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      宿主、轉(zhuǎn)化體及其制造方法、以及含o-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法

      文檔序號:581160閱讀:824來源:國知局
      專利名稱:宿主、轉(zhuǎn)化體及其制造方法、以及含o-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及宿主、轉(zhuǎn)化體及其制造方法、以及含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法。
      背景技術(shù)
      真核生物中的分泌性蛋白質(zhì)等的糖基化是翻譯后修飾中的重要過程之一,由與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體相關(guān)的各種酶來管理。通過糖基化與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖鏈由甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基葡糖胺等形成。與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖鏈有結(jié)合在天冬氨酸殘基的酰胺基的氮原子上的N-糖苷型糖鏈和結(jié)合在絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基的氧原子上的O-糖苷型糖鏈這兩種。該糖鏈被認(rèn)為影響著蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的賦予以及與細(xì)胞的相互作用。因此,為了制造醫(yī)藥品,嘗試著開發(fā)用于制造結(jié)合有N-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì)的技術(shù)(例如參照專利文獻(xiàn)1和2)。對于N-糖苷型糖鏈已積累了各種認(rèn)識,但對于O-糖苷型糖鏈的認(rèn)識較少。通常,在機(jī)體內(nèi)生成結(jié)合有具有各種結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì),特別是在醫(yī)藥品的制造中,將結(jié)合于蛋白質(zhì)的糖鏈的結(jié)構(gòu)控制為特定的結(jié)構(gòu)是很重要的。于是,對于具有O-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì),也要求開發(fā)出以高生產(chǎn)性制造具有特定的糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的技術(shù)。作為以高生產(chǎn)性制造目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法,廣泛采用的是使用導(dǎo)入有編碼目標(biāo)異源蛋白質(zhì)(宿主本身不產(chǎn)生的蛋白質(zhì))的基因的轉(zhuǎn)化體的基因工程制造方法。認(rèn)為在制造來源于真核生物的蛋白質(zhì)時,宿主最好使用作為真核生物的微生物,從不含對人體造成不良影響的物質(zhì)的角度來看,多使用酵母。其中,已知與Saccharomyces cerevisiae (下稱釀酒酵母)等出芽酵母相比,作為裂殖酵母的Schizosaccharomyces pombe (下稱粟酒裂殖酵母)的細(xì)胞周期和染色體結(jié)構(gòu)、RNA剪接等與動物細(xì)胞更為相似,認(rèn)為所生成的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾也與動物細(xì)胞更為接近。釀酒酵母中的O-糖苷型糖鏈的合成由甘露糖通過PMT基因家族所編碼的O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶與蛋白質(zhì)的絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的氧結(jié)合而引發(fā)(參照非專利文獻(xiàn)I和2)。隨后,KTR基因家族所編碼的α 1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和MNNl基因家族所編碼的α 1,3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶參與糖鏈的延伸(參照非專利文獻(xiàn)3)。另一方面,對于粟酒裂殖酵母,參與O-糖苷型糖鏈的延伸的基因尚未確定。對于使用粟酒裂殖酵母的異源蛋白質(zhì)的制造,已開發(fā)出在粟酒裂殖酵母中起作用的啟動子和分泌信號基因、多克隆載體等。但是,參與粟酒裂殖酵母中的O-糖苷型糖鏈的糖鏈修飾的基因尚不清楚,因此至今為止無法控制O-糖苷型糖鏈的結(jié)構(gòu)。由于以上原因,希望開發(fā)出用粟酒裂殖酵母制造具有特定的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)1 :日本專利特表2004-501642號公報專利文獻(xiàn)2 :日本專利特表2005-514021號公報
      非專利文獻(xiàn) I Strahl-BoI singer S, Gentzsch M 和 Tanner ff, Biochim BiophysActa,1426,297-307(1999).非專利文獻(xiàn)2 :Girrbach V 和 Strahl S,J Biol Chem,278,12554-12562 (2003)非專利文獻(xiàn)3 :Lussier M, Sdicu M 和 Bussey H, Biochim Biophys Acta, 1426,323-334(1999)發(fā)明的揭示于是,本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)化體及該轉(zhuǎn)化體的制造方法,所述轉(zhuǎn)化體可使用粟酒裂殖酵母作為宿主來獲得具有將糖鏈結(jié)構(gòu)控制為O-Man-Gal (異源蛋白質(zhì)的氧原子上依次結(jié)合有甘露糖、半乳糖的糖鏈)雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的也在于提供用于獲得該轉(zhuǎn)化體的粟酒裂殖酵母宿主?!?br> 本發(fā)明的目的還在于提供使用所述轉(zhuǎn)化體的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法。本發(fā)明的宿主是由omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母構(gòu)成的宿主,用于通過基因工程方法使編碼異源蛋白質(zhì)的基因表達(dá),再使糖鏈結(jié)合于所表達(dá)的異源蛋白質(zhì),從而生成具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體以omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作為宿主,包含編碼異源蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體較好是還包含編碼在所述粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信號的基因,該基因結(jié)合于編碼所述異源蛋白質(zhì)的基因的5’末端。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中,較好是與所述異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)是具有O-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制造方法的特征在于,以omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作為宿主,將編碼異源蛋白質(zhì)的基因整合到所述宿主中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制造方法中,較好是在編碼所述異源蛋白質(zhì)的基因的5’末端側(cè)具有編碼在粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信號的基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制造方法中,較好是與所述異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)是具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法是制造具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的方法,其特征在于,對所述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng),獲取所生成的具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法中,較好是無論與所生成的具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型異源蛋白質(zhì)是否具有糖鏈,也無論該野生型異源蛋白質(zhì)的糖鏈結(jié)構(gòu)如何,所生成的具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的糖鏈均具有O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法中,較好是從培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液中獲取具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明的粟酒裂殖酵母宿主可用作為用于生成具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的宿主。利用本發(fā)明的以粟酒裂殖酵母作為宿主的轉(zhuǎn)化體,可獲得具有將糖鏈結(jié)構(gòu)控制為O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制造方法,可制造轉(zhuǎn)化體,該轉(zhuǎn)化體可獲得具有將糖鏈結(jié)構(gòu)控制為O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。利用本發(fā)明,可使用所述轉(zhuǎn)化體來制造將糖鏈結(jié)構(gòu)控制為O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的包含O-糖苷型糖鏈的 異源蛋白質(zhì)。附圖的簡單說明圖I是表不KTR家族和omh基因所編碼的蛋白質(zhì)的氣基酸序列的圖。圖2是表示例2中細(xì)胞形態(tài)的觀察結(jié)果的圖。圖3是表示例3中的培養(yǎng)后的結(jié)果的圖。圖4是表示例4中的酸性磷酸酶的分析結(jié)果的非變性PAGE照片。(泳道I)野生型粟酒裂殖酵母,(泳道2) omhl突變株,(泳道3) omh2突變株,(泳道4) omh3突變株,(泳道5) omh4突變株,(泳道6) omh5突變株,(泳道7) omh6突變株。圖5是表示例5 12中的殼多糖酶的分析結(jié)果的SDS-PAGE照片。(泳道I)釀酒酵母,(泳道2)野生型粟酒裂殖酵母,(泳道3) omhl突變株,(泳道4)omh2突變株,(泳道5) omh3突變株,(泳道6) omh4突變株,(泳道7) omh5突變株,(泳道8) omh6突變株。圖6是表示例13 19中通過正相HPLC分析糖鏈結(jié)構(gòu)的結(jié)果的圖。(a)野生型粟酒裂殖酵母,(b) omhl突變株,(c)omh2突變株,(d)omh3突變株,(e)omh4突變株,(f) omh5突變株,(g)omh6突變株。圖7是表示例20中的糖鏈結(jié)構(gòu)的正相HPLC分析結(jié)果的圖。(a)pREP41_GFP,(b)pREP41-omhl-GFP。圖8是表示例20中的細(xì)胞的觀察結(jié)果的圖。(a)裝載有諾馬斯基(Nomarski)光學(xué)系統(tǒng)的觀察裝置,(b)熒光顯微鏡(GFP觀察),(c)熒光顯微鏡(RFP觀察)。圖9是表示例21和22中的殼多糖酶的分析結(jié)果的SDS-PAGE照片。(泳道I)粟酒裂殖酵母野生株,(泳道2) omhl突變株。

      圖10是表示例23和24中的糖鏈結(jié)構(gòu)的正相HPLC分析結(jié)果的圖。(a)粟酒裂殖酵母野生株,(b)omhl突變株。圖11是例25中的分離純化后的雙糖的糖鏈結(jié)構(gòu)的反相HPLC分析結(jié)果。(a)和(e)標(biāo)準(zhǔn)糖鏈,(b) (d)粟酒裂殖酵母野生株,(f) (h)omhl突變株。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的宿主是由omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母構(gòu)成的宿主,可用作為用于制造本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的宿主。將編碼異源蛋白質(zhì)的基因(以下也稱“異源蛋白質(zhì)基因”)導(dǎo)入該宿主,從而制造本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體生成具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì),本發(fā)明的蛋白質(zhì)的制造方法中獲取所生成的該具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明中,“異源蛋白質(zhì)”是指作為宿主的粟酒裂殖酵母本身不產(chǎn)生(野生型的粟酒裂殖酵母不具有編碼該蛋白質(zhì)的基因)的蛋白質(zhì)。從工業(yè)價值高的角度來看,異源蛋白質(zhì)優(yōu)選人或其它哺乳動物所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。“與異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)”是指產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的生物(粟酒裂殖酵母以外的生物)的細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體所生成的異源蛋白質(zhì)的糖鏈可以與該野生型蛋白質(zhì)的糖鏈不同。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體所生成的異源蛋白質(zhì)是具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的糖鏈的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì),是實質(zhì)上不具有O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)以外的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。作為異源蛋白質(zhì)基因,從容易穩(wěn)定地獲得O-糖苷型糖鏈的結(jié)構(gòu)被控制為O-Man-GaU氧原子上依次結(jié)合有甘露糖、半乳糖的糖鏈結(jié)構(gòu))的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的角度來看,優(yōu)選編碼野生型的蛋白質(zhì)具有O-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì)(糖蛋白)的基因。作為這樣的異源蛋白質(zhì),可例舉例如粟酒裂殖酵母不產(chǎn)生的殼多糖酶、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等。利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體,即使是野生型不具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì),也可通過在N末端融合分泌信號來將所表達(dá)的異源蛋白質(zhì)輸送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體,因此通過氨基酸序列以及該蛋白質(zhì)的~■級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu),可獲得具有O-糖昔型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。對于野生型中的N末端不具有分泌信號的蛋白質(zhì),也可以制成具有編碼合適的分泌信號的 DNA序列的嵌合序列。(宿主)用作宿主的粟酒裂殖酵母是屬于裂殖酵母屬的酵母,是被認(rèn)為與其它酵母相比耐酸性特別優(yōu)良,細(xì)胞周期和染色體結(jié)構(gòu)、RNA剪接等與動物細(xì)胞更為相似,所生成的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾也與動物細(xì)胞更為接近的微生物。作為本發(fā)明的宿主的粟酒裂殖酵母是具有omhl基因缺失或失活的染色體的突變型。該突變型粟酒裂殖酵母維持著上述特征,且向該宿主中導(dǎo)入異源蛋白質(zhì)基因而得的轉(zhuǎn)化體也維持著上述特征。omhl基因(SPBC19C7. 12c,登錄號060160)是粟酒裂殖酵母中編碼作為合成O-糖苷型糖鏈的酶(蛋白質(zhì))的后述的omhlp的基因之一,是特別在該合成中起到重要作用的酶的基因。本說明書中,登錄號表示蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot(URL http://www.Uniprot.org/)的登錄號。O-糖苷型糖鏈的合成與Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母)同樣,由PMT基因家族所表達(dá)的O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶引發(fā)。該基因在從酵母到多細(xì)胞生物的范圍內(nèi)高度保守,在粟酒裂殖酵母中也是通過PMT基因家族所編碼的O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)中的絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基上添加甘露糖。在蛋白質(zhì)上添加了第一個甘露糖后,在釀酒酵母中,如上所述,由KTR基因家族和MNNl基因家族編碼的α 1,2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和α 1,3_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶與糖鏈的延伸有關(guān)。與之相對,參與粟酒裂殖酵母中的O-糖苷型糖鏈延伸的酶的基因至今尚未確定。于是,本發(fā)明人考察了粟酒裂殖酵母的染色體中與參與釀酒酵母的O-糖苷型糖鏈的延伸反應(yīng)的KTR基因(編碼α 1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶的基因)家族的同源性高的基因(omh基因,O-糖苷α 1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶同源物(Ο-glycoside α 1,2-mannosy I transferase homologues))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在粟酒裂殖酵母中參與0_糖苷型糖鏈延伸的酶的6個基因,即SPBC19C7. 12c (omhl基因)、SPBC16H5. 09c(omh2基因,登錄號:042944)、SPCC777. 07 (omh3 基因,登錄號074546)、SPBC1773. 08c (omh4 基因,登錄號094565)、SPBC32H8. 08c (omh5 基因,登錄號Q96ffffl)和 SPAC959. 04c (omh6 基因,登錄號Q9P4X2)。此外,在粟酒裂殖酵母中未發(fā)現(xiàn)與所述MNNl基因的同源性高的基因。圖I所示為由釀酒酵母的KTR基因家族的Kre2基因、Ktrl基因、Ktr3基因編碼的蛋白質(zhì)與由omhl基因 omh6基因編碼的各蛋白質(zhì)的氨基酸序列的比較。
      相對于釀酒酵母的KTR基因家族的Kre2基因、Ktrl基因、Ktr3基因亞家族,omhl基因 omh5基因的堿基序列的同源性為33 55%。另一方面,omh6基因與omhl基因 omh5基因相比同源性低。Kre2基因所編碼的α 1,2_甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(下稱Kre2p)具有與公知的各種糖基轉(zhuǎn)移酶所具有的DXD基序相當(dāng)?shù)腅PD(Glu247-Pro248-Asp249)位點(圖I)。omhl基因 omh6基因所編碼的α ,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(以下分別稱為omhlp omh6p)也具有與之相當(dāng)?shù)奈稽c,雖然249位的天冬氨酸殘基也可能會變成絲氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酸殘基,但247位的谷氨酸高度保守。因此認(rèn)為omhlp omh6p通過與Kre2p同樣的機(jī)制參與糖鏈的延伸。S卩,Kre2p的247位的谷氨酸通過2價陽離子的配位與給體的糖核苷酸(⑶P-甘露糖)的磷酸基相互作用,220位的酪氨酸殘基(圖1的〇記號)在所述給體的糖核苷酸與受體末端的甘露糖之間的糖轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。認(rèn)為omhlp omh6p也與Kre2p同樣地通過酪氨酸殘基的幫助來進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移。在Kre2p與omhlp omh6p之間,7個半胱氨酸殘基(圖I的 記號)的位置也是保守的。除此之外,在很多位點氨基酸序列都高度保守(圖I的反轉(zhuǎn)部分)。因此認(rèn)為omhlp omh6p具有與Kre2p同樣的三維結(jié)構(gòu)。此外,Kre2p中與所述給體和受體結(jié)合而成為的活性位點的氨基酸序列(YNLCHFffSNFEI,圖I的下劃線部分)也在omhlp omh6p中高度保守,因此認(rèn)為omhlp omh6p通過與Kre2p同樣的機(jī)制進(jìn)行糖鏈延伸。這些omh基因中,omhl基因是編碼在O-糖苷型糖鏈的延伸反應(yīng)中起著重要作用的酶的基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中,通過使omhl基因缺失或失活,從而不表達(dá)omhlp,可將轉(zhuǎn)化體所生成的異源蛋白質(zhì)上結(jié)合的O-糖苷型糖鏈的結(jié)構(gòu)控制為0-Man-Gal。認(rèn)為其原因在于,omhl基因所編碼的omhlp (α 1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶)參與了使第二個甘露糖與結(jié)合在蛋白質(zhì)上的第一個甘露糖結(jié)合的反應(yīng)。即,認(rèn)為通過使omhl基因缺失或失活,可使第二個甘露糖無法與第一個甘露糖結(jié)合,因此半乳糖通過半乳糖基轉(zhuǎn)移酶與第一個甘露糖結(jié)合。omhl基因 omh6基因均非粟酒裂殖酵母生長所必需的基因,并且即使使omhl基因失活或缺失,細(xì)胞的表型也無特別變化。因此,本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體雖然使omhl基因失活或缺失,但卻可穩(wěn)定地制造包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。粟酒裂殖酵母中,使omhl基因缺失或失活的情況下,omhl基因的功能無法通過omh2基因 omh6基因的過表達(dá)來彌補(bǔ)。即使破壞omh2基因 omh5基因中的任一個,也能生成與野生型相同的包含O-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì),因此認(rèn)為這些基因所編碼的酶均與第三個甘露糖的添加有關(guān)或者在糖鏈的合成中承擔(dān)剩余的功能。作為使omhl基因缺失或失活的方法,可采用公知的方法。具體而言,可通過采用拉圖爾法(Nucreic Acids Res (2006) 34 :ell和國際公開第2007/063919號文本等中記載)來使基因缺失。也可通過采用誘變劑的突變分離法(酵母分子遺傳學(xué)實驗法,1996年,學(xué)會出版中心)、采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的隨機(jī)突變法(PCR方法及應(yīng)用(PCR MethodsAppl.),1992年,第2卷,p. 28-33.)等向基因的一部分中引入突變,藉此使該基因失活。(轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體通過向上述本發(fā)明的omhl基因缺失或失活的宿主中導(dǎo)入異源蛋白質(zhì)基因而獲得。異源蛋白質(zhì)基因除了具有編碼目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的部分以外,也可以具有編碼分泌信號的部分。該編碼分泌信號的部分是編碼在產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的生物(粟酒裂殖酵母以外)的細(xì)胞中起作用的分泌信號的部分,在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了在N末端具有分泌信號的蛋白質(zhì)后,分泌信號部分在細(xì)胞內(nèi)被去除,然后從細(xì)胞分泌出不具有分泌信號的異源蛋白質(zhì)。異源蛋白質(zhì)基因具有編碼分泌信號的部分的情況下,該分泌信號必須在上述本發(fā)明的宿主中也能起作用。該分泌信號在上述本發(fā)明的宿主中不起作用的情況下,較好是使用在上述宿主中起作用的分泌信號來代替該不起作用的分泌信號。作為在上述本發(fā)明的宿主中起作用的分泌信號,較好是粟酒裂殖酵母所具有的分泌信號。通過使編碼該粟酒裂殖酵母所具有的分泌信號的基因結(jié)合于異源蛋白質(zhì)基因的5’末端側(cè),從而表達(dá)在異源蛋白質(zhì)的N末端側(cè)結(jié)合有該分泌信號的蛋白質(zhì),接著在上述本發(fā)明的宿主內(nèi)去除該分泌信號。作為在粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信號基因,較好是國際公開第96/23890號文本中記載的分泌信號基因。特別好是使用編碼該文獻(xiàn)中記載的分泌信號P3的基因。為了轉(zhuǎn)化宿主,使用包含異源蛋白質(zhì)基因的表達(dá)載體。異源蛋白質(zhì)基因不包含在·宿主內(nèi)起作用的分泌信號基因的情況下,較好是包含在宿主內(nèi)起作用的分泌信號基因。異源蛋白質(zhì)基因包含在宿主內(nèi)不起作用的分泌信號基因的情況下,較好是使用除去了該分泌信號基因的異源蛋白質(zhì)基因,并使用在宿主內(nèi)起作用的分泌信號基因來代替。載體還可以包含通常在宿主內(nèi)起作用的啟動子,還可以包含終止子、5’ -非翻譯區(qū),3’ -非翻譯區(qū)中的任一種以上。啟動予只要是能在作為宿主的粟酒裂殖酵母中起作用而表達(dá)異源蛋白質(zhì)的啟動子即可。作為本發(fā)明的啟動子,可例舉例如日本專利特開平5-15380號公報、日本專利特開平7-163373號公報及日本專利特開平10-234375號公報中記載的來源于動物細(xì)胞病毒的啟動子,優(yōu)選CMV啟動子、SV40啟動子。除此之外,可使用日本專利特開平11-192094號公報、國際公開第2007/26617號文本等中記載的已知是能在粟酒裂殖酵母中起作用的啟動子的各種啟動子。作為使用包含異源蛋白質(zhì)基因的表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母的方法,已知以上述公知例為代表的各種方法,可使用該公知的方法。作為上述例子以外的具體例子,可采用例如日本專利特開2000-262284號公報、日本專利特開2003-310269號公報、日本專利特開2005-198612號公報等中記載的載體及使用該載體的轉(zhuǎn)化方法。異源蛋白質(zhì)基因不僅能以表達(dá)載體的形式導(dǎo)入宿主的染色體外而獲得轉(zhuǎn)化體,也能以表達(dá)盒的形式導(dǎo)入宿主的染色體內(nèi)。表達(dá)盒具有異源蛋白質(zhì)基因以及上述啟動子和分泌信號等,通常使用同源重組法整合到宿主的染色體中。作為通過使用表達(dá)盒將異源蛋白質(zhì)基因整合到染色體中的方法來轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母的方法,較好是使用上述日本專利特開2000-262284號公報中記載的方法。如果將表達(dá)盒整合到染色體中,則容易抑制在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)過程中表達(dá)盒從細(xì)胞脫落而失去生成包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的能力這一現(xiàn)象。將表達(dá)盒整合到粟酒裂殖酵母的染色體中的情況下,從包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性提高的角度來看,所整合的表達(dá)盒較好是2個以上。將如上所述的載體導(dǎo)入粟酒裂殖酵母的細(xì)胞內(nèi)來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化而得的轉(zhuǎn)化體可使用所述抗生素抗性基因或營養(yǎng)需求性標(biāo)記物來選擇。
      使用包含抗生素抗性基因的載體的情況下,通過使用含有該抗生素的培養(yǎng)基,可選擇出轉(zhuǎn)化體。作為抗生素抗性基因,可例舉例如新霉素抗性基因。作為營養(yǎng)需求性標(biāo)記物,可例舉例如乳清苷酸脫羧酶基因(ura4基因)或異丙基蘋果酸脫氫酶基因(Ieul基因)。使用營養(yǎng)需求性標(biāo)記物的情況下,例如可以將使ura4基因缺失或失活而制成的尿嘧啶需求性粟酒裂殖酵母作為宿主,利用包含ura4基因的所述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后,選擇尿嘧啶需求性消失了的宿主,藉此獲得整合有載體的轉(zhuǎn)化體。作為選擇方法,可例舉例如以下所示的方法。通過可利用所述營養(yǎng)需求性標(biāo)記物選擇轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,可從所得的克隆中選擇出多個克隆。接著,將這些克隆分別進(jìn)行液體培養(yǎng)后,考察各培養(yǎng)液中的異源蛋白質(zhì)的表達(dá)量,選擇出異源蛋白 質(zhì)的表達(dá)量較多的轉(zhuǎn)化體。此外,通過對這些選擇出的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行基于脈沖場凝膠電泳法的基因組分析,可考察出整合到染色體中的表達(dá)盒的數(shù)量。[含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法]本發(fā)明的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法是對本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng),獲取由該轉(zhuǎn)化體所生成的具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的方法。作為培養(yǎng)液,可使用公知的酵母培養(yǎng)用培養(yǎng)基,只要是含有粟酒裂殖酵母可利用的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等而能高效地進(jìn)行粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。作為培養(yǎng)液,既可以使用天然培養(yǎng)基,也可以使用合成培養(yǎng)基。作為碳源,可例舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖及淀粉等碳水化合物。其中優(yōu)選葡萄糖或蔗糖。作為氮源,可例舉例如氨、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨等無機(jī)酸的銨鹽及蛋白胨、肉精、酵母提取物。其中優(yōu)選硫酸銨或酵母提取物。作為無機(jī)鹽類,可例舉磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉。其中優(yōu)選磷酸鎂。 培養(yǎng)液中還可以含有蛋白脂質(zhì)。培養(yǎng)可通過振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)等方法進(jìn)行。培養(yǎng)溫度較好是16 37°C,更好是25 32°C。培養(yǎng)時間可適當(dāng)決定。培養(yǎng)既可以是分批培養(yǎng),也可以是連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)的方法可例舉例如下述方法從培養(yǎng)了一定時間的培養(yǎng)液中獲取包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)并同時回收培養(yǎng)上清,向該培養(yǎng)上清中再次添加培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),反復(fù)進(jìn)行上述操作來連續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通過進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的生廣性進(jìn)一步提聞。可采用公知的蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)液中獲取包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。如上所述,根據(jù)本發(fā)明,通過使用以具有omhl基因缺失或失活的染色體的粟酒裂殖酵母作為宿主的轉(zhuǎn)化體,可獲得O-糖苷型糖鏈被控制為O-Man-Gal的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。
      實施例下面,示出實施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。但是,本發(fā)明并不受到下述記載的限定。本實施例中的轉(zhuǎn)化通過乙酸鋰法或電穿孔法(Electroporation)進(jìn)行。[例I]克隆及omh基因的破壞
      使用ura4作為選擇標(biāo)記物,進(jìn)行omhl基因 omh6基因的破壞。使用表I所示的正向引物和反向引物,從野生型粟酒裂殖酵母的基因組DNA中擴(kuò)增分別包含omhl基因、omh2基因、omh3基因的一部分或全部的3條DNA片段(I. 3kb、1.6kb、
      I.25kb),進(jìn)行亞克隆。載體使用pGEM-T Easy載體和pGEM_T載體普洛麥格(Promega)。亞克隆后,通過使用KpnI和EcoRI的限制酶處理在載體的omhl基因內(nèi)進(jìn)行酶切,從而在該位置插入ura4+盒(I. 6kb),藉此得到破壞了 omhl基因的載體。同樣地,使用限制酶EcoRV和HindIII得到破壞了 omh2基因的載體,使用限制酶EcoRI和XhoI得到破壞了omb3基因的載體。接著,使用將分別具有被破壞的omhl基因的載體制成直線狀而得的DNA片段,對尿嘧啶合成能力缺損的粟酒裂殖酵母ARC039株(單倍體)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,通過尿嘧啶選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇,藉此得到具有被破壞的omh I基因的omh I突變株。具有被破壞的omh2基因的omh2突變株和具有被破壞的omh3基因的omh3突變株也通過同樣的方法構(gòu)建。通過DNA印跡法和PCR來確認(rèn)獲得了所要的omhl突變株、omh2突變株、omh3突變株。使用IoxP 盒載體(pBS loxP-ura4-loxP, Biosci Biotechnol Biochem,68,545-550 (2004)中記載)進(jìn)行omh4基因 omh6基因的破壞。采用分別具有XhoI和HindIII限制酶位點的正向引物和反向引物(表I)通過PCR來擴(kuò)增omh4基因的上游側(cè)的片段,采用分別具有EcoRI和BamHI限制酶位點的正向引物和反向引物(表I)通過PCR來擴(kuò)增下游側(cè)的片段。將這些擴(kuò)增片段分別用合適的限制酶進(jìn)行處理后,插入到pBS loxP-ura4-loxP載體,得到omh4基因的上游側(cè)片段和下游側(cè)片段分別位于loxP-ura4-loxP盒的兩側(cè)的omh4基因破壞用載體。此外,使用表I所示的正向引物和反向引物,通過同樣的方法得到omh5基因破壞用載體和omh6基因破壞用載體。使用將這些載體制成直線狀而得的DNA片段,對尿嘧啶合成能力缺損的粟酒裂殖酵母ARC039株(單倍體)進(jìn)行轉(zhuǎn)化,通過尿嘧啶選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇,藉此分別得到omh4突變株、omh5突變株、omh6突變株。[表 I]
      權(quán)利要求
      1.一種宿主,該宿主是由Omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)構(gòu)成的宿主,其特征在于,用于通過基因工程方法使編碼異源蛋白質(zhì)的基因表達(dá),再使糖鏈結(jié)合于所表達(dá)的異源蛋白質(zhì),從而生成具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。
      2.一種轉(zhuǎn)化體,其特征在于,以omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)作為宿主,包含編碼異源蛋白質(zhì)的基因。
      3.如權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化體,其特征在于,還包含編碼在所述粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信號的基因,該基因結(jié)合于編碼所述異源蛋白質(zhì)的基因的5’末端。
      4.如權(quán)利要求2或3所述的轉(zhuǎn)化體,其特征在于,與所述異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)是具有O-糖苷型糖鏈的蛋白質(zhì)。
      5.一種轉(zhuǎn)化體的制造方法,其特征在于,以omhl基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)作為宿主,將編碼異源蛋白質(zhì)的基因整合到所述宿主中。
      6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體的制造方法,其特征在于,在編碼所述異源蛋白質(zhì)的基因的5’末端側(cè)具有編碼在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中起作用的分泌信號的基因。
      7.如權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化體的制造方法,其特征在于,與所述異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型蛋白質(zhì)是具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。
      8.一種包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法,其特征在于,對權(quán)利要求2 4中的任一項所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng),獲取所生成的具有呈O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。
      9.如權(quán)利要求8所述的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法,其特征在于,無論與所生成的具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)相對應(yīng)的野生型異源蛋白質(zhì)是否具有糖鏈,也無論該野生型異源蛋白質(zhì)的糖鏈結(jié)構(gòu)如何,所生成的具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的糖鏈均具有O-Man-Gal雙糖結(jié)構(gòu)。
      10.如權(quán)利要求8或9所述的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法,其特征在于,從培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液中獲取具有O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。
      全文摘要
      本發(fā)明的目的在于提供可使用粟酒裂殖酵母作為宿主而獲得具有將糖鏈結(jié)構(gòu)控制為特定的結(jié)構(gòu)的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體、該轉(zhuǎn)化體的制造方法及用于獲得該轉(zhuǎn)化體的宿主、以及包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法。本發(fā)明提供的宿主是由具有omh1基因缺失或失活的染色體的粟酒裂殖酵母構(gòu)成的宿主,用于通過基因工程方法使編碼異源蛋白質(zhì)的基因表達(dá),再使糖鏈結(jié)合于所表達(dá)的異源蛋白質(zhì),從而生成具有特定的O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供使用該宿主的轉(zhuǎn)化體及其制造方法、以及使用該轉(zhuǎn)化體的包含O-糖苷型糖鏈的異源蛋白質(zhì)的制造方法。
      文檔編號C12N1/19GK102985541SQ20098013973
      公開日2013年3月20日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月1日
      發(fā)明者竹川薰, 浜祐子, 東田英毅 申請人:旭硝子株式會社
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