專利名稱：用于生產(chǎn)l-天門冬酰胺酶ⅱ的重組宿主的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有均一純度的特異性重組大腸桿菌(E co//) L-天門 冬酰胺酶II的新載體、宿主細胞和方法。
相關(guān)領(lǐng)域描述
L-天門冬酰胺酶是一種將氨基酸L-天冬酰胺水解為L-天冬氨酸和氨的 酶，即，其是一種脫氨基酶。大腸桿菌含有天門冬酰胺酶的兩種同工酶 L-天門冬酰胺酶I和L-天門冬酰胺酶II。 L-天門冬酰胺酶I位于胞質(zhì)溶膠中， 對天冬酰胺的親和性低。L-天門冬酰胺酶II位于周質(zhì)，對L-天冬酰胺具有 高親和性。
L-天門冬酰胺酶II可通過去除細胞外的天冬酰胺，用于治療依賴L-天 冬酰胺進行蛋白合成的肺瘤或癌癥。其在治療白血病，例如急性淋巴細胞 白血病(acute lymphoblastic leukemia)中特別有效。L-天門冬酰胺酶通常與 其它抗腫瘤或抗癌治療聯(lián)合使用，盡管在某些臨床情形下其可以單獨使用。 L-天門冬酰胺酶最初從若干生物體中純化，包括大腸桿菌(五.co/Z)和軟腐歐 文氏菌(五nWm'a carotowra )。在哺乳動物中，^f又在豚鼠(Cavioidea超科)和 某些闊鼻猴(New World monkey)中發(fā)現(xiàn)略高于痕量的L-天門冬酰胺酶II。
大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II為相同亞單位的四聚體，具有良好的&at 和Km。大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II(本領(lǐng)域也稱啦支L-天冬酰胺酰胺水解酶， EC-2型、EC3.5丄1)可以商品名Elspar (Merck & Co. ，Inc.)從商業(yè)上獲得， 也可從Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd獲得。
L-天門冬酰胺酶II本身具有蛋白質(zhì)療法的通常不利因素，例如患者對 外源蛋白的高清除率，以及在用該酶治療的患者體內(nèi)可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。 為了克服這些缺點，已經(jīng)開發(fā)了與聚乙二醇偶聯(lián)的L-天門冬酰胺酶II衍生
4物,由Enzon Pharmaceuticals, Inc.以商品名pegaspargase或Oncaspar⑧推向市 場。Pegaspargase使用Merck提供的、從大腸桿菌提取的L-天門冬酰胺酶II 制備。Pegaspargase(也稱單曱氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基L-天門冬酰胺酶) 具有基本上非抗原性、從循環(huán)中的清除速率下降的優(yōu)點。
然而，盡管獲得了這些成功，如果大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II蛋白能 夠由重組宿主細胞使用合適的染色體外表達載體(例如質(zhì)粒)生產(chǎn)，將會 更加有效和經(jīng)濟。這類表達載體可以被工程化，以使得蛋白的生產(chǎn)比天然 大腸桿菌菌抹更有效率。雖然這種重組制備具有可能的優(yōu)點，據(jù)信迄今為 止并沒有商用L-天門冬酰胺酶II的準確公開的多肽序列，也沒有公開編碼 該酶的多核香酸序列。例如，先前Maita等人，1980, //op; e >Se_y/eA Z.尸/zj^'o/. C7ze肌361(2), 105-117,以及Maita等人，1974， 乂所oc/ze附.76, 1351-1354 [Tokyo].凈艮道了 L-天門冬酰胺酶II肽序列，然而，如下文中討論的那樣， 該早期工作有大量觀"序錯誤。
L-天門冬酰胺酶II亞單位質(zhì)粒表達的另一個可能障礙是存在編碼L-天 門冬酰胺酶II亞單位的基因，該基因?qū)τ诳赡苡米魉拗骷毎拇竽c桿菌菌 抹染色體而言是天然的。這樣，就擔心從攜帶染色體外表達載體的Eco" 宿主細胞中收集的L-天門冬酰胺酶II可能包括代表L-天門冬酰胺酶不止一 種同工型的亞單位。由于為了臨床和管理目的需要獲得明確表征的酶產(chǎn)品， 這一可能性迄今為止代表了在改善大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II蛋白生產(chǎn)效 率方面嚴肅的技術(shù)挑戰(zhàn)。
發(fā)明概述
本發(fā)明滿足了上述對大腸桿菌L-天門冬酰胺酶n的需求，該酶以重組
體形式高效和經(jīng)濟地生產(chǎn)，而提供與商品名為Oncaspa,的大腸桿菌L-天門 冬酰胺酶II蛋白具有同樣的多肽結(jié)構(gòu)的酶產(chǎn)品，同時該酶產(chǎn)品不含可檢測 量的L-天門冬酰胺酶II其它同工型。
因此，本發(fā)明提供了大腸桿菌宿主細胞，其包含大腸桿菌染色體和至 少一份拷貝的重組染色體外載體，其中染色體外載體編碼L-天門冬酰胺酶 II蛋白的亞單位，大腸桿菌宿主細胞染色體編碼L-天門冬酰胺酶II蛋白的 相同亞單位，其中大腸桿菌宿主染色體不編碼L-天門冬酰胺酶II任何其它 的同工型。所述染色體外載體優(yōu)選為適于在大腸桿菌中復(fù)制并表達的質(zhì)粒。
5優(yōu)選的，所表達的L-天門冬酰胺酶蛋白包括4個亞單位，該亞單位具
有根據(jù)SEQIDNO:l的多肽序列，其對應(yīng)于用于生產(chǎn)Oncaspa^的L-天門冬 酰胺酶II亞單位的序列，而質(zhì)粒載體包括與適當?shù)膯幼涌刹僮鬟B接的編 碼L-天門冬酰胺酶蛋白亞單位的核酸分子。該啟動子是任何合適的啟動子， 但任選選自由T7、 araB、 trp、 tac、 lac、人P。 XPR,、 aroH和phoA啟動子組 成的組。質(zhì)粒載體任選包括其它載體元件，其在高效表達和/或產(chǎn)品純化中 可能是需要的，這些其它載體元件與L-天門冬酰胺酶開放閱讀框架和/或啟 動子可操作連接。這些載體元件包括例如相容的操縱子序列、核糖體結(jié)合 位點、轉(zhuǎn)錄終止子、信號序列、抗藥性標記以及復(fù)制起點。也可以具有由 質(zhì)粒攜帶的相關(guān)阻遏蛋白基因的拷貝，例如lacl 。
優(yōu)選的，所述編碼L-天門冬酰胺酶II亞單位的質(zhì)粒DNA分子包含SEQ ID NO: 2,編碼L-天門冬酰胺酶II蛋白亞單位的染色體DNA分子包含SEQ ID NO: 3。
附圖簡述


圖1顯示了 pEN537質(zhì)粒載體的圖鐠。 發(fā)明詳述
相應(yīng)地，為了對相應(yīng)于Oncaspar 和Kyowa Hapkko L-天門冬酰胺酶的 L-天門冬酰胺酶II的生產(chǎn)進行改善，需要獲得編碼該酶的載體，以及提供 僅表達L-天門冬酰胺酶II單一同工型的宿主細胞。因此，對來自Merck& Co., Inc.的L-天門冬酰胺酶II和獲自Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.的L-天門冬 酰胺酶II進行測序，所得序列與來自大腸桿菌K-12的L-天門冬酰胺酶II 進行比較(由Jennings等報道，1990 J^oc&r/o/ 172: 1491-1498，其整體引入 本文作為參考)。所述K12L-天門冬酰胺酶I1由ansB基因編碼(GeneBank No.M34277，引入本文作為參考)。
如前所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，L-天門冬酰胺酶1I包含4個相同 的亞單位。因此，提到的編碼酶和酶蛋白序列的基因或DNA分子，指編碼 這些相同亞單位中的一個的基因。
肽測序通過本領(lǐng)域標準方法進行，如下面實施例1所概述的。令人驚 訝的是，Merck & Co., Inc.,和Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd的亞單^立的蛋白序列相同(參見SEQIDNO: 1)。根據(jù)該數(shù)據(jù)，可以認為早期由Maita等， /980 i/o; / e Se少/eA Z.尸/z;^》/. CTzem. 361(2), 105-117,和Maita等，1974, 歷oc/zem. 76, 1351-1354 [Tokyo]報道的Merck L-天門冬酰胺酶序列實際上存 在許多錯誤。
所得的序列同樣與K12L-天門冬酰胺酶I1的亞單位結(jié)構(gòu)進行了比較。 發(fā)現(xiàn)K12 L-天門冬酰胺酶II亞單位在4個特定殘基位點不同于Merck & Co., Inc的L-天門冬酰胺酶II 。相對于Merck L-天門冬酰胺酶II， K12酶的亞 單位將Ala27替換為Val27, Asp64替換為Asn64, 1^252替換為Ser252，以及 Asri263替換為Thr263。
如前所述，優(yōu)選大腸桿菌宿主細胞的染色體不表達與染色體外載體(即 質(zhì)粒)不同同工型的L-天門冬酰胺酶II。這一所希望的結(jié)果可通過一些可 選擇的途徑之一而獲得。例如，大腸桿菌宿主染色體上的任何L-天門冬酰 胺酶II基因可被全部或部分刪除或敲除?；蛘撸霈F(xiàn)在宿主染色體上的任 何其它L-天門冬酰胺酶II基因可被天然啟動子的內(nèi)在調(diào)控性質(zhì)所抑制，這 種天然啟動子在與有利于染色體外載體編碼的L-天門冬酰胺酶II同工型表 達的相同培養(yǎng)條件下不允許染色體L-天門冬酰胺酶II同工型的表達。然而， 優(yōu)選的，讓染色體和染色體外L-天門冬酰胺酶II基因表達L-天門冬酰胺酶 II的相同同工型。
為此目的，對由幾種可得到的大腸桿菌菌抹生產(chǎn)的L-天門冬酰胺酶II 亞單位進行測序，并且與商用的酶產(chǎn)品進行比較。出乎意料的是，大腸桿 菌BLR(DE3)菌抹[來自Novagen Corporation;目錄號69208-3]產(chǎn)生了與商 用酶相同結(jié)構(gòu)的染色體編碼的L-天門冬酰胺酶II,卻發(fā)現(xiàn)同樣受試的大腸 桿菌GX1210和大腸桿菌GX6712菌抹產(chǎn)生了 L-天門冬酰胺酶II的不同同 工型。
鑒別了優(yōu)選的大腸桿菌宿主后，可構(gòu)建染色體外表達的載體(即作為 染色體外實體存在，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制)。適用于大腸桿菌的染 色體外載體包括，例如pUC或pBR322衍生的質(zhì)粒。其包括質(zhì)粒例如pET 和pBAD,以及多種含有表達元件，如T7、 araBAD、 phoA、 trc、 Ol、 0R、
P。 PR的質(zhì)粒。
在載體中，編碼L-天門冬酰胺酶II亞單位的核酸序列與合適的啟動 子序列可操作連接。合適的啟動子包括，例如T7、 araBAD、 phoA、 trc、O。
Or、 Pi^和PR啟動子。優(yōu)選的，所述啟動子為T7病毒啟動子。
合適的誘導(dǎo)物元件包括，諸如阿拉伯糖、乳糖或熱誘導(dǎo)，磚酸限制
(phosphate limitation )、色氨酸限制等，在此不——列舉。優(yōu)選的，誘導(dǎo)物 元件為乳糖操縱子，其可被異丙基硫代半乳糖苷("IPTG")誘導(dǎo)。
合適的信號序列(信號肽)可衍生自pelB， fd pIII或ompA。優(yōu)選的， 信號肽來自ansB。
合適的抗生素選擇性標記物在本領(lǐng)域是公知的。例如賦予氨芐西林 (ampicillin )、卡那審素(kanamycin )、 氣零素(chloramphenicol )、矛J-w平 (rifampicin )或四環(huán)素(tetracycline )抗藥性的那些選擇性標記物,以及其他。
合適的復(fù)制起點序列包括在下列質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的那些pf/CW，
合適的終止序列包括，例如噬菌體fd主要終止子，TF和〃wB。
通常，質(zhì)粒優(yōu)選用在大腸桿菌中。常規(guī)的質(zhì)粒載體為雙鏈環(huán)狀DNA分 子，優(yōu)選經(jīng)工程化而帶有酶識別位點，以適于插入外源性DNA序列；以及 帶有抗生素選擇性基因、用于宿主細胞內(nèi)自主增殖的復(fù)制起點，以及用于 辨別或選擇含有重組插入DNA的克隆的基因?？捎玫馁|(zhì)粒載體包括，例如 pET3， pET9， pETll以及擴展的pET系列(見Novagen Corporation目錄)， pBAD, trc, phoA, trp和OiVPL,R質(zhì)粒。
如下文舉例說明，pET表達系統(tǒng)的質(zhì)粒，例如pET27b十是優(yōu)選的。為 了提供有效和可控的酶表達，所述表達載體也包括啟動子，操縱子，核糖 體結(jié)合位點，信號序列，轉(zhuǎn)錄終止子，復(fù)制起點以及阻遏蛋白基因的受調(diào) 控的拷貝(例如lacl)。
宿主大腸桿菌菌抹將在其染色體中含有相容的調(diào)控元件。例如，BLR (DE3)細胞中含有受lacUV5啟動子調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因。該菌林是 噬菌體DE3的溶原性細菌。向BLR(DE3)的培養(yǎng)物中加入IPTG可誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶，其繼而轉(zhuǎn)錄在pET質(zhì)粒上的靶基因。BLR(DE3)也是recA-的， 其可對染色體外質(zhì)粒上的基因提供進一步的穩(wěn)定性。
為了獲得編碼Merck和Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd.酶的核酸分子，可
采用合適的方法修飾可用的L-天門冬酰胺酶n。L-天門冬酰胺酶ii亞單位
大腸桿菌K-12 ansB的326個成熟氨基酸的序列由978個堿基對的片段所編碼，見Jennings MP和BeachamIR所沖艮道(1990/Sa"en'oZ 172: 1491-1498; GeneBankNo. MM277)。在成熟蛋白前含有22個氨基酸信號肽的ansB基因 用常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從另一種大腸桿菌K-12菌抹(GX1210;獲 自Genex Corporation)中克隆。編碼大腸桿菌K-12 ansB L-天門冬酰胺酶II 亞單位的ansB基因通過定點誘變(例如采用Amersham Sculptor方法)進行 修飾(adapted),以表達含有上述殘基置換的L-天門冬酰胺酶II，來進行 下述堿基置換。堿基530處T變?yōu)镃,堿基640處的A變?yōu)镚,堿基1205 處的T變?yōu)锳，堿基1239處的C變?yōu)锳。編號基于GeneBankNo. M34277 給出的編號，引入本文作為參考。所得的密碼子改變[相應(yīng)位置上GTG變?yōu)?GCQ; AAT變?yōu)镚AT; TCT變?yōu)锳CT和ACC變?yōu)锳AC]將ansB基因轉(zhuǎn)化 為修飾的基因(下文中稱ansB*; SEQIDNO: 2),其表達與從Merck & Co.， Inc.和Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd獲得的相同的L-天門冬酰胺酶II亞單 位。
31^8*基因可插入如上所述的任何適于在大腸桿菌中進行高效蛋白表
達的染色體外載體。特別的，ansBf基因被插入到質(zhì)粒pET-27b+中(Novagen Corporation),通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌菌林BLR (DE3),如下文實施例 中所詳述的，以獲得帶有&1^8*質(zhì)粒、作為符合Merck L-天門冬酰胺酶II 的均一同工型表達L-天門冬酰胺酶II亞單位的大腸桿菌。
優(yōu)選的，使用根據(jù)實施例鑒定的、稱為菌抹EN538 (保藏為ATCC保藏 號PTA 7490)的克隆，可通過任何本領(lǐng)域已知的適于大腸桿菌的方法培養(yǎng)。 合適的培養(yǎng)系統(tǒng)包括分批、補料分批和連續(xù)培養(yǎng)法。培養(yǎng)基選自本領(lǐng)域已 知的最適于大腸桿菌的培養(yǎng)基。一旦培養(yǎng)物到達足夠的密度(為約加OD660 至約200 OD柳)，向培養(yǎng)基中加入合適的誘導(dǎo)物，例如IPTG。足夠長時間 后(約0.5小時至約20小時)，所產(chǎn)生的L-天門冬酰胺酶II通過標準方法 從培養(yǎng)基和/或從培養(yǎng)物中收集的細胞團塊(cellmass)中純化。
細胞團塊通過離心和/或過濾收集，并且用任何本領(lǐng)域已知的方法裂解。 胞體的裂解可以通過下列方法完成，其包括酶促細胞壁裂解然后進行滲 透性溶解，凍融，超聲處理，機械破裂(例如微流化)，采用裂解劑等。隨 后通過過濾和/或離心從可溶蛋白成分中分離破裂的細胞團塊。為獲得最佳 收率，可采用數(shù)個裂解、清洗和分離循環(huán)。
所述酶可通過公知的純化方法從上清和/或培養(yǎng)基中回收和純化。所述方法包括硫酸銨沉淀、酸提取、層析聚焦、陰離子或陽離子交換層析、磷 酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、FPLC⑧(快 速蛋白液相層析)、高效液相層析等。
可對發(fā)酵過程的若干參數(shù)進行調(diào)整，以優(yōu)化天門冬酰胺酶的表達或控 制蛋白從周質(zhì)滲漏至生長培養(yǎng)基中的程度。這些變量包括培養(yǎng)基組分(例如
碳和氮源以及添加的氨基酸或其它營養(yǎng)素)，溫度，pH,誘導(dǎo)物濃度和表達
持續(xù)時間?？偟拇竽c桿菌遺傳譜系(基因型)也可影響表達和產(chǎn)物滲漏。 根據(jù)蛋白表達和從宿主細胞滲漏的結(jié)果，可能僅需要從細胞(周質(zhì))收集、 僅從培養(yǎng)基收集或從總的發(fā)酵罐內(nèi)含物中收集天門冬酰胺酶產(chǎn)品。
物的系統(tǒng)的列表，例如:v'(CR32R33》-, -[C(=0)〗v,0(CR32R33)t'0-, -[C(=0)]v'0(CR32R33)t'NR36-, -[C(=0)]v'0(CR32R330)t'NR36-, -[C(=0)]v,NR3!(CR32R33)t'-， -[C(=0)]v'NR31(CR32R33)fO-, -[C( 31(CR32R330)t'_, -[C(=C0]v'NR31(CR32R33O)t'(CR34R35)y-, -[C( 31(CR32R330)t'(CR34R35)y'0-, -[C(=0)]v'NR31(CR32R33》(CR34CR350)y'-， -[C(=0)]v'NR31(CR32R33)t'(CR34CR350)y'NR36-, -[C(=0)]v'Ml3!(CR32R33)t'NR36-，
-[C(=0)]v,0(CR32R33).
(CR34R35)t.NR36-R37
-[C(=0)]v,NR31(CR32R33)y,~<￡^>~(CR34R35)t,0-，其中
1131-1137獨立的選自由氫、氨基、取代的氨基、疊氮基、羧基、氰基、
鹵素、羥基、硝基、甲硅烷基醚、磺?；€基、Cw烷基巰基、芳基巰基、取代的芳基巰基、取代的Q-6烷硫基、C卜6烷基、C2-6烯基、C2—6炔基、C3.19支鏈烷基、C3.8環(huán)烷基、Ci—6取代的烷基、C2—6取代的烯基、(32.6取代的炔基、C^取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、6雜烷
基、取代的C,—6雜烷基、C^烷氧基、芳氧基、C,.e雜烷氧基、雜芳氧基、
C2—6烷?；?、芳基羰基、C2_6烷氧羰基、芳氧羰基、烷酰氧基、芳基羰基氧、C2_6取代的烷?；?、取代的芳基羰基、C2—6取代的烷酰氧基、取代的芳氧基
羰基、(:2.6取代的烷酰氧基、取代的和芳基羰基氧組成的組，
其中取代基選自由?；被?、酰氨基、脒、芳烷基(araalkyl)、芳基、疊氮基、烷基巰基、芳基巰基、羰基、羧酸酯、氰基、酯、醚、甲酰基、卣素、雜芳基、雜環(huán)烷基、羥基、亞氨基、硝基、硫代羰基、硫酯、硫代乙酸酯、硫代甲酸酯、烷氧基、磷?；㈧⑺狨?、次磷酸酯、甲硅烷基、巰基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰(sulfamoyl)、氨磺酰(sulfonamide)和^黃酰基組成的組。
(t，)和(y，)獨立的選自0或正整數(shù)，優(yōu)選1-6，以及
(v')為0或1。
優(yōu)選的，Lw和"選自
-C(0)CH2OCH2C(0)-;
-C(0)CH2NHCH2C(0)_;
-C(0)CH2SCH2C(0)-;
-C(0)CH2CH2CH2C(0)4。
-C(0)CH2CH2C(0)-.
或者，合適的氨基酸殘基可選自任何已知的天然L氨基酸，例如丙氨
酸、纈氨酸、亮氨酸等，和/或其組合，在此不--列舉。Lw和Ls也可包
括肽，其大小在約2至約10個氨基酸殘基范圍內(nèi)。
天然氨基酸的衍生物和類似物，以及多種本領(lǐng)域已知的非天然的氨基酸(D或L)，無論其是疏水或非疏水的，同樣落于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
A部分
1. 離去或活化基團
在A為活化基團的那些方面，合適的部分包括但不限于如下基團例如N-羥基苯并三唑基、卣素、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺基、對硝基苯氧基、咪唑基、N-鞋基琥珀酰亞胺基、p塞唑烷硫酮、鄰?；?、五氟苯氧基或2,4,6-三氯苯氧基或其它對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的合適的離去基團。
為了本發(fā)明的目的，離去基團應(yīng)當理解為能夠與所希望的靶標上的親核基團反應(yīng)的那些基團，即生物活性部分、診斷試劑、靶向部分、雙功能間隔區(qū)、中間體等等。因此靶標含有用于置換的基團，例如蛋白、肽、酶、天然或化學(xué)合成的治療性分子(如多柔比星)上的氨基，間隔區(qū)例如單保護的雙胺類化合物。應(yīng)當理解，被選擇用于A的那些基團也可與生物活性親核物質(zhì)以外的其它部分反應(yīng)。
2. 官能團
A也可以是官能團。該官能團非限制性的例子包括馬來酰亞胺基，乙蹄基，砜、羥基、氨基、羧基、巰基、酰肼、肼基曱酸酯(carbazate)等的殘基，其可以通過含胺的間隔區(qū)連接至N-二 (羥乙基)甘氨酸部分。 一旦連接到N-二 (羥乙基)甘氨酸部分，官能團(例如馬來酰亞胺)可用于將N-二 (羥乙基)甘氨酸聚合物連接至靶標，例如多肽的半胱氨酸殘基、氨基酸或肽間隔區(qū)等。
3. 烷基
式(I)中，當A為烷基時，非限制性的合適基團的列表由Cw烷基、(32.6烯基、C2.6炔基、Cw9支鏈烷基、C3—8環(huán)烷基、Cw取代的烷基、<:2.6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-s取代的環(huán)烷基、芳烷基(aralkyl) 、 d.6雜烷基和取代的d-6雜烷基。
Z部分及其功能
在本發(fā)明的一方面，Z為L7-C(=Y12),其中L7為雙功能接頭，選自定義L,-6的組，Y12選自與定義Y,的組相同的組。在本發(fā)明的這一方面，基
23團Z用作L-天門冬酰胺酶和聚合物遞送系統(tǒng)的剩余部分之間的連接。在本發(fā)明的另一方面，Z為被主動轉(zhuǎn)運至革巴細胞中的部分，疏水部分和其組合。Z，當存在時可以充當雙功能接頭、被主動轉(zhuǎn)運至靶細胞中的部分，疏水部分和其組合。
在本發(fā)明的這一方面，可釋放的聚合物系統(tǒng)制備成體內(nèi)水解能將聚合
物從L-天門冬酰胺酶上切割下來、并將酶釋放入細胞外液體、而酶仍然連有Z部分的形式。例如一種可能的Z-B組合是亮氨酸-L-天門冬酰胺酶。
L-天門冬酰胺酶綴合物的制備
用作說明目的，合適的綴合反應(yīng)包括將L-天門冬酰胺酶與本文中所述的經(jīng)過適當活化的聚合物系統(tǒng)反應(yīng)。該反應(yīng)優(yōu)選在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的蛋白修飾條件下進行，包括使用PBS援沖系統(tǒng)等，pH范圍為約6.5-8.5。大多數(shù)情況下應(yīng)當考慮采用過量的活化聚合物與L-天門冬酰胺酶反應(yīng)。
這類反應(yīng)通常會形成綴合物，其含有一種或多種與L-天門冬酰胺酶連接的聚合物。應(yīng)當理解的是，通常需要分離各種組分，以提供更為均一的產(chǎn)品。在本發(fā)明的大多數(shù)方面，反應(yīng)混合物收集后加載到適當?shù)闹鶚渲希眠f增濃度的緩沖液依次洗脫所需的組分。在進一步處理前，組分用適當?shù)姆治龉ぞ叻治?，來測定綴合蛋白質(zhì)的純度。不考慮合成途徑和選擇的活化聚合物，所述綴合物應(yīng)當與本文中定義的式(I)相一致。用本丈中所述合成技術(shù)制備的某些優(yōu)選的化合物包括
<formula>formula see original document page 24</formula>其中B為L-天門冬酰胺酶。
根據(jù)本發(fā)明制備的其它綴合物包括:<formula>formula see original document page 25</formula>
其中所有的變量如上文中所定義。例如，包括在綴合物中的某些實施方案選自由下列組成的組
<formula>formula see original document page 25</formula>其中B為L-天門冬酰胺酶?？捎糜诰Y合物中的非限制性的列表為選自
qi o
其中B為L-天門冬酰胺酶。特別優(yōu)選的綴合物是
其中B為L-天門冬酰胺酶.其它綴合物包括
R5-cR6
丫5
II
g
R ICIR
26m-PAG
其中mPEG的分子量為約10,000至約40,000。
當采用基于N-二(羥乙基)甘氨酸的聚合物系統(tǒng)時，兩種優(yōu)選的綴合物
為
其中mPEG的分子量與上述相同。
必須注意，L-天門冬酰胺酶的PEG化將對與每個蛋白上的總PEG連接 數(shù)、PEG聚合物大小和PEG接頭設(shè)計進行經(jīng)驗性的優(yōu)化。用于評價PEG化 優(yōu)化的PEG化的L-天門冬酰胺酶的關(guān)鍵特征包括體外測定(例如酶活性和 穩(wěn)定性)和體內(nèi)測定(例如藥代動力學(xué)和藥物動力學(xué))。
通過本文中所述DNA、載體和宿主細胞生產(chǎn)的L-天門冬酰胺酶可用于 本領(lǐng)域?qū)τ贓lspar (Merck & Co., Inc.)和Oncaspar (Enzon Pharmaceuticals, Inc.)已知的所有方法和適應(yīng)癥。這樣，本發(fā)明所述L-天門冬酰胺酶II (無 論其是與聚氧化烯烴綴合的，還是作為未綴合的蛋白)可以以有效治療疾 病或病癥或其它對該治療有反應(yīng)的癥狀的量，向需要的患者施用。根據(jù)已 知的Elspa,和Oncaspar 的性質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可推斷出合適的劑量、施 用途徑和給藥方案。
^t%sn
O
mPEG^義
治療方法
27實施例
下述非限制性的實施例說明本發(fā)明的某些方面。 實施例1
L-天門冬酰胺酰氨基水解酶EC-2型，EC 3,5丄1的測序；大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II蛋白
為了分別獲得商業(yè)上可從Merck & Co.和Kyowa Hakko Kogyo Co.得到
的L-天門冬酰胺酶n的氨基酸序列，對這些蛋白進行了蛋白序列分析，并
與已發(fā)表的大腸桿菌K-12 ansB基因序列(GenBank登錄號M34277)進行比較。
L-天門冬酰胺酶II測序按如下進行。 一份2mL的L-天門冬酰胺酶II (80 mg/mL; Merck)用試劑純的水稀釋，產(chǎn)生蛋白濃度為5.0 mg/mL的稀釋 液。在進行蛋白序列分析前用0.22lam濾器過濾稀釋液至小瓶中，以減少生 物負荷量。類似的，將100 mg L-天門冬酰胺酶II (Kyowa Hakko Kogyo)溶 于20mL試劑純的水中，獲得5.6 mg/mL的稀釋液，無菌過濾。采用定量 氨基酸序列分析、N-末端序列測定、肽圖譜和質(zhì)譜，測定這兩個蛋白的完 整序列。制備胰蛋白酶消化、胰凝乳蛋白酶消化、Lys-C消化和澆化氰(CnBr) 片段，用高效液相色譜("HPLC")分離，在分離的肽段上進行質(zhì)譜和氨基酸 序列分析。所完成的分析顯示這兩個商用L-天門冬酰胺酶II具有明顯的序 列一致性，然而，有4個氨基酸位置與來自大腸桿菌K-12天門冬酰胺酶的 基因序列不同。這四個有差別的位置如下表l所示。
表1
殘基位置2764252263
Merck 和 KHAlaAspThrAsn
K12 AnsBValAsnSerThr
實施例2
表達重組L-天門冬酰胺酶II的大腸桿菌菌抹EN538的構(gòu)建 對編碼大腸桿菌K-12ansBL-天門冬酰胺酶II的基因進行修飾，使之 表達具有按實施例l表l中所示的殘基置換的L-天門冬酰胺酶II。大腸桿
28菌K-12 ansB L-天門冬酰胺酶II的326個成熟的氨基酸序列通過978個 i威基對的片段編碼，見Jennings MP和Beacham IR所報道(1990 </ Bacteho/ 172: 1491-1498; GeneBankNo. M34277)。在成熟蛋白前含有22個氨基酸的 信號肽的ansB基因用常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法從另一種大腸桿菌 K-12菌抹(GX1210;來自Genex Corporation)中克隆。具體的，采用寡核芬 酸5 ，-TACTGAATTCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCA-3， (SEQ ID NO: 4)和5，-ACAGTAAGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCTG-3， (SEQ ID NO: 5) 作為引物，使用Perkin Elmer Gene Amp 9600熱循環(huán)儀、Taq聚合酶和標準 試劑。循環(huán)參數(shù)為94。C30秒，40。C30秒，72。Cl分鐘，25個循環(huán)。
擴增的 1 kb帶用TBE瓊脂糖凝膠電泳純化，Eco RI和Hind III酶切， 克隆至噬菌體載體M13mp8中。AnsB基因的DNA序列[Genebank No. M34277]經(jīng)人工DNA雙脫氧序列測定法確認?？寺〉腶nsB基因隨后進行 定點誘變，改變ansB基因的4個密碼子[堿基530處GTG變?yōu)镚CQ;堿 基640處AAT變?yōu)镚AT ;堿基1205處TCT變?yōu)锳CT;堿基1239處ACC 變?yōu)锳AC]以編碼改變的氨基酸(Val27Ala; Asn64Asp; Ser252Thr;以及 Thr263Asn),其采用Amersham RPN 1523第2版誘變試劑盒進行，如 Whitlow和Filpula所描述的那才羊[Single Chain Fvs, In Tumour Immunology. A Practical Approach, Ed. G. Gallagher, R.C. Rees， and C,W. Reynolds, 1993, Oxford University Press, pp 279-291]。
具體的，采用的誘變寡核苷酸為 5，-CAACTTTACCCGCTGTGTAGTTAS-3， (SEQ ID NO: 6)用于Val27Ala
改變；
5，-CAGCCAGACATCATCGTTCATGTC-3， (SEQ ID NO: 7)用于 Asn64Asp 支變；
5，-GTCGAACACAGTTTTATACAGGTTGC-3， (SEQ ID NO: 8)用于 Ser252Thr改變；
5'-CTGCAGTACCGTTTTTCGCGGCGG-3， (SEQ ID NO: 9)用于 Thr263Asn改變。所有4種變化一批完成，DNA測序證實了經(jīng)修飾的ansB 基因序列[在此稱為ansB+基因(SEQIDNO: 2)〗。
采用PCR擴增通過分別在該基因的5，和3，末端導(dǎo)入側(cè)翼限制位點7Vcfe/ 和5amH/，將ansB^基因克隆至質(zhì)粒pET-27b+ (Novagen Corporation)中。用限制酶A^fe/和SawH/將合成的DNA消化后，lkb的基因用T4DNA連接酶 連接至質(zhì)粒載體pET-27b(+)質(zhì)粒中，其同樣已用這兩種酶消化。重組質(zhì)粒 通過電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌菌抹BLR (DE3)中，根據(jù)生產(chǎn)商說明通過BTX Electro Cell Manipulator 600進行。
PET載體構(gòu)建體將ans;^基因置于T7啟動子后面，T7啟動子在添加 IPTG后可被誘導(dǎo)。在lacUV5啟動子的控制下，IPTG誘導(dǎo)染色體T7 RNA 聚合酶基因的表達，隨后T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄ansBf基因，獲得高水平表達 的ansB+蛋白產(chǎn)品。
轉(zhuǎn)化混合物鋪于含有卡那霉素(15 pg/ml)的LB瓊脂板上，以選擇含有 質(zhì)粒pET-27b(+)/ansBt的克隆。其稱為質(zhì)粒pEN537,如圖1所示。分離的 克隆進一步通過鋪板純化，采用標準方法(例如Novagen pET System Manual 第9版中公開的那些)分析IPTG可誘導(dǎo)的基因表達?；蛐蛄胁捎肁pplied Biosystems Prism310 Genetic Analyzer驗證。
實施例3
重組L-天門冬酰胺酶II的表達及酶的部分表征
在37°C下，在含卡那霉素(15pg/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株EN538。 在OD,為約0.8時，向培養(yǎng)物中加入IPTG (1 mM),使基因表達的誘導(dǎo)進 行約2、 3或4小時。培養(yǎng)物的SDS-PAGE分析證實了 34.6 kDa ansB水多肽 的高水平表達，采用抗大腸桿菌天門冬酰胺酶II兔多克隆抗體進行蛋白質(zhì) 印跡分析，證實了 SDS-PAGE上主要誘導(dǎo)的蛋白帶為L-天門冬酰胺酶II.。
由于在信號肽去除后，L-天門冬酰胺酶II通常分泌至周質(zhì)間隙，進行 附加試驗以檢查天門冬酰胺酶在細胞抑或培養(yǎng)基中的位置。離心培養(yǎng)物， 將細胞沉淀重懸于溶菌酶溶液中以破壞細胞壁，隨后通過SDS-PAGE檢查 可溶性和不溶性細胞相連的蛋白，以及培養(yǎng)時釋放到培養(yǎng)基中的蛋白。
這些分析顯示，37 。C誘導(dǎo)3或4小時獲得了近乎最大量的ansB*表達， 約為總細胞蛋白的30%。通過用溶菌酶處理，至少70%的天門冬酰胺酶可 從細胞沉淀中溶解。培養(yǎng)過程中釋放到生長培養(yǎng)基中的天門冬酰胺酶的量 約為天門冬酰胺酶總表達量的25%。
通過溶菌酶處理從周質(zhì)釋放的溶解的天門冬酰胺酶進一步采用 RP-HPLC測定天冬氨酸以檢查酶活性，天冬氨S吏是經(jīng)天門冬酰胺酶反應(yīng)從底物天冬酰胺產(chǎn)生的產(chǎn)物。IPTG誘導(dǎo)樣品中粗提取物的酶活性約為60
IU/mg，而從未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物制備的樣品中僅為約2 IU/mg。由于蛋白在該 步驟僅為20%純，其與報道的純天門冬酰胺酶II的比活( 250-300 IU/mg) 符合良好。該天門冬酰胺酶制品的N末端序列分析采用AppliedBioSystems PROCISE蛋白測序儀進行。其N末端序列LPNITILATGGTIAGGGDSA (SEQ ID NO: 10)與成熟的正確加工的天門冬酰胺酶所預(yù)測的N末端蛋白 質(zhì)序列完全符合。該樣品還進行了 LC-MS分析(Jupiter C-18反相柱)，主 要蛋白種類所顯示的分子量為34,592，完全符合成熟ansB5^天門冬酰胺酶 的預(yù)測質(zhì)量。未觀察到帶有正亮氨酸置換的蛋白質(zhì)種類。
實施例4
來自pEN537質(zhì)粒和大腸桿菌BLR染色體的L-天門冬酰胺酶II蛋白 編碼序列(ANSB & ANSB*基因)
染色體DNA從大腸桿菌BLR (DE3)[來自Novagen Corporation; Cat. No. 69208-3]制備。將2 ml在37 °C下含卡那霉素(15 pg/ml)的LB培養(yǎng)物中生長 的BLR在微量離心機中離心2分鐘，細胞沉淀重懸于0.5 ml STET緩沖液 中。加入苯酚/氯仿(0.5ml)，渦旋攪拌混合物，在室溫下離心5分鐘。收集 上清，與50pl的3M醋酸鈉和1 ml乙醇混合。水上孵育10分鐘后，通過 離心使DNA沉淀，再重懸于10(^1水中。采用該樣品進行PCR,以分離染 色體ansB基因。PCR反應(yīng)混合物含有5 pl的10x高保真度PCR緩沖液， 5^1的lOmMdNTP混合物，lpl的50mMMgSO4 ， 0.5的(il(50pmo1) 寡核苷酸5，-GATCCATATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCAC-3， (SEQ ID NO: 11), 0.5 pi (50 pmol)寡核苷酸
5，-GTACGGATCCTCATTAGTACTGATTGAAGATC-3，(SEQIDNO: 12)， 1 ^ 的BLRDNA, 36M!蒸餾水和lpl的Platinum Taq高保真度聚合酶。PCR 產(chǎn)物用來自Invitrogen Corporation的商用TOPO克隆系統(tǒng)克隆，按生產(chǎn)商說
明操作。
采用PCR產(chǎn)物和TOPO TA載體的克隆反應(yīng)以6 pi體積在室溫下進行 30分鐘。將反應(yīng)的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)TOPIO大腸桿菌細胞中，鋪于卡 那霉素選擇性的LB瓊脂平板上。克隆的ansB BLR染色體基因和pEN537 ansB^基因的DNA序列分析采用Applied Biosystems Prism 310 GeneticAnalyzer在質(zhì)粒上進行。兩個條帶均進行了測序。BLR ansB基因和pEN537 &1^8*基因的編碼序列在成熟蛋白編碼序列中有29個不匹配的堿基分派。 然而由于密碼子簡并，這些堿基置換沒有一個導(dǎo)致氨基酸序列的變化。所 編碼的來自BLR的ansB蛋白和所編碼的來自pEN537的ansB^蛋白被證 實在氨基酸序列上相同。這兩個天門冬酰胺酶蛋白中，所有的326個位置 -波顯示均相同。
實施例5
從細胞和培養(yǎng)基中純化
下述方法？文纟扁自Harms等，1991 /Vc^ez.w 5!xpresw'cw ami尸Mnyk^&ow 2: 144-150。
如上文所述，37 。C下，在搖床培養(yǎng)箱中用含卡那霉素(15 pg/ml)的Luria 肉湯培養(yǎng)大腸桿菌菌抹EN538的培養(yǎng)物。在OD660為0.8時，加入IPTG 至終濃度為lmM，繼續(xù)生長4小時。離心收集細胞。采用2ml培養(yǎng)物進行 分析。
為了獲得細胞提取物，將細胞沉淀重懸于1 ml裂解緩沖液中(50 mM KPO， pH 7,5, 1 mM EDTA， 0.5 mM 二硫蘇糖醇)，通過孩t流化裂解細胞。離 心去除細胞碎片，測定上清液的L-天門冬酰胺酶II活性，也用上清液通過 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)測定酶產(chǎn)量。滲透沖擊分級分離根據(jù)Boyd 等所述進行(1987,尸roc. iVa". ^cad 5W. USA 84:8525-8529,引入本文作為 參考)。簡而言之，將細胞沉淀重懸于2 ml球芽(spheroblast)緩沖液中(O.l MTris-HCl, pH8.0, 0.5 M蔗糖，0.5mMEDTA),冰上孵育5分鐘，離心。 沉淀加熱至室溫，再重懸于0.3 ml冰冷的水中，置于冰上孵育5分鐘，再 離心。上清周質(zhì)級分不需進一步處理即可進行活性測定和電泳。
酶純化
對于大規(guī)模L-天門冬酰胺酶II制備而言，細胞在分批培養(yǎng)物(IO升) 中生長，采用上述方法進行滲透沖擊。每升培養(yǎng)物使用50- 100ml體積的球 芽緩沖液和30-40 ml水。下述方法由從2升培養(yǎng)物中得到的周質(zhì)提取物開 始。所有的步驟在5-10。C下進行。硫酸銨分級分離
向100ml上清液中加入29.5g固體硫酸銨，獲得50%的飽和度。2小 時后，離心去除沉淀，棄去沉淀物。上清加入石克酸銨至90%的飽和度(100ml 中力口入27.2g)。沉淀放置過夜后離心收集，用數(shù)毫升25mM哌嗪-HCl緩沖 液(pH5.5)溶解，用相同緩沖液透析。同樣的過程應(yīng)用于其余細胞培養(yǎng)物， 以回收分泌的L-天門冬酰胺酶II。
層析聚焦
多緩沖液交換體系(Polybuffer exchanger )PBE 94的1 x 30-cm柱用200 ml前述哌。秦-HCl緩沖液(起始緩沖液)平衡。樣品溶液(10ml)上樣后，用 200 ml洗脫緩沖液(Polybuffer 74,用水稀釋10倍，HC1調(diào)節(jié)pH至4.0 ) 以流速為30 ml/h洗脫。以2 ml收集級分，適當稀釋20-|iil樣品后測定L-天門冬酰胺酶II活性。合并含天門冬酰胺酶的級分，用飽和的石危酸銨溶液 透析。酶沉淀用90。/U直酸銨洗滌，在該介質(zhì)中以混懸液儲存。
實施例6
從細胞和培養(yǎng)基中純化
如上所述，25-37 °C下，在發(fā)酵器中用培養(yǎng)基[例如見Filpula, D., McGuire, J.和Whitlow, M (1996) Production of single-chain Fv monomers and multimers, In Antibody Engineering: A Practical Approach (丄 McCafferty, H. Hoogenboom,禾口 D丄Chiswell, eds.; Oxford University Press, Oxford, UK) pp. 253_268]在卡那霉素(15 pg/ml)存在下培養(yǎng)大腸桿菌菌抹 EN538的培養(yǎng)物。在OD柳為20至200時，加入IPTG至終濃度為0,1-lmM' 繼續(xù)生長1-12小時。離心收集細胞，使細胞Manton-Gaulin細胞勻漿器。 6。C下，將所述細胞裂解液在24，300 g離心30分鐘，收集上清進行超濾/ 滲濾，傳導(dǎo)率調(diào)節(jié)至3mS。裂解液的pH用25%的乙酸調(diào)節(jié)至4.1，用含5 mM的醋酸鈉、25mMNaCl、 pH4.1的緩沖液滲濾。
天門冬酰胺酶用S-Sepharose陽離子交換柱層析進行收集。結(jié)合的天 門冬酰胺酶用12.5mM磷酸鉀、25mMNaCl、 pH 6.4 (緩沖液NK64)洗脫。
合并S-Sepharose層析所收集的天門冬酰胺酶峰級分，加入0.1 % Tween80,室溫下孵育20分鐘。加入一份體積的緩沖液NK64，樣品加載到
33Q-Sepharose柱上。Q柱用Q-25緩沖液(25 mM NaCl, 10 mM磷酸鉀，pH 6.4) 清洗，天門冬酰胺酶用緩沖液Q-135 (135 mMNaCl溶于10mM磷酸鉀，pH 6.4)洗脫。
向合并的酶級分中加入硫酸鎂粉末，至終濃度為0.25M，加載到用0.25 M的MgSCU、 10mM磷酸鉀、pH 7.8預(yù)平衡的笨基疏水相互作用柱上。天 門冬酰胺酶以餾分的形式收集在流出液中，用分子量截斷值為30kDa的聚 砜膜滲濾在Filtron單元中，緩沖液為75 mM NaCl、 1 mM磷酸鉀，pH7.2。
天門冬酰胺酶級分用等體積的水稀釋，加栽到羥基磷灰石柱上。用緩 沖液H15 (50 mM NaCl, 15 mM磷酸鉀，pH 7.8)洗脫，以除去雜質(zhì)，純化的 天門冬酰胺酶用緩沖液Hl50(50 mM NaCl， 150 mM磷酸鐘，pH 7.8)洗脫。
實施例7
從細胞和培養(yǎng)基中純化
按照實施例6生長、誘導(dǎo)和勻漿的大腸桿菌菌抹EN538的培養(yǎng)物采用 50 kDa的Microgon中空纖維針對8倍產(chǎn)物體積的20 mM醋酸鈉、40 mM NaCl、 pH4.6滲濾，流速2.9 L/min, 16psi，直至八280低于0.1，傳導(dǎo)率為 5 mS。產(chǎn)物用0.22 )im的膜過濾。
陽離子交換層析采用Poros-HS柱進行，層析柱用20mM醋酸鈉、pH 4.6、 40 mM NaCl平衡。經(jīng)滲濾的澄清溶液以0.5柱體積(CV ) /分鐘的速 率上樣，層析柱用5CV的20mM醋酸鈉，pH 4.6, 40 mMNaCl洗滌。天門 冬酰胺酶用20 mM醋酸鈉，pH4.6, 135mMNaCl洗脫。
向上述產(chǎn)物中加入0.2 M的pH 9.2的磷酸氫二鈉，調(diào)節(jié)pH至6.3。 樣品采用50 kDa的Microgon中空纖維濾器針對10 mM pH 6.3的磷酸鈉滲 濾，流速0.74L/min, 16.5 psi。
陰離子交換層析在TMAE Fractogel上進行，層析柱用10 mM pH 6.4的 醋酸鈉平tf,將滲濾的陽離子柱洗脫物以0.5CV/min上樣，層析柱用5 CV 的10 mM的pH6.4的醋酸鈉洗滌，隨后柱子再用5 CV的10 mM醋酸鈉, pH 6.4， 25 mM NaCl洗滌，天門冬酰胺酶用10 mM醋酸鈉，pH 6.4, 100 mM NaCl洗脫。
產(chǎn)物采用50 kDa的膜針對10 mM pH 7.5的磷酸鈉滲濾至濃度為40 mg/ml，并用0.22pm的膜過濾。保藏聲明
在滿足關(guān)于國際公認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的
要求的條件下，以下生物材料的培養(yǎng)物已在下述國際保藏機構(gòu)保藏 美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)
10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A.。
國際保藏號
生物體/載體 ATCC號 保藏曰期
大腸桿菌/EN538 PTA7490 2006年4月11曰
權(quán)利要求
1. 用于生產(chǎn)大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II的重組大腸桿菌宿主細胞，其包含大腸桿菌染色體和至少一份拷貝的重組的染色體外載體，其中重組的染色體外載體編碼L-天門冬酰胺酶II的亞單位，宿主細胞染色體編碼相同的L-天門冬酰胺酶II亞單位，其中宿主染色體不編碼L-天門冬酰胺酶II的任何其它同工型。
2. 權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述染色體外載體為質(zhì)粒。
3. 權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所編碼的L-天門冬酰胺酶II亞單位包含SEQ ID NO: 1 。
4. 權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述重組染色體外載體包含編碼所述L-天門冬酰胺酶蛋白的DNA分子，所述DNA分子與合適的啟動子可操作地連接。
5. 權(quán)利要求4所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中啟動子選自T7，araB, PR/PL, phoA， trc禾口 trp啟動子。
6. 權(quán)利要求4所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述重組染色體外載體還包含操縱子、核糖體結(jié)合位點、信號序列、轉(zhuǎn)錄終止子、抗生素選擇性標記、復(fù)制起點以及阻遏蛋白的受調(diào)節(jié)的拷貝。
7. 權(quán)利要求4所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述編碼L-天門冬酰胺酶蛋白1I亞單位的DNA分子包含SEQIDNO:2。
8. 權(quán)利要求4所述的重組大腸桿菌宿主細胞，其中所述染色體包含根據(jù)SEQ ID NO:3的DNA分子。
9. 編碼SEQIDNO:l的L-天門冬酰胺酶II亞單位的分離的核酸分子，其選自根據(jù)SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3的核酸分子。
10. 染色體外載體，其含有權(quán)利要求9的SEQ.IDNO:2核酸。
11. 權(quán)利要求10的染色體外載體，其為質(zhì)粒。
12. 權(quán)利要求11的染色體外載體，其為質(zhì)粒pEN537。
13. 包含權(quán)利要求12的質(zhì)粒的大腸桿菌宿主細胞，其被稱為EN538，ATCC保藏號為PTA74卯。
14. 制備基本上不含L-天門冬酰胺酶II其它同工型的重組L-天門冬酰胺酶II的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求13的宿主細胞，以及分離所獲得的 L-天門冬酰胺酶II。
15. 聚氧化烯烴綴合物，其包含權(quán)利要求14的重組L-天門冬酰胺酶II 。
16. 治療患有對L-天門冬酰胺酶II有響應(yīng)的疾病或病癥的患者的方 法，包括施用有效量的權(quán)利要求14的L-天門冬酰胺酶II 。
17. 治療患有對L-天門冬酰胺酶II有響應(yīng)的疾病或病癥的患者的方法， 包括施用有效量的權(quán)利要求15的與聚氧化烯烴綴合的L-天門冬酰胺酶II。
18. 編碼L-天門冬酰胺酶II亞單位的分離的DNA分子，包含SEQ ID NO: 2。
19. 分離的重組蛋白分子，其包含帶有相同亞單位的四聚體酶，該亞 單位為SEQ ID NO: 1。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)大腸桿菌L-天門冬酰胺酶II的重組大腸桿菌宿主細胞。所述宿主細胞包含大腸桿菌染色體和至少一份拷貝的重組的染色體外載體，其中重組染色體外載體編碼L-天門冬酰胺酶II，宿主細胞染色體編碼相同的L-天門冬酰胺酶II，宿主染色體不編碼任何其它的L-天門冬酰胺酶II同工型。
文檔編號A61K38/46GK101484181SQ200780024860
公開日2009年7月15日 申請日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者戴維·R·菲爾普拉, 王懋梁 申請人:安佐制藥股份有限公司