專(zhuān)利名稱(chēng)：用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸細(xì)胞的非病毒組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于殼聚糖的納米顆粒和核酸載體。另外，本發(fā)明涉及在體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖是無(wú)毒的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺的陽(yáng)離子共聚物，所述共聚物具有良好的粘膜粘著特性，并已被廣泛用于可控的藥物遞送。殼聚糖的粘膜粘著性被認(rèn)為延長(zhǎng)了相關(guān)藥物在胃腸道的停留時(shí)間，因此增加了其生物利用度。(Kotze AF, Luessen HL, Thanou M，VerhoefJC, de Boer AG, Juninger HE，Lehr CM. Chitosan and chitosanderivatives as absorption enhancers for peptide drugs across mucosal印ithelia(作為用于肽類(lèi)藥物跨粘膜上皮的吸收增強(qiáng)劑的殼聚糖和殼聚糖的 ttj 生物).Mathiowitz E, Chickering DE, Lehr CM, eds. BioadhesiveDrug Delivery Systems (生物粘著藥物遞送系統(tǒng)).New York, NY =Marcel Dekker ； 1999.)幾個(gè)團(tuán)體已經(jīng)探究了殼聚糖作為DNA遞送載體的潛力，且許多殼聚糖/DNA復(fù)合物的特性也已被檢測(cè)以試圖確定能良好適合基因轉(zhuǎn)染的組合物。已發(fā)現(xiàn)所述復(fù)合物在溶解性、聚合傾向、復(fù)合物穩(wěn)定性、顆粒大小、釋放DNA的能力以及轉(zhuǎn)染效率的其他特性中是不同的。大分子量的殼聚糖在生理PH下是相對(duì)不溶的，但溶于酸性溶液以備用。一旦形成， 含有大分子量的殼聚糖和DNA的復(fù)合物是相對(duì)穩(wěn)定的，但已被報(bào)道轉(zhuǎn)染效率低下，這可能是由于DNA攝取和釋放差導(dǎo)致。低分子量的殼聚糖/DNA復(fù)合物在溶液中更為可溶但較不穩(wěn)定。據(jù)報(bào)道低分子量的殼聚糖聚合物與DNA形成不穩(wěn)定的復(fù)合物，如在電場(chǎng)中分離(瓊脂糖凝膠電泳)所提示的那樣。這些復(fù)合物在體外也顯示了低轉(zhuǎn)染效率和低水平的報(bào)告基因表達(dá)(例如，Koping-Hoggard et al.，Gene Then，8 1108-1121，2001 ；MacLaughlin, et al., J Control Release. 1998Dec4 ；56(1-3):259-72 ；Sato et al. , Biomaterials, 22:2075-2080,2001 ；US2005/0170355 ；US2005/0164964)。實(shí)驗(yàn)也顯示，低分子量的殼聚糖 /DNA復(fù)合物在用鹽或血清刺激的應(yīng)答中傾向釋放DNA，提示它們不能很好地適合許多體內(nèi)應(yīng)用。殼聚糖分子量對(duì)體外轉(zhuǎn)染效率的影響的研究還不明確。一些研究顯示， 對(duì)20-200kDa大小范圍內(nèi)的殼聚糖聚合物而言，轉(zhuǎn)染效率對(duì)分子量沒(méi)有明顯的依賴(lài) (Koping-Hoggard et al.,上述；MacLaughl in et al,上述)。但其他人(Sato etal·,上述)報(bào)道，與>100kDa的殼聚糖聚合物相比，15kDa和52kDa的殼聚糖顯示更高的體外報(bào)告基因表達(dá)，且1.3kDa的殼聚糖聚合物是無(wú)效的。而且，體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率之間的不一致經(jīng)常被報(bào)道(例如，Koping-Hoggard et al.，Gene Ther. 20040ct ；11(19) :1441-52 ； US2005/0170355 ；US2005/0164964)。許多研究已經(jīng)檢測(cè)了大分子量殼聚糖/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)胃腸道細(xì)胞的能力。將合并溶內(nèi)體(endosomolytic)肽的殼聚糖/DNA復(fù)合物直接給予上部的小腸，顯示盲腸已在上皮細(xì)胞、派爾集合淋巴結(jié)(Peyer' spatches)和腸系膜淋巴結(jié)產(chǎn)生報(bào)告基因表達(dá)(MacLaughlin et al.，上述)。另外，已顯示口服殼聚糖與編碼促紅細(xì)胞生成素的DNA的復(fù)合物產(chǎn)生瞬時(shí)的紅細(xì)胞壓積增加(Chen et al.，World J. Gastroenter.，10:112-116， 2004)。在食物過(guò)敏模型中，殼聚糖已經(jīng)被用于口部遞送編碼花生變應(yīng)原蛋白Arah2的DNA 以試圖使小鼠耐受攝取花生提取物(Roy et al.，Nat. Med.，5:387-391，1999)?？傊?，相對(duì)低轉(zhuǎn)染效率和低水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)已被報(bào)道，部分由于低的DNA攝取和釋放，也部分由于腸道內(nèi)細(xì)胞的迅速更新。腸道上皮是體內(nèi)更新最迅速的組織之一，上皮細(xì)胞每3-5天更新。 重要的是，腸道粘膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因表達(dá)由于腔粘膜細(xì)胞壽命短的這一事實(shí)又是復(fù)雜的，一旦它進(jìn)入細(xì)胞核，提供短暫時(shí)期的DNA的表達(dá)。其他研究組已經(jīng)以多種方式化學(xué)修飾殼聚糖，以試圖開(kāi)發(fā)具有改善的轉(zhuǎn)染效率以及諸如轉(zhuǎn)導(dǎo)遠(yuǎn)端腸道組織的能力的其他所需特性的DNA復(fù)合物。Kai等人在他們的報(bào)告中指出已經(jīng)離開(kāi)胃部且已進(jìn)入較為中性的十二指腸環(huán)境的殼聚糖/DNA組合物失去了具有輔助改變PH的正電荷，并由此傾向釋放相關(guān)的DNA。Kai等人報(bào)道凍干的大分子量的殼聚糖/ DNA復(fù)合物的N-乙?；饔梅€(wěn)定了口部遞送的復(fù)合物，且增加了遠(yuǎn)端腸道轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。Kai et al.，Pharm. Res. 21838-843，2004。考慮到腔內(nèi)腸粘膜細(xì)胞的壽命，通過(guò)殼聚糖遞送到腸粘膜的基因的長(zhǎng)期表達(dá)還沒(méi)有被報(bào)道可能并不令人吃驚。此外，殼聚糖DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染諸如內(nèi)分泌細(xì)胞的較不常見(jiàn)的腸粘膜細(xì)胞類(lèi)型的能力還沒(méi)有被詳細(xì)檢測(cè)。與實(shí)現(xiàn)腸內(nèi)分泌細(xì)胞的長(zhǎng)期表達(dá)和轉(zhuǎn)染相關(guān)的困難可由考慮到腸道結(jié)構(gòu)而被理解。胃腸道壁由四層組成。所述腸道最內(nèi)層是粘膜層，其由與腔接界的被覆上皮組成。 所述上皮是身體與攝取物質(zhì)相互作用的部位。在影響吸收的胃腸道區(qū)域，所述上皮是單層細(xì)胞厚度。所述上皮位于基底層，其進(jìn)一步覆蓋固有層。在所述腸道的吸收區(qū)域下方，以固有層的長(zhǎng)度布滿(mǎn)了毛細(xì)血管床，而且吸收的食物原料的加工產(chǎn)物是進(jìn)入這些血管。人小腸由三部分組成十二指腸、空腸和回腸。所述小腸的粘膜廣泛折疊，當(dāng)環(huán)狀折疊突入腸腔時(shí)，使它有一個(gè)褶飾邊的外觀。這種折疊填充了所述小腸腔的大部分面積，且使上皮的吸收表面積增加了幾倍。在腔表面，所述小腸粘膜的折疊出現(xiàn)絨毛，所述絨毛是進(jìn)一步增加吸收面積的粘膜的外翻部分。每一絨毛進(jìn)一步由一個(gè)細(xì)胞厚度的上皮覆蓋。該上皮絕大多數(shù)由吸收性腸細(xì)胞構(gòu)成，該細(xì)胞在它們的頂(腔)面分布有數(shù)千個(gè)短的微小絨毛， 使吸收面積再次增加了許多倍。被稱(chēng)為糖萼的所述微小絨毛的外表面是細(xì)絲狀的并富有碳水化合物。這個(gè)膜區(qū)域也富有有助于被消化的物質(zhì)降解和吸收的多種酶和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。吸收性腸細(xì)胞構(gòu)成了超過(guò)90%的所述絨毛的上皮細(xì)胞和甚至更大比例的所述腔的表面積。分散在這些細(xì)胞之中的是數(shù)目相對(duì)較小的內(nèi)分泌細(xì)胞，據(jù)報(bào)道其構(gòu)成大約0. 3 % 的所述絨毛上皮。與其呈現(xiàn)大的和超結(jié)構(gòu)的復(fù)合物頂表面的吸收性腸細(xì)胞相比，內(nèi)分泌細(xì)胞有與所述固有層毛細(xì)管并列的寬闊的基底表面，且面向腔時(shí)變得極窄。比腸道粘膜的內(nèi)分泌細(xì)胞更難以想到的是腸道粘膜的前體細(xì)胞。在凸出的絨毛下面，在內(nèi)襯于隱窩深處的上皮中，存在產(chǎn)生粘膜的主要細(xì)胞類(lèi)型的前體細(xì)胞，包括吸收性腸細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞。所述絨毛上皮層形成大約每三天就更新的短壽命分化上皮細(xì)胞的連續(xù)層，且上皮的維持需要大量細(xì)胞的分裂和分化。所述隱窩的前體細(xì)胞產(chǎn)生從所述隱窩遷移出到絨毛并進(jìn)行分化的子代。通常腸內(nèi)分泌細(xì)胞特征在于對(duì)信號(hào)或刺激物(“促分泌素”)應(yīng)答時(shí)分泌合成的蛋白進(jìn)入血液的能力。內(nèi)分泌細(xì)胞的特定實(shí)例包括K細(xì)胞、L-細(xì)胞、S-細(xì)胞、G-細(xì)胞、D-細(xì)胞、I"細(xì)胞、Mo-細(xì)胞和Gr-細(xì)胞。K細(xì)胞主要位于胃、十二指腸和空腸。這些內(nèi)分泌細(xì)胞分泌激素GIP，其正常功能是促進(jìn)餐后胰島素的釋放。腸內(nèi)分泌細(xì)胞通常，且特別是K細(xì)胞，是用于轉(zhuǎn)基因遞送的有吸引力的細(xì)胞靶標(biāo)。 這些細(xì)胞具有加工許多蛋白前體的能力，并且具有提供調(diào)節(jié)的分泌蛋白進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)響應(yīng)信號(hào)的細(xì)胞機(jī)制。這些特性以前已被利用(參見(jiàn)Cheung et al.，Science，290 1959-1962， 2000 ；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第09/804，409號(hào)；通過(guò)引用特別并入本文)。用K-細(xì)胞特異的葡萄糖反應(yīng)性胰島素表達(dá)構(gòu)建體設(shè)計(jì)的K細(xì)胞被觀察到表達(dá)和分泌胰島素響應(yīng)升高的血糖，且能夠在糖尿病小鼠模型中恢復(fù)正常的葡萄糖耐受。盡管對(duì)殼聚糖作為核酸遞送的病毒方式的另一選擇有普遍的興趣，但是低轉(zhuǎn)染效率、穩(wěn)定性和溶解性問(wèn)題、體內(nèi)不可預(yù)測(cè)性以及只能轉(zhuǎn)染短壽命粘膜細(xì)胞已經(jīng)大大阻止了殼聚糖在腸道嚴(yán)格的環(huán)境中作為核酸載體的應(yīng)用。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了基于殼聚糖的納米顆粒，所述納米顆粒包括表達(dá)在腸粘膜細(xì)胞時(shí)能夠發(fā)揮治療效應(yīng)的治療性核酸。這些基于殼聚糖的納米顆粒提供了治療或防止多種狀況和病癥的新的非病毒方法。本發(fā)明公開(kāi)的是能夠在體內(nèi)的腸粘膜引起治療性核酸長(zhǎng)期表達(dá)的基于殼聚糖的納米顆粒。所述納米顆粒對(duì)治療性RNA或治療性蛋白在腸粘膜中長(zhǎng)期產(chǎn)生是有用的。本發(fā)明公開(kāi)的是能夠引起由治療性核酸編碼的治療性蛋白的系統(tǒng)水平增加的基于殼聚糖的納米顆粒。所述基于殼聚糖的納米顆粒能夠?qū)⑸硐嚓P(guān)水平的治療性蛋白遞送入血液循環(huán)系統(tǒng)。本發(fā)明公開(kāi)的是能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸粘膜前體細(xì)胞的基于殼聚糖的納米顆粒。所述納米顆粒用于腸粘膜內(nèi)治療性RNA或治療性蛋白的長(zhǎng)期產(chǎn)生。本發(fā)明公開(kāi)的是能夠體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞的基于殼聚糖的納米顆粒。 所述納米顆粒提供了在粘膜細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)治療性蛋白的產(chǎn)生，所述細(xì)胞類(lèi)型能夠加工前體蛋白并以調(diào)節(jié)的或組成性方式分泌治療性蛋白進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)。在本發(fā)明的許多優(yōu)選實(shí)施方案中，基于殼聚糖的納米顆粒包括編碼能夠在非腸組織內(nèi)發(fā)揮治療效應(yīng)的治療性蛋白的治療性核酸。特別優(yōu)選的是具有系統(tǒng)活性的治療性蛋白。在本發(fā)明的許多優(yōu)選實(shí)施方案中，基于殼聚糖的納米顆粒被設(shè)計(jì)用于治療性核酸在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)的非組成性表達(dá)。所述納米顆粒提供治療性核酸的動(dòng)態(tài)長(zhǎng)期表達(dá)。在許多優(yōu)選實(shí)施方案中，納米顆粒被設(shè)計(jì)以便提供治療性核酸在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)的可調(diào)節(jié)表達(dá)。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，納米顆粒被設(shè)計(jì)以便提供治療性蛋白從腸內(nèi)分泌細(xì)胞的調(diào)節(jié)的分泌響應(yīng)促分泌素。與上述目的一致，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含基于殼聚糖的納米顆粒的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含基于殼聚糖的納米顆粒的組合物，所述納米顆粒包含(i)多個(gè)具有3kDa至250kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物，以及(ii)治療性構(gòu)建體，其中所述治療性構(gòu)建體包含可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治
6療性核酸，其中所述治療性核酸在表達(dá)于腸粘膜細(xì)胞時(shí)，能夠發(fā)揮治療效應(yīng)，并且其中所述的基于殼聚糖的納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)所述治療性核酸在腸粘膜長(zhǎng)于約4天，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約5天，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約6天，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約7天，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約10天，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約2周，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約3周，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約4周，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約6周， 更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約8周，更優(yōu)選的是長(zhǎng)于約10周，且最優(yōu)選的是長(zhǎng)于約12周的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含基于殼聚糖的納米顆粒的組合物，所述納米顆粒能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸粘膜前體細(xì)胞。這種納米顆粒包含(i)多個(gè)具有3kDa至250kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物，以及(ii)治療性構(gòu)建體，其中所述治療性構(gòu)建體包括可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸，其中所述治療性核酸在腸粘膜細(xì)胞表達(dá)時(shí)，能夠發(fā)揮治療效應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒能夠引起治療性核酸在腸粘膜長(zhǎng)于約4天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約5天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約7天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約2周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約3周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約4周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6周， 更優(yōu)選長(zhǎng)于約8周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10周，且最優(yōu)選長(zhǎng)于約12周的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含基于殼聚糖的納米顆粒的組合物，所述納米顆粒能夠增加治療性蛋白的所述系統(tǒng)水平。這種納米顆粒包含(i)多個(gè)具有3kDa至250kDa 的平均分子量的殼聚糖聚合物，以及(ii)治療性構(gòu)建體，其中所述治療性構(gòu)建體包括可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸，其中所述治療性核酸在表達(dá)于腸粘膜細(xì)胞時(shí)，能夠發(fā)揮治療效應(yīng)，其中所述治療性核酸編碼從腸粘膜被遞送入系統(tǒng)循環(huán)的治療性蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒能夠引起所述治療性核酸在腸粘膜長(zhǎng)于約4天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約5天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約7天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10 天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約2周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約3周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約4周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約8周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10周，且最優(yōu)選長(zhǎng)于約12周的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒基本上由(i)多個(gè)具有3kDa至250kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物，以及(ii)治療性構(gòu)建體組成，其中所述治療性構(gòu)建體包括可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸，其中所述治療性核酸在表達(dá)于腸粘膜細(xì)胞時(shí)，能夠發(fā)揮治療效應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒的所述表達(dá)調(diào)控區(qū)具有非組成性活性，且所述納米顆粒能夠引起所述治療性核酸的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)表達(dá)。在特別的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)調(diào)控區(qū)是可調(diào)節(jié)的，并且所述納米顆粒能夠引起所述治療性核酸的長(zhǎng)期的可調(diào)節(jié)的表達(dá)。所述基于殼聚糖的納米顆粒的殼聚糖聚合物優(yōu)選具有小于約250kDa，更優(yōu)選小于 230kDa，更優(yōu)選小于220kDa的平均分子量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約3kDa 至約2IOkDa的平均分子量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約IOkDa 至約250kDa的平均分子量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約IOkDa 至約2IOkDa的平均分子量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的所述多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約3kDa至約50kDa的平均分子量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約3kDa 至約6kDa的平均分子量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約200kDa 至約2IOkDa的平均分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約1:1至約100:1的胺磷酸鹽(N:P) 比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約從1:1至約6:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約1:1至約4:1的N:P比。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約3 1的N P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約10:1至約90:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約10:1至約50:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約10:1至約40:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約10:1至約30:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約60:1至約100:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約70:1至約100:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約20:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約60:1的N:P比。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約1:1至約50:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約1:1至約5:1的殼聚糖與核酸
的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約1:1至約3:1的殼聚糖與核酸
的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約2:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約5:1至約45:1的殼聚糖與核酸
的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約5:1至約25:1的殼聚糖與核酸
的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約5:1至約20:1的殼聚糖與核酸
的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約5:1至約15:1的殼聚糖與核酸
的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約30:1至約50:1的殼聚糖與核
酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有從約35:1至約50:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約10:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約30:1的殼聚糖與核酸的重量比。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)，具有+5mV至+50mV的平均ζ 電位的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)，具有+30mV至+50mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)，具有+30mV至+40mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)，具有+32mV至+40mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)，具有+5mV至+25mV的平均 ζ電位的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)，具有+5mV至+SmV的平均 ζ電位的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含具有小于225nm的平均直徑的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含具有SOnm至225nm的平均直徑的納米顆粒。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含具有SOnm至175nm的平均直徑的納米顆粒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物具有約1 μ g/ml至約1. 5mg/ml，更優(yōu)選約1 μ g/ml 至約lmg/ml，更優(yōu)選約10 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約50 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約 100 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約150 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約200 μ g/ml至約lmg/ ml的DNA濃度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物的PH小于6. 5，更優(yōu)選小于6. 0，且最優(yōu)選約4. 5 至約5. 5。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒的所述殼聚糖聚合物的脫乙?；潭却笥诩s 70 %，更優(yōu)選大于約75 %，更優(yōu)選大于約80 %，更優(yōu)選大于約85 %，更優(yōu)選大于約90 %，更優(yōu)選大于約95 %，且最優(yōu)選至少98 %。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含低分子量的殼聚糖納米顆粒，其中所述低分子量納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有3kD至25kD的平均分子量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，低分子量的殼聚糖納米顆粒具有10 1至90 1的N:P比。在優(yōu)選實(shí)施方案中，低分子量的殼聚糖納米顆粒在PH為5時(shí)，具有+30mV至+50mV的平均ζ電位，更優(yōu)選+30mV至+40mV。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，低分子量殼聚糖納米顆粒具有小于175nm的平均直徑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含高分子量的殼聚糖納米顆粒，其中所述高分子量納米顆粒的所述多個(gè)殼聚糖聚合物具有25kD至250kD的平均分子量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，高分子量的殼聚糖納米顆粒具有2:1至40:1的N:P比。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 高分子量的殼聚糖納米顆粒在PH為5時(shí)，具有+5mV至+25mV的平均ζ電位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，高分子量的殼聚糖納米顆粒具有小于225nm的平均直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 高分子量的殼聚糖納米顆粒具有1:1至30:1的殼聚糖與核酸的重量比。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有約3. 9kD的平均分子量，且脫乙酰化程度約98%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含具有小于175nm的平均直徑的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物具有約25μ g/ml至約100μ g/ ml的DNA濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約40:1至約80:1的N:P比，最優(yōu)選約60:1的N:P比。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有20:1至40:1的殼聚糖與核酸的重量比，最優(yōu)選30:1的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒的所述多個(gè)殼聚糖聚合物具有約3. 9kD 的平均分子量，且脫乙?；潭燃s98%。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含具有小于 175nm的平均直徑的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物具有約200 μ g/ml至約 lmg/ml的DNA濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約10:1至約30:1的N:P比， 最優(yōu)選約20:1的N:P比。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有5:1至15:1，最優(yōu)選10 1的重量比的殼聚糖與核酸的重量比。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的納米顆粒能夠轉(zhuǎn)染所述小腸的腸粘膜前體細(xì)胞。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒能夠轉(zhuǎn)染十二指腸、空腸或回腸的腸粘膜前體細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒能夠轉(zhuǎn)染胃的腸粘膜前體細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒能夠轉(zhuǎn)染結(jié)腸的腸粘膜前體細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒能夠轉(zhuǎn)染腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞能夠產(chǎn)生選自K細(xì)胞、L-細(xì)胞、S-細(xì)胞、G-細(xì)胞、D-細(xì)胞、I-細(xì)胞、Mo-細(xì)胞和Gr-細(xì)胞的腸內(nèi)泌細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞是K細(xì)胞前體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒缺乏內(nèi)吞溶酶體肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒的治療性核酸編碼治療性RNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性RNA是siRNA、反義RNA、短發(fā)夾RNA或酶性RNA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒的所述治療性核酸編碼治療性蛋白。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性蛋白是分泌的治療性蛋白。優(yōu)選地，所述納米顆粒能夠增加所述分泌的治療性蛋白的系統(tǒng)水平。優(yōu)選地，所述納米顆粒能夠引起所述分泌的治療性蛋白的所述系統(tǒng)水平的長(zhǎng)期增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白的系統(tǒng)水平的長(zhǎng)期增加是靜態(tài)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白的系統(tǒng)水平的長(zhǎng)期增加是動(dòng)態(tài)的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒的治療性核酸編碼治療性蛋白，所述蛋白選自激素、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體、促有絲分裂因子、生長(zhǎng)因子、分化因子、影響血管發(fā)生的因子、影響血凝塊形成的因子、影響血糖水平的因子、影響葡萄糖代謝的因子、影響脂質(zhì)代謝的因子、影響血膽固醇水平的因子、影響血LDL或HDL水平的因子、影響細(xì)胞凋亡的因子、影響食物攝取的因子、影響能量消耗的因子、影響食欲的因子、影響營(yíng)養(yǎng)吸收的因子、影響炎癥的因子以及影響骨形成的因子。特別優(yōu)選編碼胰島素、瘦素、胰高血糖素拮抗劑、 GLP-U GLP-2、葛瑞林((ihrelin)、膽囊收縮素、生長(zhǎng)激素、凝血因子、PYY、紅細(xì)胞生成素、炎癥抑制因子、IL-10、IL-17拮抗劑、TNFa拮抗劑、生長(zhǎng)激素釋放激素或甲狀旁腺激素的治療性核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是胰島素。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是胰島素類(lèi)似物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是瘦素。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是PYY。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的治療性核酸編碼分泌的治療性蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白能夠通過(guò)調(diào)節(jié)的分泌從腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白能夠從腸內(nèi)分泌細(xì)胞被分泌響應(yīng)優(yōu)選是營(yíng)養(yǎng)物的促分泌素。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白在應(yīng)答葡萄糖時(shí)能夠從腸內(nèi)分泌細(xì)胞被分泌。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于殼聚糖的納米顆粒包含兩種或更多不同的治療性核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)不包含CMV啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)不包含病毒啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)包含非組成性啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)包含腸特異的調(diào)控序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)包含粘膜細(xì)胞特異的調(diào)控序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)包含腸內(nèi)分泌細(xì)胞特異的調(diào)控序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的表達(dá)調(diào)控區(qū)包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子可通過(guò)小分子化合物調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是營(yíng)養(yǎng)物可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)物可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子由葡萄糖調(diào)節(jié)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)物可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是GIP啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的治療性構(gòu)建體還包含整合序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療性構(gòu)建體包含單一的整合序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療性構(gòu)建體包含第一和第二整合序列，所述第一和第二整合序列側(cè)鄰著可操作連接到所述治療性核酸的表達(dá)調(diào)控區(qū)(即，所述表達(dá)調(diào)控區(qū)與治療性核酸在一起)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述整合序列是與選自水手(mariner)、睡美人(sleeping beauty)、FLP、Cre、Φ。31、R、λ 的整合元件以及來(lái)自諸如AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件結(jié)合起作用的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基于殼聚糖的納米顆粒除了包括治療性構(gòu)建體之外，還包括非治療性構(gòu)建體，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到第二表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸序列，所述第二表達(dá)調(diào)控區(qū)在腸粘膜前體細(xì)胞中是有功能的。該第二表達(dá)調(diào)控區(qū)和可操作連接到所述治療性核酸的表達(dá)調(diào)控區(qū)可以相同或不同。所述編碼的整合元件優(yōu)選選自水手、睡美人、FLP、Cre、Φ031、R、λ、以及來(lái)自諸如AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆?；旧嫌?i)多個(gè)具有3kD至250kD的平均分子量的殼聚糖聚合物，(ii)治療性構(gòu)建體以及(iii)非治療性構(gòu)建體組成，其中所述治療性構(gòu)建體包含可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸，其中所述治療性核酸表達(dá)于腸粘膜細(xì)胞內(nèi)時(shí)能夠發(fā)揮治療效應(yīng)，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到第二表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸序列，所述第二表達(dá)調(diào)控區(qū)在腸粘膜前體細(xì)胞是有功能的。在一個(gè)方面，所述發(fā)明提供能夠體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸粘膜前體細(xì)胞的基于殼聚糖的納米顆粒，所述顆粒包括⑴多個(gè)殼聚糖聚合物和(ii)非治療性構(gòu)建體，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸。所述被編碼的整合元件優(yōu)選選自水手、睡美人41^、0^、0031、1 、λ以及來(lái)自諸如AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述納米顆?；旧嫌?i)多個(gè)殼聚糖聚合物和(ii)非治療性構(gòu)建體組成，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸，所述表達(dá)調(diào)控區(qū)在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)是有功能的。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用治療性核酸體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸粘膜細(xì)胞的方法，所述方法包括將體內(nèi)腸粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括接觸所述小腸的粘膜。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述方法包括將十二指腸、空腸或回腸的粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括將所述胃的粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括將所述結(jié)腸的粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基于殼聚糖的納米顆粒轉(zhuǎn)染所述腸粘膜的腸粘膜前體細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸粘膜前體細(xì)胞是腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞產(chǎn)生選自K細(xì)胞、L-細(xì)胞、S-細(xì)胞、G-細(xì)胞、D-細(xì)胞、 I-細(xì)胞、Mo-細(xì)胞和Gr-細(xì)胞的腸內(nèi)泌細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞產(chǎn)生K細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸粘膜前體細(xì)胞是所述小腸的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸粘膜前體細(xì)胞是所述十二指腸、空腸或回腸的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸粘膜前體細(xì)胞是所述胃的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸粘膜前體細(xì)胞是所述結(jié)腸的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸粘膜前體細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)治療性核酸的粘膜細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療性核酸編碼治療性RNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性核酸編碼治療性蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性蛋白是分泌的治療性蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的治療性核酸編碼治療性蛋白，所述蛋白選自激素、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體、促有絲分裂因子、生長(zhǎng)因子、分化因子、影響血管發(fā)生的因子、影響血凝塊形成的因子、影響血糖水平的因子、影響葡萄糖代謝的因子、影響脂質(zhì)代謝的因子、影響血膽固醇水平的因子、影響血LDL或HDL水平的因子、影響細(xì)胞凋亡的因子、影響食物攝取的因子、影響能量消耗的因子、影響食欲的因子、影響營(yíng)養(yǎng)吸收的因子、 影響炎癥的因子以及影響骨形成的因子。特別優(yōu)選編碼胰島素、瘦素、胰高血糖素拮抗劑、 GLP-U GLP-2、葛瑞林、膽囊收縮素、生長(zhǎng)激素、凝血因子、PYY、紅細(xì)胞生成素、炎癥抑制因子、11^10、11^-17拮抗劑3順(1拮抗劑、生長(zhǎng)激素釋放激素或甲狀旁腺激素的治療性核酸。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是胰島素。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是胰島素類(lèi)似物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是瘦素。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是PYY。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性蛋白在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并且進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)以致所述治療蛋白的系統(tǒng)水平增加。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)的分泌被釋放入系統(tǒng)循環(huán)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性蛋白的系統(tǒng)水平的增加長(zhǎng)于約4天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約5天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約7天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約2周， 更優(yōu)選長(zhǎng)于約3周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約4周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約8周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10周，且最優(yōu)選長(zhǎng)于約12周。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療性蛋白的系統(tǒng)水平的增加是靜態(tài)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性蛋白的系統(tǒng)水平的增加是動(dòng)態(tài)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將所述體內(nèi)腸粘膜與第一基于殼聚糖的納米顆粒和第二基于殼聚糖的納米顆粒接觸。所述第一基于殼聚糖納米顆粒能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸粘膜前體細(xì)胞并且包含(i)多個(gè)殼聚糖聚合物和(ii)治療性構(gòu)建體，其中所述治療性構(gòu)建體包含治療性核酸和整合序列，所述治療性核酸可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)。所述第二基于殼聚糖納米顆粒能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)染腸粘膜前體細(xì)胞并且包含(i)多個(gè)殼聚糖聚合物和(ii)非治療性構(gòu)建體，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到其在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸。不受理論的限制，可以用所述第一和第二納米顆粒轉(zhuǎn)染在腸粘膜內(nèi)的腸粘膜前體細(xì)胞。所述第二納米顆粒的核酸被表達(dá)在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生整合元件，由此所述整合元件將可操作連接到由所述第一納米顆粒提供的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸整合入所述腸粘膜前體細(xì)胞的基因組。在另一實(shí)施方案中，所述方法包括將體內(nèi)腸粘膜與基于殼聚糖的納米顆粒接觸， 所述納米顆粒包含(i)多個(gè)殼聚糖聚合物、(ii)治療性構(gòu)建體以及(iii)非治療性構(gòu)建體，其中所述治療性構(gòu)建體包含可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸和整合序列，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到在腸粘膜前體細(xì)胞有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸序列。不受理論的限制，可以使用所述納米顆粒轉(zhuǎn)染腸粘膜內(nèi)的腸粘膜前體細(xì)胞。所述編碼整合元件的核酸被表達(dá)在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生整合元件，由此所述整合元件將可操作連接到表達(dá)調(diào)控區(qū)的所述治療性核酸整合入所述腸粘膜前體細(xì)胞的基因組。應(yīng)了解取決于預(yù)期使用的特定整合元件，用于促進(jìn)整合的治療性和非治療性構(gòu)建體的最優(yōu)比可以變化。在沒(méi)有不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)情況下，治療性與非治療性構(gòu)建體的最優(yōu)比由本領(lǐng)域的技術(shù)人員做出決定。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供實(shí)現(xiàn)治療性核酸在哺乳動(dòng)物腸粘膜細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)的方法。所述方法包括將哺乳動(dòng)物的所述腸粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸，其中所述納米顆粒包括治療性核酸，且其中所述治療性核酸被表達(dá)在所述哺乳動(dòng)物的腸粘膜細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括本發(fā)明的納米顆粒的所述用途，所述納米顆粒包括治療性構(gòu)建體和非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括本發(fā)明的兩個(gè)納米顆粒的用途，第一納米顆粒包含治療性構(gòu)建體，且第二納米顆粒包含非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供增加哺乳動(dòng)物內(nèi)分泌的治療性蛋白的系統(tǒng)水平的方法。 所述方法包括將哺乳動(dòng)物的腸粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸，其中所述納米顆粒包括編碼分泌的治療性蛋白的治療性核酸，其中所述分泌的治療性蛋白在所述腸粘膜的粘膜細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，且其中所述在腸粘膜內(nèi)產(chǎn)生的分泌的治療性蛋白進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)以致所述分泌的治療性蛋白的所述系統(tǒng)水平是增加的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括本發(fā)明的納米顆粒的用途，所述納米顆粒包括治療性構(gòu)建體和非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括本發(fā)明的兩個(gè)納米顆粒的用途，第一納米顆粒包含治療性構(gòu)建體，且第二納米顆粒包含非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供治療患有可由增加治療性蛋白的所述系統(tǒng)水平治療的疾病或狀況的患者的方法。所述方法包括將患者的腸粘膜與本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒接觸，其中所述納米顆粒包括編碼分泌的治療性蛋白的治療性核酸，其中所述分泌的治療性蛋白在所述患者的所述腸粘膜的粘膜細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，且其中產(chǎn)生在所述粘膜細(xì)胞內(nèi)的分泌的治療性蛋白進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)以致所述分泌的治療性蛋白的系統(tǒng)水平增加到治療有效水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疾病是代謝性疾病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疾病是糖尿病。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述狀況是病態(tài)肥胖。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述狀況是生長(zhǎng)缺陷。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)口給予所述基于殼聚糖的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)內(nèi)窺鏡給予所述基于殼聚糖的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)直腸給予所述基于殼聚糖的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞是腸內(nèi)分泌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸內(nèi)分泌細(xì)胞選自K-細(xì)胞、L-細(xì)胞、S-細(xì)胞、G-細(xì)胞、D-細(xì)胞、I-細(xì)胞、Mo-細(xì)胞和Gr-細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腸內(nèi)分泌細(xì)胞是K細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞是所述小腸的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞是十二指腸、空腸或回腸的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞是胃的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述粘膜細(xì)胞是結(jié)腸的粘膜細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的治療性核酸編碼治療性蛋白，所述蛋白選自激素、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體、促有絲分裂因子、生長(zhǎng)因子、分化因子、影響血管發(fā)生的因子、影響血凝塊形成的因子、影響血糖水平的因子、影響葡萄糖代謝的因子、影響脂質(zhì)代謝的因子、影響血膽固醇水平的因子、影響血LDL或HDL水平的因子、影響細(xì)胞凋亡的因子、影響食物攝取的因子、影響能量消耗的因子、影響食欲的因子、影響營(yíng)養(yǎng)吸收的因子、 影響炎癥的因子以及影響骨形成的因子。特別優(yōu)選編碼胰島素、瘦素、胰高血糖素拮抗劑、 GLP-U GLP-2、葛瑞林、膽囊收縮素、生長(zhǎng)激素、凝血因子、PYY、紅細(xì)胞生成素、炎癥抑制因子、11^10、11^-17拮抗劑3順(1拮抗劑、生長(zhǎng)激素釋放激素或甲狀旁腺激素的治療性核酸。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是胰島素。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是胰島素類(lèi)似物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是瘦素。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述編碼的治療性蛋白是PYY。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)的分泌被從腸內(nèi)分泌細(xì)胞釋放。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分泌的治療性蛋白的所述系統(tǒng)水平的增加長(zhǎng)于約4 天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約5天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約7天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10天，更優(yōu)選
14長(zhǎng)于約2周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約3周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約4周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約8周， 更優(yōu)選長(zhǎng)于約10周，且最優(yōu)選長(zhǎng)于約12周。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括本發(fā)明的納米顆粒的用途，所述納米顆粒包括治療性構(gòu)建體和非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括本發(fā)明的兩個(gè)納米顆粒的用途，第一納米顆粒包含治療性構(gòu)建體且第二納米顆粒包含非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠增加所述治療性蛋白的系統(tǒng)水平的藥物組合物。這種藥物組合物包含本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含編碼分泌的治療性蛋白的治療性核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括本發(fā)明的兩種或多種不同的治療性核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括本發(fā)明的第一基于殼聚糖的納米顆粒， 以及本發(fā)明的第二基于殼聚糖的納米顆粒，其中所述第一和第二納米顆粒包含不同的治療性核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含本發(fā)明的治療性構(gòu)建體和非治療性構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括本發(fā)明的第一基于殼聚糖的納米顆粒和本發(fā)明的第二基于殼聚糖的納米顆粒，其中所述第一納米顆粒包含治療性構(gòu)建體，以及第二納米顆粒包含非治療性構(gòu)建體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物能夠增加所述治療性蛋白的系統(tǒng)水平長(zhǎng)于約4天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約5天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約7天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10天，更優(yōu)選長(zhǎng)于約2周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約3周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約4周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約6周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約 8周，更優(yōu)選長(zhǎng)于約10周，且最優(yōu)選長(zhǎng)于約12周。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)口部給予所述藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)內(nèi)窺鏡給予所述藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)直腸給予所述藥物組合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供修飾的腸粘膜細(xì)胞，所述修飾的腸粘膜細(xì)胞通過(guò)根據(jù)本文公開(kāi)的方法將體內(nèi)的腸粘膜與基于殼聚糖的納米顆粒接觸而產(chǎn)生。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生能夠引起治療性核酸在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)的納米顆粒的方法。 所述方法包括納米顆粒制備混合物的形成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約3kDa至約250kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約3kDa至約210kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約IOkDa至約250kDa的平均分子量的
殼聚糖聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約IOkDa至約210kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約3kDa至約50kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約3kDa至約6kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了具有從約200kDa至約210kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約1:1至約100:1的胺磷酸鹽(N:P)比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約1:1至約6:1的 N:P 比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約1:1至約4:1的 N:P 比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有約3:1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約10:1至約90:1 的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約10:1至約50:1 的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約10:1至約40:1 的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約10:1至約30:1 的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約60:1至約100:1 的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約70:1至約100:1 的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有約20 1的N:P比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有約60:1的N:P比。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約1:1至約50:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約1:1至約5:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約1:1至約3:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有約2:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約5:1至約45:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約5:1至約25:1的
16殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約5:1至約20:1的
殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約5:1至約15:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約30:1至約50:1 的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有從約35:1至約50:1 的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有約10:1的殼聚糖與核酸的重量比。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒制備混合物具有約30:1的殼聚糖與核酸的重量比。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過(guò)本文公開(kāi)的納米顆粒制備方法生產(chǎn)的基于殼聚糖的納米顆粒。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供制備用于治療可由增加分泌的治療蛋白的系統(tǒng)水平治療的疾病或狀況的藥劑的方法。所述方法包括生產(chǎn)本文公開(kāi)的基于殼聚糖的納米顆粒的方法。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了用包括所標(biāo)明的多種分子量的殼聚糖聚合物的基于殼聚糖的納米顆粒體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)果。圖2顯示用包括所標(biāo)明的多種分子量的殼聚糖聚合物的基于殼聚糖的納米顆粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染鼠十二指腸的腸粘膜細(xì)胞的結(jié)果。圖3顯示用包括所標(biāo)明的多種分子量的殼聚糖聚合物的基于殼聚糖的納米顆粒且以多種Ν:Ρ比在體內(nèi)轉(zhuǎn)染鼠十二指腸的腸粘膜細(xì)胞的結(jié)果。圖4顯示用N:P比為2. 85:1的RC05基于殼聚糖的納米顆粒在體內(nèi)轉(zhuǎn)染鼠十二指腸的腸粘膜細(xì)胞與用FIV和AAV顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比的結(jié)果。圖5顯示用Ν:Ρ比為60:1的Pl基于殼聚糖的納米顆粒在體內(nèi)轉(zhuǎn)染(單次給予) 鼠十二指腸的腸粘膜細(xì)胞的結(jié)果，其中所述納米顆粒包括EFl α -SEAP的構(gòu)建體。顯示了不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血中SEAP蛋白的水平。圖6顯示用Ν:Ρ比為60:1的Pl基于殼聚糖的納米顆粒在體內(nèi)轉(zhuǎn)染(單次給予)鼠十二指腸的腸粘膜細(xì)胞的結(jié)果，其中所述納米顆粒包含(i)CMV-IacZ整合構(gòu)建體 (P匪2611-β -gal)，以及(ii)CMV-Mariner 表達(dá)構(gòu)建體(pCMV_C9. gck)。顯示了轉(zhuǎn)染后 14 天的基因拷貝數(shù)。圖7A顯示使用的帶有水手轉(zhuǎn)座酶的CMV-IacZ整合構(gòu)建體( 匪沈11_ β -gal)的示意圖。圖7B顯示水手表達(dá)構(gòu)建體(pCMV-C9. gck)的示意圖。圖8顯示在遞送后2天殼聚糖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到小鼠十二指腸粘膜細(xì)胞的結(jié)果， 以及使用OC31時(shí)在遞送后14天的持續(xù)性結(jié)果。圖9顯示單次給予攜帶GIP-hlNS基因的χΦ-GEMS 以實(shí)現(xiàn)人胰島素在小鼠的長(zhǎng)期系統(tǒng)的產(chǎn)生的結(jié)果。圖10顯示用攜帶GIP-胰島素基因的基于殼聚糖的納米顆粒處理的小鼠的葡萄糖和進(jìn)餐應(yīng)激結(jié)果。圖11顯示矩陣研究的結(jié)果，所述矩陣研究分析用攜帶GIP-hlNS基因的不同的基于殼聚糖的納米顆粒處理的小鼠中人C-肽隨著時(shí)間的產(chǎn)生。圖12顯示用攜帶GIP-hlNS基因的基于殼聚糖的納米顆粒處理的豬十二指腸在遞送后7天人胰島素mRNA測(cè)量的結(jié)果。圖13顯示矩陣研究的結(jié)果，所述矩陣研究分析用攜帶GIP-hlNS基因的不同的基于殼聚糖的納米顆粒處理的豬中人胰島素的產(chǎn)生。圖14顯示通過(guò)經(jīng)口遞送殼聚糖包裹的DNA多聚物轉(zhuǎn)化胃粘膜細(xì)胞。在口服載體后 2天，小鼠胃粘膜的胰島素和SEAP基因表達(dá)的水平。NTC =非處理對(duì)照，T =處理的動(dòng)物。詳細(xì)說(shuō)明腸粘膜細(xì)胞如本文所使用的“腸粘膜細(xì)胞”指所述腸粘膜的細(xì)胞。內(nèi)分泌細(xì)胞、非內(nèi)分泌細(xì)胞以及其前體都包括在腸粘膜細(xì)胞之中。腸粘膜前體細(xì)胞包括干細(xì)胞。腸粘膜前體細(xì)胞是所述腸粘膜的分化細(xì)胞類(lèi)型的直接或間接的前體。腸粘膜前體細(xì)胞包括未分化的腸粘膜細(xì)胞。腸粘膜前體細(xì)胞產(chǎn)生所述腸粘膜的主要細(xì)胞類(lèi)型，包括內(nèi)分泌細(xì)胞和非內(nèi)分泌細(xì)胞。腸內(nèi)分泌細(xì)胞前體細(xì)胞是例如K細(xì)胞的腸內(nèi)分泌細(xì)胞的腸粘膜細(xì)胞的前體。腸粘膜細(xì)胞的特定實(shí)例包括諸如K細(xì)胞、L-細(xì)胞、S-細(xì)胞、G-細(xì)胞、D-細(xì)胞、I-細(xì)胞、Mo-細(xì)胞、Gr-細(xì)胞的內(nèi)分泌細(xì)胞和諸如吸收性腸細(xì)胞的非內(nèi)分泌細(xì)胞。內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征是它們分泌合成蛋白進(jìn)入血液響應(yīng)信號(hào)或刺激物(“促分泌素”)的能力。一般認(rèn)為非內(nèi)分泌細(xì)胞不會(huì)分泌合成蛋白進(jìn)入血液響應(yīng)信號(hào)或刺激物。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的腸內(nèi)分泌細(xì)胞是K細(xì)胞(Sandstrom 0.，El-Salhy M.， Mech. Ageing Dev. 108:39(1999))。幾種類(lèi)型的腸內(nèi)分泌細(xì)胞以及通常由此產(chǎn)生的蛋白的部分目錄顯示于表1中。表1
細(xì)胞類(lèi)型肽G-細(xì)胞胃泌素D-細(xì)胞生長(zhǎng)抑制素K-細(xì)胞葡萄糖依賴(lài)性促胰島素多肽L-細(xì)胞GLP-IGLP-2I-細(xì)胞膽囊收縮素Mo-細(xì)胞促胃動(dòng)素Gr-細(xì)胞葛瑞林基于殼聚糖的納米顆粒所用“基于殼聚糖的納米顆?！被颉癉NA/殼聚糖顆?！笔侵赴ǘ鄠€(gè)殼聚糖聚合物和DNA分子的復(fù)合物。“多聚物(Polyplex) ”與本文的“基于殼聚糖的納米顆?！笨山粨Q使用。所述基于殼聚糖的納米顆粒的殼聚糖聚合物優(yōu)選具有小于約250kDa的平均分子量。 在所述基于殼聚糖的納米顆粒中的DNA分子被遞送到體內(nèi)細(xì)胞?；跉ぞ厶堑募{米顆粒在本文中經(jīng)常被稱(chēng)為納米顆粒。
如本文中所使用的，殼聚糖聚合物的平均重量指重量平均分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，殼聚糖通過(guò) Richardson et al. , Int. J. Pharmaceutics, 178:231-243,1999 的方法獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，如下生產(chǎn)高分子量的基于殼聚糖的納米顆粒。將分別準(zhǔn)備的質(zhì)粒DNA和殼聚糖溶液調(diào)整到等于所需終濃度的兩倍的濃度。DNA在水中或50mM的硫酸鈉溶液中被稀釋。所需分子量的殼聚糖聚合物制劑被溶于PH為5. 5的5mM的醋酸鈉中，所述殼聚糖聚合物制劑包括優(yōu)選具有小于250kDa的平均分子量的殼聚糖聚合物。兩種溶液在被組合以形成基于殼聚糖的納米顆粒制劑混合物之前在55°C孵育5分鐘。等體積的所述兩種溶液被混合且被迅速渦旋30秒以形成DNA/殼聚糖顆粒。該制劑在使用之前可以在多種緩沖液中被進(jìn)一步稀釋。本發(fā)明的所述納米顆粒的生產(chǎn)不需要凍干且在乙?；磻?yīng)中不需要使用凍干的產(chǎn)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，如下生產(chǎn)基于殼聚糖的納米顆粒，特別是低分子量的基于殼聚糖的納米顆粒。將殼聚糖粉末加入到0. 5%的醋酸水溶液中直至所述殼聚糖工作液的PH 達(dá)到4. 8。然后將所述工作液通過(guò)膜過(guò)濾器(AcrodiscO. 2μπι孔徑，Pall Life Sciences) 過(guò)濾。質(zhì)粒A和質(zhì)粒B的儲(chǔ)存DNA溶液(溶于IxTE)以質(zhì)粒A對(duì)質(zhì)粒B的5 1比混合，在水中稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)膜過(guò)濾器(AcrodiscO. 2μπι孔徑，Pall LifeSciences)過(guò)濾以產(chǎn)生所述DNA工作液。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分。所述基于殼聚糖的納米顆粒的殼聚糖聚合物優(yōu)選具有小于約250kDa的平均分子量，更優(yōu)選小于230kDa，更優(yōu)選小于220kDa。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的所述多個(gè)殼聚糖聚合物具有從約3kDa至約250kDa的平均分子量。在本發(fā)明的優(yōu)選納米顆粒中， 殼聚糖聚合物平均分子量的其他范圍包括3至6kDa、3至10kDa、3至50kDa、3至210kDa、10 至 210kDa、10 至 250kDa 和 210 至 250kDa。所述基于殼聚糖納米顆粒制劑混合物中優(yōu)選的DNA濃度是在約1 μ g/ml至約 1. 5mg/ml的范圍，更優(yōu)選約10 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約25 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約 50 μ g/ml 至約 lmg/ml，更優(yōu)選約 100 μ g/ml 至約 lmg/ml。所述基于殼聚糖的納米顆粒制劑混合物中優(yōu)選的殼聚糖濃度是在0.001%至 1.0%的重量比的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基于殼聚糖的納米顆粒具有從約1:1至約100:1的胺 磷酸鹽(N:P)比。本發(fā)明的優(yōu)選基于殼聚糖的納米顆粒的其他N:P比范圍包括約1:1至約 6:1，約1:1至約4:1，約10:1至約90:1，約10:1至約50:1，約10:1至約40:1，約10:1至約30:1，約60:1至約100:1，以及約70:1至約100:1。通過(guò)改變所述殼聚糖乙?；某潭瓤梢愿淖儦ぞ厶堑陌泛俊Ｓ糜诒景l(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒的所述殼聚糖聚合物優(yōu)選具有70 %至100 %，更優(yōu)選80 %至100 %，更優(yōu)選90%至100%的脫乙?；Ｔ趦?yōu)選的實(shí)施方案中，所述基于殼聚糖的納米顆粒具有從約1:1至約50:1的殼聚糖與核酸的重量比。優(yōu)選的基于殼聚糖的納米顆粒的其他殼聚糖與核酸的重量比范圍包括約1:1至約5:1，約1:1至約3:1，約5:1至約45:1，約5:1至約25:1，約5:1至約20:1，約 5:1至約15:1，約30:1至約50:1，以及約35:1至約50:1。
19
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)具有+5mV至+50mV的平均ζ 電位的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)具有+30mV至+50mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)具有+30mV至+40mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)具有+32mV至+40mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)具有+5mV至+25mV的平均ζ電位的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含在PH為5時(shí)具有+5mV至+SmV的平均ζ電位的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含具有小于225nm的平均直徑的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含具有SOnm至225nm的平均直徑的納米顆粒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含具有SOnm至175nm的平均直徑的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物具有約1 μ g/ml至約1. 5mg/ml，更優(yōu)選約1 μ g/ ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約10 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約50 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約 100 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約150 μ g/ml至約lmg/ml，更優(yōu)選約200 μ g/ml至約lmg/ ml的DNA濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物具有低于6. 5，更優(yōu)選低于6. 0，且最優(yōu)選約4. 5 至約5. 5的PH0在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的殼聚糖聚合物具有大于約70%，更優(yōu)選大于約75 %，更優(yōu)選大于約80 %，更優(yōu)選大于約85 %，更優(yōu)選大于約90 %，更優(yōu)選大于約 95%，且最優(yōu)選至少98%的脫乙?；?。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含低分子量的殼聚糖納米顆粒，其中所述低分子量納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有3kDa至25kDa的平均分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，低分子量納米顆粒具有10 1至90 1的N:P比。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，低分子量的殼聚糖納米顆粒在PH為5時(shí)，具有+30mV至+50mV，更優(yōu)選+30mV至+40mV的平均ζ電位。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，低分子量的殼聚糖納米顆粒具有小于175nm的平均直徑。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包括高分子量的殼聚糖納米顆粒，其中所述高分子量的納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有25kDa至250kDa的平均分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，高分子量殼聚糖納米顆粒具有2 1至40 1的N:P比。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 高分子量殼聚糖納米顆粒在PH為5時(shí)，具有5mV至25mV的平均ζ電位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，高分子量的殼聚糖納米顆粒具有小于225nm的平均直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，高分子量殼聚糖納米顆粒具有1:1至30:1的殼聚糖與核酸的重量比。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有約3. 9kDa的平均分子量以及約98%的脫乙?；?。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包括具有小于175nm的平均直徑的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物具有約25 μ g/ml至約 100 μ g/ml的DNA濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約40:1至約80:1的N:P 比，最優(yōu)選約60:1的N:P比。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有20:1至40:1的殼聚糖與核酸的重量比，最優(yōu)選30:1的重量比。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒的多個(gè)殼聚糖聚合物具有約3. 9kDa的平均分子量以及約98%的脫乙酰化度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包括具有小于 175nm的平均直徑的納米顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物具有約200 μ g/ml至約 lmg/ml的DNA濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有約10:1至約30:1的N:P比， 最優(yōu)選約20:1的N:P比。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米顆粒具有5:1至15:1的殼聚糖與核酸的重量比，最優(yōu)選10:1的重量比?？梢员皇褂没蛱砑右愿淖冝D(zhuǎn)染效率的操作或特征包括溶酶體溶解 (lysosomolytic)試劑在納米顆粒中的共絡(luò)合，盡管溶酶體溶解劑不是必需的。包括附加的共絡(luò)合的治療劑的組合納米顆粒是被包括的。這些附加試劑和溶酶體溶解劑可以在絡(luò)合形成過(guò)程中被共絡(luò)合。另外，所述納米顆粒的穩(wěn)定性可以通過(guò)交聯(lián)改變。另外，配體或靶部分可以偶聯(lián)到或以別的方式連接到納米顆粒以增強(qiáng)特異性或例如通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的攝取。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒能夠產(chǎn)生治療性核酸在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)。分化的腸粘膜細(xì)胞通常是短壽命的。正如本文所使用的，粘膜細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)指一個(gè)或多個(gè)粘膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而且粘膜內(nèi)的表達(dá)優(yōu)選多于約4天。 不受理論的限制，在本發(fā)明中粘膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染的優(yōu)選位置的小腸的環(huán)境中，本發(fā)明的納米顆?？梢赃M(jìn)入所述腸粘膜的隱窩并轉(zhuǎn)染腸粘膜前體細(xì)胞。相對(duì)于終末分化和短壽命的粘膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，這提供了治療性核酸的長(zhǎng)期表達(dá)。另外，在治療性構(gòu)建體包含整合序列的實(shí)施方案中，所述納米顆粒提供了所述治療性核酸進(jìn)入前體細(xì)胞(包括干細(xì)胞)的基因組的基因整合，且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了治療性核酸在起源于所述前體細(xì)胞的一系列分化的粘膜細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)。因此，如本文使用的，粘膜細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)并不一定指在相同細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，治療性構(gòu)建體的所述表達(dá)調(diào)控區(qū)具有組成性活性，提供治療性核酸的所述靜態(tài)表達(dá)。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性構(gòu)建體的所述表達(dá)調(diào)控區(qū)不具有組成性活性。這提供了治療性核酸的動(dòng)態(tài)表達(dá)。所用“動(dòng)態(tài)”表達(dá)是指隨著時(shí)間變化的表達(dá)。這種隨時(shí)間的表達(dá)可以包括無(wú)表達(dá)期或檢測(cè)不到的表達(dá)期，在所述無(wú)表達(dá)或檢測(cè)不到的表達(dá)期間，治療性核酸存在于粘膜細(xì)胞，但沒(méi)有表達(dá)或沒(méi)有在可檢測(cè)的水平表達(dá)。動(dòng)態(tài)表達(dá)可以包括幾種這樣的由可檢測(cè)表達(dá)期分開(kāi)的低或無(wú)表達(dá)期。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療性核酸被可操作連接到可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。這提供了所述治療性核酸的可調(diào)節(jié)表達(dá)。引起治療性核酸長(zhǎng)期表達(dá)的能力是許多優(yōu)選的本發(fā)明的基于殼聚糖的納米顆粒的鑒別特征。所述產(chǎn)生長(zhǎng)期表達(dá)的能力指優(yōu)選的納米顆粒在單次給予后引起長(zhǎng)期表達(dá)的能力，盡管本文的一些方法包括基于殼聚糖的納米顆粒的重復(fù)給予。特別地，在納米顆粒能夠引起治療性核酸的長(zhǎng)期表達(dá)的實(shí)施方案中，這種治療性核酸的長(zhǎng)期表達(dá)可以是動(dòng)態(tài)的，具有低表達(dá)或檢測(cè)不到的表達(dá)期。表達(dá)調(diào)控區(qū)表達(dá)調(diào)控區(qū)包括影響可操作連接的治療性核酸的表達(dá)的諸如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)多核苷酸(本文中有時(shí)被稱(chēng)為元件)。優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控區(qū)是在腸組織或特定的腸組織細(xì)胞類(lèi)型中選擇性活化的那些。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性構(gòu)建體的表達(dá)調(diào)控區(qū)包括腸特異性啟動(dòng)子。腸特異性啟動(dòng)子在腸粘膜細(xì)胞及潛在的其他腸細(xì)胞內(nèi)顯示活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸特異性啟動(dòng)子在廣泛多樣的其他組織中并不顯示基本活性。在廣泛多樣的細(xì)胞類(lèi)型中顯示活性的諸如CMV啟動(dòng)子的病毒啟動(dòng)子不是腸特異性啟動(dòng)子。腸特異性啟動(dòng)子可以顯示組成性或非組成性活性。特別優(yōu)選的是可調(diào)節(jié)的腸特異性啟動(dòng)子。例如，胰高血糖素原基因的啟動(dòng)子包括腸特異的元件且可以用于本 M 明(Lee, Y. C, et al. J Biol.Chem.267:10705 (1992) ；Gajic andDrucker, Endocrinol. 1321055(1993)。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性構(gòu)建體的表達(dá)調(diào)控區(qū)包括腸粘膜細(xì)胞特異的啟動(dòng)子。腸粘膜細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)顯示活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腸粘膜細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在其他腸細(xì)胞或廣泛多樣的其他組織中不顯示基本活性。在許多優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性構(gòu)建體的表達(dá)調(diào)控區(qū)包含腸內(nèi)分泌細(xì)胞特異的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的是可調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌細(xì)胞特異的啟動(dòng)子。所述GIP啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的腸內(nèi)分泌細(xì)胞啟動(dòng)子的具體實(shí)例(參見(jiàn)U. S. S. N. 09/804, 409，其整體以引用的方式被清楚地并入本文)。所述GIP啟動(dòng)子是葡萄糖可調(diào)節(jié)的，并且能賦予可操作連接的治療性核酸以葡萄糖可調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌細(xì)胞特異的表達(dá)?？梢员挥糜诒景l(fā)明的腸特異性啟動(dòng)子的其他實(shí)例列于表2中。這些啟動(dòng)子的許多也是可調(diào)節(jié)的。該列表僅是示例性的，并不意圖詳盡用于本發(fā)明的所有可能的腸特異性啟動(dòng)子。表2用于將蛋白的表達(dá)靶向腸內(nèi)分泌細(xì)胞的示例性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子
權(quán)利要求
1.包含基于殼聚糖的納米微粒的組合物，所述基于殼聚糖的納米顆粒包含(i)具有 3kDa至250kDa的平均分子量的多個(gè)殼聚糖聚合物和(ii)治療性構(gòu)建體，其中所述治療性構(gòu)建體包含可操作連接到在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)有功能的表達(dá)調(diào)控區(qū)的治療性核酸，其中所述治療性核酸表達(dá)于所述腸粘膜細(xì)胞時(shí)能夠發(fā)揮治療作用，以及其中所述基于殼聚糖的納米微粒能夠引起所述治療性核酸在腸粘膜長(zhǎng)于4天的表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒能夠引起所述治療性核酸在腸粘膜長(zhǎng)于14天的表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒能夠引起所述治療性核酸在腸粘膜長(zhǎng)于60天的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒能夠引起所述治療性核酸的表達(dá)產(chǎn)物的系統(tǒng)水平的增加。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒是低分子量殼聚糖納米顆粒，其中所述多個(gè)殼聚糖聚合物具有小于25kDa的平均分子量。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒具有10:1至90:1的 N:P 比。
7.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒具有小于225nm的直徑。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒是高分子量殼聚糖納米顆粒，其中所述多個(gè)殼聚糖聚合物具有大于25kDa的平均分子量。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒具有2:1至40:1的 N:P 比。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述基于殼聚糖的納米顆粒具有小于225nm的直徑。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述治療性核酸編碼治療性蛋白。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述表達(dá)調(diào)控區(qū)包含腸特異的調(diào)控序列。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述治療性構(gòu)建體還包含整合序列。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，還包含非治療性構(gòu)建體，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼整合元件的核酸序列，所述整合元件可操作連接到在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)有功能的第二表達(dá)調(diào)控區(qū)，并且其中所述第二表達(dá)調(diào)控區(qū)和所述可操作連接到所述治療性核酸的表達(dá)調(diào)控區(qū)可以相同或不同。
15.包含基于殼聚糖的納米顆粒的組合物，所述基于殼聚糖的納米顆粒包含(i)多個(gè)殼聚糖聚合物和(ii)非治療性構(gòu)建體，其中所述非治療性構(gòu)建體包含編碼可操作連接到表達(dá)調(diào)控區(qū)的整合元件的核酸，所述表達(dá)調(diào)控區(qū)在腸粘膜前體細(xì)胞內(nèi)有功能。
16.在腸粘膜細(xì)胞表達(dá)治療性核酸的方法，所述方法包括將腸粘膜與權(quán)利要求1所述的組合物接觸，由此將所述治療性核酸表達(dá)于所述腸粘膜的腸粘膜細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，還包括將所述腸粘膜與權(quán)利要求15所述的組合物接觸。
18.在腸粘膜細(xì)胞表達(dá)治療性核酸的方法，包括將腸粘膜與權(quán)利要求14所述的組合物接觸，由此將所述治療性核酸表達(dá)于所述腸粘膜的腸粘膜細(xì)胞。
19.引起治療性核酸的表達(dá)產(chǎn)物的系統(tǒng)水平增加的方法，包括將腸粘膜與權(quán)利要求4 所述的組合物接觸，由此將所述治療性核酸表達(dá)于所述腸粘膜的腸粘膜細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供能保護(hù)核酸并將所述核酸遞送入腸粘膜細(xì)胞的基于殼聚糖的納米顆粒。提供用于在腸粘膜細(xì)胞表達(dá)治療性核酸的組合物和方法。也提供用于從腸粘膜的細(xì)胞系統(tǒng)地遞送治療性蛋白的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102164618SQ200780010950
公開(kāi)日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者安東尼·T·鐘, 艾瑞克·粟 申請(qǐng)人:恩根尼公司