(jīng)被使用，但是直到近年它的用途才被推廣。過氧化物在十九世紀(jì)80年代第一次被用于牙齒漂白，且仍是最普遍使用的牙齒漂白方法。最新發(fā)展的方法包括激光處理。0004盡管牙齒漂白可以非常有效，但是對于許多過程具有一些缺點(diǎn)。例如，漂白劑的使用可能導(dǎo)致牙床和/或牙齒腫痛。而且，漂白并不是對所有人都有效。實際上，甚至最新的激光方法也不總是有效，且效果持續(xù)的時間長度可能相對短(例如12-18個月)。因此，對一些人，假齒冠或鑲牙仍是最好的選擇。而且，普遍用于家庭漂白的牙托可能是不舒服的。實際上，盡管牙齒漂白己經(jīng)變得更普遍并且已經(jīng)開發(fā)了新的方法和組合物，但是在本領(lǐng)域?qū)τ谟糜谘例X美白的安全、有效、易于使用的方法和組合物的仍存在需求。
發(fā)明內(nèi)容0005本發(fā)明提供使用過水解酶漂白牙齒的組合物和方法。在一些實施方式中，任何適合的過酸被用在本發(fā)明的牙齒美白和/或清潔方法和/或組合物中。0006本發(fā)明提供包括至少一種過水解酶的口腔護(hù)理組合物。在一些優(yōu)選實施方式中，口腔組合物是選自潔齒劑、牙膏、牙粉、漱口劑、預(yù)漱口液、牙齒美白產(chǎn)品和牙齒清潔劑的口腔護(hù)理產(chǎn)品。在一些具體的優(yōu)選實施方式中，過水解酶包括SEQIDNO:2中所列的氨基酸序列。在一些可選優(yōu)選實施方式中，過水解酶被包括SEQIDNO:l中所列序列在內(nèi)的DNA序列編碼。但是，并不意味本發(fā)明被限定于這些具體的序列，因為許多變體、同源物、衍生物等也可用在本發(fā)明中，其非限定性地包括在美國專利申請第10/581,014號中提出的酶(通過引用以其全部并入本文)。在一些實施方式中，組合物包括足夠用于美白牙齒的至少一種過水解酶的量。在其它的實施方式中，組合物進(jìn)一步包括過氧化氫生成系統(tǒng)。在更進(jìn)一步的實施方式中，組合物進(jìn)一步包括過氧化氫。在又一優(yōu)選的其它實施方式中，組合物進(jìn)一步包括過酸生成系統(tǒng)。在一些附加的優(yōu)選實施方式中，組合物進(jìn)一步包括選自過乙酸和乙酸的酸。0007本發(fā)明還提供了漂白牙齒的方法，包括在適合漂白牙齒的條件下，使牙齒與包含過水解酶的口腔護(hù)理組合物接觸。在一些優(yōu)選的實施方式中，口腔組合物是選自潔齒劑、牙膏、牙粉、漱口劑、預(yù)漱口液、牙齒美白產(chǎn)品和牙齒清潔劑的口腔護(hù)理產(chǎn)品。在一些具體的優(yōu)選實施方式中，過水解酶包括SEQIDNO:2中所列的氨基酸序列。在一些可選的優(yōu)選實施方式中，過水解酶被包含SEQIDNO:1中所列序列在內(nèi)的DNA序列編碼。但是，并不意味本發(fā)明被限定在這些具體的序列，因為許多變體、同源物、衍生物等也用在本發(fā)明中，其非限定性地包括在美國專利申請第10/581,014號中提出的酶(通過引用以其全部并入本文)。在一些實施方式中，組合物包括足夠用于美白牙齒的至少一種過水解酶的量。在其它的實施方式中，組合物進(jìn)一步包括過氧化氫生成系統(tǒng)。在更進(jìn)一步實施方式中，組合物進(jìn)一步包括過氧化氫。在又一優(yōu)選的附加實施方式中，組合物進(jìn)一步包括過酸生成系統(tǒng)。在一些附加的優(yōu)選實施方式中，組合物進(jìn)一步包括選自過乙酸和乙酸的酸。具體實施例方式0008大多數(shù)人認(rèn)為清潔、潔白的牙齒是美學(xué)上非常希望的。但是，人牙齒不是真正的潔白，這是由于牙齒固有的黃色(即由于內(nèi)在污染)，以及由于在牙齒表面上外來污跡的累積(即外來污染)。具有明顯的內(nèi)在和/或外來污跡的牙齒基于美觀和表明不良口腔衛(wèi)生這兩方面而令普通公眾厭惡。0009目前，用潔齒劑進(jìn)行的日常刷牙是去除外來污跡的最普遍使用方法。但是，單獨(dú)的刷牙不能完全地防止外來污跡的形成。在刷牙期間，通常未達(dá)到的牙列區(qū)域(即鄰間的牙齒表面和前牙的舌區(qū))非常易于累積污跡。一旦污跡形成，沒有得到專業(yè)的牙齒清潔，它是很難去除的。0010最近，已認(rèn)定過乙酸對于變色的或污染的人牙齒是驚人有效的漂白或美白劑(參考例如EP599435B1和EP545594B1)。EP545594顯示，過乙酸的1%(重量)水溶液當(dāng)在環(huán)境溫度至口腔范圍溫度應(yīng)用到牙齒時，比過氧化氫的30%(重量)水溶液產(chǎn)生了更快和更好的美白效果。而且，過乙酸可以直接應(yīng)用到牙齒，如通過使用綿簽；并入到局部應(yīng)用的口腔組合物例如牙膏、凝膠或漱口液中；或通過過氧化物源例如過氧化氫、過氧化脲、過硼酸鈉、過碳酸鈉和金屬過氧化物如Sr02、Ca02和Na02，與包含不穩(wěn)定乙?；鶊F(tuán)的過氧酸前體或活化劑反應(yīng)，原位產(chǎn)生在口腔組合物中。這種活化劑的示例性實例包括四乙?；叶贰⑽逡阴；咸烟?、四乙酰基甘脲、山梨糖醇六乙酸酯或果糖五乙酸酯。0011與為消費(fèi)者家庭使用包裝的過乙酸的使用相關(guān)的一個主要缺點(diǎn)是它相對的不穩(wěn)定性。過乙酸的稀釋1%水溶液在環(huán)境溫度下，在短短的30天內(nèi)將基本分解。在3。C下存儲明顯地提高穩(wěn)定性，但沒有達(dá)到消費(fèi)者產(chǎn)品或?qū)I(yè)產(chǎn)品的正常市場期限所要求的程度。而且，在消費(fèi)者產(chǎn)品和專業(yè)產(chǎn)品中存在的許多普通輔料例如香料和其它有機(jī)材料可以很快地與過乙酸反應(yīng)，這破壞了輔料和過乙酸。這些因素傾向于表明，在潔齒劑應(yīng)用中應(yīng)用過乙酸化學(xué)的優(yōu)選方法是在使用時間內(nèi)原位產(chǎn)生過乙酸。在這些現(xiàn)有的實施方式中，過氧化氫的來源和乙酸的羧酸鹽衍生物如酰胺或酯，可以在足夠高到從過氧化氫中產(chǎn)生足夠濃度的過羥基的pH值下，在水中混合到一起。相反，本發(fā)明提供了一種酶促產(chǎn)生用于牙齒美白的過酸的原位方法。0012此外，美國專利第5,055,305號(通過引用以其全部并入本文)描述了用于體外清潔牙齒的泡騰片劑，其包含作為主要成分的漂白劑，該漂白劑包括過硫酸鹽過硼酸鹽或焦磷酸鈉水合物或金屬過氧化物、過氧酸漂白前體和產(chǎn)生泡騰的堿性成分。在公開的多種有機(jī)過酸前體中是羧酸酯例如乙酰水楊酸(參考例如BR836,988;通過引用以其全部并入本文)?？梢钥紤]的是，通過本發(fā)明的過水解酶原位酶促產(chǎn)生過乙酸或其它過酸也可以用在相似的牙齒清潔方法中。0013EP400858(通過引用以其全部并入本文)描述了用于體外清潔牙齒的顆粒組合物，其包括無機(jī)過酸鹽漂白劑、有機(jī)過氧酸漂白前體和泡騰發(fā)生劑?？梢钥紤]，通過本發(fā)明的過水解酶原位酶促產(chǎn)生過乙酸或其它過酸也可以用在相似的牙齒清潔方法中。0014在一些實施方式中，本發(fā)明用于從酯底物和過氧化氫酶促產(chǎn)生過酸。在一些優(yōu)選的實施方式中，底物選自下列的一個或多個甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、已酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二垸酸、十四垸酸、十六垸酸、十八烷酸和油酸。重要地，本發(fā)明提供了在寬的pH和溫度范圍下有效漂白/美白的方法。在一些實施方式中，在該方法中使用的pH范圍是4-10。在一些可選的實施方式中，使用的溫度范圍是5。和40。C之間。本發(fā)明提供了在過酸氧化的最佳pH值下進(jìn)行漂白，以及提供了在中性pH、酸性pH、堿性pH和低溫下進(jìn)行漂白。0015在那些潔齒劑組合物被設(shè)計用于體外用途的應(yīng)用中，必需的是過乙酸快速產(chǎn)生且發(fā)揮作用，因為使用者通常希望限制潔齒劑與牙齒接觸的時間。而且，用于體外應(yīng)用到牙齒的過氧化物產(chǎn)生劑和過氧酸漂白前體的種類被嚴(yán)格地限制，這是由于要求這些成分生理學(xué)上是安全的且對口腔組織沒有刺激。用于體外應(yīng)用的進(jìn)一步要求是過乙酸在接近安全的生理中性pH7的相對中性pH值下產(chǎn)生。0016本文所提供的過乙酸的原位產(chǎn)生和使用比本領(lǐng)域熟知的方法和組合物具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括控制如何快速和在哪里產(chǎn)生過乙酸，以及對于口腔護(hù)理制劑提供了選擇更穩(wěn)定前體的靈活性。在酶和底物選擇中的這種靈活性還提供了用于使過酸產(chǎn)物固定在牙齒上的系統(tǒng)。0017在本發(fā)明的開發(fā)期間，多種水平的過乙酸被用于與下列進(jìn)行比較緩沖液陰性對照、過氧化氫陽性對照和從二乙酸丙二醇酯和過氧化氫通過過水解酶產(chǎn)生的過乙酸。這些結(jié)果顯示，酶促產(chǎn)生的過乙酸在臨床上產(chǎn)生明顯的牙齒美白。0018而且，本發(fā)明提供了用于牙齒美白應(yīng)用的過酸前體的穩(wěn)定存儲方法和組合物。這些組合物和方法也用于漂白人造牙齒(例如假牙)。此外，使用本發(fā)明的方法和組合物原位產(chǎn)生過酸，在使患者最小敏感的情況下，將更強(qiáng)的氧化種類局部輸送，用于漂白和美白內(nèi)在牙齒污跡。0019而且，本發(fā)明的過水解酶和/或水解酶對多種酰基供體底物是活性的，并且在低底物濃度下是活性的，且由于高的過酸酸的比率，提供了有效過水解的方法。實際上，已經(jīng)意識到，更高的過水解對水解比率對于漂白應(yīng)用是優(yōu)選的(參考例如美國專利第5，352,594、5,108,457、5,030,240、3974,082和5,296,616號，所有這些通過引用并入本文)。在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的過水解酶提供大于l的過水解與水解比率。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，過水解酶提供了大于l的過水解與水解比率且用于漂白。0020如上面所述，由酶促過水解產(chǎn)生過酸的關(guān)鍵成分是酶、酯底物和過氧化氫。過氧化氫可以一次直接加入，或者"原位"持續(xù)產(chǎn)生。但是，這些酶還可以與任何其它適合的過氧化氫源一起使用，包括通過化學(xué)、電化學(xué)和/或酶的方式產(chǎn)生的過氧化氫源?；瘜W(xué)來源的實例是上面提到的過碳酸鹽和過硼酸鹽，電化學(xué)來源的實例是供應(yīng)氧氣和氫氣的燃料電池，以及酶的實例包括從葡萄糖與葡萄糖氧化酶的反應(yīng)中產(chǎn)生過氧化氫。下面的方程式提供了用于本發(fā)明的偶合系統(tǒng)的實例。葡萄糖氧化酶葡萄糖+H20------------------------->葡糖酸+H202+過水解酶H202+酯底物--------------------------->醇+過酸0021這個系統(tǒng)產(chǎn)生酸(一種或多種)，在一些實施方式中，酸導(dǎo)致系統(tǒng)pH降低。并不意味本發(fā)明被限定于任何具體的酶，因為與適合的底物產(chǎn)生過氧化氫和酸的任何酶在本發(fā)明的方法中都可使用。例如，源自乳酸菌(Lactobacillus)種的乳酸氧化酶，已知其從乳酸和氧氣中產(chǎn)生過氧化氫，可用于本發(fā)明。實際上，本發(fā)明方法的一個優(yōu)點(diǎn)是酸的產(chǎn)生(例如，在上面實例中的葡糖酸)降低堿性溶液的pH到過酸在漂白中最有效的pH范圍(即為或低于pKa)?？梢援a(chǎn)生過氧化氫的其它酶(例如，糖氧化酶、醇氧化酶、乙二醇氧化酶、甘油氧化酶、氨基酸氧化酶等等)，與本發(fā)明的過水解酶結(jié)合，也用于酯底物，以產(chǎn)生過酸。從底物產(chǎn)生酸而不產(chǎn)生過氧化氫的酶也在本發(fā)明中使用。這樣酶的實例非限定性包括酯化酶、脂肪酶、磷脂酶、角質(zhì)酶、蛋白酶。在一些優(yōu)選的實施方式中，酯底物選自下面酸中的一個或多個甲酸，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、已酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二垸酸、十四垸酸、十六烷酸、十八烷酸和油酸。因此，如本文所描述，本發(fā)明相比于目前使用的方法和組合物提供了明確的優(yōu)點(diǎn)。0022因此，考慮的是，通過使用本發(fā)明的組合物，可以得到更潔白的牙齒且保持無污跡?？梢钥紤]的是，本發(fā)明的過水解酶用于組合物中，例如牙膏、牙凝膠、抗斑漱口液、漱口劑等，以提供和保持更潔白的牙齒。在一些優(yōu)選的方式中，包括本發(fā)明過水解酶的牙齒漱口液被使用，以到達(dá)牙齒表面更多不能到達(dá)的區(qū)域，以及提供在牙齒釉質(zhì)內(nèi)的滲透，以去除內(nèi)在的污跡。也考慮的是，本發(fā)明可與常規(guī)的刷牙結(jié)合使用，但這并不意味本發(fā)明限于刷牙和/或任何其它維護(hù)牙齒的方法的附加使用。定義0023除非本文另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。例如，Singleton和Sainsbury的Z)z'c"owa^y。Afz'cro6z'o/ogyMo/ecw/ar說o/ogy(微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典)，第二版，JohnWiley和Sons,紐約(1994);以及Hale禾口Matham的77ie//arperCo〃z>wD/cri0wa/7o/說o/ogy,HatperPerennial,紐約(1991)，為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供了在本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的通用字典。盡管任何相似于或等價于本文描述的方法和材料可用在本發(fā)明實踐中，但是在本文描述優(yōu)選的方法和材料。因此，緊接在下面定義的術(shù)語通過參考作為整體的說明書被更加全面地描述。而且，如本文所使用，單數(shù)詞"一種(一個)(a)"、"一種(一個)(an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文明確地另外指明。除非另外指明，分別地，核酸以5'到3'方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基到羧基方向從左到右書寫。應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于描述的具體方法、方案和試劑，因為這些可以變化，這取決于在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所使用的背景。0024貫穿本說明書所給出的每一個最大數(shù)字界限旨在包括每個更低的數(shù)字界限，如同這樣的更低數(shù)字界限被明確地寫在本文一樣。貫穿本說明書所給出的每一個最小數(shù)字界限包括每個更高的數(shù)字界限，如同這樣的更高數(shù)字界限被明確地寫在本文一樣。貫穿本說明書所給出的每一個數(shù)字范圍將包括落入到這樣寬的數(shù)字范圍內(nèi)的每一個更窄的數(shù)字范圍，如同這樣的更窄的數(shù)字范圍被明確地寫在本文一樣。0025如本文中所用，術(shù)語"牙齒美白"和"牙齒漂白"可以交替使用，以指代提高一個牙齒或多個牙齒的亮度(例如美白)。該術(shù)語旨在包括適合于美白牙齒的任何方法，包括本發(fā)明，以及化學(xué)處理、弱酸處理、摩擦性牙齒美白和激光牙齒美白。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了適合于美白牙齒的過水解酶和含過水解酶的組合物。0026如本文中所用，在牙齒內(nèi)的"內(nèi)在污跡"指代在釉質(zhì)和其下面的牙質(zhì)內(nèi)的從色原產(chǎn)生的顏色。人牙齒的內(nèi)在顏色傾向于隨著年齡更黃，這是由于釉質(zhì)變薄而下面的黃色牙質(zhì)變黑。內(nèi)在污跡的去除通常需要使用過氧化物或其它氧化性化學(xué)制劑，其滲透釉質(zhì)且使內(nèi)部的色原脫色。0027與內(nèi)在污跡相反，當(dāng)外源的色原物質(zhì)結(jié)合于釉質(zhì)，通常在自然涂層牙齒的薄層中時，"外來污跡"在牙齒表面形成。大多數(shù)人隨時間的推移，在他們的牙齒上積累了一定程度不好看的外來污跡。這種污染過程由下面因素被促進(jìn)(1)包含丹寧酸的食物和飲料例如咖啡、茶或紅酒的攝??；(2)煙草產(chǎn)品的使用；和/或(3)暴露于某些陽離子物質(zhì)(例如，錫、鐵和雙氯苯雙胍己烷(chlorhexidine))。這些物質(zhì)傾向于粘附到釉質(zhì)的羥磷灰石結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致牙齒的變色且伴隨牙齒潔白度的降低。經(jīng)過一些年的時期，外來污跡可以滲透釉質(zhì)層且導(dǎo)致內(nèi)在污跡。0028如本文中使用，術(shù)語"過水解酶"指一種酶，其能夠催化導(dǎo)致適合于牙齒美白的足夠高數(shù)量過酸的形成的反應(yīng)。在附加的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的過水解酶特征在于具有獨(dú)特的三級結(jié)構(gòu)和一級序列。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的過水解酶包括獨(dú)特的一級和三級結(jié)構(gòu)。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的過水解酶包括獨(dú)特的四級結(jié)構(gòu)。在一些優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的過水解酶是恥標(biāo)分支桿菌(M.swegmflto)過水解酶，而在可選的實施方式中，過水解酶是這種過水解酶的變體，而在又一實施方式中，過水解酶是這種過水解酶的同源物。在進(jìn)一步的優(yōu)選實施方式中，單體水解酶被改造，以產(chǎn)生多聚體酶，其比單體具有更好的過水解酶活性。但是，本發(fā)明并不旨在限于這種具體的恥垢分支桿菌過水解酶、這種過水解酶的具體變體以及這種過水解酶的具體同源物。在特別優(yōu)選的實施方式中，過水解酶包括在US04/40438和美國專利申請序列第10/584,014號中所公開的那些(在此通過引用以它們的全部并入本文)。在一些最特別優(yōu)選的實施方式中，過水解酶包括SEQIDNO:2所列的氨基酸序列，其在一些優(yōu)選實施方式中被SEQIDNO:1所列的DNA序列編碼，這兩種都在下面列出。但是，本發(fā)明并不旨在限于這些具體的序列，因為變體、同源物和衍生物也在本發(fā)明中使用。實際上，美國專利申請序列第10/584,014中描述了在本發(fā)明中使用的眾多變體和同源物。MAKRJLCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRW丁GVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVUMLGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQVL'rSAGGVGTTYPAPKVLWSPPPLAPMPHFWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDG1HFTEANNRDLGVALAEQVRSLL(SBQIDNO:2)-5'-ATGGCCAAGCGAATTCTOTGTTTCGGTOATTCCCTGACCTGGGGCTGOGTCCCCGTCGAAOACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCOCTGGACCOQTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCXJQACTTCGAGGTCJATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGOCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTOCCGCTCGSACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCCJCTCGACATCGCGCTGGGCA'raTCGGTGCTCOTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCOGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTOGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGQCGCCCATOCCOCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGOGCGGCGAGCAGAAGACCACTG八GCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGQTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACC(3AGGCCAACAATCCJCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTA八-3，(SEQH3NO:l)0029如本文使用，"個人護(hù)理產(chǎn)品"指在頭發(fā)、皮膚、頭皮和牙齒的清潔、漂白和/或消毒中使用的產(chǎn)品，非限定性包括洗發(fā)精、潤膚露、浴液、局部保濕劑、牙膏、牙凝膠、洗口液、漱口液、抗斑洗液和/或其它局部清洗劑。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，這些產(chǎn)品在人類中使用，而在其它實施方式中，這些產(chǎn)品在非人動物(例如在獸醫(yī)應(yīng)用中)上使用。0030如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"指該術(shù)語描述的藥物、藥劑和/或惰性成分適合于與人體和其它動物的組織接觸，而沒有不適的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、剌激性、過敏反應(yīng)等等，與合理的收益/風(fēng)險比率相稱。0031如本文所使用，"清潔組合物"和"清潔制劑"指用于從牙齒中去除不希望化合物的組合物(漱口液、牙膏等)。該術(shù)語包括挑選用于希望的具體類型的清潔組合物和產(chǎn)品形式(例如液體、糊劑、凝膠、乳液、顆粒或噴霧組合物)的任何材料/化合物，只要組合物與過水解酶和在組合物中使用的其它酶(一種或多種)相容。0032如本文使用，在含過水解酶組合物中"增強(qiáng)的性能"被定義為，相比較于其它組合物，增強(qiáng)了漂白敏感性污漬的清潔，如使用牙齒領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法所確定的。在具體的實施方式，本發(fā)明的過水解酶提供了在氧化和去除有色污跡方面的增強(qiáng)性能。在又一實施方式中，本發(fā)明的過水解酶在去除污跡和/或污跡脫色方面提供增強(qiáng)的性能。0033如本文所用，術(shù)語"相容"，意指清潔組合物材料沒有將過水解酶的酶活性降低到這樣的程度在正常使用情況期間，過水解酶沒有如希望般有效。具體的清潔組合物材料在本文后面詳細(xì)地被舉例。0034如本文所用，"有效量的過水解酶"指在具體應(yīng)用中為取得所需酶活性所需要的過水解酶數(shù)量。這樣的有效量容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，且基于許多因素例如使用的具體酶變體、清潔應(yīng)用、清潔組合物的具體組成和是否需要液體或非液體(例如乳液)組分等等。0035如本文所用，"口腔清潔組合物"指潔齒劑、牙膏、牙凝膠、牙粉、漱口液、口腔噴霧劑、口腔凝膠、口香糖、止咳糖、香囊、片劑、生物凝膠、磨光糊劑、牙處理溶液等等。與本發(fā)明的過水解酶一起使用的口腔護(hù)理組合物在本領(lǐng)域中是熟知的(參考例如美國專利第5,601,750,、6,379,653和5,989，526號，通過引用以它們的全部并入本文)。0036如本文所用，"?；?是有機(jī)酸基團(tuán)的通用名，其是羧酸在去除-OH基團(tuán)后的殘基(例如乙酰氯CH3C0-C1是從乙酸CH3COO-H形成的?；?。單個?；鶊F(tuán)的命名通過用"-yl"代替酸中的"ic"形成(通過用"酰基"代替"酸"命名)。0037如本文所用，術(shù)語"?；?指這樣的化學(xué)轉(zhuǎn)化，其將酰基(RCO-)取代進(jìn)入分子中，一般取代-OH基團(tuán)的活性氫。0038如本文使用，術(shù)語"轉(zhuǎn)移酶"指一種酶，其催化官能化合物轉(zhuǎn)移到一類底物上。0039如本文使用，"離去基團(tuán)"指這樣的親核體，其一旦由另一個親核體取代即與?；w分開。0040如本文使用，術(shù)語"酶轉(zhuǎn)化"指通過將底物或中間體與酶接觸，將底物修飾為中間體或?qū)⒅虚g體修飾為最終產(chǎn)物。在一些實施方式中，通過將底物或中間體直接暴露到適當(dāng)酶中進(jìn)行接觸。在其它的實施方式中，接觸分別包括將底物或中間體暴露到表達(dá)和/或分泌酶的生物，和/或?qū)⑾Ｍ牡孜锖?或中間體分別代謝為希望的中間體和/或最終產(chǎn)物的生物。0041如本文使用，術(shù)語"對蛋白質(zhì)水解的穩(wěn)定性"指蛋白質(zhì)(例如酶)經(jīng)受蛋白質(zhì)水解的能力。該術(shù)語并不擬限于使用任何具體蛋白酶評估蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。0042如本文所用，"氧化穩(wěn)定性"指在氧化條件下蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的能力。具體地，該術(shù)語指在存在多種濃度的過氧化氫和/或過酸下蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的能力。在多種氧化條件下的穩(wěn)定性可以通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法和/或通過本文描述的方法測量。氧化穩(wěn)定性的基本變化通過與缺少氧化化合物時存在的酶活性相比較，酶活性半衰期的至少大約5%或更大的增加或減少(在大多數(shù)實施方式中，優(yōu)選的是增加)得以驗證。0043如本文使用，"pH穩(wěn)定性"指在具體的pH值下蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的能力。一般地，大多數(shù)酶具有限定的pH范圍，在這樣的pH值范圍內(nèi)它們將起作用。除了在中間范圍的pH值(即大約pH7)起作用的酶，也有在非常高或非常低pH值的條件下能夠起作用的酶。在多種pH下的穩(wěn)定性可以通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法和/或者通過本文描述的方法測定。pH穩(wěn)定性的基本變化通過與在酶的最佳pH下的酶活性相比較，酶活性半衰期的至少大約5%或更大的增加或減少(在大多數(shù)實施方式中，優(yōu)選的是增加)得以驗證。但是，本發(fā)明并不擬限定在任何pH穩(wěn)定水平或pH范圍。0044如本文所使用，"熱穩(wěn)定性"指在具體溫度下蛋白質(zhì)起作用的能力。一般地，大多數(shù)酶具有它們起作用的限定的溫度范圍。除了在中等范圍溫度(例如，室溫)起作用的酶，也有在非常高或非常低溫度下能夠運(yùn)行的酶。熱穩(wěn)定性可以通過本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法和/或者通過本文描述的方法測定。熱穩(wěn)定性的基本變化通過暴露在與酶活性的最佳溫度不同的溫度(即更高或更低)時，變體的催化活性半衰期的至少大約5%或更大的增加或減少(在大多數(shù)實施方式中，優(yōu)選的是增加)得以驗證。但是，本發(fā)明并不擬限定在任何溫度穩(wěn)定性水平或溫度范圍。0045如本文所使用，術(shù)語"化學(xué)穩(wěn)定性"指蛋白質(zhì)(例如酶)對不利地影響它的活性的化學(xué)物質(zhì)的穩(wěn)定性。在一些實施方式中，這樣的化學(xué)物質(zhì)非限定性包括過氧化氫、過酸、陰離子清潔劑、陽離子清潔劑、非離子型清潔劑、螯合劑等。但是，本發(fā)明并不擬限定在任何具體的化學(xué)穩(wěn)定性水平或化學(xué)穩(wěn)定性范圍。0046如本文所用，術(shù)語"純化"和"分離"指從樣品中去除污染物。例如，過水解酶通過在溶液或制劑中去除不是過水解酶的污染蛋白質(zhì)和其它化合物而被純化。在一些實施方式中，重組過水解酶在細(xì)菌或真菌宿主細(xì)胞中被表達(dá)且這些重組過水解酶通過去除其它宿主細(xì)胞成分而被純化；樣品中重組過水解酶的百分比因此增加。0047如本文所用，"蛋白質(zhì)"指由氨基酸構(gòu)成并被本領(lǐng)域技術(shù)人員識別為蛋白質(zhì)的任何組分。術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"肽"和多肽在本文中交替使用。其中肽是蛋白質(zhì)的一部分，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解上下文中該術(shù)語的用途。0048如本文所用，功能和/或結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是"相關(guān)蛋白"。在一些實施方式中，這些蛋白質(zhì)衍生自不同的屬和/或種，包括在生物類別之間的差異(例如細(xì)菌蛋白質(zhì)和真菌蛋白質(zhì))。在一些實施方式中，這些蛋白質(zhì)衍生自不同的屬和/或種，包括在生物類別之間的差異(例如細(xì)菌酶和真菌酶)。在另外的實施方式中，相關(guān)蛋白從相同的種提供。實際上，本發(fā)明并不擬限于來自任何具體來源(一種或多種)的相關(guān)蛋白。此外，術(shù)語"相關(guān)蛋白"包括三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物(例如，本發(fā)明的過水解酶)。在進(jìn)一步實施方式中，該術(shù)語包括免疫交叉反應(yīng)性蛋白。0049如本文所用，術(shù)語"衍生物"指通過下列方式從蛋白質(zhì)衍生而來的蛋白質(zhì):將一個或多個氨基酸加入到C-末端和N-末端的一端或兩端；一個或多個氨基酸在氨基酸序列中的一個或多個不同位點(diǎn)的取代；和/或一個或多個氨基酸在蛋白質(zhì)的一端或兩端或在氨基酸序列內(nèi)的一個或多個位點(diǎn)的缺失；和/或一個或多個氨基酸在氨基酸序列中的一個或多個位點(diǎn)上的插入。蛋白質(zhì)衍生物的制備優(yōu)選地通過下列步驟實現(xiàn)修飾編碼天然蛋白的DNA序列、轉(zhuǎn)化該DNA序列到適合宿主中和表達(dá)該修飾的DNA序列以形成衍生蛋白質(zhì)。0050相關(guān)(和衍生的)蛋白質(zhì)包括"變體蛋白質(zhì)"。在一些優(yōu)選的實施方式中，變體蛋白質(zhì)通過小數(shù)目的氨基酸殘基，區(qū)別于母體蛋白質(zhì)和相互區(qū)別。不同氨基酸殘基的數(shù)目可以是一個或多個，優(yōu)選l、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多個氨基酸殘基。在一些優(yōu)選的實施方式中，在變體之間的不同氨基酸的數(shù)目在1和10之間。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，相關(guān)蛋白質(zhì)和特別是變體蛋白質(zhì)包括至少35%、40%、45%、50°/。、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。此外，如本文所用的相關(guān)蛋白質(zhì)或變體蛋白質(zhì)，指在突出區(qū)域(prominentregion)的數(shù)目上區(qū)別于另一種相關(guān)蛋白質(zhì)或母體蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。例如，在一些實施方式中，變體蛋白質(zhì)具有l(wèi)、2、3、4、5、或10個區(qū)別于母體蛋白的相應(yīng)突出區(qū)域。0051在本領(lǐng)域中熟知適合于產(chǎn)生本發(fā)明的過水解酶變體的，其非限定性包括位點(diǎn)飽和誘變、掃描誘變、插入誘變、隨機(jī)誘變、位點(diǎn)定向誘變和定向進(jìn)化，以及多種其它重組方法。0052如本文使用，術(shù)語"類似序列"指提供與感興趣的蛋白質(zhì)(即，典型為感興趣的原始蛋白)相似的功能、三級結(jié)構(gòu)和/或保守殘基的蛋白質(zhì)內(nèi)的序列。例如，在包含a螺旋或e折疊結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域內(nèi)，在類似序列內(nèi)的取代氨基酸優(yōu)選地保持相同的特異性結(jié)構(gòu)。該術(shù)語還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實施方式中，類似序列被形成，使得取代氨基酸產(chǎn)生顯示相似或增強(qiáng)功能的變體酶。在一些優(yōu)選的實施方式中，在感興趣的蛋白中的氨基酸的三級結(jié)構(gòu)和/或保守殘基位于感興趣的節(jié)段或片段處或附近。因此，在感興趣的節(jié)段或片段包含例如a螺旋或e折疊結(jié)構(gòu)的地方，取代氨基酸優(yōu)選地保留特異性結(jié)構(gòu)。0053如本文使用，"同源蛋白質(zhì)"指與感興趣的蛋白質(zhì)(例如另一來源的過水解酶)具有相似行為和/或結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(例如過水解酶)。同源物并不擬在進(jìn)化上是必需相關(guān)的。因此，該術(shù)語旨在包括從不同的種類中得到的相同的或相似的酶(一種或多種)(即，在結(jié)構(gòu)和功能方面相似)。在一些優(yōu)選的實施方式中，鑒別具有與感興趣的蛋白相似的四級、三級和/或一級結(jié)構(gòu)的同源體是希望的，因為用源自同源體的相似片段取代感興趣的蛋白質(zhì)中的節(jié)段或片段將降低變動的破壞性。在一些實施方式中，同源蛋白質(zhì)誘導(dǎo)與感興趣的蛋白質(zhì)相似的免疫響應(yīng)(一種或多種)。0054如本文所用，"同源基因"指源自不同種的至少一對基因，這些基因彼此對應(yīng)且彼此相同或非常相似。該術(shù)語包括通過物種形成(即新物種的發(fā)育)分離的基因(例如直向同源基因)，以及通過基因復(fù)制分離的基因(例如，共生同源基因)。這些基因編碼"同源蛋白"。0055如本文所用，"直向同源物"和"直向同源基因"指通過物種形成從共同的祖基因(即同源基因)進(jìn)化的不同種中的基因。典型地，在進(jìn)化過程中直向同源物保持相同的功能。直向同源物的同一性可用于可靠預(yù)測在新近測序的基因組中的基因功能。0056如本文所用，"旁系同源物"和"共生同源基因"指通過在基因組內(nèi)復(fù)制而相關(guān)的基因。盡管直向同源物在進(jìn)化過程中保持相同的功能，但旁系同源物發(fā)展了新的功能，即使一些功能經(jīng)常與原始功能相關(guān)。共生同源基因的實例非限定性包括編碼胰島素、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，這些都是絲氨酸蛋白酶且在相同種內(nèi)一起發(fā)生。0057如本文所用，"野生型"和"天然的"蛋白質(zhì)是在自然界發(fā)現(xiàn)的那些蛋白質(zhì)。術(shù)語"野生型序列"和"野生型基因"在本文交替使用，以指代在宿主細(xì)胞中天然或自然發(fā)生的序列。在一些實施方式中，野生型序列指作為蛋白工程項目起點(diǎn)的感興趣序列。編碼自然發(fā)生蛋白質(zhì)的基因可以依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的通常方法得到。該方法一般地包括合成標(biāo)記探針，其具有編碼目標(biāo)蛋白區(qū)域的推定序列；從表達(dá)蛋白質(zhì)的生物制備基因組文庫；以及通過對探針的雜交，針對目標(biāo)基因篩選該文庫。陽性雜交克隆隨后被制圖和測序。0058如本文所用的術(shù)語"重組DNA分子"指由通過分子生物技術(shù)結(jié)合在一起的DNA片段構(gòu)成的DNA分子。實驗0059提供下面的實施例，是為了說明和進(jìn)一步闡明本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式和方面，并不被解釋為限定其范圍。0060在下面的實驗公開中，下面的縮寫被采用°C(攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；H20(水)；HC1(鹽酸)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；Ug和ug(微克);mg(毫克)；ng(毫微克)；ul和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；um禾口um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；UM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特);MW(分子量)；sec(秒)；min(分)hr(小時)；MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉);OD420(在420納米處光密度);ABTS(2,2，-連氮-雙)3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯；過氧化酶的底物)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水[150mMNaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2]);SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)氨基甲醇)；TAED(N,N，N，,N，-四乙?；叶?；w/v(重量比體積)；v/v(體積比體積)；Per(過水解酶)；戶^(過水解酶基因)；Ms(恥垢分支桿菌)；MS(質(zhì)譜)；Amersham(AmershamLifeScience,Inc.ArlingtonGeights,伊禾U諾斯州)；ICN(ICNPharmaceuticals，Inc.CostaMesa,加利福尼亞州)；Pierce(PierceBiotechnology,Rickford，伊禾U諾斯州)；Amicon(Amicon，Inc.Beverly,馬薩諸塞州)；ATCC(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,弗吉尼亞州)；Amersham(AmershamBiosciences，Inc.，Piscataway,新澤西州)；BectonDickinson(BectonDickinsonLabware,LincolnPark,新澤西州)；BioRad(BioRad，Richmond,加利福尼亞州)；Clontech(CLONTECHLaboratories,PaloAlto，加利福尼亞州)；Difco(DifcoLaboratories,Detroit,密歇根州)；GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,馬里蘭州)；Sigma(SigmaChemicalCo.，St丄ouis,密蘇里州)；Sorvall(SorvallInstruments,DuPont子公司，BiotechnologySystems,Wilmington,特拉華州)；SPSS(SPSSInc.,Chicago,伊利諾斯州)；Microsoft(Mocrosoft，Inc.,Redmond，華盛頓州)；Agilent(AgilentTechnologies,PaloAlto,力n禾ll福尼亞州)；Minolta(KonicaMinolta,Ramsey,新澤西州)；禾HContinental(ContinentalDiamondToolCorp.，NewHaven,印第安納州)。牙齒樣品0061在下面的實施例中，具有天然內(nèi)在污跡的人固齒從口腔外科醫(yī)生獲得。適合牙齒的選擇基于去除外來污跡后內(nèi)在污跡的存在，去除外來污跡使用本領(lǐng)域熟知的方法，包括使用借助水性浮石漿進(jìn)行的橡膠杯拋光。VITA⑧牙齒比色板被用作牙齒選擇的參考。在干燥后，僅僅具有色級為A3或更黑的樣品在這些實驗中被使用。測試樣品由直徑3mm的人釉質(zhì)圓柱體組成，安放在10mm直徑的黑色丙烯酸樹脂牙托中。人釉質(zhì)的圓形片使用3mm的金剛石芯鉆(Cintinental)切害i」。為了切割釉質(zhì)，人牙齒首先被安放在2平方厘米的自固化齒科丙烯酸樹脂(牙托粉)塊中，唇表面暴露在外。每塊隨后被夾到小老虎鉗中且浸入到水容器中，以預(yù)防釉質(zhì)在切割過程中灼燒。每個浸泡的牙齒位于安放在電鉆壓力機(jī)末端的金剛石芯鉆的正下方且與之垂直。以高的速度，金剛石芯鉆降低在牙齒上且施加輕微的壓力，此時鉆頭切割穿過釉質(zhì)和牙質(zhì)。3mm的切割釉質(zhì)片隨后從金剛石芯鉆的末端取下，且在圓形模具的幫助下嵌入到黑色的自固化齒科丙烯酸樹脂(牙托粉)中，提供直徑10mm的圓形塊。以這樣的方式進(jìn)行由于鉆的過程暴露的牙齒物質(zhì)的區(qū)域由丙烯酸樹脂(牙托粉)密封，而3mm表面釉質(zhì)仍然暴露。最后的牙齒樣品在解剖顯微鏡下檢査。非理想的樣品被棄用?？山邮艿臉悠酚谜麴s水徹底沖洗，且在保濕盒中冷藏直到使用。實施例l污跡測量0062在這些實驗中，用下面的方法測量在牙齒上的污跡。在牙齒內(nèi)的內(nèi)在污跡量通過使用具有漫射照明/8。視角和3mm孔的MinoltaCM-503i分光光度計獲得顏色讀數(shù)進(jìn)行測量。使用C正LAB(CommissionInternationaledeLEclairage，RecommendationsonUniformColorSpaces-ColorDifferenceEquations.PsychometriccolorTerms,Suppl.2toCIEpublication15(E-13.1)1971(TC-1.3)，1978，Paris:BureauCentraldelaCIE,1978)顏色等級可以獲得完整可見顏色光的測量。這個等級依據(jù)3個參數(shù)L*(亮-暗值)、a*(紅-綠色度)和M(黃-藍(lán)色度)對顏色定量。為了得到可重復(fù)的讀數(shù)，在進(jìn)行顏色測量之前，釉質(zhì)樣品被允許在室溫下風(fēng)干30分鐘。當(dāng)樣品被暴露在空氣中時，牙齒在它們干燥的最初幾分鐘內(nèi)變得更白，且顏色參數(shù)急劇變化，但在30分鐘之后穩(wěn)定。0063通過將釉質(zhì)的圓形3mm片段的中心對齊在Minolta分光光度計的3mm直徑目標(biāo)孔正上方——這能夠準(zhǔn)確定位每一次試驗的樣品，獲得測量值。對于每個樣品，可以得到使用1^*3*13*等級的3個顏色讀數(shù)的平均值。實施例2牙齒的處理0064在這個實施例中，描述了處理牙齒樣品的方法。在處理之前，牙齒樣品的基線1^3*1)*顏色值被確定，且被用于使牙齒樣品分級為每組8個樣品的平衡組。為測試，每個牙齒樣品被浸入到20ml的各自測試溶液中30分鐘。測試溶液在暴露期間用機(jī)械攪袢器以60rpm攪拌。0065在每個30分鐘處理之后，樣品被沖洗，隨后被放回到新鮮的測試溶液中。處理被連續(xù)地進(jìn)行，在1、2、4、8、16和24小時后獲取顏色讀數(shù)。作為對照組，8個牙齒在蒸餾水中被相似地處理。0066污跡計算如下面描述進(jìn)行。對于每個顏色因素(L*、a^Bb*)，在基線和測定后讀數(shù)之間的差別代表測試溶液去除內(nèi)在污跡從而美白牙齒的的能力。數(shù)據(jù)如下計算和定義去除的內(nèi)在污跡=處理后的顏色讀數(shù)減去基線牙齒顏色讀數(shù)0067牙齒顏色的總變化使用CIELAB方程AE=[(AL*)2+(Aa*)2+(厶1)*)2]1/2計算。1^^*13*等級的單個部分也被獨(dú)立地分析，以確定白度(L*)、紅-綠顏色范圍(a*)和黃-藍(lán)顏色范圍(b*)的具體變化。0068在每一類別中取得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計顯著性通過方差分析確定。數(shù)據(jù)使用PC計算機(jī)和EXCEL(微軟)電子表格程序制成表格，且使用SPSS(SPSS)統(tǒng)計程序分析。所有的比較使用雙尾檢驗(2-tailtest)進(jìn)行。0069在這些實驗中使用的測試組是組1-在IOO毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH7.5-.0)中的0.20%過乙酸。組2-在100毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH7.5-.0)中的0.10%過乙酸。組3-在100毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH7.5-.0)中的0.05%過乙酸。組4-在IOO毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH7.5-.0)中的0.02%過乙酸。組5-100毫摩爾磷酸鹽緩沖液(載體對照)組6-3%過氧化物(陽性對照)組7-蒸餾水(陰性對照)組8-在100毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH7.5-8.0)中的酶、底物和過氧化物。組9-在100毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH7.5-.0)中的底物和過氧化物。0070在過乙酸原液中的乙酸和過乙酸用NaOH滴定，以得到測試組的pH(pH7.5-8.0)。如需要，在過乙酸被加入之前，加入NaOH。0071可以通過將0.56ml的12.5MNaOH加入到100ml緩沖液中，然后加入0.62ml32。/。的過乙酸(含40-45%乙酸)，制備0.2%過乙酸原液。通過將50mL過乙酸溶液進(jìn)行連續(xù)系列稀釋到50ml緩沖液中，制備其余的過乙酸溶液。因為過酸溶液是不穩(wěn)定的，它們在制備的一小時之內(nèi)使用(即，用于兩次連續(xù)的30分鐘處理)。在這些實驗中使用的酶是在US04/40438中(在此通過引用以其全部并入本文)描述的恥垢分支桿菌過水解酶。制備酶組所使用的方案如下0072反應(yīng)條件100mM磷酸鈉pH7.90.17%過氧化氫(50mM)0.42%丙二醇二乙酸酯(25mM)+/-4111酶(過水解酶)0073制備和混合50ml200mM磷酸鈉pH5.7ml3%過氧化氫420100%丙二醇二乙酸酯(PGDA)44mL蒸餾水(在容量瓶中加到lOOmL最終體積)00742X酶稀釋液將60pL的16，000ppm酶(過水解酶)原液加入到60磷酸鹽緩沖液中0075儲備酶測試溶液和2X酶稀釋液被制備。隨后，20ml的測試溶液被放置在2個燒杯中。牙齒樣品隨后被放入到每個測試溶液中，且將l(VL的酶稀釋液加入到一個20mL測試溶液燒杯中，并通過攪拌進(jìn)行混合。然后啟動振動器攪拌和計時器。溶液以每天安排的實驗所需要的數(shù)量被制備，因為該溶液被發(fā)現(xiàn)在實驗的全天(即大約8小時)對于使用是穩(wěn)定的。0076過乙酸濃度如下面描述測定。試劑用KOH調(diào)整到pH5的125mM檸檬酸(擰檬酸鹽緩沖液)250mMKI水溶液(避直接光保存)100mMABTS(底物)水溶液(在棕色Eppendor試管中被分成lmL等分試樣且在-8(TC下冷凍；在25'C水浴中解凍)。0077新鮮過乙酸(PAA;Sigma32%)在4。C下保存。過乙酸可以變化到35%且隨時間改變。如果希望，它可以被滴定以得到高精度。0078通過在水中稀釋原液制備25mMKI的工作原液，制備溶液。隨后，10mLlOOmMABTS和2mL25mMKI被加入每mL的檸檬酸鹽緩沖液。該溶液("ABTS試劑")按需要配制，包括以更大體積，作為工作原液。當(dāng)一直保存在黑暗和室溫時，它可以多達(dá)兩天有效。0079如下面描述，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。PAA的工作原液通過將32%104倍在水中稀釋到0.4mM制備(注意原液包含乙酸)。稀釋液系列從在水中的0.4mM工作原液制備(PAA的標(biāo)準(zhǔn)濃度在水解的B(OH)3、pH8.5緩沖液中配制，半衰期為25分鐘)。在室溫下，50到100pL的標(biāo)準(zhǔn)PAA稀釋液被加入到lmL的ABTS試劑中。該溶液被很好地混合且在室溫下溫育3分鐘。隨后測定在420mn(或其它選定的波長)處的吸光度。發(fā)現(xiàn)，在光譜中沒有為了校正基線位移而可以減去的點(diǎn)，因為ABTS吸收在從UV到近紅外的整個波長范圍之內(nèi)的光。0080也進(jìn)行了時程試驗。酶反應(yīng)被建立，隨后酶被加入到混合物中。在各時間點(diǎn)，移出50到10(^L等分試樣量的酶反應(yīng)混合物且加入到lmL的ABTS試劑中。在420nm處的吸光度隨后被觀察。0081發(fā)現(xiàn)，ABTS試驗在PAA和過氧化氫之間很好地區(qū)別。標(biāo)準(zhǔn)曲線趨向并不是完全的直線，在從19到0.59mM時摩爾消光響應(yīng)(extinctionresponse)分別從61.9*103到44*103，這是在420nm處讀取的(兩摩爾ABTS氧化每摩爾的PAA)。如果希望，以低一些的消光系數(shù)在另外的波長處讀取吸光度。PAA與ABTS的反應(yīng)是快速的并在大約1.5分鐘內(nèi)完成。以這些實驗為基礎(chǔ)，建議的顯色時間被設(shè)為3分鐘。樣品以一致的方式被讀數(shù)，以產(chǎn)生結(jié)果的最小偏差。為了使明顯非線性引起的誤差最小化，吸光度值應(yīng)該在0.1OD42。以上。結(jié)果在下列表中被提供。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>卞平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=8。用不同字母標(biāo)明的數(shù)值基于ANOVA和SNK檢驗在p<0.05時在統(tǒng)計學(xué)上是不同的。用相同字母標(biāo)明的數(shù)值沒有統(tǒng)計學(xué)差異。*牙齒用20ml的溶液在30分鐘間隔進(jìn)行處理。0083如在上面表中顯示，在最早四小時的處理期間觀察到對過乙酸的明顯劑量響應(yīng)，而以數(shù)值表示的劑量響應(yīng)效應(yīng)在長達(dá)16小時的處理時觀察到。0084酶處理在1小時后在統(tǒng)計學(xué)上沒有不同于多種空白對照/陰性對照，但是在2小時或更多小時之后，具有明顯的牙齒美白效應(yīng)。實際上，在8小時之后，酶和所有測試的過乙酸溶液在統(tǒng)計學(xué)上等同于過氧化氫陽性對照且不同于多種陰性對照/空白對照。因為AmericanDentalAssociation(美國牙齒協(xié)會)指南認(rèn)為具有至少4倍的AE牙齒美白變化臨床上是有意義的，所以由本發(fā)明提供的系統(tǒng)提供了人牙齒的明顯牙齒美白。0085在本說明書提到的所有專利和出版物表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。本文通過引用并入所有專利和出版物的程度，就如同每個出版物被特別且單獨(dú)地被表明通過引用而并入一樣。0086已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的是可以對公開的實施方式進(jìn)行多種改動，且這樣的改動意欲在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。0087本領(lǐng)域的技術(shù)人員意識到，本發(fā)明很好地適合于實現(xiàn)目標(biāo)且取得提到的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及其中固有的那些結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文所描述的組合物和方法是優(yōu)選實施方式的代表，是示例性的，并不擬作為本發(fā)明范圍的限定。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，容易明了的是，對本文中公開的本發(fā)明可以進(jìn)行多種替換和改動，而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。0088在本文示例性地適當(dāng)描述的本發(fā)明可以在缺少本文未具體公開的任何一種元素或多種元素、任何限制或多種限制下進(jìn)行。使用的術(shù)語和表達(dá)被用作描述的術(shù)語而不是限制的術(shù)語，并不意圖使用這樣的術(shù)語和表達(dá)排除所顯示和描述的任何等價的特征的或其部分，但是可認(rèn)為在要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)的多種改動是可能的。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明己經(jīng)通過優(yōu)選的實施方式和任選的特征被具體地公開，但本文所公開概念的改動和變化可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員采用，且這樣的改動和變化被認(rèn)為在由所附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。0089本發(fā)明己經(jīng)被一般性地和廣泛地描述。落在一般性公開內(nèi)的每個更窄的種類和次級組也形成本發(fā)明的一部分。這包括具有從種類中去除任何主題的附帶條件或負(fù)面限制的本發(fā)明一般性描述，而不考慮去除的物質(zhì)是否在本文被具體地述及。權(quán)利要求1.口腔護(hù)理組合物，其包括至少一種過水解酶。2.如權(quán)利要求l所述的口腔護(hù)理組合物，其中所述的組合物是選自潔齒劑、牙膏、牙粉、漱口劑、預(yù)漱口液、牙齒美白產(chǎn)品和牙齒清潔劑的口腔護(hù)理產(chǎn)品。3.如權(quán)利要求l所述的口腔護(hù)理組合物，其中所述的組合物包括足夠用于美白牙齒的所述至少一種過水解酶的量。4.如權(quán)利要求l所述的口腔護(hù)理組合物，其中所述的組合物進(jìn)一步包括過氧化氫生成系統(tǒng)。5.如權(quán)利要求l所述的口腔護(hù)理組合物，其中所述的組合物進(jìn)一步包括過氧化氫。6.如權(quán)利要求l所述的口腔護(hù)理組合物，其中所述的組合物進(jìn)一步包括過酸生成系統(tǒng)。7.如權(quán)利要求l所述的口腔護(hù)理組合物，其中所述的組合物進(jìn)一步包括選自過乙酸和乙酸的酸。8.用于漂白牙齒的方法，包括在適合漂白所述牙齒的條件下，使所述牙齒與權(quán)利要求1所述的口腔護(hù)理組合物接觸。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的口腔護(hù)理組合物是選自潔齒齊U、牙膏、牙粉、漱口劑、預(yù)漱口液、牙齒美白產(chǎn)品和牙齒清潔劑的口腔護(hù)理產(chǎn)品。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的口腔護(hù)理組合物包括足夠用于美白牙齒的所述至少一種過水解酶的量。11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的口腔護(hù)理組合物進(jìn)一步包括過氧化氫生成系統(tǒng)。12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的口腔護(hù)理組合物進(jìn)一步包括過氧化氫。13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的口腔護(hù)理組合物進(jìn)一步包括過酸生成系統(tǒng)。14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的口腔護(hù)理組合物進(jìn)一步包括選自過乙酸和乙酸的酸。全文摘要本發(fā)明提供了使用過水解酶美白牙齒的組合物和方法。文檔編號A61K8/22GK101394832SQ200780007751公開日2009年3月25日申請日期2007年2月26日優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日發(fā)明者A·J·波羅斯,E·M·孔卡申請人:金克克國際有限公司