專利名稱：腦損傷和疾病的mapc治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是4吏用多能成體3且細胞(multipotent adult progenitor cells, "MAPCs")治療腦損傷、障礙、功能異常和疾病，特別是治療缺氧 性和缺血性腦損傷，其包括但不限于缺氧性-缺血性腦損傷和中風。
背景技術(shù)：
腦損傷，包括腦疾病，在美國和全世界都是一種主要的健康問題。 許多腦損傷起因于缺氧，包括通常由給腦供應血液的狹窄或阻塞引起的 局部性缺氧，和通常由壓縮受試者的空氣供應引起的彌散性缺氧。局部
性缺氧可導致，例如，皮層梗死(cortical infarcts )和中風。彌散性缺氧 可導致缺氧性缺血性腦損傷("HI損傷")。皮層梗死和中風以及HI損傷是 重要的健康關(guān)注點。
HI損傷及其相關(guān)的結(jié)果每年影響著顯著數(shù)量的活產(chǎn)。在兒童中測定 缺血性和缺氧性腦損傷的發(fā)病率和影響是復雜的；但是，通過任何評估 的染病患者數(shù)目都是巨大的。HI損傷發(fā)病率高達1/4000的活產(chǎn)。參見 Nelson W 丄朋cWA^wo/. 2:150-158 (2004)。這些嬰兒大多數(shù)存活，具 有相當多的認知和運動缺陷。參見Barker,爿朋A/^/. H: Suppl 1:3-6 (1999)。因所有原因所致新生兒腦病發(fā)生于每1000個出生中的1至6個。 參見,例如，美國婦產(chǎn)科學會(American College of Obstetricians and Gynecologists)網(wǎng)址www.acog.org。產(chǎn)時新生兒窒息的風險估計有全部 活產(chǎn)的2.5%。參見Heinonen " 5J(9G巡261-264 (2002)。此大量的 嬰兒中，較少量會經(jīng)歷明顯足以產(chǎn)生與運動和認知殘疾相關(guān)的腦損傷的 HI腦病。在美國，大腦性癱瘓，或者慢性、非進行性運動殘疾，每1000 個人中影響到l至2個。這些患者的約6%通過與HI損傷相關(guān)的產(chǎn)傷而 獲得其殘疾。參見，例如，NINDS網(wǎng)址www.ninds.nih.gov。
目前HI損傷的足月兒全部臨床結(jié)果很少。所有罹患HI損傷的足月 新生兒中，10°/。死亡，30%永久的神經(jīng)損傷。參見Volpe, NEUROLOGY OF THE NEWBORN, 4th Ed" W.B. Saunders, Philadelphia ( 2001)。近來公 開的I期低體溫試-驗，即在足月兒中缺氧性-缺血性腦病的低體溫的隨機 對照試驗的對照組產(chǎn)生的統(tǒng)計結(jié)果中，甚至發(fā)現(xiàn)更高水平的死亡率所 包括的新生兒中37%死亡，25%神經(jīng)性損傷。參見Shankaran W a/., W 五"g〃她d坦1574-1584 (2005)。
除了支持療法以外，HI損傷的治療是有限的。在新生兒HI治療中 的多中心I期臨床試驗中，已報道全身低體溫是安全并且有益的。然而， 治療的有效性顯示限于出生后的短時間內(nèi)。參見上文引述的Shankaran (2005)。
治療的缺少、患病個體數(shù)量、結(jié)合便于護理和終生康復所需費用，顯示HI損傷代表了流行的、重要的、尚未滿足的醫(yī)學需要。還同樣適 用于多種其它病癥，所述病癥特征在于損傷腦組織，特別是皮層腦組織， 例如由缺氧、梗死及其它損傷和/或創(chuàng)傷所導致的那些，例如產(chǎn)生缺血和 /或壞死的損傷，例如導致和/或相關(guān)于HI腦損傷、腦意外和/或中風的缺 血和/或壞死。因此需要改進的方法，以用于治療這些以及相關(guān)和相似的 損傷、病理和疾病。
干細胞的應用針對此目的已引起了一些興趣，并且在此領(lǐng)域有一些 令人鼓舞的觀測結(jié)果。在近年有多種干細胞已被分離和表征。它們是從 高度受限的分化潛能和在培養(yǎng)物中生長的有限能力的那些，到明顯不受 限的分化潛能和在培養(yǎng)物中生長的無限能力的那些。前者通常更容易衍 生，并且能夠從不同的成人組織獲得。后者必須衍生自生殖細胞和胚胎， 并且被稱為胚胎干("ES")細胞、胚胎生殖("EG")細胞和生殖細胞。胚胎 干("ES")細胞能無限的自我更新，并且可分化成所有的組織類型。ES細 胞得自胚泡的內(nèi)細胞群。胚胎生殖("EG")細胞得自植入后胚胎的原始生 殖細胞。得自成體組織的干細胞價值有限，原因是它們是免疫原性的， 具有有限的分化潛能，并且具有有限的在培養(yǎng)物中繁殖的能力。ES、 EG 和生殖細胞不會遇到這些不利點，但是它們具有在同種異體宿主中形成 畸胎瘤的明顯傾向，提高了它們在醫(yī)學治療中的預期擔憂。對于此原因， 盡管它們的有利地擴大的分化潛能，但令人悲觀的是有關(guān)它們在臨床應 用中的效用。得自胚胎的干細胞還受到倫理學的爭論，其可能防礙它們 在治療疾病中的應用。
尋找替代ES、 EG和生殖細胞的一些努力已集中于得自成體組織的 細胞。雖然成體干細胞已在大多數(shù)哺乳動物組織中凈皮鑒別，它們的分化 潛能是有限的，并且比ES、 EG和生殖細胞狹窄得多。事實上許多這類 細胞僅能引起一種或少數(shù)的分化細胞類型，并且許多其它的細胞限于單 一的胚細胞系。例如，造血干細胞僅能分化形成造血細胞系，神經(jīng)干細 胞分化成僅神經(jīng)外胚層的起源的細胞，并且間質(zhì)干細胞("MSCs")限于間 質(zhì)起源的細胞(中胚層的細胞類型)。相應地，這些類型的干細胞固有地 限于它們的治療適用性。
相應地，有需要可用于治療皮層梗死、HI損傷和其它疾病的干細胞， 所述干細胞具有ES、 EG和生殖細胞的自我更新和分化能力但不是免疫 原性的；當對于宿主是同種異體移植的或異種移植的時候不會形成畸胎瘤；不會出現(xiàn)與ES、 EG和生殖細胞相關(guān)的其它安全問題；保持ES、 EG和生殖細胞的其它優(yōu)點；容易從易得來源中分離，該易得來源例如 胎盤、臍帶、臍帶血、血液和骨髓；可以長時間安全保存；可以容易獲 得并且對志愿者、供體或患者以及其它表示同意者無風險；以及不會使 人承擔與獲得和操作ES、 EG和生殖細胞相關(guān)的技術(shù)和后勤的困難。
一種在本文稱為多能成體祖細胞("MAPCs，，)的細胞類型已被分離 和表征(參見，例如，美國專利No.7,015,037,通過引用以其全部內(nèi)容并 入本文)。("MAPCs"還稱為"MASCs")。這些細胞提供了ES、 EG和生殖 細胞的許多優(yōu)點而無它們的多數(shù)缺點。例如MAPCs能夠無限的生長而 不喪失它們的分化潛能。它們在NOD-SCID小鼠中隨多重發(fā)育語系顯示 高效、長期的移入和分化，并且同時沒有畸胎瘤形成(ES、 EG和生殖細 胞常見)的跡象(Reyes, M. and C.M. Verfaillie爿朋W爿cad 塑: 231-5 (2001))。
發(fā)明概述
因此，在它的一些實施方案中，本發(fā)明提供了治療腦損傷、功能異 常、障礙或疾病的方法，其通過(a)給罹患腦損傷、功能異常、障礙和/ 或疾病的受試者施用細胞(MAPCs),該細胞(i)不是胚胎干細胞、不是 胚胎生殖細胞并且不是生殖細胞；(ii)可以分化成內(nèi)胚層的、外胚層的和 中胚層的胚細胞系中的至少兩種中每種細胞系的至少一種細胞類型；(b) 有或無附加的免疫抑制治療。
在實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和/或疾病是大腦的損傷、 功能異常、障礙和/或疾病。在實施方案中它是在大腦皮層中的和/或大 腦皮層的損傷、功能異常、障礙和/或疾病。在實施方案中它是在海馬中 的和/或海馬的損傷、功能異常、障礙和/或疾病。在實施方案中它是在 腦皮層中的和/或腦皮層(還稱為腦的皮層區(qū)域)的損傷、功能異常、障礙 和/或疾病。
在有關(guān)上述各個和全部的實施方案中，特別值得一提的是，所述損 傷、功能異常、障礙和/或疾病是與缺氧相關(guān)和/或因缺氧引起的損傷、 功能異常、障礙和/或疾病。在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異 常、障礙和/或疾病是因缺氧引起的。在此關(guān)注的實施方案中，所述缺氧 是局部的。在此關(guān)注的實施方案中，所述缺氧是彌散的。在此關(guān)注的實施方案中，所述疾病是缺氧性缺血性腦損傷。
在進一步的有關(guān)相同的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和 /或疾病是與血液供應不足相關(guān)的和/或因血液供應不足引起的損傷、功 能異常、障礙和/或疾病。在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異常、 障礙和/或疾病是因動脈或靜脈狹窄或阻塞引起的，其包括但不限于血栓 或栓塞引起的阻塞。在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異常、障 礙和/或疾病是與梗死和/或缺血相關(guān)的和/或因梗死和/或缺血引起的。在 此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和/或疾病是與壞死相 關(guān)的和/或因壞死引起的。在此關(guān)注的實施方案中，所述梗死是皮層梗死。
在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和/或疾病是中風。
在本發(fā)明的實施方案中，所述細胞(MAPCs)單獨使用。在實施方案 中，所述細胞與其它治療劑一起作為主要治療形式使用。在實施方案中， 所述細胞作為唯一治療劑使用。在一些實施方案中，所述細胞與一種或 多種其它治療劑一起使用。在一些實施方案中，所述細胞單獨使用或者 與一種或多種其它治療劑在一種或多種主要治療形式中使用。在一些實 施方案中，所述細胞單獨使用或者與一種或多種其它治療劑在一種或多 種附加治療形式中使用。在一些實施方案中，所述細胞單獨使用或者與 一種或多種其它治療劑在一種或多種主要治療形式中或在一種或多種 附加治療形式中使用。
在一些方面和實施方案中，本發(fā)的主題進一步說明性地描述于下文 編號段落中。所述段落是說明而非限制本發(fā)明，并且本發(fā)明的全部理解 僅通過閱讀本公開的全部內(nèi)容即可獲得，所述全部內(nèi)容包括全部正文、 全部附圖、由此提供的摘要，并且所述全部內(nèi)容根據(jù)所述觀點以及用與 此相關(guān)的和本發(fā)明適合的本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識和經(jīng)馬全說明性地描述 來解釋本文的主題。
在任一給定編號段落中引述的短語"根據(jù)上文或下文任一項的，，表 示該段落的主題單獨地與任意一個或多個其它編號段落的主題呈各種 可能組合。在這方面，所述段落明確地支持要求本文引述主題的所有這 些組合。在某些實例中，其中編號段落的主題被從不同編號段落的主題 組合中排除，所述的排除是通過短語"根據(jù)上文或下文任一項的，除了 某編號以外"來表示的，其中所述的編號被當作該被排除的段落。
1.在受試者中治療腦損傷和/或腦功能異常、和/或腦障礙和/或腦疾病的方法，其包括給可能罹患、正在罹患或已經(jīng)罹患腦損傷和/或腦 功能異常、和/或腦障礙和/或腦疾病的受試者，通過有效途徑并以有效 治療所述腦損傷和/或腦功能異常、和/或腦障礙和/或腦疾病的量，施用 細胞(MAPCs),該細胞不是胚胎干細胞、胚胎生殖細胞或生殖細胞， 并且可以分化成內(nèi)胚層的、外胚層的和中胚層的胚細胞系中的至少兩種 中每種細胞系的至少 一種細胞類型。
2. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了60-65以外，其中所述的受 試者未用免疫抑制治療附加性地與所述細胞一起治療。
3. 根據(jù)上述或下述任 一 項的方法，其中所述的腦損傷和/或腦功能 異常、和/或腦障礙和/或腦疾病是因缺氧引起的。
4. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的腦損傷和/或腦功能 異常、和/或腦障礙和/或腦疾病是因給腦的血液供應的閉塞或阻塞引起 的。
5. 根據(jù)上述或下述任 一 項的方法，其中所述的腦損傷和/或腦功能
異常、和/或腦障礙和/或腦疾病是梗死。
6. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的腦損傷和/或腦功能 異常、和/或腦障礙和/或腦疾病是皮層梗死。
7. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的腦損傷和/或腦功能 異常、和/或腦障礙和/或腦疾病是中風。
8. 根據(jù)上述或下述任 一 項的方法，其中所述的腦損傷和/或腦功能 異常、和/或腦障礙和/或腦疾病是缺氧性缺血性腦損傷。9. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在所述受試者 中不是免疫原性的。
10. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞可以分化成內(nèi) 胚層的、外胚層的和中胚層的胚細胞系中每種細胞系的至少 一種細胞類 型。
11. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞表達端粒酶。
12. 才艮據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細月包對oct-3/4呈陽性。
13. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在它們施用于
所述受試者之前在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10至40細胞倍增。
14. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是哺乳動物細胞。
15. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是人、馬、牛、 山羊、綿羊、豬、大鼠或小鼠細胞。
16. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是人、大鼠或 小鼠細胞。
17. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是人細胞。
18. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞得自從以下任 一項分離的細胞胎盤組織、臍帶組織、臍帶血、骨髓、血液、脾組織、 胸腺組織、脊髓組織、脂肪組織和肝臟組織。
19. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞得自從以下任 一項分離的細胞胎盤組織、臍帶組織、臍帶血、骨髓、血液和脾組織。
20. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞得自從以下任
一項分離的細胞胎盤組織、臍帶組織、臍帶血、骨髓或血液。
21. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞得自從骨髓或
血液中的任意 一種或多種分離的細月包。
22. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞對于所述受試 者是同種異體的。
23. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞對于所述受試 者是異種的。
24. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞對于所述受試 者是自體的。
25. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的受試者是哺乳動物。
26. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的受試者是哺乳寵物 動物、哺乳家畜動物、哺乳研究動物或非人類靈長動物。
27. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的受試者是人。
28. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞以一種或多種 劑量施用于所述受試者，所述劑量包括104至108所述細胞/千克所述受 試者質(zhì)量。
29. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞以一種或多種 劑量施用于所述受試者，所述劑量包括105至107所述細胞/千克所述受 試者質(zhì)量。30. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞以一種或多種 劑量施用于所述受試者，所述劑量包括5x 106至5乂 107所述細胞/千克 所述受試者質(zhì)量。
31. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞以一種或多種
劑量施用于所述受試者，所述劑量包括2x 1(^至4x 107所述細胞/千克 所述受試者質(zhì)量。
32. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中除所述細胞之外， 一種或
多種因子被施用于所述受試者。
33. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中除所述細胞之外， 一種或
多種生長因子、分化因子、信號因子和/或增加歸巢(Homing)的因子被施 用于所述受試者。
34. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中除所述細胞之外， 一種或 多種細胞因子被施用于所述受試者。
35. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞附加于另一治 療施用于受試者，所述另一治療是在所述細胞施用之前、同時或之后施用。
36. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中另外的一種或多種抗生素 劑被施用于所述受試者。
37. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中另外的一種或多種抗真菌 劑被施用于所述受試者。
38. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中另外的一種或多種抗病毒 劑^L施用于所述受試者。
39. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中抗生素劑和/或抗真菌劑和 /或抗病毒劑中的兩種或多種的其它任意組合被施用于所述受試者。
40. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在制劑中^皮施 用，該制劑包含一種或多種其它藥物活性劑。
41. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在制劑中^1施 用，該制劑包含一種或多種抗生素劑。
42. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在制劑中#:施
用，該制劑包含一種或多種抗真菌劑。
43. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在制劑中#1施 用，該制劑包含一種或多種抗病毒劑。
44. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過腸胃外途 徑施用于所述受試者。
45. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過下述腸胃 外途徑中的任意一種或多種施用于所述受試者靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、心臟 內(nèi)、脊柱內(nèi)、鞘內(nèi)、骨內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、皮內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下和月幾 內(nèi)注射。
46. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過下述腸胃 外途徑中的任意一種或多種施用靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、真皮內(nèi)、皮 下和月幾內(nèi)注射。
47. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過下述腸胃
外途徑中的任意一種或多種施用靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和肌內(nèi)注射。
48. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過皮下注射 針頭經(jīng)注射器施用于所述受試者。
49. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過導液管施 用于所述受試者。
50. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過外科植入 施用。
51. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過使用關(guān)節(jié) 鏡操作經(jīng)植入施用于所述受試者。
52. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞通過立體定位 注射施用于所述受試者。
53. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞在支持體內(nèi)或 支持體上施用于所述受試者。
54. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞以包嚢化的形 式施用于所述受試者。
55. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞被配制成適合 通過下述途徑中的任意一種或多種施用口服、直腸、皮膚外
(epicutaneous )、目艮、鼻和肺。
56. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞以一個劑量施 用于所述患者。
57. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是在連續(xù)兩個或多個劑量的系列中施用于所述受試者。
58. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是以單個劑 量、兩個劑量或多于兩個劑量施用，其中所述劑量相同或不同，并且它 們是以它們之間相等或不等的間隔施用。
59. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，其中所述的細胞是歷經(jīng)以下的
期間施用的少于l天至l周、1周至1月、1月至1年、l年至2年、
或長于2年。
60. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了2以外，其中除了用所述
細胞治療外，所述受試者已經(jīng)、將會、或正在用一種或多種免疫抑制劑 治療。
61. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了2以外，其中除了用所述
細胞治療外，所述受試者已經(jīng)、將會、或正在用以下的一種或多種治療 皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素A、環(huán)孢菌素類免疫抑制劑、環(huán)磷酰胺、抗胸腺 細胞球蛋白、硫唑嘌呤、雷帕霉素、FK-506和除FK-506以外的大環(huán)內(nèi) 酯類免疫抑制劑、以及免疫抑制單克隆抗體劑(即， 一種免疫抑制劑，其 是一種免疫抑制單克隆抗體或者是一種在整個或者在一個或多個部分 包含單克隆抗體的藥劑，例如包括單克隆抗體Fc或Ag結(jié)合位點的嵌合 蛋白質(zhì))。
62. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了2以外，其中除了用所述 細胞治療外，所述受試者已經(jīng)、將會、或正在用以下的一種或多種治療 皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素A、石危唑嘌呤、雷帕霉素、環(huán)》粦酰胺、FK-506、 或免疫抑制單克隆抗體劑。
63. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了2以外，其中所述細胞在 制劑中被施用，該制劑包含一種或多種其它免疫抑制劑。
64. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了2以外，其中所述細胞在 制劑中被施用，該制劑包含以下的一種或多種皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素 A、環(huán)孢菌素類免疫抑制劑、環(huán)磷酰胺、抗胸腺細胞球蛋白、硫唑嘌呤、 雷帕霉素、FK-506和除FK-506以外的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑、以及免 疫抑制單克隆抗體劑。
65. 根據(jù)上述或下述任一項的方法，除了2以外，其中所述細胞在 制劑中被施用，該制劑包含以下的一種或多種皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素 A、硫唑噤呤、環(huán)磷酰胺、雷帕霉素、FK-506、和免疫抑制單克隆抗體劑。
附圖簡述
圖1是流程圖，其顯示用于本文描述的某些實施例的 一般試驗方案， 如實施例1所述。
圖2是一組圖，其顯示同基因性和同種異體MAPC移植物促進新生 HI大鼠行為恢復，如實施例2所述。運動和神經(jīng)功能的行為試驗是在第 7天和第14天、在接受同基因性和同種異體MAPC移植物的動物中進 行。在移植后第7天動物開始顯示更少行為缺乏的趨勢，然后到移植后 第14天顯示明顯減少的運動異常，其與對照比較。星號表示統(tǒng)計學顯 著性為p<0.05,其與陰性對照比較(介質(zhì)輸注)。
圖3是一個圖，其顯示MAPC移植物減少CA3神經(jīng)元細胞在HI受 損動物中的損失，如實施例3所述。該圖顯示了由海馬切片組織分析觀 測的存活細胞。在移植MAPCs后第14天將動物處死。制備腦切片，Nissl 染色，才企查MAPC和介質(zhì)治療動物的海馬神經(jīng)元的存活率。對每一切片 受損傷的和未受損傷的對側(cè)海馬區(qū)域計算每個視野存活的細胞，并且比 較這些計數(shù)。未受損傷的海馬細胞數(shù)取值為100%。該數(shù)據(jù)證明了 MAPC 移植后CA3區(qū)域中神經(jīng)元的統(tǒng)計學顯著性保護。(ANOVAF值為35.33, df =2, 19和pO扁l; Fisher posthoc為pO扁l)。
圖4是一組圖，其顯示異種MAPC移植物外科誘導缺血性中風之后 促進成年大鼠行為恢復，如實施例7所述。運動和神經(jīng)功能的行為試-瞼 在誘導中風之后第14和21天進行(顱內(nèi)移植后第7和14天)。動物接受 100,000、 200,000和400,000異種MAPC細胞或者僅為對照的介質(zhì)PBS。 星號表示對照組和MAPC實驗組之間的顯著差異(重復測定ANOVA, pO.0001; Fisher' s PLSD posthoc t誦檢驗，p，s<0.0001)。
圖5是一個圖，其顯示在大鼠缺血性中風之后異種和同種異體 MAPC移植物促進持久的和統(tǒng)計學顯著性的運動恢復。運動功能的行為 試驗在第14天進行，以及在此后56天中每第14天進行，如實施例10 所述。星號表示統(tǒng)計學顯著性為pO.OOOl，其與陰性對照比較(非存活 的輻照的MAPCs)。
圖6是一個圖，其顯示在大鼠缺血性中風之后異種和同種異體 MAPC移植物促進持久的和統(tǒng)計學顯著性的神經(jīng)恢復。神經(jīng)功能的行為試^r在第14天進行，以及在此后56天中每第14天進行，如實施例10 所述。星號表示統(tǒng)計學顯著性為pO.OOOl,其與陰性對照比較(非存活 的輻照的MAPCs)。
圖7是一個圖，其顯示給缺血性中風大鼠施用異種MAPCs后運動 功能的劑量依賴性改善，如實施例12所述。運動功能的行為試驗在第 14天進行，以及在此后56天中每第14天進行。星號表示統(tǒng)計學顯著性 為p<0.01,其與陰性對照比較(非存活的輻照的MAPCs)。
圖8是一個圖，其顯示用異種MAPCs治療的缺血性中風大鼠的神 經(jīng)功能的劑量依賴性改善，如實施例12所述。神經(jīng)功能的Bederson試 驗在第14天進行，以及在此后56天中每第14天進行。星號表示統(tǒng)計 學顯著性為p<0.01,其與陰性對照比較(非存活的輻照的MAPCs)。
圖9是一個圖，其顯示用異種MAPCs治療的缺血性中風大鼠的運 動功能的劑量依賴性改善，如實施例14所述。測定運動功能的EBST 是在IV輸注之后1周進行，然后8周中每周1次進行，以證明長期效 果。延遲1表示誘導缺血性損傷之后接受細胞1天的組，延遲2表示損 傷之后接受細胞2天的組，以及延遲7為缺血性損傷之后接受細胞7天 的組。星號表示統(tǒng)計學顯著性為p<0.001,其與陰性對照比較(中風后第 7天提供的非存活的輻照的MAPCs)。
圖IO是一個圖，其顯示劑量依賴性地改善用異種MAPCs治療的缺 血性中風大鼠的神經(jīng)功能，如實施例14所述。測定神經(jīng)功能的Bederson 試驗是在IV輸注之后1周進行，然后8周中每周1次進行，以證明長 期效果。延遲1表示誘導缺血性損傷之后接受細胞1天的組，延遲2表 示缺血性損傷之后接受細胞2天的組，以及延遲7表示缺血性損傷之后 接受細胞7天的組。星號表示統(tǒng)計學顯著性為p<0.001，其與陰性對照 比較(中風后第7天提供的非存活的輻照的MAPCs)。
圖ll是圖和照片，其顯示缺血性中風大鼠內(nèi)源性神經(jīng)元細胞損失 通過IV輸注MAPCs隨時間而減小，如實施例16所述。在MAPC輸注 開始之后第56天將動物處死。為測定神經(jīng)元的存活率，制備腦切片， Nissl染色。在全部植入的動物中測定存活率，在損傷之后不同時間接受 MAPCs的動物中比舉支神經(jīng)元存活率。對同一切片對側(cè)區(qū)域中每一受損 傷位置和未受損傷位置計算每個視野存活的細胞，并且比較結(jié)果。未受 損傷的對側(cè)位置數(shù)值設(shè)為100%。顯示于圖11的該數(shù)據(jù)表明了 MAPC移植后半影區(qū)中神經(jīng)元的統(tǒng)計學顯著性保護。星號表示統(tǒng)計學顯著性為
p<0.05，其與其它組比較。該圖上方的嵌入物顯示了受損傷位置的代表 性的橫切面。
詞匯表
一4殳地，術(shù)語和短語才艮據(jù)它們本領(lǐng)域已確定的含義應用于本文。^旦 是，為了避免可能的歧義，本文所用的某些術(shù)語和短語的含義描述如下 "A"或"an"表示一個或多個；至少一個。 "附加的，，表示共同地、 一起、除...之外還、結(jié)合，等。 "腦梗死(cerebral infract)，，、"腦梗死(ceberal infarction)，，是指大 腦的缺血性病癥，其由到達或通過大腦的血流梗阻引起。腦梗死通常導 致組織壞死，該組織已經(jīng)因該梗阻致喪失血流而失氧。腦梗死通常導致 持久的病灶神經(jīng)缺乏。
"腦血管意外，，與中風含義相同。
"腦缺血，，是指當流到大腦的血液降低到維持正常神經(jīng)功能的最小 需求以下時所發(fā)生的病癥。腦缺血通常由以下引起頸動脈狹窄、基底 動脈狹窄、推動脈狹窄和腦血管閉塞性疾病。其還可由煙霧病(moyamoya disease)和Takayasu氏動脈炎引起。
"共同施用"可包括同時或連續(xù)施用兩種或多種藥物。 "皮層的"是指器官或部分器官等的外側(cè)部分。例如大腦的外側(cè)部分 是指大腦皮層。人大腦皮層為2-4 mm (0.08-0.16英寸)厚并且在許多復 雜的腦功能中發(fā)揮中樞作用。人大腦皮層的表面是褶疊的，并且皮層表 面的三分之二以上位于所述褶疊的溝中，稱為"溝，，。大腦皮層的種系
發(fā)育較老的部分稱為海馬。更近發(fā)育的部分稱為新-皮層。
"皮層梗死"是指與到腦皮層的血液供應喪失相關(guān)的梗死；通常是與 到大腦的血液供應喪失相關(guān)的梗死；皮層梗死具有幾乎與腦梗死相同的 含義。
"細胞因子"是指誘導或提高細胞運動的細胞因子，例如MAPCs或 其它干細胞、祖細胞或分化細胞的歸巢。細胞因子還可刺激此類細胞分裂。
如用于本文的，"有害的"表示有害的。順便說明，如用于本文的， "有害的免疫應答"表示有害的免疫應答，例如不足或太弱的那些，太強的那些，和/或指向錯誤的那些。此外有害的免疫應答是干擾藥物作用 的免疫應答，包括其它方面的正常免疫應答。實例包括涉及排斥移植體 和移植物的免疫應答，以及引起移植物抗宿主病的在移植物和移植物中 免疫活性細胞的應答。
"分化因子"是指細胞因子，例如生長因子，其誘導譜系定型。 "功能異常"表示，如用于本文的，障礙、疾病或不同于正常過程的 有害作用。順便說明，皮層梗死和氧缺乏(缺氧)可引起功能異常，例如 或?qū)е氯毖該p傷。其它功能異常還包括，例如，涉及排斥移植體和移 植物的免疫應答，以及引起移植物抗宿主病的免疫活性細胞在移植物和 移植物中的應答，然后其通常必需用免疫抑制治療法來治療。
"EC細胞"是指胚胎癌細胞。
"有效量"、"有效劑量"等通常表示一種量，其提供了需要的局部和 全身作用。例如有效量是足以實現(xiàn)有益的或需要的臨床結(jié)果的量。有效 量可以在單次施用中一次性全部提供，或者分成幾份量并在多次施用中 提供有效量。例如，MAPCs的有效量可在一次或多次施用中被施用， 并且可以包括任何預先選擇量的細胞。應當考慮的精確計算有效量可以 基于每一受試者的個體因素，包括他們的大小、年齡、損傷、和/或待治 療的疾病或損傷、從操作發(fā)生或疾病開始時的時間量。對于給定受試者， 基于本領(lǐng)域常規(guī)的考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定有效量。因此，例如， 本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員，例如醫(yī)生，基于如本文和本領(lǐng)域公開的MAPCs 的已知性質(zhì)，同時考慮前述因素，將能夠確定對于給定受試者的有效量。 如用于本文的，"有效劑量"與"有效量"含義相同。
通常，在本上下文中的術(shù)語有效表示足以達到需要的結(jié)果，其可為 在一些關(guān)注項中改善的預后和/或更好的患者狀態(tài)。通常它是指損傷、功 能異常、障礙或疾病的好轉(zhuǎn)或治愈。在腦損傷、功能異常、障礙或疾病 的情況中，例如，有效劑量可以是達到需要的神經(jīng)學結(jié)果的那種，所述 神經(jīng)學結(jié)果可包括減少未用"有效，，量治療時將會發(fā)生的細胞損傷、整 個地阻止進一步的細胞損傷、和/或使細胞損傷反轉(zhuǎn)。在本上下文中，"有 效"還可定義為臨床結(jié)果，例如無進一步的神經(jīng)功能下降和/或神經(jīng)功能 改善。在此方面，為此目的，神經(jīng)功能的改善可經(jīng)由看護提供者通過多 種試3全和測量的4壬意 一種來判斷。
幾乎同樣地將有效劑量和量用于其它損傷、功能異常、障礙和疾病。"EG細胞"是指胚胎生殖細胞。
"移入"是指細胞接觸并摻合到存在的感興趣的體內(nèi)組織中。 "富集的群體"表示相對于原始群體中的其它的細胞或組分而言
MAPCs數(shù)目的相對增加，例如相對于培養(yǎng)物例如原始培養(yǎng)物或者體內(nèi) 中的一種或多種非-MAPC細胞類型而言MAPCs數(shù)目的增加。
"ES細胞"是指胚胎干細胞。
"擴張"是指未分化的一個或者多個細胞的繁殖。
"GVHD"是指移植物抗宿主病，其表示的是進程，該進程最初發(fā)生 于免疫妥協(xié)的宿主中，此時其經(jīng)由移植物的免疫活性細胞被認為是非自 身的。
"HVG"是指宿主抗移植物應答，其表示當宿主排斥移植物時發(fā)生的 進程。通常，當移植物被認為是外來的(非自身的)時，該HVG是通過宿 主的免疫活性細胞而^皮觸發(fā)。
"缺氧"是指氧缺乏。在神經(jīng)學的語境中，它是指到達腦的氧減少， 雖然供血充足它也可能發(fā)生。缺氧可能起因于氣哽、抑制(strangling), 窒息、頭部創(chuàng)傷、 一氧化碳中毒、心臟停搏、以及全身麻醉及血流閉塞 或阻塞的并發(fā)癥。腦缺氧導致事件的級聯(lián)，該級聯(lián)會導致細胞損傷和細 胞死亡。腦缺氧/缺血可由影響心血管泵送系統(tǒng)或呼吸系統(tǒng)的廣泛疾病i普 引起。腦缺氧/缺血被分成四類局部腦缺血、整體腦缺血、彌散性腦缺 氧和腦梗死。
局部腦缺血(FCI)是由腦中的血凝塊引起，該血凝塊減少了患病區(qū)域 的血流。FCI的嚴重度不同，并且通常對敏感神經(jīng)元引起不可逆的損傷。 整體腦缺血(GCI)由心室纖顫或心搏暫停引起，其終止了到達腦的血流。 從持續(xù)長于5至10分鐘的GCI恢復是有問題的。更長的GCI通常是致 命的。彌散性腦缺氧(DCH)是由血氧合作用不足引起，并且通常導致輕 度至中度低氧血癥。純粹的DCH引起腦功能異常，但是不會導致不可 逆的腦損傷。其可由肺部疾病、高空病、或嚴重貧血引起。腦梗死(CI) 起因于腦區(qū)域中的局部血管閉塞，其可引起壞死。
"梗死(infarct)"、"梗死(infarction)"是指組織中的壞死區(qū)域， 其起因于缺血(血流梗阻)，所述缺血通常由血栓或栓塞引起。它還是指 血流中的梗阻，導致缺血，其通常由血栓或栓塞引起。
"免疫抑制"是指在受試者中防止、抑制和/或反轉(zhuǎn)免疫應答，例如對外來抗原的免疫應答，例如同種異體或異異種細胞或組織。在某些情況 下，例如，免疫抑制治療需要抑制受試者的免疫應答，該免疫應答可能 對用細胞或器官的移植物治療受試者的需要的臨床結(jié)果不利。
"缺血，，是指血液供應的限制，通常是由于血管阻塞，導致對該阻塞 的血管供氧的組織的功能異?；驌p傷。缺血還指到達身體部位的血流不 足，其由血管的收縮或阻塞引起。腦組織中缺血引發(fā)了一個級聯(lián)(稱為缺 血性級聯(lián))，其導致蛋白水解酶、活性氧簇、和可損傷并最終殺死腦組織 的其它物質(zhì)釋放。
"分離的"是指 一種細胞或多種細胞，它們與 一種或多種細胞或者一 種或多種細胞組分不相關(guān)聯(lián)，而后者與體內(nèi)或原始培養(yǎng)物中的一種或多 種細胞相關(guān)聯(lián)。
"MAPC"是"多能成體祖細胞"的首字母縮寫。它是指非-ES、非-EG、 非-生殖細胞，其可產(chǎn)生一種以上胚層的細胞鐠系，例如所有三種胚層 (即，內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。MAPCs還具有端粒酶活性。它們對 oct-3/4(例如，人oct-3A)可以是陽性的。它們還表達rex-l、 rox-l、 sox-2、 SSEA-4和/或nanog中的 一種或多種。在MAPC中的術(shù)語"成體"是非限 制性的。其僅表示不是ES、 EG或生殖細胞的那些細胞。通常，如用 于本文的，MAPC是單數(shù)，MAPCs是復數(shù)。MAPCs還稱為多能成體干 細胞(MASCs)。參見，例如美國專利No.7,015,037,其通過引用并入本 文，作為本文公開的方法，以用于分離和生長MAPCs/MASCs,此類方 法僅僅是示例性和說明性的，并且不以任何方式限制可根據(jù)本發(fā)明使用 的jt匕類方法。
"MASC"參見MAPC。
"MNC"是指單核細胞。
"形式"表示類型、途徑、手段或方法，例如，治療形式；即治療的類型。
"MSC"是間質(zhì)干細胞的縮寫。
有關(guān)MAPCs的"多能"是指分化時可產(chǎn)生一種以上胚層的細胞譜系， 例如所有三種原始胚層(即，內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。
"持久性"是指細胞在體內(nèi)抵抗排斥的能力，以及隨時間(例如，數(shù)日、 數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年)在數(shù)目上保持和/或增加的能力。
"原始培養(yǎng)物"是指細胞群體，其直接得自來自生物體的物質(zhì)在傳代培養(yǎng)前的分離塊。通常，原始培養(yǎng)物是通過以下建立的(a)從生物體分 離組織；(b)將該組織解剖和/或分解，和(c)使來自該組織的細胞開始生 長，可混懸于介質(zhì)中或者，更典型的，附加到培養(yǎng)容器的表面。原始培 養(yǎng)物不包括，并且優(yōu)選地，傳代培養(yǎng)分離塊的細胞，例如通過細分或稀 釋該細胞以及將它們重新接種于新鮮介質(zhì)和/或新鮮培養(yǎng)容器中。通常， 附著細胞的原始培養(yǎng)物是通過使細胞從附著于適宜底物的組織碎片中 遷移出來而獲得，或者是通過將該組織經(jīng)機械或酶分解以產(chǎn)生細胞混懸 液而獲得，然后將它們中的一些附著于底物。
用于多能成體祖細胞(MAPCs)的"祖(Progenitor)"表示這些細胞可 以產(chǎn)生其它細胞，例如進一步分化的細胞。該術(shù)語是非限制性的，并且 并不是將這些細胞限于具體的譜系。
"自我更新"是指產(chǎn)生復制子代干細胞的能力，該子代干細胞具有分 化成相同于其起源的那些細胞的潛能。用于本上下文的類似術(shù)語是"增 殖"。
"中風，，是急性神經(jīng)損傷。其通過中斷到達腦的血液供應而引起80% 的病例(指的是缺血性中風)，該供應的中斷擾亂(梗死)、并且通常是打斷 了腦的血液灌流。該打斷可產(chǎn)生于動脈血流中的中斷，^旦它還可產(chǎn)生于 靜脈流中的中斷。灌流被擾亂的那部分腦不能接受足夠的氧，造成細胞 損傷和死亡。其結(jié)果是中風。
中風可導致暫時的神經(jīng)損傷、永久損傷或死亡。損傷可能是局部性 的或全身性的。缺血性中風通常分類為血栓性中風、栓塞性中風、全身 性灌注不足(Watershed或BorderZone中風)或靜脈血栓。血栓性中風是 由動脈狹窄通過血栓(通常包括動脈粥樣硬化斑塊)引起的。栓塞性中風 通過栓塞(最常見為血凝塊)阻塞動脈而造成的。
"受試者"是脊推動物，例如哺乳動物，例如人。哺乳動物包括，但 不限于，人類、畜養(yǎng)動物、體育動物和寵物。通過本發(fā)明方法需要治療 的受試者包括罹患障礙、功能異?；蚣膊〉哪切?，所述疾患例如皮層梗 死和/或缺氧性缺血性腦損傷、或者其副作用、或者其治療，其可受益于 作為主要的或附加的治療的MAPCs的施用。
如用于本文的，"移植物"表示引入到受試者中的細胞、組織或器官。 該移植物可得自所述受試者、得自培養(yǎng)物或者得自非受試者來源。
"治療(treat)，，、"治療(treating)，，、"治療(treatment)，，等與患者的處理和護理有關(guān)，特別是有關(guān)與障礙或疾病的斗爭，其包括但不 限于預防、改善、抑制和/或治愈缺乏、功能異常、障礙或疾病或其它導 致有害作用的其它進程，例如斗爭、預防、改善、抑制和/或治愈損傷、 功能異常、障礙或疾病。還參見有效、有效量、有效劑量。
"治療(therapy)"是治療(treatment)的同義詞。
發(fā)明詳述
如本文描述的，根據(jù)本發(fā)明的某些方面和實施方案，MAPCs可用 于治療腦損傷、功能異常、障礙和/或疾病，例如，但不限于皮層梗死和 缺氧性缺血性腦損傷，有和沒有附加的免疫抑制治療。
本發(fā)明不同的實施方案提供了使用MAPCs的方法，用于將腦的損 傷、功能異常、障礙和/或疾病排除、預防、斗爭、改善、減輕、減少、 減到最小、消除和/或治愈等。在實施方案中，它是在腦皮層中和/或腦 皮層(還稱為腦的皮層區(qū)域)的損傷、功能異常、障礙和/或疾病。在實施 方案中，它是在大腦中和/或大腦的損傷、功能異常、障礙和/或疾病。 在實施方案中，它是在大腦皮層中的和/或大腦皮層的損傷、功能異常、 障礙和/或疾病。在實施方案中，它是在海馬中的和/或海馬的損傷、功 能異常、障礙和/或疾病。
在有關(guān)上述各個和全部的實施方案中，特別值得一提的是，所述損 傷、功能異常、障礙和/或疾病是與缺氧相關(guān)和/或因缺氧引起的損傷、 功能異常、障礙和/或疾病。在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異 常、障礙和/或疾病是因缺氧引起的。在此關(guān)注的實施方案中，所述缺氧 是局部的。在此關(guān)注的實施方案中，所述缺氧是彌散的。在此關(guān)注的實 施方案中，所述疾病是缺氧性缺血性腦損傷。
在進一步的有關(guān)相同的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和
P;礙和/或:病、。在、此關(guān)注的實施^方案中，所述損傷 功能異常、障礙和 /或疾病是因動脈或靜脈狹窄或阻塞引起的，其包括但不限于血栓或栓塞 引起的阻塞。在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和/ 或疾病是與梗死和/或缺血相關(guān)的和/或因梗死和/或缺血引起的。在此關(guān) 注的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和/或疾病是與壞死相關(guān)的 和/或因壞死引起的。在此關(guān)注的實施方案中，所述梗死是皮層梗死。在此關(guān)注的實施方案中，所述損傷、功能異常、障礙和/或疾病是中風。
本發(fā)明實施方案提供了使用MAPCs的方法，其中使用了附加的免 疫抑制治療和/或治療。實施方案提供了使用MAPCs的方法，其中未使 用附加的免疫抑制治療。
因此，在它的一些實施方案中，本發(fā)明提供了細胞，該細胞(i)不 是胚胎干細胞、不是胚胎生殖細胞并且不是生殖細胞；(ii)可以分化成內(nèi) 胚層的、外胚層的和中胚層的胚細胞系中的至少兩種中每種細胞系的至 少一種細胞類型；以及(iii)對治療腦損傷和/或功能異常和/或障礙和/或疾 病是有效的。
在實施方案中，所述的腦損傷和/或功能異常和/或障礙是由氧缺乏 引起和/或與氧缺乏相關(guān)。在實施方案中，它是由缺氧引起或與缺氧相關(guān)。 在實施方案中，它是由血液供應的狹窄或阻塞引起或與血液供應的狹窄 或阻塞相關(guān)。在實施方案中，它是梗死和/或缺血或與梗死和/或缺血相 關(guān)。在實施方案中，它是中風。在實施方案中，它是缺氧缺血性腦損傷。 在實施方案中，它是皮層梗死或與皮層梗死相關(guān)。
在本發(fā)明的實施方案中，所述細胞在其中單獨使用或者和其它治療 劑和形式作為主要治療形式一起使用。在本發(fā)明的一些實施方案中，所 述細胞作為唯一治療劑使用或者與其它治療劑 一起使用。在本發(fā)明的一 些實施方案中，所述細胞單獨使用或與其它治療劑或形式使用，均在一 種或多種主要治療形式中以及在一種或多種附加的治療形式中。
MAPCs
根據(jù)本發(fā)明的細胞在此作更詳細地描述，并且在本文通常是指"多 能成體祖細胞"，以及首字母縮寫"MAPC"(并且"MAPCs，，通常用作復數(shù))。 應當理解，這些細胞不是ES、不是EG、并且不是生殖細胞，并且它們 具有分化成三種原始胚層譜系(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)中的至少兩種 的細胞類型，例如分化成所有三種原始鐠系的細胞。
MAPCs可以形成以下細胞，例如，特別值得一提的是，內(nèi)臟中胚層 細胞、肌細胞，骨細胞，軟骨細胞，內(nèi)分泌細胞、外分泌細胞、內(nèi)皮細胞、 毛發(fā)形成細胞、牙形成細胞、內(nèi)臟中胚層細胞、造血細胞、基質(zhì)細胞、 骨髓基質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞、神經(jīng)外胚層的細胞、上皮細胞、目艮細胞、 胰臟細胞和肝細胞類細胞，以及特別值得一提的許多相同譜系的細胞。例如，在由MAPCs形成的細胞中是成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、 骨骼肌肉細胞、骨骼肌細胞、膽上皮細胞、胰腺腺泡細胞(pancreatic acinary cells)、系膜細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、cardiomyocytes、骨 細胞、血管形成細胞、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元(其包括5-羥色胺能、GABA 能、多巴胺能神經(jīng)元)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞、胰臟上皮細胞、 腸上皮細胞、肝上皮細胞、皮膚上皮細胞、腎上皮細胞、腎臟上皮細胞、 胰島細胞、成纖維細胞、肝細胞，以及特別值得一提的是如前述的相同 i普系的其它細月包。
MAPCs具有端粒酶活性，其對于自我更新以及避免復制性衰老是 必需的。通常它們還表達oct-3/4。 Oct-3/4(在人中為oct-3A)特別不同于 ES、 EG和生殖細胞。它^fe認為是具有廣泛分化能力的未分化細胞的標 志物。Oct-3/4通常還被認為具有維持細胞在未分化狀態(tài)下的作用。Oct-4 (在人中為oct-3)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其表達于原腸形成前期胚胎、早期卵 裂期胚胎、胚泡的內(nèi)細胞群的細胞和胚胎癌("EC")細胞(Nichols, J. et al. (1998)^195: 379-91)，并且當細胞被誘導分化時其被下調(diào)節(jié)。oct-4(在 人中為oct-3)基因轉(zhuǎn)錄到人的至少兩種剪接變體即oct-3A和oct-3B中。 oct-3B剪接變體發(fā)現(xiàn)于許多分化細胞中，然而oct-3A剪接變體(以前還 表示成oct-3/4)被報道對未分化的胚胎干細胞是特異的。參見Shimozaki et al. (2003) Development 130: 2505-12。 oct-3/4的表達在決定胚胎發(fā)生 和分化的早期步驟中發(fā)揮重要作用。Oct-3/4與rox-1 —起引起Zn-指蛋 白rex-1的轉(zhuǎn)錄激活，其還^皮要求保持ES細胞呈未分化的狀態(tài)(Rosf5ord, E. and Rizzino, A. (1997) Biochem Biophvs Res Commun 203: 1795-802; Ben-Shushan, E. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 1866-78)。
MAPCs還可表達其它標記物。它們是rex-l、 rox-1和sox-2。 rex-1 :故oct-3/4控制，該oct-3/4激活rex-1的下游區(qū)表達。rox-1和sox-2在非 -ES細胞中表達。
在本發(fā)明的一些實施方案中，將MAPCs與一種或多種其它藥物和/ 或治療形式作為主要治療形式使用。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述 細胞作為附加的治療形式使用，即作為另一主要治療形式的附加物。在 一些實施方案中，所述細胞用作附加的治療形式的唯一活性劑。在其它 實施方案中，所述細胞與一種或多種其它藥物或治療形式一起作為附加 的治療形式使用。在一些實施方案中，所述細胞既作為主要的又作為附加的治療藥物和/或形式4吏用。在此兩方面，細月包可以單獨在主要的和/ 或在附加的形式中使用。它們還可以與其它治療劑或形式一起，在主要 的或在附加的形式中或者在兩種形式中使用。
如上文所述，主要的治療，例如治療藥物、治療、和/或治療形式， 靶向于(即，將要作用于)主要的功能異常，例如疾病，也就是待治療的。 附加的治療，例如治療和/或治療形式，可以與主要治療(例如治療藥物、 治療、和/或治療形式)組合施用，以作用于主要的功能異常，例如疾病， 以及所述主要的治療的補充的作用，從而增加該治療方案的總體效果。 也可以施用附加的治療，例如藥物、治療、和/或治療形式，以作用于主 要的功能異常的并發(fā)癥和/或副作用，所述功能異常例如疾病和/或由治 療例如治療藥物、治療、和/或治療形式引起的那些。關(guān)于這些應用的任 一種， 一種、兩種、三種或更多種主要的治療可以與一種、兩種、三種 或更多種附加的治療一起使用。
在一些實施方案中，將MAPCs在功能異常例如疾病和/或副作用發(fā) 病之前施用于受試者。在實施方案中，將所述細胞在功能異常發(fā)展時施 用。在一些實施方案中，將所述細胞在功能異常確立之后施用。MAPCs 可以在功能異常的發(fā)展、持久、和/或傳播的任何階段或者其消退之后施 用。
如上文所述，本發(fā)明的實施方案提供了用于主要的或附加的治療的 細胞和方法。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述細胞被施用于同種異體 受試者。在一些實施方案中，它們對于所述受試者是自體的。在一些實 施方案中，它們對于所述受試者是同基因性的。在一些實施方案中，所 述細胞對于受試者是異種的。不論是同種異體、自體的、同基因性的、 或異種的，在本發(fā)明不同的實施方案中，所述MAPCs在所述受試者中 僅是弱免疫原性的或者是非-免疫原性的。在實施方案中，所述的MAPCs 具有充分低的免疫原性或者是非-免疫原性的，并且有害的免疫應答大體 上基本沒有，即當施用于同種異體受試者時，它們可用作"萬能"供體 細胞而無組織分型和匹配。根據(jù)本發(fā)明不同的實施方案，所述的MAPCs 還可保存并維持在細胞庫中，并且因此可保持在需要時有效使用。
此外，在此方面，不同實施方案中的MAPCs可以被施用而無附加 的免疫抑制治療。
在所有的這些和其它方面，本發(fā)明的實施方案提供了來自哺乳動物的MAPCs,該哺乳動物包括，在一種實施方案中為人類；在其它實施 方案中為非人類靈長動物，大鼠和小鼠，以及狗、豬、山羊、綿羊、馬 和牛。從如上文所述的哺乳動物制備的MAPCs可以用于本文所述的本 發(fā)明所有方法和其它方面。
根據(jù)本發(fā)明不同實施方案的MAPCs可以從此類哺乳動物的不同隔 室和組織中分離，其中它們發(fā)現(xiàn)于，包括但不限于，骨髓、外周血液、 臍帶血、血液、脾臟、肝臟、肌肉、腦、脂肪組織、胎盤和其它下文討 論的。在一些實施方案中，MAPCs在使用之前被培養(yǎng)。
在一些實施方案中，MAPCs是遺傳工程的，例如改善它們的免疫 調(diào)節(jié)性質(zhì)。在一些實施方案中，遺傳工程的MAPCs是通過體外培養(yǎng)產(chǎn) 生的。在一些實施方案中，遺傳工程的MAPCs是從轉(zhuǎn)基因的生物體產(chǎn) 生的。
MAPCs的作用才幾理
對于MAPCs性質(zhì)、活性和作用，不限于任意一種或多種解釋性機 理，值得一提的是，它們可發(fā)揮有益的作用，例如通過不同的形式用 MAPCs治療的作用。例如，MAPCs可具有直接有益的作用。此直接的 作用可以主要地是MAPCs與宿主細胞之間直接接觸的事件。該接觸可 以用細胞的結(jié)構(gòu)組件或者用在它們的直接環(huán)境中的組分。此類直接機理 可涉及直接接觸、擴散、攝取、或本領(lǐng)域技術(shù)人公知的其它過程。MAPCs 的該直接活性和作用可能是空間上受限的，例如限于局部沉積的區(qū)域或 者限于經(jīng)注射到達的身體腔室。
MAPCs還可"歸巢(Home)"以應答"歸巢"信號，例如在損傷或疾病位 置釋放的那些。由于歸巢通常由信號介導，該信號的固有的功能是將細 胞召集到需要修復的位置，該歸巢行為可能是將MAPCs濃集到治療靶 位的有力工具。此作用可以通過如下文討論的特殊因子刺激。
MAPCs還可通過其對因子的應答來調(diào)節(jié)有益的作用，例如用 MAPCs治療的作用。這可發(fā)生另外的或可選的直接調(diào)節(jié)。此類因子可 包括歸巢因子、促細胞分裂劑和其它刺激因子。它們還可包括分化因子、 以及激發(fā)具體細胞過程的因子。后者是這樣的因子，即它們通過其它特 定因子的細胞(例如涉及召集細胞的那些，例如干細胞(包括MAPCs))引 起向損傷或疾病的位置分泌。除了上述和另選的那些，MAPCs可分泌作用于內(nèi)源性細胞例如干 細胞或祖細胞的因子。所述因子可作用于其它細胞，以引起、提高、減 少、或抑制它們的活性。MAPCs可以分泌作用于干細胞、祖細l包或分 化細胞的因子，造成這些細胞分裂和/或分化。歸巢到需要修復的位置的 MAPCs可分泌吸引其它細胞到此位置的營養(yǎng)因子。這樣，MAPCs可以 吸引干細胞、祖細胞或分化細胞到它們需要的位置。MAPCs還可以分 泌造成這些細胞分裂和分化的因子。
此類因子包括營養(yǎng)因子的分泌可歸功于MAPCs在例如以下中的作 用限制炎癥損傷、限制血管滲透、改善細胞生存、以及引起和/或增加 修復細胞到達損傷位置的歸巢。此類因子還直接影響T-細胞增殖。通過 減少它們的吞噬性和抗原呈遞活性，此類因子還可影響樹狀突細胞，其 還可影響T-細胞的活性。
通過這些和其它機理，MAPCs可在不同的損傷、功能異常、障礙 和疾病的治療中提供有益的作用。
MAPC施用 M4尸C賴務(wù)
MAPCs可以從不同的組織制備，例如/人骨髓細月包，如本文其它處 更詳細討論的。
在許多實施方案中，供施用于受試者的MAPCs的純度約為100%。 在其它實施方案中，它是95%至100%。在一些實施方案中，它是85% 至95%。特別在與其它細胞的混合物的情況下，MAPCs的百分數(shù)可以 為2%畫5%、 3%隱7%、 5%曙10%、 7%誦15%、 10%-15%、 10%畫20%、 15%-20%、 20%-25%、 25%國30%、 30%-35%、 35%-40%、 40%-45%、 45%-50%、 60%-70%、 70%誦80%、 80%-90%或90%-95%。
在給定體積中MAPCs的數(shù)目可以通過公知的和常規(guī)的操作和儀器 測定，其中使用存在和/或不存在的某些標記物，包括本文描述的那些， 例如端粒酶(teleomerase),以及，此時需要的是分化成三種如本文所述 三種原始譜系中的 一種以上的細胞的能力。在給定體積細胞混合物中的 MAPCs百分數(shù)可以通過計數(shù)細胞(例如在一等份樣品中的細J包)和測定 為MAPCs的細胞的數(shù)目來測定，其中使用前述筌別MAPCs的操作。細 胞可以容易地:故人工計數(shù)，或者通過使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)。MAPCs可以:故測定，例如在給定體積中的MAPCs，其是通過特異性染色，例
如使用特異性結(jié)合試劑，其通常為結(jié)合到萸光標記物的抗體，接著目測
或計數(shù)，或者通過自動鑒別和計數(shù)儀器例如通過FACS (焚光激活細胞分 析器)儀。
以MAPCs治療障礙或疾病等可以用未分化的MAPCs。治療還可使 用已經(jīng)處理的MAPCs以便它們定型到分化的途徑。治療還可包括已被 處理分化成具有有限分化潛能的低效能干細胞的MAPCs。其還包括已 被處理分化成具有最終分化的細胞類型的MAPCs。 MAPCs的最佳類型 或混合物可通過它們使用的具體環(huán)境來確定，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言 其為常規(guī)設(shè)計的情形，以確定在此方面MAPCs的有效類型或組合。
備
對于給定的應用，供施用MAPCs的制劑選擇取決于不同的因素。 它們中突出的是受試者的物種，待治療障礙、功能異?；蚣膊〉男再|(zhì)及 其在所述受試者中的狀態(tài)和分布，被施用的其它治療和藥物的性質(zhì)，施 用MAPCs的最佳途徑，MAPCs經(jīng)由該途徑的殘存率，給藥方案，以及 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將會明顯的其它因素。特別地，例如，適宜的
載體和其它添加物的選擇將取決于確切的施用途徑和特定劑型的性質(zhì)。
細胞存活可能是使用MAPCs的治療效果的重要決定因素。對于主 要的和附加的治療均如此。當耙位對細胞播種和細胞生長均不適宜時產(chǎn) 生了另 一顧慮。這可能防礙治療性MAPCs到達該位置和/或移入到那里。 在實施方案中，本發(fā)明包括測量增加細胞生存和/或克服由播種和/或生 長的障礙產(chǎn)生的問題的用途。
包含MAPCs的組合物的實例包括液體制劑，其包括溶液劑、混懸 劑和供肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用的制劑(例如可注射的施用)，例如無菌混懸 劑或乳劑。此類組合物可包括MAPCs與適宜載體、稀釋劑或賦形劑的 混合物，所述載體、稀釋劑或賦形劑例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、 右旋糖等。該組合物還可以是冷凍干燥的。該組合物可以含有輔助性物 質(zhì)例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、凝膠化或增粘添加物、防腐劑、 調(diào)味劑、著色劑等，取決于施用途徑和所需要的制劑?？梢詤⒖紭藴式?科書例如"REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCE,"第17版, 1985(其通過引用并入本文)以制備適宜的制劑，而不必過多的試驗。本發(fā)明的組合物通常方便地以液體制劑提供，例如等滲水溶液劑、
混懸劑、乳劑、或粘稠組合物，其可以被緩沖至選擇的pH值。液體制 劑通常比凝膠劑、其它粘稠組合物和固體組合物更容易制備。此外，液 體組合物稍微更為方便施用，尤其是通過注射。另一方面，粘稠組合物 可以配制到適宜的粘度范圍，以提供與特定組織更長的接觸期。
通常將會包括多種添加物，以提高該組合物的穩(wěn)定性、無菌性和等 滲性，例如抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑是特別值得一 提的。預防微生物的作用可通過多種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲 酸酯類、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等來保證。在許多情況下，期望包括 等滲劑，例如糖類、氯化鈉等。通過使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸 鋁和明膠，可以使可注射藥物制劑的吸收延長。然而，根據(jù)本發(fā)明，所 用的任何載體、稀釋劑、添加物應當與所述細胞相容。
除了細胞外，MAPC溶液、混懸液和凝膠通常含有大量的水(優(yōu)選純 化的、無菌水)。還可以存在少量的其它成分，例如pH調(diào)節(jié)劑(例如，堿 例如NaOH)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、潤濕劑和膠凝劑(例 如甲基纖維素)。
通常該組合物是等滲的，即當它們適宜地制備以供施用時具有與血 液和體液相同的滲透壓。
本發(fā)明組合物需要的等滲性可使用氯化鈉或其它藥學可接受的試 劑例如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、或其它無機或有才幾溶質(zhì)來實 現(xiàn)。對于含有鈉離子的緩沖劑而言氯化鈉是特別優(yōu)選的。
如果需要，使用藥學可接受的增稠劑，可以將組合物的粘度維持在 選定的水平。甲基纖維素是優(yōu)選的，原因是它容易且經(jīng)濟可得，而且它 容易處理。其它適宜的增稠劑包括，例如，黃原膠、羧甲基纖維素、羥 丙基纖維素、卡波姆等。增稠劑的優(yōu)選濃度取決于所選擇的試劑。重點 是使用一定的量，此量將達到所選擇的粘度。粘稠組合物通常從溶液通 過添加此類增稠劑來制備。
藥學可接受的防腐劑或細胞穩(wěn)定劑可以用于增加MAPC組合物的 保存期。如果包括此防腐劑，其將在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的選擇不會影 響MAPCs的存活性和效果的組合物的范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，所述組合物的組分應當是化學惰性的。 這對于熟知化學和藥學原則的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將不會存在問題。通過參考標準教科書或通過簡單試驗(不涉及過度的試驗)使用本公開、本 文引用的資料和本領(lǐng)域通?？傻玫馁Y料提供的信息，可以容易地避免所 述問題。
根據(jù)需要，通過將在需要量的適宜溶劑中的實施本發(fā)明所用的細胞 與不同量的其它成分合并，可以制備無菌可注射溶液。
還優(yōu)選的是注射用溶液，包括立體定位注射劑和輸液劑，例如IV
輸液劑。
在一些實施方案中，MAPCs被配制成單劑量可注射的劑型，例如 溶液劑、混懸劑或乳劑。適合MAPCs注射的藥物制劑通常是無菌水溶 液和分散體?？勺⑸渲苿┑妮d體可以是含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖 鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)及其適宜的混合物 的溶劑或分散介質(zhì)。
熟練技術(shù)人員可容易確定在以本發(fā)明方法施用的組合物中的細胞 和任選添加物、介質(zhì)和/或載體的量。通常，任何添加物(除了所述細月包 夕卜)是以在溶液(例如在磷酸鹽緩沖鹽水)中的0.001-50 wty。的量存在。所 述活性成分是以微克至毫克級的量存在，例如約0.0001至約5 wt%,優(yōu) 選約0.0001至約1 wt%,最優(yōu)選約0.0001至約0.05 wt%,或者約0.001 至約20wt。/Q,優(yōu)選約0.01至約10 wt%,最優(yōu)選約0.05至約5wt。/0。
對于任何待施用于動物和人的組合物，以及對于任何特別的施用方 法，優(yōu)選的是確定毒性，例如通過測定在適宜動物模型中的致死劑量 (LD)和LD50,所述動物例如嚙齒類例如小鼠或大鼠；以及，組合物的 劑量、其中的組分的濃度、和施用所述組合物的時間，其引發(fā)了適宜的 應答。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識、本公開、和本文引述的資料，此類 測定不需要過度的試驗。并且，連續(xù)施用的時間可以;f皮確定，而不必過 多的試馬全。
在一些實施方案中，MAPCs被包嚢以供施用，特別是其中包嚢提高 了治療的有效性，或者提供了處理和/或保存時間的益處。結(jié)果是，在一 些增加免疫抑制介導的MAPC的作用的實施方案中，包嚢還可減少對免 疫抑制藥物治療的需求。
此外，在一些實施方案中包嚢提供了對受試者免疫系統(tǒng)的屏障，其 可進一步減少受試者對MAPCs的免疫應答(其通常在同種異體移植物中 是無免疫原性的或者僅僅是弱免疫原性的)，從而減少任何在施用所述細胞時可能會發(fā)生的移植物排斥或炎癥。
在其中MAPCs與另 一類型的細胞(其在同種異體或異種環(huán)境中更具 有典型的免疫原性)混合使用的不同的實施方案中，如果該混合的細胞 是具有免疫能力的并且將該宿主識別為非自身的時，包嚢可減少或消除 不良的宿主對該非-MAPC細胞和Z或GVHD的免疫應答，所述減少或消除 可發(fā)生在免疫妥協(xié)的宿主中。
在植入之前可以通過薄膜和月交嚢將MAPCs包嚢。預計許多可用的細 胞包嚢方法的任一種均可使用。在一些實施方案中，細胞各自被包嚢。 在一些實施方案中，許多細胞被包嚢在相同的膜中。在植入后所述細胞 將被移除的實施方案中，包嚢許多細胞的相對更大的結(jié)構(gòu)，例如在單一 的膜中，可以提供用于回收的便利的手段。
廣泛變化的材料可用于不同的實施方案中以用于MAPCs的微包嚢。 此類材料包括，例如，聚合物膠嚢、藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽微膠嚢、 聚-L-賴氨酸-藻酸鋇膠嚢、藻酸鋇膠嚢、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC) 空心纖維和聚醚砜(PES)空心纖維。
用于可供MAPCs施用的細胞微包嚢的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的，例如在Chang, P., et al., 1999; Matthew, H.W., et al., 1991; Yanagi, K., etal.， 1989; Cai Z.H., et al.， 1988; Chang， T.M., 1992中以及在美國專利 No.5,639,275 (例如，其描述了用于穩(wěn)定表達生物活性分子的細胞的長期 維持的生物相容的膠嚢)中。包嚢的另外的方法是在歐洲專利公開號 No.301,777以及美國專利No.4,353,888、 4,744,933、 4,749,620、 4,814,274、 5,084,350、 5,089,272、 5,578,442、 5,639,275和5,676,943中。前述全部文 獻與MAPCs的包嚢相關(guān)的部分通過引用并入本文。
某些實施方案將MAPCs摻入到聚合物中，例如生物聚合物或合成 聚合物。生物聚合物的實例包括，但不限于，纖連蛋白、fibin、血纖蛋 白原、凝血酶、膠原和蛋白聚糖。其它因子，例如上文討論的細胞因子， 也可以摻入到該聚合物中。在本發(fā)明的其它實施方案中，MAPCs可以 被摻入到三維凝膠的間隙中。通常，大量的聚合物或凝膠將以外科植入。 可以配制在足夠小的粒子或纖維中的聚合物或凝膠可以通過其它常用 的、更方便的、非外科的途徑施用。
本發(fā)明的藥物組合物可以制備成許多形式，其包括片劑、硬或軟明 膠膠嚢劑、水性溶液劑、混懸劑和脂質(zhì)體，以及其它緩釋制劑，例如成形的聚合物凝膠?？诜后w藥物組合物可以是例如以下的形式水性或 油性混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑、或酏劑，或者可以以干燥產(chǎn)物呈 現(xiàn)，以供用水或其它適宜的介質(zhì)在使用前重構(gòu)。此類液體藥物組合物可 含有常規(guī)添加物，例如混懸劑、乳化劑、非水性介質(zhì)(其可包括食用油) 或防腐劑?？梢耘渲七@樣的口服劑型，其中細胞在穿過胃后釋放到腸中。 此類制劑描述于美國專利No.6,306,434以及其中包含的文獻中。
適合直腸施用的藥物組合物可以制備成單位劑量的栓劑。適宜的載 體包括鹽水溶液和其它本領(lǐng)域常用的材料。
對于通過吸入施用，細胞可以方便地從吸入器、霧化器或加壓包裝 遞送，或者從遞送氣霧劑的其它方便手段遞送。加壓包裝可包括適宜的 推進劑例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其 它適宜的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥以遞送計量化的 量來確定劑量單位。
另選的，對于通過吸入或吹入施用，可以釆用干粉組合物形式的方 式，例如調(diào)節(jié)劑和適宜的粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物。該粉末 組合物可以以單位劑型存在于例如膠嚢或藥筒(cartridges)中，或者例如 存在于明膠或泡罩包裝中，所述粉末可以在吸入器或吹入器的幫助下從 上述形式中施用。對于鼻內(nèi)施用，可以通過液體噴霧例如通過塑料瓶霧 化器施用細胞。
岸它活^^為、
MAPCs可以與其它藥物活性劑施用。在一些實施方案中，此類活 性劑的一種或多種與MAPCs —起配制以供施用。在一些實施方案中， MAPCs和一種或多種活性劑是在分離的制劑中。在一些實施方案中， 包含MAPCs和/或一種或多種活性劑的所述組合物以彼此附加的應用而 凈皮配制。
MAPCs可以在包含免疫抑制劑的制劑中施用，例如任何數(shù)目的皮 質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素A、環(huán)孢菌素類免疫抑制劑、環(huán)磷酰胺、抗胸腺細 胞球蛋白、石危唑嘌呤、FK-506和除FK-506以外的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制 劑、以及雷帕霉素的任何組合。在某些實施方案中，此類藥物包括皮質(zhì) 類固醇、環(huán)孢菌素A、 ^琉唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、雷帕霉素和/或FK-506。 根據(jù)前文的免疫抑制劑可以是唯一的此類另外的藥物，或者可以與其它藥物例如本文記述的其它藥物組合。其它免疫抑制劑包括他克莫司、麥 考酚酸嗎乙酯和西羅莫司。
此類藥物還包括抗生素劑、抗真菌劑和抗病毒劑，以指定可根據(jù)本 發(fā)明實施方案使用的幾種其它藥理活性物質(zhì)和組合物。
典型的抗生素或抗真菌化合物包括，但不限于，青霉素、鏈霉素、 兩性霉素、氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、麥考酚酸、萘啶酸、新霉
素、制霉菌素、巴龍霉素、多粘菌素、噪羅霉素、利福霉素(rifampicin)、 大觀霉素、四環(huán)素、泰洛星、zeocin,以及頭孢菌素類、氨基糖苷類和 棘球白素類(echinocandins)。
此類其它添加物涉及這樣的事實，即MAPCs，像其它干細胞，施 用于受試者之后可以"歸巢"到有利于其生長和功能的環(huán)境中。此"歸巢" 通常在其需要的位置濃縮所述細胞，例如免疫障礙、功能異?；蚣膊〉?位置。已知許多物質(zhì)刺激歸巢。它們包括生長因子和營養(yǎng)信號因子例如 細胞因子。它們可用于刺激MAPCs的歸巢以治療靶向的位置。它們可 以在用MAPCs治療之前、與MAPCs—起或在MAPCs施用之后施用于 受試者。
某些細胞因子，例如，改變或影響MAPCs或其分化的相似物遷移 到治療所需位置，例如免疫妥協(xié)的位置?？捎糜诖朔矫娴募毎蜃影?， 但不限于，基質(zhì)細胞衍生的因子-1 (SDF-1)、干細胞因子(SCF)、血管生 成素-1、胎盤衍生的生長因子(PIGF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、刺 激內(nèi)皮黏附分子例如ICAMs和VCAMs表達的細胞因子、和引起或促進 歸巢的細胞因子。
它們可以作為預治療施用于受試者、與MAPCs—起施用、或者在 MAPCs已^皮施用之后施用，以通過改善歸巢或通過其它才幾理促進歸巢 到需要的位置并且達到改善的治療作用。此類因子可以與MAPCs合并 到適合它們一起施用的制劑中。或者，此類因子可以分別地配制和施用。
特別值得一提的是，因子(例如上文討論的細胞因子)和MAPCs的施 用順序、制劑、劑量、給藥頻率和施用途徑通常會隨所治療的障礙或疾 病、其嚴重度、受試者、被施用的其它治療、障礙或疾病的階段和預后 因素而改變。對于其它治療已經(jīng)確立的一般方案提供了一個在MAPC-介導的直接或附加的治療中確定適宜給藥的框架。這些，與本文提供的 其它信息 一起，將使本領(lǐng)域技術(shù)人中能夠確定根據(jù)本發(fā)明實施方案的適宜的施用操作，而無需過多的試驗。
在實施方案中，細胞被配制成適合治療腦損傷，其包括本文所述的 腦損傷和/或功能異常和/或障礙和/或疾病。在實施方案中，所述制劑可
有效地用于腸胃外施用。在實施方案中，所述的制劑可有效地用于I.V.
輸注。在實施方案中，所述的制劑可有效地用于立體定位注射。 途徑
通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于將細胞施用于受試者的各
種途徑，可以將MAPCs施用于受試者。
在不同的實施方案中，可以將所述MAPCs通過有效遞送細胞治療 的任何途徑施用于受試者。在一些實施方案中，所述細胞通過注射(包括 局部和/或全身注射)施用。在某些實施方案中，所述細胞在待治療的功 能異常的位置內(nèi)和/或接近于該位置施用。在一些實施方案中，所述細胞 在功能異常的局部而不是接近于該位置通過注射施用。在一些實施方案 中，所述細胞通過全身注射例如靜脈注射施用。
可用于本發(fā)明實施方案所關(guān)注的方法是用于通過腸胃外途徑施用 MAPCs的方法。特別值得一提是，用于本發(fā)明不同的實施方案中的施 用的腸胃外途徑包括通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、心臟內(nèi)、脊柱內(nèi)、鞘內(nèi)、骨 內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、皮內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下和/或肌內(nèi)注射施用。在一些 實施方案中，使用靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下和/或肌內(nèi)注射。 在一些實施方案中，4吏用靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和/或肌內(nèi)注射。
在本發(fā)明不同的實施方案中，MAPCs通過全身注射施用。對于施 用MAPCs而言，全身注射，例如靜脈注射，提供了一種最簡單及最小 侵入的途徑。在某些情況下，為了最佳效能和/或通過MAPCs歸巢到靶 位，這些途徑可能要求高的MAPC劑量。在許多種實施方案中，MAPCs 可以通過耙向和/或局部注射施用，以確保在粑位的最佳作用。
在本發(fā)明某些實施方案中，MAPCs可以通過皮下注射針頭經(jīng)注射 器施用于所述受試者。在不同的實施方案中，MAPCs通過導液管施用 于所述受試者。在許多種實施方案中，MAPCs通過外科植入施用。在 此進一步的方面，在本發(fā)明不同的實施方案中，MAPCs通過使用關(guān)節(jié) 鏡操作植入施用于所述受試者。在一些實施方案中，MAPCs通過立體 定位注射施用于所述受試者。在一些實施方案中，MAPCs在固體支持體內(nèi)或固體支持體上施用于所述受試者，該固體支持體例如聚合物或凝
膠。在不同的實施方案中，MAPCs以包嚢化的形式施用于所述受試者。 在本發(fā)明另外的實施方案中，MAPCs被適宜地配制成供口服、直
腸、皮膚夕卜(epicutaneous)、眼、鼻和/或肺遞送，并且相應地凈支施用。 在實施方案中，腸胃外施用被用于治療腦損傷，其包括本文所述的
腦損傷和/或功能異常和/或障礙和/或疾病。在實施方案中，使用IV輸注。
在實施方案中，使用立體定位注射。
絲
組合物可以在劑型中施用，或者通過醫(yī)學和獸醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的技術(shù)施用，其中考慮例如以下的因素年齡、性別、體重、具體患 者的條件、以及將要施用的制劑(例如固體還是液體)。對于人類或其它 哺乳動物的劑量可以根據(jù)本公開、本文引述的資料和本領(lǐng)域的知識，通 過本領(lǐng)域:技術(shù)人員確定而無不必過多試^^ 。
適合于根據(jù)本發(fā)明不同的實施方案使用的MAPCs的劑量將取決于 許多因素。其可能考慮不同的環(huán)境而變化。對于主要的和附加的治療， 決定待施用的MAPCs最佳劑量的參數(shù)通常包括以下的部分或全部所 治療的疾病及其階段；受試者的物種，其健康、性別、年齡、體重和代 謝速率；受試者的免疫反應能力；被施用的其它治療；根據(jù)受試者病史 或遺傳型所預期的潛在并發(fā)癥。所述參數(shù)還包括MAPCs是同基因性 的、自體的、同種異體的還是異種的；它們的效能(特異活性)；對于 MAPCs必需靼向有效的位置和/或分布；以及所述位置的此類特征例 如對于MAPCs和/或MAPCs的移入物的可接受性。另外的參數(shù)包括與 其它因子(例如生長因子和細胞因子)的MAPCs同時施用。在給定情況下 的最佳劑量還將考慮細胞被配制的方式、它們被施用的方式、以及施用 之后細胞集中于靶位的程度。最后，最佳劑量的確定必將提供有效的劑 量，該有效的劑量既不會低于最大有益作用的閾值，也不會高于與 MAP C s劑量相關(guān)的有害作用大于增加劑量的益處的閾值。
對于一些實施方案，MAPCs的最佳劑量將在供自體的單核骨髓移 植使用的劑量范圍內(nèi)。根據(jù)動物研究通過外推法，考慮大小(質(zhì)量)和代 謝因素的差異，以及根據(jù)對于其它細胞治療(例如移植治療)所確立的 劑量需求，可以估計出上述的劑量范圍。在實施方案中，每次施用的最佳劑量范圍為1(^至l(^MAPC細胞/kg 受者質(zhì)量。在實施方案中，每次施用的最佳劑量為105至108 MAPC細 胞/kg。在實施方案中，每次施用的最佳劑量為5xl()S至5xl(fMAPC 細胞/kg。在實施方案中，每次施用的最佳劑量為1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()6的任一個至1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()7的任一個。
通過參考，在前述中的一些中-高劑量是類似于自體的單核骨髓移植 的有核細胞的劑量。 一些中-低劑量類似于用于自體的單核骨髓移植的 CD34+細胞/kg的數(shù)目。
應當理解，單一劑量可以一次、分次或經(jīng)一定時間連續(xù)遞送。全部 劑量還可以遞送到單個位置或者經(jīng)數(shù)個位置分開擴散。
在不同的實施方案中，MAPCs可以在初始劑量中施用，然后通過 進一步施用MAPCs來維持。MAPCs可以通過最初的一種方法施用，然 后通過相同的方法或者通過一種或多種不同的方法施用。受試者的 MAPC水平可以通過細胞繼續(xù)進行的施用來維持。不同的實施方案通過 靜脈注射，既可以初始施用MAPCs,也可以維持其在受試者中的水平， 或者兩者均可。在許多種實施方案中，使用了施用的其它形式，其取決 于本文其它處所討論的患者的病癥和其它因素。
應當注意，人受試者通常比試驗動物治療得更長；但是，治療通常 具有與疾病過程和治療有效的長度相稱的長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮使 用人和/或動物例如大鼠、小鼠、非人類靈長動物等進行的其它操作的結(jié) 果，以確定對于人的適宜劑量。根據(jù)這些因素并考慮由本公開和現(xiàn)有技 術(shù)提供的指導，此類確定將使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠這樣做而不必過多試 驗。
對于初始施用和進一步的劑量或者對于后續(xù)的施用的適宜方案可 以全部相同或者可以變化。適宜的方案可以通過熟練技術(shù)人員根據(jù)本公 開、本文引述的文獻、和本領(lǐng)域的知識確定。
劑量、頻率、治療持續(xù)時間將取決于許多因素，包括疾病的性質(zhì)、 受試者和其它可以施用的治療。因此，廣泛變化的方案可用于施用 MAPCs。
在一些實施方案中，MAPCs以一個劑量施用于受試者。在其它實 施方案中，MAPCs是在連續(xù)兩個或多個劑量的系列中施用于受試者。 在一些其它實施方案中，其中MAPCs以單次劑量、兩次劑量和/或兩次以上劑量施用，所述劑量可以相同或者不同，并且它們可以以相互之間 相等或不等的間隔施用。
MAPCs可以在寬范圍的時間中以許多頻率施用，例如直到達到需 要的治療效果。在一些實施方案中，MAPCs歷經(jīng)少于一天的時間施用。 在其它實施方案中歷經(jīng)兩天、三天、四天、五天或六天施用。在一些實 施方案中，MAPCs每周施用一次或多次，歷經(jīng)數(shù)周時間。在其它實施 方案中，它們歷經(jīng)數(shù)周時間達一至數(shù)月施用。在不同的實施方案中，它 們可以歷經(jīng)數(shù)月時間施用。在其它實施方案中，它們可以歷經(jīng)一年或多 年的時間施用。治療的一般時限將會與疾病過程時長、所用治療法的效 果和^^皮治療的受試者的病癥和應答相稱。
在一些實施方案中，MAPCs施用一次、兩次、三次或三次以上， 直到達到需要的治療效果，或者施用不再顯示出可能對所述受試者提供 益處。在一些實施方案中，MAPCs連續(xù)施用達一定時間，例如通過靜 脈滴注。MAPCs的施用可以是短的時間，達數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月、數(shù)年 或更長的時間。
在實施方案中，施用單次彈丸濃注治療腦損傷，其包括本文所述腦 損傷和/或功能異常和/或障礙和/或疾病。在實施方案中，兩個或多個單 次彈丸濃注的施用是在時間上經(jīng)一天或多天分開施用。在實施方案中， 每一劑量歷經(jīng)從數(shù)分鐘至數(shù)小時時間的任何時限通過I.V.輸注施用。在 實施方案中，單次劑量的細胞是通過立體定位注射施用。在實施方案中， 兩個或多個劑量是通過立體定位注射施用到腦的相同或不同區(qū)域。在此 關(guān)注的涉及彈丸濃注、IV和立體定位注射以用于治療腦損傷的實施方案 中，每一施用的細胞劑量是每一施用104至1(^MAPC細胞/kg受者質(zhì)量。 在實施方案中，所述的劑量是105至108 MAPC細胞/kg。在實施方案 中，所述的劑量是5xl()S至5xl(^MAPC細胞/kg。在實施方案中，所 述的劑量是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()6至l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()7中的任一個。
如美國專利No.7,015,037中描述的MAPCs
人MAPCs描述于現(xiàn)有技術(shù)中。對于人和小鼠，分離MAPC的方法 是現(xiàn)有技術(shù)已知的。因此目前對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可能的是獲得 骨髓抽吸物、腦或肝活組織檢查物、和其它器官，并使用本領(lǐng)域技術(shù)人中可得的陽性和/或陰性選擇技術(shù)分離，這依賴于表達(或未表達)在那些 細胞中的基因(例如，通過機能或形態(tài)學分析，例如上文引用申請中公開 的那些，其通過引用并入本文)。說明性的方法描述于例如，美國專利
No.7,015,037中，其內(nèi)容通過引用并入本文以用于MAPCs的說明和制備 的方法。
如美國專利No.7，015，Q37中描述的MAPCs的分離和生長 來自例如人、大鼠、小鼠、狗和豬的MAPC分離的方法是本領(lǐng)域已 知的。i兌明性的方法描述于，例如，美國專利No.7,015,037和 PCT/US02/04652 (以WO 02/064748公開)中，以及這些方法，連同本文 公開的MAPCs的特征，僅通過說明和非限制性實例的方式，通過引用 并入本文。
MAPCs最初從骨髓中分離，隨后從包括腦和肌肉的其它組織建立 (Jiang, Y. et al.， 2002)。 MAPCs可以從包括但不限于以下的許多來源分 離骨髓、胎盤、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝、脊髓、血液、脂肪組 織和皮膚。例如，MAPCs可以得自骨髓抽吸物，其可通過本領(lǐng)域:忮術(shù) 人員可得的標準方式獲得(參見，例如，Muschler, G,F., et al., 1997; Batinic: D., et al., 1990)。
在美國專利No.7,015,037所述條件下的人MAPC表型 通過22-25細胞倍增之后獲得的人MAPCs的FACS免疫表型分析， 顯示所述細月包不表達CD31、 CD34、 CD36、 CD38、 CD45、 CD50、 CD62E 和-P、 HLA-DR、 Mucl8、 STRO-l、 cKit、 Tie/Tek;并且表達寸氐水平的 CD44、 HLA-I型和卩2-微球蛋白，但表達CDIO、 CD13、 CD49b、 CD49e、 CDw90、 Flkl (N〉10)。
在培養(yǎng)物中以約2 x 10Vcm2重復播種， 一旦細胞經(jīng)歷>40的倍增， 所述表型變得更同質(zhì)，并且沒有細胞表達的HLA-I型或者CD44 (n=6)。 當細胞以更高的融合生長時，它們表達高水平的Mucl8、 CD44、 HLA-I 型和卩2-凝:J求蛋白，其類似于針對MSC所述的表型(N二8) (Pittenger, 1999)。
免疫組織化學顯示，以約2 x 10"cm2播種密度生長的人MAPCs表 達EGF-R、 TGF-R1和-2、 BMP-R1A、 PDGF-Rla和-B,并且MAPCs的小的亞群體(在1和100/()之間)用抗-SSEA4抗體染色(Kannagi, R, l983)。
使用Clontech cDNA陣列，測定了人MAPCs的表達的基因圖，其 以約2 x 103細胞/cm2的播種密度培養(yǎng)22和26細胞倍增。
A. MAPCs不表達CD31, CD36， CD62E, CD62P, CD44國H, cKit, Tie, IL1、 IL3、 IL6、 ILll、 G CSF、 GM國CSF、 Epo、 Flt3國L或CNTF的 受體，以及低水平的HLA-I型、CD44-E和Muc-18 mRNA。
B. MAPCs表達4十對細l包因子BMP1 、 BMP5、 VEGF、 HGF、 KGF、 MCP1的mRNA;細月包因子受體Flkl、 EGF-R、 PDGF-Rla、 gpl30、 LIF-R、 activin畫Rl和國R2、 TGFR畫2、 BMP國R1A;粘著受體CD49c、 CD49d、 CD29; 以及CDIO。
C. MAPCs表達針對hTRT和TRF1的mRNA; POU域轉(zhuǎn)錄因子 oct-4、 sox-2 (要求有oct-4以保持未分化狀態(tài)的ES/EC, Uwanogho D., 1995)、 sox 11 (神經(jīng)發(fā)育)、sox 9 (軟骨形成)(Lefebvre V., 1998); homeodeomain 4爭錄因子Hox畫a4和畫a5(頸和胸廓細節(jié)(specification);呼 吸道器官發(fā)生)(Packer AI, 2000)、 Hox-a9 (髓細胞生成)(Lawrence H, 1997)、 Dlx4(頭的前腦和邊緣結(jié)構(gòu)的細節(jié))(AkimenkoMA, 1994)、 MSX1 (胚胎的中胚層、成年的心臟和肌肉、軟骨-和骨發(fā)生)(Foerst-Potts L, 1997), PDX1 (胰臟)(pffield MF, 1996)。
D. oct-4、 LIF-R和hTRT mRNA的存在通過RT-PCR證實。
E. 此外，RT-PCR顯示rex-l mRNA和rox-l mRNA在MAPCs中 表達。
將Oct-4、 rex-l和rox-l在得自人和鼠科動物骨髓以及得自鼠科動 物肝臟和腦的MAPCs中表達。人MAPCs表達LIF-R，并用SSEA-4陽 性染色。最后，發(fā)現(xiàn)oct-4、 LIF-R、 rex-l和rox-l mRNA水平增加培養(yǎng) 超過30細胞倍增的MAPCs,其導致表型更同質(zhì)的細胞。相反，以高密 度培養(yǎng)的MAPCs損失了這些標記物的表達。這與在40細胞倍增之前 的衰老以及分化到不同于成軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞的細胞的損 失有關(guān)。因此，與rex-l、 rox-l和sox-2結(jié)合的oct-4的存在與MAPCs 培養(yǎng)物中的大多數(shù)原始細胞的存在相關(guān)。
培養(yǎng)MAPCs的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如，美國專利 No.7,015,037，其關(guān)于培養(yǎng)MAPCs的方法通過引用并入本文)。培養(yǎng) MAPCs的密度可以從約100細胞/cm2或約150細胞/cm2至約10,000細胞/cm2變化，包括約200細胞/cm2至約1500細胞/cm2至約2000細胞/cm2。 該密度可以在物種之間變化。另外，最佳的密度可以根據(jù)培養(yǎng)條件和細 胞來源而變化。對于給定培養(yǎng)條件和細胞的組，確定最佳密度是在本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。
而且，低于約10%的有效大氣氧濃度，包括約3-5%,可以在培養(yǎng) 物中的MAPCs分離、生長期和分化的任何時間使用。
本發(fā)明通過以下說明性的、非限制性的實施例作附加描述。
實施例
實施例l:在大鼠中用MAPCs的缺氧性-缺血性損傷以及用MAPCs和免 疫抑制治療
通過單側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)的方法，接著通過8°/。缺氧，將7日齡 Sprague Dawley (SD)大鼠幼崽(每試驗組11=7)經(jīng)受HI損傷，如描述于 Rice Wa/.,爿wzTV^ro/. 2: 131-141(1981)，其通過引用以其全部內(nèi)容并且 特別是有關(guān)此方法并入本文。損傷之后7天，用冷藏保存的MAPCs(移 植前臨時融化)使動物經(jīng)受腦功能區(qū)定位(stereotaxic)移植到海馬區(qū)域， 所述MAPCs得自SD大鼠(同基因性的，GFP-標記的，每只動物200,000 個細胞)或Fisher大鼠(同種異體，P-gal-標記的，每只動物200,000個細 胞)。在整個生命過程中全部動物每天用免疫抑制治療(CSA, lmg/kg, i.p.)。在移植后的第7天和第14天，進行提高身體擺動試3全(Elevated Body Swing Test, EBST)和旋轉(zhuǎn)棒試驗，以揭示全身性的和協(xié)調(diào)的運動 和神經(jīng)功能，如描述于Borlongan"(2/.,JA^wmy"'., j^: 5372-5378 (1995) 中的，其通過引用以其全部內(nèi)容特別是有關(guān)這些評價行為性能的方法并 入本文。在試-瞼之后第14天，使動物安樂死以用于移植的MAPCs的免 疫組織化學分析。試驗的流程圖描繪于圖1。在試驗過程期間在接受 MAPC移植物的動物中未觀察到死亡。
實施例2A: HI-損傷大鼠在MAPC注射后第7天和第14天的運動技能 的評價。
將動物如實施例1所述處理。與介質(zhì)灌注損傷的動物相比較，在移 植后第7天，MAPC移植的HI損傷動物顯示出由EBST測定的較少的 運動不對稱傾向(64%-65%對75%)，以及在旋轉(zhuǎn)棒(rotarod)上花費更長的時間(14.1-16.5對18秒)。比之于接受介質(zhì)灌注的那些對照動物，在 移植后第14天，MAPC移植的動物顯示出明顯減少運動不對稱 (66%-70%對87%),以及在旋轉(zhuǎn)棒上花費更長的時間(27.3-28.3對21秒)。 在它們的行為改善方面，在兩個試驗期間，移植到受損傷動物中的同基 因性和同種異體MAPCs無顯著差異。結(jié)果在圖2中作圖示性描述。通 過運動和神經(jīng)測定，結(jié)果顯示了在大鼠HI損傷;溪型中注射MAPCs的治 療作用。
實施例2B: MAPC注射到HI大鼠腦之后第14天MAPC植入物的組織 分析
將動物如實施例1所述處理。在移植后第14天處死之后的HI損傷 動物的腦檢中，通過組織學檢查來檢測移植的MAPCs。檢測GFP-陽性 同基因性移植物主要在原始的海馬CA3移植位置和鄰近的CA2區(qū)域， 其用DAPI共同標記。通過抗-p-gal染色和用DAPI共同標記4企測的同種 異體移植物顯示了在HI損傷的腦中移植存活的相似模式。在14天時移 植物存活為0.96%(ANOVA F值為24.27， df = 2, 19以及p < 0.0001; Fisher posthoc為p< 0.0001)。結(jié)果顯示，在大鼠HI損傷才莫型動物中直接腦內(nèi) 注射后，同種異體和同基因性MAPCs植入到注射位置，并且持續(xù)至少 2周。
實施例3:植入的MAPCs保護內(nèi)源性神經(jīng)
將動物如實施例1所述處理。多數(shù)如實施例2B所述進行組織分析， 但將預備的腦切片Nissl染色，以測定內(nèi)源性神經(jīng)元存活的水平。與用 對照介質(zhì)注射的動物相比，用同基因的或同種異基因的MAPCs注射的 動物中內(nèi)源性神經(jīng)元死亡顯著減少。該結(jié)果圖示性地描述于圖3。結(jié)果 顯示，MAPC施用保護了來自缺氧性缺血性損傷的內(nèi)源性神經(jīng)元，導致 神經(jīng)元成活率增加。
實施例4:通過標記物分析顯示植入的MAPCs和神經(jīng)元的共區(qū)域化
將動物如實施例1所述處理。對于上文所述MAPC標記物(對于同 基因性MAPCs為GFP,或者對于同種異體MAPCs為p-gal),同時對于 MAP2即一種良好表征的神經(jīng)元標記物，將由MAPC治療的大鼠產(chǎn)生的
40腦切片共染色。表達各個MAPC標記物和神經(jīng)元標記物的少數(shù)細胞被 發(fā)現(xiàn)于同基因性和同種異體植入的動物中，顯示一些MAPCs已分化成 神經(jīng)元；盡管可能的是， 一些雙重染色細胞是植入的MAPC細胞與內(nèi)源 性神經(jīng)元細胞的融合的罕見結(jié)果。在大鼠HI損傷模型中施用于動物中 之后第14天，該結(jié)果顯示了 MAPCs的早期表型神經(jīng)元分化。
實施例5:當通過立體定位注射或通過I.V.輸注施用而無免疫抑制時， MAPCs在新生大鼠HI損傷模型中是治療有益的
通過單側(cè)頸動脈結(jié)扎術(shù)，接著通過8%缺氧，將7日齡Sprague Dawley(SD)大鼠幼崽(每試驗組i^7)經(jīng)受HI損傷，如上文實施例1和本 文引述的參考文獻所述。HI損傷7天之后，用冷藏保存的MAPCs(移植 前臨時融化)使動物經(jīng)受腦功能區(qū)定位移植到海馬區(qū)域，所述MAPCs得 自Fisher大鼠(同種異體，(3-gal-標記的，每只動物200,000個細胞)。在移 植后的第7天和第14天，使用EBST試驗和旋轉(zhuǎn)棒試驗進行行為試驗， 以揭示全身性的和協(xié)調(diào)的運動和神經(jīng)功能。到第14天，與僅接受PBS 的對照組相比，在EBST和旋轉(zhuǎn)棒試驗中，MAPC治療的動物在顱內(nèi)和 IV遞送組中均顯示出統(tǒng)計學顯著的改善(兩個試馬全均為p<0.05)。
實施例6:在MCA閉塞嚙齒動物中風才莫型中用異種(人〗MAPCs治療中
28只SD成年大鼠經(jīng)歷大腦中動脈(MCA)閉塞手術(shù)，以誘發(fā)動物手 術(shù)中風。誘發(fā)中風7天之后，將動物分成四組，每組7只。各組接受直 接大腦內(nèi)施用以下中的一種(1)3^1的PBS注射液(對照)，(2)3pl的PBS 注射液，其含有100,000人MAPCs, (3) 3^1的PBS注射液，其含有200,000 人MAPCs，和(4) 3|il的PBS注射液，其含有400,000人MAPCs。如以 下實施例所述測試動物，并于第21天處死動物。
實施例7:在中風才莫型中由運動和神經(jīng)試騶3正實的MAPC施用的治療益
將動物如實施例6所述處理。在細胞移植之后第7和第14天，將 各動物經(jīng)歷EBST和Bederson試驗，以確定運動和神經(jīng)功能，如上文所 述。與對照相比，在移植之后第7天，接受200,000或400,000細胞的動物在EBST的搖擺偏移中觀察到統(tǒng)計學顯著改善。經(jīng)過14天，與對 照組相比，全部三組接受人MAPC注射的動物顯示顯著改善。結(jié)果描繪 于圖4左側(cè)的上和下圖。
同時進行但是與EBST分開，將各大鼠經(jīng)歷四個任務(wù)Bederson板， 以評1介MCA閉塞中風之后14天和21天的神經(jīng)功能。對于四個試-瞼的 每一個，將四個試一瞼記分為O(無可觀測的神經(jīng)缺損)至3(嚴重的神經(jīng)缺 損)。然后將四個得分取均值，得到神經(jīng)功能的總測量值。MAPC移植后 第7天，與對照動物相比，接受200,000或400,000細胞的動物在神經(jīng) 功能方面顯示出統(tǒng)計學顯著改善。經(jīng)過14天，與對照組相比，接受人 MAPC注射的全部3組證明了顯著的改善。結(jié)果描繪于圖4右側(cè)的上和 下圖。
在用200,000或400,000 MAPCs處理的動物的運動和神經(jīng)試馬全中， 根據(jù)第一試驗點(注射后7天)，結(jié)果顯示動物的劑量依賴性、統(tǒng)計學顯 著改善。(用IOO，OOO MAPCs處理的動物比之后僅用對照介質(zhì)處理的動 物未顯示統(tǒng)計學顯著改善)。該結(jié)果證明，當與僅用介質(zhì)處理的動物相比 時，通過直接大腦內(nèi)注射到大鼠中風腦中，在早到注射后至少一周并且 保持長到注射后至少二周，在運動和神經(jīng)有益性試驗中施用異種MAPCs 均得到了統(tǒng)計學顯著改善。
實施例8:在大鼠HI中風模型中MAPC植入到腦中
將動物如上文實施例6所述處理。在MAPC移4直后第14天最后的 行為測定之后，將動物處死，再收集腦。將石蠟植入組織的半-薄切片用 DAPI染色，以顯現(xiàn)所有的細胞核和小鼠抗-HuNu (人細胞核)多克隆抗 體，接著用FITC-結(jié)合羊抗小鼠單克隆抗體以染色植入的人MAPCs。在 皮層(CTX)、室下區(qū)(SVZ)和紋狀體(STR)中發(fā)現(xiàn)MAPCs。結(jié)果顯示在大 腦內(nèi)注入大鼠后，人MAPCs生存并且植入，其顯示MAPC施用的顯著 治療作用。細胞的分布顯示，MAPCs遷移到腦的第二區(qū)域以及在原始 位置的植入處，在此處細胞^皮注入。對于100,000和200,000 MAPCs注 射可見到生存和遷移的相同模式。在僅注射介質(zhì)的對照中風動物的腦 中，未檢測到HuNu免疫反應性。在中風之后14天，對于100,000、 200,000 和400,000 MAP植入劑量，移植存活百分數(shù)分別為0.55%、 0.7%和 0.51%。該結(jié)果清楚地顯示，在中風才莫型腦中，MAPCs不但存活并且植入到注射的位置，而且它們還遷移并植入到遠離注射位置的第二位置。
總之，到直接大腦內(nèi)注射后至少兩周，異種人MAPCs存在于損傷和注 射(紋狀體)的位置，并且存在于受注射的腦的第二位置，包括皮層和在 室下區(qū)中。
實施例9:在大鼠手術(shù)模型中用同種異體(大鼠)MAPCs、用異種 (人)MAPCs,并且均同時用和不用免疫抑制治療缺血性中風
35只SD大鼠經(jīng)受大腦中動脈(MCA)結(jié)扎手術(shù)以誘導動物手術(shù)性中 風。在誘導中風之后7天，將各動物分成5組，每組7只動物。每組接 受直接大腦內(nèi)施用以下中的一種(1)3^1的PBS注射液，其含有400,000 大鼠MAPCs,無免疫抑制；(2)3^1的PBS注射液，其含有400,000大鼠 MAPCs,有免疫抑制治療(CSA, lmg/kg， i.p.); (3)3^1的PBS注射液， 其含有400,000人MAPCs,無免疫抑制；(4) 3^1的PBS注射液，其含有 400,000人MAPCs,有免疫抑制治療(CSA, lmg/kg， i.p.),和(5) 3pl的 PBS注射液，其含有400,000輻照的、不可存活的人MAPCs，有免疫抑 制治療(CSA, lmg/kg, i.p.)。
實施例10:在大鼠手術(shù)模型中用同種異體(大鼠)MAPCs、用異種 (人〗MAPCs,并且均同時用和不用免疫抑制治療缺血性中風的行為和神 經(jīng)學評價
將動物如實施例9所述處理。在細l包移植之后14天，以及此后8 周每隔14天，將各動物經(jīng)歷EBST和Bederson試-瞼以測定運動和神經(jīng) 功能。在有和沒有免疫抑制治療的情況下，在EBST和Bederson評價中， 異種和同種異體MAPCs的施用均導致統(tǒng)計學顯著的和持續(xù)的改善。該 結(jié)果顯示，缺血性損傷之后7天移植MAPCs在行為和神經(jīng)功能方面得 到了統(tǒng)計學顯著的長期(8-周)的持續(xù)治療益處。該結(jié)果進一步顯示，對 于證實的治療作用而言不需要免疫抑制。結(jié)果圖示性地描述于圖5和6。
實施例11:在大鼠手術(shù)才莫型中用異種(人)MAPCs經(jīng)注射或I.V.輸注遞送， 并且用和不用免疫抑制治療缺血性中風
42只SD大鼠經(jīng)受大腦中動脈(MCA)結(jié)扎手術(shù)以誘導動物手術(shù)性中 風。在誘導中風之后7天，將各動物分成6組，每組7只動物。每組接受靜脈內(nèi)施用以下中的一種(1)400,000人MAPCs,有免疫抑制治療 (CSA, lmg/kg, i.p.); (2)400,000人MAPCs，無免疫抑制；(3)1,000,000 人MAPCs,有免疫抑制治療(CSA， lmg/kg, i.p.); (4)1,000,000人MAPCs， 無免疫抑制治療；(5)1,000,000輻照的、不可存活的人MAPCs,有免疫 抑制治療(CSA， lmg/kg, i.p.),和(6) 1,000,000輻照的、不可存活的人 MAPCs,無免疫抑制治療。
實施例12:在大鼠手術(shù)才莫型中用異種(人)MAPCs經(jīng)注射或I.V.輸注遞送， 并且用和不用免疫抑制治療缺血性中風一行為和神經(jīng)學評價
將動物如實施例11所述處理。在細胞移植之后14天，以及此后8 周每隔14天，分別通過EBST和Bederson試驗評價各動物的運動和神 經(jīng)功能。
在試-瞼之后移植后的第56天將動物處死。
在運動功能方面結(jié)果顯示出顯著的劑量依賴性治療作用。用 1,000,000存活的MAPCs輸注的動物比之于用輻照的MAPCs治療的相 應對照組顯示出顯著的改善。有和沒有免疫抑制時均獲得相同的結(jié)果。 用400,000存活的MAPCs輸注的動物比之于用輻照的MAPCs治療的相 應對照組沒有顯著的改善。有和沒有免疫抑制時均獲得相同的結(jié)果。
在神經(jīng)功能方面結(jié)果也顯示出顯著的劑量依賴性治療作用。用 400,000和1,000,000存活的MAPCs治療的動物比之于用輻照的MAPCs 治療的相應對照組均顯示出顯著的改善。在用400,000細胞治療的動物 中歷經(jīng)56天的試驗有恢復下降的傾向，但用1,000,000細胞治療的動物 無此傾向。有和沒有免疫抑制時均獲得相同的結(jié)果。
總之，在運動和神經(jīng)功能方面，在整個8周的試-瞼過程中，用 1,000,000存活的MAPCs治療的動物顯示出統(tǒng)計學顯著的、持續(xù)的改善。 此外，治療作用不需要免疫抑制。有和沒有CSA時結(jié)果相同。
結(jié)果圖示性地描述于圖7和8。
實施例13:時間對大鼠手術(shù)模型用異種(人)MAPCs經(jīng)I.V.輸注遞送治療 缺血性中風的影響
28只SD大鼠歷受大腦中動月永MCA結(jié)4L手術(shù)以-漆導動物手術(shù)性中 風。將動物分成4組，每組7只動物。每組通過靜脈內(nèi)輸注接受1,000,000異種(人)MAPCs,無免疫抑制。除了在誘導中風之后的不同時間施用 MAPCs之外，所有組別均相同處理。根據(jù)誘導之后的以下天數(shù)將MAPCs 施用于各組(1)1天，(2)2天，和(3)7天。此外，在誘導之后第7天， 第(4)組接受1,000,000輻照的、不可存活的MAPCs。 研究期間在接受MAPCs的動物中未觀察到死亡。
實施例14:時間對大鼠手術(shù)才莫型用異種(人〗MAPCs經(jīng)I.V.輸注遞送治療 缺血性中風的影響 一運動和神經(jīng)功能
將動物如實施例13所述處理。在細胞移植之后7天，以及此后8 周每隔7天，分別通過EBST和Bederson試驗評價各動物的運動和神經(jīng) 功能。
在運動和神經(jīng)功能方面，與用輻照的MAPCs治療的對照組(第4組) 相比，全部三組用存活的MAP C s治療的動物的結(jié)果顯示統(tǒng)計學顯著的、 持續(xù)的改善。用存活的MAPCs治療的三組所獲得的運動功能的結(jié)果之 間無統(tǒng)計學差異。對于神經(jīng)功能的三組的結(jié)果也同樣。
結(jié)果證明，當在缺血性腦損傷之后第 一天至第七天通過IV施用時， 在運動和神經(jīng)功能方面，MAPCs均提供了治療益處。
結(jié)果圖示性地描述于圖9和10。
實施例15:時間對大鼠手術(shù)模型用異種〖人)MAPCs經(jīng)I.V.輸注遞送治療 缺血性中風的影響 一植入
將動物如實施例12所述處理。各組在第56天的最終行為試驗之后 將動物處死。從處死的動物中采集腦。由腦制備蠟植入組織的半-薄切片。 將切片用DAPI染色以顯現(xiàn)所有的細胞核，再用多克隆小鼠抗HuNu(人 細胞核)抗體、接著用FITC-結(jié)合羊抗鼠單克隆抗體以染色植入的人 MAPCs。對DAPI染色的細胞和FITC染色的細胞計數(shù)。根據(jù)FITC染色 的細胞數(shù)目確定植入細胞的總數(shù)目。注射的MAPCs植入物的百分數(shù)是 根據(jù)植入細胞總數(shù)比輸注到各動物的細胞總數(shù)的比值計算的。
結(jié)果顯示在損傷之后施用的早期植入的細胞稍少。損傷之后施用 MAPCs 1天的動物平均為0.75%植入。損傷之后施用MAPCs 2天的動 物平均為1.1%植入的細胞。損傷之后施用MAPCs 7天的動物平均為 1.27%存活的植入的細胞。此趨勢無統(tǒng)計學顯著性；但是，這表明，中風后即刻的缺血性損傷的炎癥環(huán)境可能對MAPCs的植入和長期生存益 處較小，然后此環(huán)境在此后僅存在少數(shù)幾天。
實施例16:時間對大鼠手術(shù)才莫型用異種(人〗MAPCs經(jīng)I.V.輸注遞送治療 缺血性中風的的影響——神經(jīng)元保護作用
將動物如實施例12所述處理。如實施例14所述制備腦切片。將備 用的切片(針對實施例14使用的那些)用Nissl染色以確定內(nèi)源性神經(jīng)元 的存活。結(jié)果顯示施用MAPC時統(tǒng)計學顯著地減少內(nèi)源性神經(jīng)元的死 亡。MAPCs對內(nèi)源性神經(jīng)元的存活的保護作用隨著中風誘導與MAPC 施用之間的時間的減少而增加。比之于中風誘導后第2天接受MAPCs 的動物，在中風誘導后第1天接受MAPCs的動物中有更多存活的神經(jīng) 元，并且此差異是統(tǒng)計學顯著的。類似地，比之于中風誘導后第7天接 受MAPCs的動物，在中風誘導后第2天接受MAPCs的動物中有更多存 活的神經(jīng)元，并且此差異也是統(tǒng)計學顯著的。結(jié)果表明，缺血性事件之 后施用MAPCs越早，對內(nèi)源性神經(jīng)元存活的保護作用越大。
結(jié)果圖示性地描述于圖11。
權(quán)利要求
1.在受試者中治療腦損傷的方法，其包括給可能罹患、正在罹患或已經(jīng)罹患腦損傷的受試者，通過有效途徑并以有效治療所述腦損傷的量施用細胞，該細胞不是胚胎干細胞、胚胎生殖細胞或生殖細胞，并且可以分化成內(nèi)胚層的、外胚層的和中胚層的胚細胞系中的至少兩種中每種胚細胞系的至少一種細胞類型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的用細胞治療的受試者沒有附加性地用免疫抑制療法治療。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的腦損傷是因缺氧引起的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的腦損傷是缺氧性缺血性腦損傷。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的腦損傷是因血液供應的閉塞 或阻塞引起的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的腦損傷是皮層梗死。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的腦損傷是中風。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞可以分化成內(nèi)胚層的、 外胚層的和中胚層的胚細胞系中每種胚細胞系的至少 一種細胞類型。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞表達端粒酶。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞對oct-3/4呈陽性。
11. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞在它們施用于所述受 試者之前在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10至40細胞倍增。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞是哺乳動物細胞。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞是人細胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞得自從以下任一項分 離的細胞胎盤組織、臍帶組織、臍帶血、骨髓、血液、脾組織、胸腺 組織、脊髓組織、脂肪組織和肝臟組織。
15. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞對于所述受試者是同 種異體的。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞對于所述受試者是異 種的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞于所述受試者是自體的。
18. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的受試者是人。
19. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞以一種或多種劑量施 用于所述受試者，所述劑量包括105至108所述細胞/千克所述受試者質(zhì)量。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的細胞以一種或多種劑量施 用于所述受試者，所述劑量包括106至5 x 107所述細胞/千克所述受試者質(zhì)量。
21. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中除所述細胞之外， 一種或多種生 長因子、分化因子、信號因子和/或增加歸巢的因子被施用于所述受試者。
22. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中進一步地將以下一種或多種的任 意組合施用于所述受試者抗生素劑、抗真菌劑和/或抗病毒劑。
23. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述細胞在制劑中被施用，該制 劑包含一種或多種其它的藥物活性劑。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的制劑進一步包含以下一種 或多種的任意組合抗生素劑、抗真菌劑和/或抗病毒劑。
25. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞通過腸胃外途徑施用 于所述受試者。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述的細胞通過靜脈內(nèi)輸注施用。
27. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的細胞通過立體定位注射施 用于所述受試者。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中除了用所述細胞治療外，所述受 試者已經(jīng)、將會、或正在用一種或多種免疫抑制劑治療。
29. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中除了用所述細胞治療外，所述受 試者已經(jīng)、將會、或正在用以下的一種或多種治療皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢 菌素A、環(huán)孢菌素類免疫抑制劑、環(huán)磷酰胺、抗胸腺細胞球蛋白、 >琉唑 嘌呤、雷帕霉素、FK-506和除FK-506以外的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑、 以及免疫抑制單克隆抗體劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用MAPCs治療腦的各種損傷、障礙、功能異常、疾病等，特別是在一些方面，涉及由缺氧所致的，包括由全身性缺氧引起以及由血液供應不足引起的損傷、障礙、功能異常、疾病等的治療。在一些進一步的細節(jié)中，本發(fā)明涉及，例如，在例如兒童中用MAPCs治療缺氧性缺血性腦損傷，以及在例如成人中用MAPCs治療皮層梗死和中風。
文檔編號A61K35/50GK101410125SQ200780010390
公開日2009年4月15日 申請日期2007年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者C·V·博爾倫根, D·C·赫斯, J·E·卡羅爾, R·J·迪恩斯, R·W·邁斯 申請人:阿特西斯公司;喬治亞州醫(yī)學院研究所有限公司