專利名稱：擴大殺蟲蛋白質(zhì)宿主范圍的方法及手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組體DNA技術(shù)的領(lǐng)域。本發(fā)明特別是涉及擴大殺蟲蛋白質(zhì)宿主范圍和/或增加它們在某些物種中毒性的方法和手段。這些目標可以通過將一種殺蟲蛋白質(zhì)與另一種能夠與未成熟的或成熟的靶昆蟲的中腸或后腸上皮相互作用的蛋白質(zhì)節(jié)片相融合而達到。本發(fā)明涉及這種新的具有擴大的宿主范圍和/或增加了毒性的嵌合蛋白質(zhì)的設(shè)計。更具體地，本發(fā)明涉及這樣一種嵌合蛋白質(zhì)，它包括具有殺蟲活性的第一種蛋白質(zhì)節(jié)片和能與靶昆蟲(包括成長階段的幼蟲和成熟的昆蟲)的中腸或后腸細胞膜牢固地結(jié)合的第二種蛋白質(zhì)節(jié)片，而第一種蛋白質(zhì)則不能有效地結(jié)合在上述細胞膜上。第一種蛋白質(zhì)節(jié)片最好是蘇蕓金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的結(jié)晶蛋白質(zhì)(δ-內(nèi)毒素)，或是其具有殺蟲活性的片段，而第二種蛋白質(zhì)節(jié)片例如可以是昆蟲核多角體病毒的表面糖蛋白。通過將蘇蕓金芽孢桿菌的殺蟲結(jié)晶蛋白質(zhì)與另一種能結(jié)合到靶昆蟲中腸或后腸上皮的蛋白質(zhì)節(jié)片中相聯(lián)合，換句話說，被限制蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍可顯著增加，并且毒性可得到改進。本發(fā)明涉及與生產(chǎn)和使用這種嵌合蛋白質(zhì)有關(guān)的全部手段和方法。本發(fā)明包括增加宿主范圍和/或改進殺蟲蛋白質(zhì)毒性而無需構(gòu)成這種嵌合蛋白質(zhì)的其它方法。
近四十年來，農(nóng)業(yè)、公共衛(wèi)生機構(gòu)和森林工業(yè)越來越多地依靠合成化學(xué)藥品以防止多種害蟲。但是，使用這些廣譜化學(xué)殺蟲劑提出了一系列的問題，如環(huán)境污染，對非靶動物的不良作用，在食物和水中的殘余物，在食物鏈中化學(xué)物質(zhì)的聚集以及由于反復(fù)使用化學(xué)殺蟲劑而發(fā)展了昆蟲的抵抗力。公眾對環(huán)境質(zhì)量的關(guān)注導(dǎo)致了增加對可供選擇的安全的害蟲控制對策的重視。
多年來，人們對使用在昆蟲中致病和顯示毒性的病原體，特別是使用病毒和細菌作為合成化學(xué)藥品取代物以控制昆蟲蟲害和各種動物和人的疾病載體已有相當(dāng)大的興趣?，F(xiàn)在，也許最被人們了解的并無疑在商業(yè)上取得最大成功的生物學(xué)控制劑是革蘭氏陽性土壤細菌，即蘇蕓金芽孢桿菌(B.thuringiensis，Bt)。
已經(jīng)查明了許多具有不同昆蟲宿主范圍的蘇蕓金芽孢桿菌菌株，它們中的大多數(shù)對于鱗翅目(Lepidoptera)某些成員的幼蟲是活性的，但有一些則對少數(shù)雙翅目(dipteran)或鞘翅目(coleopteran)物種顯示出毒性。蘇蕓金芽孢桿菌由于其特性已證明是有效的并對環(huán)境是無害的，并且因而被認為是傳統(tǒng)殺蟲劑的取代物。蘇蕓金芽孢桿菌孢子結(jié)晶混合物的配方商業(yè)上可以買到。但是，蘇蕓金芽孢桿菌作為生物學(xué)昆蟲控制劑的實際使用由于它有限的宿主范圍和對許多害蟲的不良效果而受到很大的限制。
幾家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司目前正耗費他們的主要財力在全世界各個地方篩選土壤試樣，期望得到具有增加的毒性和較廣泛的或不同宿主范圍的新的蘇蕓金芽孢桿菌分離菌，但只取得有限的成功。
為改進效力和宿主范圍的努力已經(jīng)初步失敗，這是因為迄今只有較少的力量用于研究理解蘇蕓金桿菌蘇蕓金芽孢桿菌特性的分子基礎(chǔ)。
已知蘇蕓金芽孢桿菌在孢子形成期間產(chǎn)生結(jié)晶內(nèi)含物。當(dāng)被靶昆蟲的幼蟲攝食時，這些結(jié)晶內(nèi)含物被溶于幼蟲的中腸，釋放出一種或多種結(jié)晶蛋白質(zhì)(Cry蛋白質(zhì)，也稱做δ-內(nèi)毒素)27-140KD，它們呈現(xiàn)出特殊的高殺蟲活性。試驗結(jié)果表明，這些結(jié)晶蛋白質(zhì)的大多數(shù)是原毒素(protoxins)，它們在昆蟲的中腸內(nèi)被蛋白水解轉(zhuǎn)化成較小毒性的多肽?！盎罨摹倍舅嘏c感受的昆蟲的中腸上皮細胞相互作用。按照最近的模式，該毒素誘導(dǎo)感受細胞膜中小的非特殊管孔(0.5-1nm)的形成，導(dǎo)致離子的凈注入并伴隨有水的流入。結(jié)果該細胞膨脹并溶解(lyse)。
許多殺蟲蛋白質(zhì)，如由蘇蕓金芽孢桿菌產(chǎn)生的Cry型殺蟲蛋白質(zhì)，它們作為殺蟲劑的有效性受到限制，這是由于它們的宿主范圍相當(dāng)窄，一般局限于同屬物種。按照H.Hofte和H.R.Whiteley的新近觀點[Microbiological Reviews 53，242-255(1989)]，在現(xiàn)有技術(shù)中已對42種蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)編碼基因進行了核苷酸序列的報導(dǎo)，其中的14種顯然有特殊的區(qū)別，而其余的則是相同的或僅稍有不同，因而代表包括其不同變異體的相同基因。Hofte和White-ley提供了這些基因的詳細特性，并且根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)(核苷酸和導(dǎo)出的氨基酸序列)和宿主范圍提出了對這些基因和編碼的結(jié)晶蛋白質(zhì)的命名和分類表。蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)的特性被認為是由這些蛋白質(zhì)的超變氨基酸區(qū)所確定，從而這些相同蛋白質(zhì)的毒性部分被認為是基本上相同的并限定在高的保存區(qū)內(nèi)。例如，Hofte和Whiteley(出處同上)比較了所導(dǎo)出的蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)寬范圍的氨基酸序列，并且顯示了存在有5個高保存區(qū)，即類似于并存在于幾乎全部結(jié)晶蛋白質(zhì)中的相同氨基酸序列的許多情況中的區(qū)域。Ge等人的研究[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，4037-4041(1989)]目的在于確定蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)的特性區(qū)域，他們使用了重組體DNA技術(shù)，以便在兩種蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)分子之間交換所保存的和可變區(qū)域的某些位置(這兩種分子對家蠶的幼蟲具有顯著不同的毒性)。將高毒性蛋白質(zhì)的毒性部分(在氨基酸90和332之間的保存區(qū))換成具有低毒性蛋白質(zhì)的相同區(qū)域，仍然產(chǎn)生高毒性的蛋白質(zhì)。
對于這些殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍/特性，可響應(yīng)的超變氨基酸區(qū)域被認為是將該蛋白質(zhì)結(jié)合在昆蟲腸上皮的微絨毛(microvillar)細胞膜上的特殊蛋白質(zhì)受體[Hofmann.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，7844-7848(1988);Van Rie et al.，Science 247，72-74(1990)]。將殺蟲蛋白質(zhì)結(jié)合到該膜上使得蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域能與靶蛋白質(zhì)接觸或形成孔，二者中的任一情況均導(dǎo)致細胞的死亡[Hoefte and Whiteley(出處同上)]。但是，這仍然沒有完全理解在分子水平上蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶毒性的確切作用方式。
蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)的殺蟲作用已經(jīng)傳統(tǒng)地通過使用孢子-結(jié)晶混合物的粗制品被研究過[Burges，H.D.(ed.)“Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980”Academic Press，Inc.(London)，Ltd.，London]。然而，要解釋這些研究結(jié)果是困難的，特別是由于許多蘇蕓金桿菌菌株同時產(chǎn)生一種以上的結(jié)晶蛋白質(zhì)，因而難于確定各個蛋白質(zhì)的毒性范圍和其它特性。迄今，單獨的結(jié)晶蛋白質(zhì)已經(jīng)由蘇蕓金芽孢桿菌提純獲得[Yamamoto and Mclaughlin，Biochem.Biophys.Res.Commun.103，414-421(1982)]，或通過在異源宿主中引入或表達相應(yīng)的基因而獲得[參看Hofte和Whiteley的評論文章表2(出處同上)]。
已經(jīng)作過各種努力，通過引入新的結(jié)晶蛋白質(zhì)基因，例如連接來自其它蘇蕓金芽孢桿菌菌株的質(zhì)?；蛲ㄟ^直接轉(zhuǎn)化在蘇蕓金芽孢桿菌復(fù)制子中克隆化的結(jié)晶蛋白質(zhì)基因以改善蘇蕓金芽孢桿菌菌株的宿主范圍[Heierson et al.，J.Bacteriol.169，1147-1152(1987)]。Carlton，B.C.[Proceedings of the Conference“Biotechnology，Biological Pesticides and Novel Plant-Pest Resistance for Insect Pest Management”held July 18-20，1988，Organized by Insect Pathology Resource Center，Boyce Thompson Institute for Plant Research at Cornell University，Ithaca，NY，USA，pp.38-43]報導(dǎo)了對科羅拉多(Colorado)馬鈴薯甲蟲和蠋昆蟲具有活性的雙功能蘇蕓金芽孢桿菌菌株的構(gòu)成。馬鈴薯甲蟲的活性是由Bt.的天然分離物產(chǎn)生的。對于蠋呈活性的公知菌株與對馬鈴薯甲蟲呈活性的菌株交配，結(jié)果產(chǎn)生具有所需特性的轉(zhuǎn)錄接合體。
體外試驗的數(shù)據(jù)有力地提出，活化的毒素識別了僅在感性昆蟲中腸上皮上的高度親和性的結(jié)合位點(假設(shè)的受體)，以及在確定蘇蕓金芽孢桿菌宿主范圍當(dāng)中這些受體因子的存在、缺失或修飾。然而，迄今這一觀察結(jié)果并沒有以任何方式用于研制具有改進的性能和廣泛宿主范圍的新型生物殺蟲劑。通過使用重組體DNA工藝的技術(shù)改善蘇蕓金芽孢桿菌宿主范圍的罕見努力集中在構(gòu)成新的含有編碼毒素的組合基因的蘇蕓金芽孢桿菌的構(gòu)成上，該組合基因?qū)Ω鞣N昆蟲宿主顯示出活性。
我們已意外地發(fā)現(xiàn)，在某些殺蟲毒素，例如蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)(Cry蛋白質(zhì)，δ-內(nèi)毒素)和某些昆蟲腸上皮細胞之間的低效相互反應(yīng)，可以通過將附加的病毒源的蛋白質(zhì)區(qū)域提供到毒素上而有效地得到改善，使該毒素能夠有效地與靶昆蟲的腸(通常是中腸或后腸)上皮相互反應(yīng)。
另外已發(fā)現(xiàn)，殺蟲毒素宿主范圍或毒性的類似增加，可以通過提供對細胞膜的脂類組分具有高度親和性的細菌蛋白質(zhì)區(qū)域而達到。
這種方法例如可以通過構(gòu)成嵌合蛋白質(zhì)而實現(xiàn)，它不僅通過在中腸上皮細胞表面使富集更多的毒素而改進毒性，而且還通過它的受體結(jié)合區(qū)域而賦于特性。因此，通過構(gòu)成殺蟲活性毒素的嵌合基因和特定的中腸/后腸結(jié)合蛋白質(zhì)，就可產(chǎn)生具有增大宿主范圍和毒性的嵌合的毒素蛋白質(zhì)。
一方面，本發(fā)明涉及增大殺蟲蛋白質(zhì)宿主范圍或毒性的方法，通過與其宿主范圍內(nèi)的昆蟲腸上皮相互作用而發(fā)揮它的活性，該方法包括借助于能夠結(jié)合到靶昆蟲腸上皮的其它蛋白質(zhì)將殺蟲劑提供到靶昆蟲的腸上皮。其它的蛋白質(zhì)例如可以是病毒源，或者可以是細菌蛋白質(zhì)或是對膜的脂類組分具有高親合性的蛋白質(zhì)區(qū)域。如果靶昆蟲是在殺蟲蛋白質(zhì)的原始宿主范圍之內(nèi)，則蛋白質(zhì)的毒性可以通過對靶昆蟲的腸提供一種較好的結(jié)合而增加。另一方面這種方法適用于對不包括在其原始宿主范圍內(nèi)的昆蟲擴大殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍。
另一方面，本發(fā)明涉及包括第一和第二DNA片段的DNA，同時編碼一種嵌合蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)包括具有通過與其宿主范圍內(nèi)的昆蟲腸上皮相互反應(yīng)而發(fā)揮殺蟲活性的第一蛋白質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域由第一DNA片段編碼，該嵌合蛋白質(zhì)還包括能結(jié)合到靶昆蟲腸上皮的第二個病毒或細菌蛋白質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域由第二DNA片段編碼，上述由第一DNA片段編碼的蛋白質(zhì)區(qū)域不能或不能有效地結(jié)合在該腸上皮上。如果第二DNA片段編碼細菌蛋白質(zhì)區(qū)域，則該區(qū)域選擇對膜的脂類組分具有高親合性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域。
再一方面，本發(fā)明涉及包括具有以上所定DNA序列的表達盒的表達載體。
另外一方面，本發(fā)明涉及嵌合蛋白質(zhì)，它包括具有通過與其宿主范圍內(nèi)的昆蟲腸上皮相互反應(yīng)而發(fā)揮殺蟲活性的第一蛋白質(zhì)節(jié)片，以及能結(jié)合到靶昆蟲腸上皮的第二蛋白質(zhì)節(jié)片，上述第一蛋白質(zhì)節(jié)片不能或不能有效地結(jié)合在該腸上皮上。如上文所規(guī)定的，第二蛋白質(zhì)節(jié)片由第二DNA片段編碼。
再一方面，本發(fā)明涉及制備這種嵌合蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在重組體宿主細胞中表達如上述所限定的DNA序列，該重組體宿主細胞是用含所需DNA序列的表達載體所轉(zhuǎn)化的一種微生物或細胞培養(yǎng)物。
另一方面，本發(fā)明涉及用包括如上所限定的DNA序列的表達載體所轉(zhuǎn)化的重組體微生物。


圖1示出了125I-標記的[苜蓿銀紋夜蛾多核多角體病病毒(Au-tographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus)(AcMNP)]病毒結(jié)合到紋緣膜泡囊(BBMV)上的飽和動力學(xué)，該膜泡囊是由Trichoplusia ni.幼蟲的腸組織選擇分離的。將不同量的置于PBS+Ca+Mg緩沖液中的I-125標記的游離病毒(1-60μl)，加入總體積為100-400μl的膜泡囊(1-2μl/5-10μg蛋白質(zhì))中，然后在20℃培養(yǎng)60分鐘，再將泡囊成球并洗滌。盛有規(guī)定量I-125標記的病毒(1-60μl)但不盛有膜泡囊的對比試管和盛有膜泡囊的試管一起被培養(yǎng)、成球和洗滌，并用閃爍計數(shù)器記數(shù)。這些本底計數(shù)由膜泡囊的結(jié)合計數(shù)扣除，然后將它們繪出。當(dāng)用較高量(2-3μl)膜泡囊完成結(jié)合時，觀察到類似的結(jié)合動力學(xué)圖樣。結(jié)合到BBMV病毒上的實際讀數(shù)根據(jù)病毒標記(比活性)的效率而變化。初步試驗表明，為達到最大的結(jié)合，需要用標記病毒至少培養(yǎng)30分鐘。
圖2示出了在反應(yīng)混合物中存在有未標記冷病毒顆粒時，結(jié)合到紋緣膜泡囊(BBMV)上的125I-標記的病毒的抑制作用。完全按上述圖1進行將I-125標記的病毒結(jié)合在膜泡囊上，所不同的是正好在加入標記病毒之前，將適當(dāng)量(1-10μl)的未標記游離病毒以冷態(tài)(4℃)加入膜泡囊中，充分混合并在20℃開始培養(yǎng)。游離的未標記病毒通過在1ml勻漿器中攪勻該病毒制劑若干次(15-20X)而獲得，在微離心機中以15Krpm旋轉(zhuǎn)該勻漿10分鐘，并且只使用上清液。上圖是在一定濃度未標記病毒存在時進行的典型結(jié)合反應(yīng)。實際的圖形隨著培養(yǎng)混合物中存在的未標記游離病毒顆粒的濃度而變化。
圖3示出了含有兔血清和預(yù)免疫血清的病毒gp64的多克隆抗體對AcMNP病毒與紋緣膜泡囊結(jié)合的抑制特性。完全如前所述進行在有或沒有血清時，I-125標記的AcMNP病毒的結(jié)合。將血清在PBS+Ca+Mg緩沖液(1∶100和1∶500)中稀釋，緊接著將病毒加入血清并開始在冰上預(yù)培養(yǎng)15分鐘。在病毒和血清(總體積15-20μl)在冰上預(yù)培養(yǎng)之后，將混合物加入膜泡囊中，充分混合并且開始在20℃培養(yǎng)60分鐘。再如上所述進行膜泡囊小球的洗滌。
圖4示出了AcMNP病毒gp64蛋白質(zhì)(非糖基化的)對粉紋夜蛾(Trichoplusia ni.)BBMVs的結(jié)合。S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸標記的AcMNP病毒外膜蛋白質(zhì)gp64(非糖基化的)是在體外，通過使用兔網(wǎng)狀細胞提取物(Promega)于37℃經(jīng)兩小時將體外制得的mRNA(用SP6 RNA聚合酶，Promega)轉(zhuǎn)譯而制得的。通過使用具有10K道爾頓(dalton)過濾單位的1.5ml過濾器(Millipore)過濾提取物，用PBS緩沖液3×1.5ml洗滌濾液，將標記的gp64與未結(jié)合的S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸分離。過濾和洗滌是在Sorval冷卻離心機中于4℃進行的。這一濾液用于全部結(jié)合試驗。完全按上述進行對BBMV的結(jié)合，不同的是培養(yǎng)僅進行15分鐘。在一次典型的試驗中，1-10μl上述濾液被用于結(jié)合。對比試管載有等體積標記的gp64蛋白質(zhì)但沒有BBMV。這些本底計數(shù)由試樣中扣除然后繪圖。1μl濾液含大約100000cpm。
圖5示出了被結(jié)合到粉紋夜蛾BBMV上的35S甲硫氨酸標記的gp64(非糖基化的)的SDS剖面。如前所述用BBMV培養(yǎng)S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸標記的gp64蛋白質(zhì)，但對每條分道所述的條件不同。C.輸入gp64物料1，3和5本底結(jié)合物料結(jié)合到盛有加入1μl gp64濾液的試管(在沒有BBMV時)。分道2，4和6標記的物料結(jié)合到1μl(2，4)和2μl(6)BBMV上。所有的結(jié)合反應(yīng)僅進行15分鐘。全部BBMV小球如前所述被洗滌并載在凝膠上。
圖6示出了處理結(jié)合到BBMV上的gp64蛋白質(zhì)(非糖基化的)的結(jié)果，該BBMV是由粉紋夜蛾的腸組織上分離出來的。完全按上述進行S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸標記的gp64蛋白質(zhì)(非糖基化的)對BBMV的結(jié)合，但對于每個試樣提到有變化的除外。試樣被重新懸浮在2×SDS凝膠緩沖液中并載在10%聚丙烯酰胺凝膠上。將該凝膠固定，用1.6%水揚酸鈉浸漬、干燥并在Kodak X射線膠片上曝光。分道(1).在體外制得的gp64蛋白質(zhì)(用10K道爾頓過濾器過濾之后)。(2).有2μl BBMV存在時在20℃體外培養(yǎng)制得的gp64蛋白質(zhì)，培養(yǎng)時間經(jīng)(3)30分鐘，(4)60分鐘，以及(5)90分鐘。試樣c-e在20℃培養(yǎng)后載在凝膠上，而不用BBMV洗滌。分道f-h含有用不同量BBMV培養(yǎng)的標記的gp64蛋白質(zhì)試樣，即(6)10μl，(7)15μl以及(8)20μl BBMV，培養(yǎng)時間60分鐘，用PBS+Ca+Mg+BSA緩沖液洗滌BBMV3次，并將BBMV小球載在凝膠上。箭頭指明了完整的和處理過的gp64蛋白質(zhì)。
圖7示出了在大腸桿菌中表達鞘翅目毒素后獲得的SDS凝膠剖面。
圖8示出了在大腸桿菌中表達修飾的鞘翅目毒素后獲得的SDS凝膠剖面。
圖9示出了本發(fā)明構(gòu)成的Btt/gp64基因的融合。
圖10示出了通過免疫印跡檢測大腸桿菌中Btt/gp64融合蛋白質(zhì)的結(jié)果。
圖11示出了用Btt/gp64融合蛋白質(zhì)處理的粉紋夜蛾存活的新生幼蟲與對比例的比較圖。
圖12示出了由Btt提純的鞘翅目毒素的SDS-PAGE的分析結(jié)果。
圖13是質(zhì)粒pT7-7的限制性核酸內(nèi)切酶圖。
圖14示出了AcNPV的gp64病毒細胞膜糖蛋白的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖15示出了Btt毒素基因的限制圖。
圖16示出了嵌合蛋白質(zhì)pFAV10的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖17示出了嵌合蛋白質(zhì)PFx7的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖18示出了嵌合蛋白質(zhì)pFAc13的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖19示出了在其表面帶有g(shù)p64表面蛋白質(zhì)和相鄰殺蟲毒素的蛋白質(zhì)分子的感染桿狀病毒屬(Baculovirus)的昆蟲細胞。
圖20a，20b和20c示出了嵌合BtCry-Cyt，A基因構(gòu)成。
圖21是PG14 72KDa+25KDA的核苷酸序列。
圖22是PG14 72KDa+27KDA的核苷酸序列。
圖23示出了用Btt/gp64融合蛋白質(zhì)處理的棉鈴蟲屬(Heliothis)的幼蟲與對比例比較圖。
圖24示出了融合的和非融合的Btt蛋白質(zhì)分子的SDS-PAGE分析結(jié)果。
在本文中首先使用的術(shù)語“腸”指的是靶昆蟲的中腸或后腸，這是因為通過與腸上皮相互作用而發(fā)揮其活性的殺蟲蛋白質(zhì)的壓倒多數(shù)是與這些腸的蛋白質(zhì)相互作用。蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)合到其宿主范圍內(nèi)的昆蟲中腸上皮是已知的。
在權(quán)利要求中的貫穿說明書所使用的術(shù)語“殺蟲蛋白質(zhì)”指的是這樣的蛋白質(zhì)，它們在昆蟲中引起疾病并顯示毒性，并且通過與其宿主范圍內(nèi)的昆蟲腸細胞表面相互作用而發(fā)揮它們的殺蟲作用。由于這個原因，術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括天然存在的和合成的具有殺蟲特性的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段。天然存在的殺蟲蛋白質(zhì)例如可以是由任何原生，或后生動物、原核生物、類病毒、立克次氏體、螺旋體、鋸天牛屬等起源的。
所用的術(shù)語“結(jié)晶蛋白質(zhì)”(Cry蛋白質(zhì))指的是以結(jié)晶內(nèi)含物存在的，由蘇蕓金芽孢桿菌的孢子形成細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在現(xiàn)有技術(shù)中，這些蛋白質(zhì)通常稱做delta-內(nèi)毒素(δ-內(nèi)毒素)，在本說明書中，這兩個術(shù)語交替使用。據(jù)認為大多數(shù)結(jié)晶蛋白質(zhì)是原毒素，它們在昆蟲中腸內(nèi)被蛋白解轉(zhuǎn)化成具有較小毒性的多肽。與結(jié)晶蛋白質(zhì)有關(guān)的所用術(shù)語“其具有殺蟲活性的片段”指的是結(jié)晶蛋白質(zhì)的任意較小片段，它顯示出殺蟲活性，包括但不限于通過在昆蟲中腸內(nèi)蛋白水解的降解而獲得的較小毒性的多肽片段。因此，后一術(shù)語特定地包括部分已知的蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)，它被表示為“毒性區(qū)域”(作為與“結(jié)合”部分對照)。
術(shù)語“昆蟲”包括不同生長階段的昆蟲，即未成熟和成熟的昆蟲。未成熟的靶昆蟲通常是處于生長的幼蟲階段，并且是殺蟲毒素的一般的靶。但是，本發(fā)明提供的方法和手段對于成熟昆蟲的對照物是同樣適合的，如甲蟲、蟑螂、蝗蟲、白蟻等，它們造成了顯著的經(jīng)濟損失。
本文中使用的術(shù)語“表達載體”指的是表達媒介物，它們能夠表達本文所包含的DNA序列，這些序列被操作結(jié)合到其它能實現(xiàn)其表達的序列上。不言而喻，盡管不總是處于表達狀態(tài)，但這種表達載體在宿主生物中或是作為附加體，或是作為染色體DNA的整合部分是可復(fù)制的。因此，術(shù)語“表達載體”具有一個功能性定義，并且任何能夠?qū)崿F(xiàn)本文中排列的特定基因(DNA密碼)的DNA序列被包括在這一定義中。表達載體通常是質(zhì)粒形式，它們是循環(huán)的雙線DNA分子，在它們的載體形式中，它們不結(jié)合到染色體上。盡管質(zhì)粒是載體的最普通的使用形式，但本發(fā)明的意圖是包括任何其它形式的表達載體，它們起著等效的作用，并且在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的或后來在現(xiàn)有技術(shù)中對此成為已知的。
在本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)分子中，第一殺蟲蛋白質(zhì)片段和第二作靶的蛋白質(zhì)片段可被置于或是嵌合蛋白質(zhì)的氨基末端上，或是嵌合蛋白質(zhì)的羧基末端上。
“重組體微生物”是這樣一種微生物，它們經(jīng)重組體DNA工藝技術(shù)用載體轉(zhuǎn)化。
編碼顯示通過昆蟲細胞表面的相互作用而產(chǎn)生殺蟲活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。編碼蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)(43和56KD)的DNA序列例如公開在Hofte和Whiteley的文章中(出處同上)，并在此引作參考。Bacillus sphaericus的蛋白質(zhì)(43和56KD)對蚊是有毒的[Bauman，L.，et al.，J.Bacteriol.1702045-2050(1988);Bauman，P.et al.，J.Bacteriol.1694061-4067(1987)]?？梢岳斫獾氖?，殺蟲活性的蛋白質(zhì)序列的自然等位變化由個體到個體存在和發(fā)生。這些變化可以通過全部序列中一個或多個氨基酸的區(qū)別，或通過在氨基酸序列中的缺失、替代、插入、轉(zhuǎn)化或附加一個或多個氨基酸來表明。編碼這種天然存在的殺蟲活性蛋白質(zhì)的變型的DNA序列，是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。編碼本發(fā)明所用的殺蟲活性蛋白質(zhì)的DNA序列可以由它們的天然來源中分離，由載體(質(zhì)粒)中切離，而該載體是可購得的或者是在科學(xué)工作者中廣泛傳播的、或者換句話說，是可以用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法合成的。
胞外形式的AcNPV(苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒)，gp64的病毒細胞膜(表面)糖蛋白已在這一實驗室內(nèi)分離出來并定序。gp64的DNA序列和導(dǎo)出的氨基酸序列首先出現(xiàn)在1988年(Annual Meeting of the American Society for Virology in the University of Texas at Austin-June 12-16，1988)，在此示于圖14。
盡管本發(fā)明已通過使用這種特定蛋白質(zhì)而被說明，但通過腸進入的所有昆蟲病毒的表面蛋白質(zhì)均適用于本發(fā)明的實踐。
已被發(fā)現(xiàn)對細胞膜的大變種顯示高親合性的蛋白質(zhì)是蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis(BTI)和蘇蕓金芽孢桿菌亞種morrisoni(BTM)的PG-14菌株的CytA蛋白質(zhì)。這是一種27.3-KDA的蛋白質(zhì)，它不顯著地顯示出與任何蘇蕓金芽孢桿菌的Cry蛋白質(zhì)同源的氨基酸。更重要的是，它有極為不同的生物學(xué)特性，具有寬廣的宿主范圍，包括自然條件下的蚊和其它nematocerous蠅，以及對于體外細胞的異常寬廣的宿主范圍，包括廣泛變型的無脊椎動物和脊椎動物細胞[Thomas and Ellar，F(xiàn)EBS Microbiol.Lett.154，362-368(1983);and J.Cell Sci.60，181-197(1983);Chilcott，C.N.and D.J.Ellar.Journal of General Microbiology134，2551-2558(1988);Federici et al.The parasporal body of BTI;Structure，protein compo-sition，and toxicity.In“Bacterial Control of Mosquitoes and BlackfliesBiochemistry，Genetics，and Applications of Bacil-lus thuringiensis and Bacillus Sphaericus”(H.De Barjac andD.Sutherland，editors).Rutgers University Press，New Bruns-wick、New Jersey，1990.]。27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的核苷酸序列例如是由Galjart等人所公開的[Curr.Microbiol.16.171-174(1987)，and，for BTI，by Waalwijk，C.，et al.，Nucleic Acids Res.13，8206-8217(1985)]。
盡管使用特定的表達系統(tǒng)舉例解釋了本發(fā)明在大腸桿菌中某些特定DNA序列的表達，但要理解的是，該表達可以在廣泛范圍的原核(包括蘇蕓金芽孢桿菌)和真核生物[包括植物(基因突變)]的細胞中使用廣泛范圍的載體進行。
通常，對于克隆和表達本發(fā)明的DNA序列較佳的是原核，尤其較佳的是細菌細胞，優(yōu)選大腸桿菌。其它適合的原核包括桿菌，例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)，各種假單胞菌屬(Pseudomonas)，等等。
真核微生物，如酵母也可用于本發(fā)明的實踐。啤酒酵母(S.cere-visiae，面包酵母)是最通用的，但是大量其它酵母在現(xiàn)有技術(shù)中也是公知的并常規(guī)地用于表達外部蛋白質(zhì)。這種酵母，例如包括methy-lotrophic酵母畢赤氏酵母屬pastoris(P.pastoris)，曲霉屬(Asper-gillus)nidulans等。
適于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的質(zhì)粒在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的并在下面實施例中解釋。這些質(zhì)粒必需含啟動子，它們能通過微生物被用于表達它自身的蛋白質(zhì)。這種啟動子之一是紫膠啟動子，它的用途在實施例中敘述。廣泛用于在大腸桿菌中表達外部蛋白質(zhì)的另一種啟動子系統(tǒng)是色氨酸(trp)啟動子/操作基因系統(tǒng)[Goeddel等人，Nucleic Acids Res.8，4057(1980)]。雖然這些是最通用的，但在現(xiàn)有技術(shù)中其它微生物啟動子也是公知和使用的，并且也適用于實施本發(fā)明。該表達質(zhì)粒通常載有供轉(zhuǎn)化細胞中表型選擇的標志。在大腸桿菌中，典型的抗生素抗性序列，例如氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因被用于選擇。大概最通用的大腸桿菌表達載體是質(zhì)粒pBR322[Bolivar et al.，Gene 2，95(1977)]及其衍生物。
對酵母載體，適宜的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.255，12073(1980)]，酸性磷酸酶的啟動子，以及GPD輕便啟動子[Bitter，G.A.，Methods in Enzymology，152，673-684(1987)]。通常，任何含酵母相容啟動子的質(zhì)粒載體，復(fù)制和終止序列的起點適于表達本發(fā)明的DNA序列，以產(chǎn)生所希望的嵌合蛋白質(zhì)。
此外，通過這種方法產(chǎn)生的具有新殺蟲特性和/或增加毒性的嵌合毒素蛋白質(zhì)可以在重要的經(jīng)濟作物中表現(xiàn)出來，從而使它們抵抗了不是幾種，而是多種昆蟲的蟲害。由于使用載有CaMV35S啟動子的Ti質(zhì)粒，這些嵌合蛋白質(zhì)能在植物中象番茄、煙草、棉花、馬鈴薯等當(dāng)中表達出來[Vaeck，M.et.al.，Nature，327，6125，33-37(1987);Fischnoff，D.A.et al.，Biotechnology，5，807-813，(1987)]。
在原核或真核微生物中，異源蛋白質(zhì)的表達在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。適宜表達載體(質(zhì)粒)的構(gòu)成，用這種質(zhì)粒載體對本發(fā)明的DNA序列的可操作連接是普通技術(shù)人員的知識。
由多細胞生物、脊椎動物或無脊椎動物衍生的細胞培養(yǎng)物也可被用作宿主，優(yōu)選脊椎動物的細胞培養(yǎng)物。適宜的脊椎動物細胞株的例子是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株，HeLa、COS-7、AGMK、Rat-1細胞株。這些細胞的表達載體通常包括一個復(fù)制起點，位于待表達的5′基因的一個啟動子，轉(zhuǎn)錄終止區(qū)序列，以及某些必需的核蛋白體結(jié)合位點，多聚腺苷酸位點，等等。
本發(fā)明的表達盒的片段是可操作聯(lián)合的，即DNA序列編碼的所期望的嵌合蛋白質(zhì)對于表達盒的其它片段，如啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列功能上被定位和定向。該嵌合蛋白質(zhì)可被表達作融合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有與用作表達的宿主生物同源的蛋白質(zhì)序列，或表達作非融合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。能夠被處理以活性態(tài)提供所需嵌合蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
轉(zhuǎn)化宿主生物的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并例如已被Mania-tis等人公開[Maniatis et al.，in Molecular CloningA La-boratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA(1982)]。
本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可以用各種方法送至昆蟲，包括例如象重組體微生物殺蟲劑那樣的蛋白質(zhì)餌，以及通過傳遞基因的植物。使用本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)的殺蟲組合物可以以公知的方法，使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的載體和其它添加物制備。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，編碼蘇蕓金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的DNA序列和AcNPV的gp64病毒細胞膜糖蛋白被操作結(jié)合，并且結(jié)合的DNA序列在宿主生物中表達，以產(chǎn)生嵌合Bt/gp64的嵌合毒素蛋白質(zhì)。
AcNPV能夠感染鱗翅目幼蟲的33個物種[同族夜蛾科(Noctuidae)的19個物種]中的11個不同的組織(脂肪體、氣管皮膜組織、皮下組織、馬爾皮基氏管、肌肉、血細胞、神經(jīng)節(jié)、中腸、后腸、童期組織和睪丸)。該病毒基因產(chǎn)物gp64是一種AcNPV的胞外形式的組分(“包膜子?！被颉按掏弧?。后文中的數(shù)據(jù)表明，這種蛋白質(zhì)與各種宿主(鱗翅目幼蟲)組織的細胞表面受體相互作用，促使病毒進入該細胞。胞外病毒正在使用在各種昆蟲幼蟲組織中通常普遍存在的受體是已知的。在對與密封形式的AcMNPV相比較的胞外形式AcMNPV的傳染性進行估價時，研究人員已經(jīng)間接指明，通過喂入(口服)胞外形式的AcMNPV，能夠以很低的量感染幼蟲宿主蠋[Volkma，L.E.，and M.D.Summers，J.Invertebr.Pathal.，30102-103(1977);Keddie，B.A.，and Volkman，L.E.，J.Gen.Virol.，66，1195-1200(1985)]。這些結(jié)果間接表明，使用gp64通過受體傳遞內(nèi)吞作用(發(fā)明人整理的上述數(shù)據(jù))至少某些胞外AcMNPV的顆?？赡芤呀?jīng)通過中腸上皮細胞進入。盡管在病毒的天然壽命周期中沒有賦予gp64與中腸受體相互反應(yīng)的作用，但是由于這種病毒廣泛的組織向性和宿主范圍(Vail，P.V.et al.，J.Invertebr.Pathol.，21，198-204(1973);＆ IVth Int.Colloq.Insect Pathol.1971)，因此可以想見的是，gp64的受體也存在于中腸上皮細胞表面，從而促使胞外AcMNPV的進入。本發(fā)明人已經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，中腸上皮細胞也具有AcNPV gp64普遍存在的受體。由于AcNPV的廣泛宿主范圍和組織向性，所以gp64具有顯著的趨勢以改進市售微生物殺蟲劑的宿主范圍和毒性。結(jié)合該區(qū)域的AcNPV gp64受體與它特定宿主的中腸受體相互作用，從而將較多的嵌合毒素富集在中腸上皮的細胞表面，并且改進了毒性。甚至更重要地，通過提供將區(qū)域結(jié)合到Btδ-內(nèi)毒素上的附加受體，特性將被改進，并且Bt毒素的宿主范圍可擴大到昆蟲，對于這些昆蟲它們是無毒性的或是沒有足夠毒性的。換句話說，gp64基因序列對于細菌內(nèi)毒素，包括Bt內(nèi)毒素而言可被用作瞄準中腸的信號。
按照本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案，蘇蕓金芽孢桿菌毒素與蘇蕓金芽孢桿菌的27.3-KDA蛋白質(zhì)(來自亞種israelensis-Bti，以及morrisoni-Btm)結(jié)合，該蛋白質(zhì)以對細胞膜的脂類部分具有高親合性而公知。這種蛋白質(zhì)被顯示出是高度疏水的[Galjart et al.，(出處同上);and Ward and Ellar，J.Mol.Biol.191，1-11(1986)]，并且容易以低濃度與細胞膜結(jié)合，形成高濃度的集合物，它通過類似除垢劑的作用模式使細胞膜破裂[Chow et al.，Appl.Environm.Microbiol.55，2779-2788(1989)]。這一蛋白質(zhì)的廣泛物種宿主范圍由于其具有高的疏水性和對不飽和脂肪酸的親合性，構(gòu)成了細胞膜脂類雙分子層的主要組分[Thomas and Ellar，J.Cell Sci.60，181-197(1983);and Ward et al.，J.Mol.Biol.191，13-22(1986)]。由于這些特性的結(jié)果，與任何其它Bt蛋白質(zhì)不同的是，這一體外蛋白質(zhì)容易破裂下述細胞，如小鼠的成纖維細胞，大鼠、馬、羊和人類的紅細胞，以及昆蟲細胞如蚊、其它蠅和鱗翅目中許多物種的細胞[Thomas and Ellar，F(xiàn)EBS Microbiol.Lett.154，362-368(1983);Davidson and Yamamoto，Current Microbiol.11，171-174(1984);and Chilcott and Ellar(出處同上)]。此外，由編碼這一蛋白質(zhì)的克隆基因表達的蛋白質(zhì)顯示出，用125ng/ml的LD50對蚊蟲在體內(nèi)是有毒的[Ward et al.，J.Mol.Biol.191，13-22(1986)]。這種蛋白質(zhì)的廣泛宿主范圍的另外表征是在其對線蟲的活性中被發(fā)現(xiàn)的[Bone et al.，J.Parasitol.73，295-299(1987)]。
在昆蟲攝食后，CytA蛋白質(zhì)通過在堿性條件下的中腸蛋白酶分解成為25-KDA的相對抗性核[Armstrong et al.，J.Bac-teriol.161，39-46(1985);Ibarra and Federici，J.Bacteriol.165，527-533(1986)，and Gill et al.(出處同上)]。這種核具有27.3-KDA蛋白質(zhì)的全部生物學(xué)特性。但是，由于它在脊椎動物胃中的高度酸性條件下，顯然易于降解，所以當(dāng)攝食時，它對脊椎動物不造成毒性[Thomas and Ellar，F(xiàn)EBS Microbiol(出處同上)]。
上述各分離物的Cyt A蛋白質(zhì)在遺傳學(xué)上十分相似，不同之處僅在于位置310處的堿基[在BTI基因中的胞嘧啶，在BTM基因中的鳥嘌呤;它在BTI中的氨基酸位置82處產(chǎn)生脯氨酸并在BTM中產(chǎn)生丙氨酸;Galjart et al.(出處同上)]。
27.3-KDA蛋白質(zhì)的結(jié)合顯然取決于在細胞膜中的脂類部分中不飽和脂肪酸的存在。公知的知識表明，結(jié)合可取決于靶細胞膜中特定蛋白質(zhì)受體的存在。
所有的生學(xué)細胞膜被廣為公知的一般性能是它們由流體脂類雙層組成，它包含著多樣的具有不同功能的蛋白質(zhì)。昆蟲腸上皮細胞的微絨毛具有這些相同的性能[Chapman，The Insects-Structure and function，Elsevier，New York 1971，pp819]。
構(gòu)成嵌合BT Cry-Cyt A基因的步驟可以概述如下(參看圖20a-c)步驟1.編碼待融合蛋白質(zhì)區(qū)域的基因為進行融合而被克隆化和制備。
Cyt A基因(編碼27.3-KDa細胞溶解蛋白質(zhì))和Cry基因(編碼65-72KDa殺蟲蛋白質(zhì))由適宜的細菌物種克隆。在實施例2所說明的情況下，兩種基因均由蘇蕓金芽孢桿菌亞種mor-risoni PG-14菌株克隆。接著，基因Cyt A由用EcoR Ⅰ消化的克隆pM1切割。這種載有整個Cyt A基因的EcoRⅠ片段在二個定向上被克隆入載體pBUESCRIPT的EcoRⅠ位點，產(chǎn)生克隆PBBe14e和PBBe15e。用EcoRⅤ消化克隆pBBe15e繼而連接產(chǎn)生克隆pBBe15eRⅤ。這一步驟缺失原始克隆的非必需區(qū)域?；駽ry IVD經(jīng)過用ClaⅠ/EcoRⅤ雙重消化由PM1亞克隆化。這種片段在ClaⅠ/EcoRⅤ位點被插入pBR322以產(chǎn)出克隆pBG35。
步驟2.載有初始密碼子的基因在其3′端被截斷，并在載體的多銜接物中亞克隆化以使在碼組中用第二基因克隆。
在實施例2所述的特定情況下，一個3.5kbp HaeⅢ片段，唯一存在于Cry IVD基因中的HaeⅢ位點是在終止密碼子上游定位的32堿基對。這種消化產(chǎn)生Cry IVD基因，除了包括終止密碼子的最后的32核苷酸。這種片段被克隆入pBUESCRIPT KS的SmaⅠ位點(在適于使T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的定向上)以產(chǎn)生克隆pBBh13S。
步驟3.在多銜接物中插入基因的3′端和克隆位點的5′端之間的接點被定序，以保證克隆入碼組。
此時，在pBUESCRIPT KS多銜接物中Cry ⅣD的3′端和SmaⅠ位點5′端之間的接點，使用M13-pUC反向引物用Sequenase定序以保證合適的定位和克隆入碼組。
步驟4.制備對具有在碼組中克隆位點的CytA蛋白質(zhì)的有關(guān)區(qū)域編碼的基因片段。
將克隆pBBe15e RV用HaeⅢ消化并用作2kbp片段的來源，該片段載有CytA基因的全部編碼序列。在CytA基因的編碼序列范圍內(nèi)沒有HaeⅢ位點。這種酶切割初始密碼子上游的35核苷酸，并且HaeⅢ位點和初始密碼子之間的序列不含有終止密碼子。
步驟5.第二基因的編碼在下游被插入具有第一基因編碼序列的碼組中。
在此情況下，含有CytA基因的整個編碼序列的2dbp HaeⅢ片段被插在質(zhì)粒pBBh13S的EcoRⅤ位點內(nèi)。該位點被定位在用于插入載有截斷的Cry IVD基因的HaeⅢ片段的SmaⅠ位點的下游。已經(jīng)進行了連接并且重組體細菌被篩分以保證該兩種基因以適當(dāng)?shù)亩ㄏ蛉诤?。碼組中的克隆將由體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯確定。
步驟6.編碼第二蛋白質(zhì)的基因被截斷以產(chǎn)生編碼結(jié)合片段的序列，然后克隆入具有第一基因的碼組。
在這種情況下，存在于步驟5產(chǎn)生的質(zhì)粒中的CytA基因用酶Af1Ⅲ切割。這種酶識別這種質(zhì)粒中的兩個位點，即在CytA的編碼序列中的一個位點，以及CytA在該處插入的Sal Ⅰ位點下游的pBUESCRIPT 419堿基對中的另一位點。在CytA的編碼序列中的Af1Ⅲ位點被定位于25-KDa蛋白質(zhì)序列的精確的開始處。使這一片段克隆入具有Cry ⅣD基因的碼組中將通過將上述Af1Ⅲ片段(在用Klenow修復(fù)后)插入多銜接物的Sa1Ⅰ位點(也用Ke-lenow修復(fù))進行。
所得的融合蛋白質(zhì)將具有97-KDa(72-KDa+25KDa)的尺寸，并將在昆蟲中腸內(nèi)產(chǎn)生58-KDa(33-KDa+25-KDa)的亞單位。
盡管本發(fā)明通過嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)成，以及使用本發(fā)明提供的手段加以解釋，但也能設(shè)計其它的方法以增大Bt毒素的宿主范圍。例如在其表面具有在腸結(jié)合蛋白質(zhì)和殺蟲蛋白質(zhì)的桿狀病毒屬(任何昆蟲的核多角體病毒)可用作昆蟲毒素蛋白質(zhì)的傳遞媒介物。此外，甚至在其表面具有中腸結(jié)合蛋白質(zhì)和殺蟲蛋白質(zhì)的桿狀病毒屬感染的昆蟲細胞也能被用作昆蟲毒素的傳遞媒介物。這可以例如使用桿狀病毒屬載體通過表達作為整合的轉(zhuǎn)化細胞膜蛋白質(zhì)的殺蟲毒素蛋白質(zhì)來進行設(shè)計。這種方法產(chǎn)生在其表面含結(jié)合區(qū)域(例如gp64)和殺蟲蛋白質(zhì)的感染的昆蟲細胞。如果這種被感染細胞(冷凍干燥或冷凍的)被喂給蠋，那末gp64將牢固地結(jié)合到中腸上皮細胞上，從而將鄰近的殺蟲毒素蛋白質(zhì)帶到它的靶上或與它的靶相互作用。因而病毒的表面蛋白質(zhì)可被用作傳遞媒介物，或用作各種不具有廣泛特性的殺蟲蛋白質(zhì)的特性決定因素。所有這些方法都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另外的優(yōu)選實施方案通過下列非限制性的實施例加以解釋。
實施例1A.方法a.從腸組織中分離細胞膜泡囊從Wolfersberger，M等人所公開的粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)[(H bner)Comp.Biochem.Physiol.86A，301-308(1987)]的幼蟲腸組織中分離出細胞膜泡囊。將3-4齡的健康幼蟲冷藏在冰上的培養(yǎng)皿中，并用微解剖剪切開外表皮，以最小程度連接周圍組織將中腸慢慢拉出。垂直切開長的中腸并在冰冷的緩沖液A(17mM Tris-HCl，pH7.5，含300mM甘露醇和5mM EGTA)中沖洗凈內(nèi)部食料，在吸水前冷凍放置，稱重并冷凍至-80℃貯存。
通過Wolfersberger，M.等人(出處同上)所公開的下述方法將膜泡囊與紋緣細胞上皮分離。將由粉紋夜蛾幼蟲分離的中腸與緩沖液A(19Wt/Vol)混合并用Sorvall Omni混合器混合二次，每次以中等速率經(jīng)90秒鐘，間隔為1分鐘?；旌虾?，添加等體積冷的24mM MgCl2，用混合器充份混合90秒，再使其在冰上放置15分鐘。然后在Sorvall離心機中用SS-34轉(zhuǎn)動體以2500Xg將該溶液離心分離15分鐘。分離上清液并在分離管中用相同轉(zhuǎn)動體以30000Xg分離30分鐘。用聚四氟乙烯手動勻漿器將上述高速球丸重新懸浮在0.5倍原始均質(zhì)體積的緩沖液A中，添加等體積冷的24mM MgCl2，用混合器充份混合90秒種并如前所述使其放置在冰上15分鐘，然后如上所述將該勻漿以2500Xg離心分離15分鐘，以30000Xg離心分離30分鐘。從而將所得的細胞膜泡囊球丸以3-5毫克/毫升重新懸浮在0.5倍濃度的緩沖液A中并以15μl等分部份在-80℃下貯存。在最終球丸中紋緣上皮細胞膜泡囊的富集物表明，在最終球丸中堿性磷酸酶的比活性比最初2500Xg球團的高10倍。在我們的試驗中，細胞膜泡囊在經(jīng)至少4-6個月的結(jié)合試驗后是活性的，在此之后制備一批新泡囊。
b.AcMNPV表面蛋白質(zhì)的Ⅰ-125放射性標記按照生產(chǎn)廠商的指南(Pierce)通過使用Iodo-Gen用Ⅰ-125將病毒表面蛋白質(zhì)標記。Iodo-Gen以0.1mg/ml溶于氯仿中，并將約10μg Iodo Gen在有為蒸發(fā)氯仿供氮的細噴嘴存在其側(cè)壁上時通過緩慢地旋轉(zhuǎn)隨意使用的玻璃管涂敷到約1.5cm高的該玻璃管的11mm上。將未用過的涂Iodo-Gen管子在4℃下于干燥器中貯存直至使用(通常為3-4周)。在通風(fēng)柜中，通過將有0.3-0.5mCi無載體Ⅰ-125存在的涂敷過Iodo-Gen管子中的約50-75μg病毒蛋白質(zhì)(100μl體積PSB+Ca+Mg緩沖劑)在室溫下培養(yǎng)30-40分鐘，同時偶而搖動管子進行碘化。通過將試樣轉(zhuǎn)移入保存在4℃的8ml貝克曼異質(zhì)同晶聚合物透明管中而停止標記。通過用6.5ml冷PBS+Ca+Mg緩沖液充滿離心管并在4℃下用60Ti轉(zhuǎn)動體以25K rpm將試樣離心60分鐘從病毒蛋白質(zhì)中除去游離Iodine-125。用7ml相同的冷緩沖液洗滌病毒球丸二次并每次按上述以25K rpm離心分離60分鐘。將無Ⅰ-125的病毒球丸重新懸浮在小體積PBS+Ca+Mg緩沖液(100-300μl)中，用0.5ml盎司玻璃勻漿器(10-15沖程)均質(zhì)化，在微離心機中于4℃下以13000rpm將樣品離心分離10分鐘，仔細分離上清液并以100μl等分部份在-20℃下貯存直至使用。
c.結(jié)合試驗在最終體積400μl PBS+Ca+Mg的緩沖液中用100-200K cpm Ⅰ-125標記的病毒蛋白質(zhì)培養(yǎng)紋緣膜泡囊(5-10μg/每次試驗)。膜泡囊不加入對比管中。將管子在保持在20℃的水浴中培養(yǎng)60分鐘，然后通過在微離心機中于4℃，以13K rpm將試樣離心分離5分鐘使結(jié)合終止。仔細分離上清液并每次以短暫旋轉(zhuǎn)將膜泡囊球丸洗滌二次，重新懸浮在0.5ml含有0.1mg/ml BSA(緩沖液B)的PBS+Ca+Mg緩沖液中，并如上所述離心分離。將洗滌過的球丸重新懸浮在150μl體積的緩沖液B中，加入3ml Nugene液體閃爍體，充份混合并在具有全開放能量窗的貝克曼LSS液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)。病毒的結(jié)合以結(jié)合到膜胞囊/每次試驗上的cpm表示。
d.抗Btt的多克隆抗體的產(chǎn)生這一研究的主要工具之一是抗Btt蛋白質(zhì)的抗體。為了檢測大腸桿菌中的Btt和Btt/gp64融合蛋白質(zhì)，多克隆抗體是必需的并通過以下方法產(chǎn)生。最初，從Btt本身提純Btt蛋白質(zhì)并在SDS-PAGE上首次分析提純的蛋白質(zhì)(圖12)。然后以若干次將這一提純的蛋白質(zhì)注射入兩只兔子中從而制得多克隆抗體。檢查這些抗體并確定其抗Btt和Btt/gp64融合的效價、免疫特性。利用直接酶連接免疫吸著劑試驗(ELISA)(Engvall，E.and Perlman，P.，Immunochem.8，871-879(1971))以檢測試驗血清中的Btt抗體。簡言之，首先將抗原Btt或Btt-gp64融合蛋白質(zhì)吸附在微滴定板的井表面上。將來自兔子試驗所放血的血清試樣以不同濃度稀釋并在分離的抗原涂復(fù)的井中培養(yǎng)。在血清試樣中存在的抗原特異抗體將結(jié)合在抗原上。洗去未結(jié)合的血清或上清液組份，然后堿性磷酸酶結(jié)合的抗兔IgG被結(jié)合在已結(jié)合在抗原上的兔子抗體上。洗去過量的結(jié)合物，并將底物對硝基苯酚溶液加入每個井中。當(dāng)通過結(jié)合的酶作用于底物時所顯現(xiàn)的顏色深度與血清中抗體量成比例。
B.來自Btt的δ-內(nèi)毒素基因的克隆和表達對這一基因融合研究所需的工具之一是為了得到為來自對鱗翅目(lepidopterans)和鞘翅目(Coleopteran)甲蟲有毒的菌株δ-內(nèi)毒素編碼的基因。由于某些原因，我們先于鱗翅目BT毒素選擇了鞘翅目BT毒素[蘇蕓金芽孢桿菌擬步甲蟲(tenebrionis)，Btt]。由于gp64來自專門感染鱗翅目宿主的病毒，其中之一是當(dāng)與鞘翅目毒素融合時，由于其新得到的對鱗翅目幼蟲(粉紋夜蛾)的毒性，所以將較易于測定嵌合毒素蛋白質(zhì)。為了得到對鞘翅目的編碼基因，利用已公布的Btt蛋白質(zhì)序列[Hofte，H.，et al.，Nucleic AcidResearch，15，7183(1987)]由Safer Inc.，Newton，Massachusetts獲得了蘇蕓金芽孢桿菌擬步甲蟲(Btt)。為了合成2.98kbp鞘翅目毒素基因，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)設(shè)計并制得了以下序列的二種低核苷酸(26鏈節(jié)和31鏈節(jié))26鏈節(jié)-5′AAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC-3′;31鏈節(jié)-5′AAGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAATTG-3′。盡管PCR試驗開始是成功的，但后來由于Taq DNA聚合酶的不穩(wěn)定性質(zhì)，試驗失敗了。因而利用完全Btt DNA的HindⅢ片段建立了重組體pUC13庫。一旦為PCR而設(shè)計出的這二種低核苷酸(26鏈節(jié)和31鏈節(jié))被用作篩分Btt-pUC13重組體庫菌落的探針。從菌株蘇蕓金芽孢桿菌tenebrionis(Btt)中分離出總DNA(染色體的和質(zhì)粒兩種)(這一菌株是由Safer Inc.得到的)。然后用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ消化分離的細菌DNA并將生成的小DNA片段與被消化的Hind Ⅲ脫去磷酸的pUC13質(zhì)粒DNA載體混合，加入T4 DNA連接酶以促使pUC13載體和“外部”DNA片段之間的DNA連接。然后該連接的DNA轉(zhuǎn)化成大腸桿菌菌株MM294并將細菌細胞敷在LB-瓊脂平面上。將大約700個轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落在圓形硝化纖維紙上劃線培養(yǎng)為通過將紙放在營養(yǎng)瓊脂的頂層使其在營養(yǎng)瓊脂平面上生長。在它們生長過夜后，將含有大腸桿菌菌落的硝化纖維紙?zhí)幚硪允贯尫懦龅腄NA溶解并固定在紙上。然后使用放射性標記(32P)Btt毒素特種低核苷酸(26鏈節(jié)和31鏈節(jié))作為探針使硝化纖維紙經(jīng)受DNA雜交。鑒別出雜交在探針(pUC7-1，pUC9-10和pUC12-7)上的三個菌落以便在pUC13的Hind Ⅲ位點上含有具有預(yù)計的2.98kbp Hind Ⅲ DNA片斷的pUC13質(zhì)粒。在制定了含少量限制性內(nèi)切酶的這一片段的限制性圖后，證實了pUC12-7和pUC9-10在右定向上具有Btt基因而pUC7-1在相反定向上具有該基因。以后對這些克隆(pUC12-7和pUC7-1)進行了毒性試驗(用Colorado馬鈴薯甲蟲)，其結(jié)果進一步證實了Btt克隆的顯著特性(表1)。
表1在四天暴露期間蛋白質(zhì)提取物對6天齡Colorado馬鈴薯甲蟲幼蟲的活性處理 平均死亡率%(S.D.) 消耗葉子的面積%(S.D.)pUC13 3.3a(10.6) 21.0a(8.1)12-7未誘導(dǎo)的 36.7b(24.7) 2.7c(1.8)12-7誘導(dǎo)的 33.3b(35.0) 2.4c(1.8)7-1誘導(dǎo)的 30.0b(24.7) 5.1c(4.8)H2O對比 0a 27.0b(8.9)-后面所用類似字母的均值無顯著變化(a＝0.05;SNK)。
表2在四天暴露期間蛋白質(zhì)提取物(用蒸餾水稀釋至50%)對6天齡Colorado馬鈴薯甲蟲幼蟲的活性處理 平均死亡率%(S.D.) 消耗葉子的面積%(S.D.)50%12-7末誘導(dǎo)的 46.7 2.8a(1.9)50%12-7誘導(dǎo)的 40.0 3.5a(5.0)50%7-1誘導(dǎo)的 13.3 11.8a(19.0)H2O 對比 - 36.8b(31.4)-后面所用類似字母的均值無顯著變化(a＝0.05;SNK)C.大腸桿菌中Btt基因的高水平表達盡管pUC12-7對鞘翅目幼蟲是有毒的(表1)，但我們不能測定comasie-Blue染色的SDS-PAGE上的66KD或27KD Btt毒素蛋白質(zhì)。這向我們表明，由于基因表達是由Btt啟動子引發(fā)的，所以制得的Btt毒素是極少量。由于以后的試驗(Btt/gp64融合)也需要高水平的表達，我們決定在大腸桿菌中使用具有強T7噬菌體啟動子的表達質(zhì)粒PT7-7以大量表達Btt蛋白質(zhì)(圖7和13)。開始，首先將來自pUC12-7的Btt毒素基因亞克隆成PT7-7載體(為表達外部基因的T7啟動子基底載體)。而后在大腸桿菌中在體內(nèi)以具有T7噬菌體基因10蛋白質(zhì)氨基末端的融合蛋白質(zhì)(PT7-SX12和PT7-X9)和以非融合天然Btt毒素蛋白質(zhì)(PT7-4-4)表達翅鞘目毒素。所有這些重組體質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化成載有對T7RNA聚合酶蛋白質(zhì)編碼結(jié)構(gòu)基因的大腸桿菌菌株BL21[Studier，F(xiàn).W.，＆ B.A.Moffatt，J.Mol.Biol.，189，113-130(1986)]。這一基因是在lac Z啟動子控制之下，并且重組體Btt可通過用IPTG誘導(dǎo)表達。這些重組體質(zhì)粒使Btt毒素表達至比pUC12-7更高的水平并且對鞘翅目幼蟲也是有毒的(圖8和表2)。
表2蛋白質(zhì)提取物對10天齡CPB幼蟲的效能。
Lepzinotarsa decemiineata。幼蟲保持在被處理的葉子上經(jīng)4天。
處理 平均消耗面積%(S.D.) 死亡率%H2O 40.3(27.6)b 0＃T7-7(100%) 36.9(20.3)b 0＃X-9(100%) 1.9(0.7)a 50＃X-9(50%) 3.0(1.4)a 50＃X-9(10%) 6.6(8.5)a 0＃4-4(100%) 2.0(1.9)a 40＃4-4(50%) 2.0(0.8)a 30＃4-4(10%) 6.5(3.9)a 10＃12-7(100%) 1.1(-)a 90＃12-7(50%) 2.6(0.7)a 40＃12-7(10%) 4.0(2.1)a 0
后面所用相同字母的均值無顯著區(qū)別(a＝0.05，SNK)結(jié)論盡管由二個對比處理試驗得到的值顯著較小，但在消耗的面積平均百分數(shù)中，各蛋白質(zhì)提取物之間未觀察到任何顯著的區(qū)別。對＃12-7提取物，幼蟲的死亡率顯著較高，這表示出了活性毒素。D.Btt/gp64基因融合的結(jié)構(gòu)和表達在構(gòu)成上述表達大腸桿菌中Btt毒素蛋白質(zhì)的重組體質(zhì)粒后，構(gòu)成了Btt/gp64基因融合。這些重組體DNA融合的方案示于圖9。在Btt蛋白質(zhì)羧基末端的編碼區(qū)處的單一Xmnl限制性位點被分裂，并且使含有多個限制性位點的聚合銜接物通過DNA連接位于Xmnl位點附近。利用聚合銜接物的限制性位點，構(gòu)成三種不同的Btt/gp64基因融合(pFAV10，pFX7和pFAC13)并示于圖9。所有這些重組體質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化成載有對T7RNA聚合酶蛋白質(zhì)編碼的構(gòu)造基因的大腸桿菌菌株BL21。這一基因是在lac Z啟動子控制之下，并可通過用IPTG誘導(dǎo)表達重組體Btt/gp64基因融合。對這些Btt/gp64融合蛋白質(zhì)的免疫印跡試驗表明，所有這些融合蛋白質(zhì)都被表達出來，但與Btt本身比較時，是處于低水平的。(圖10)。
E.毒性生物檢定a)對粉紋夜蛾新生幼蟲進行了用Btt/gp64融合蛋白質(zhì)的毒性生物檢定。這些試驗基本上是用利馬豆人工食料完成的。我們生長了大批表達這些融合蛋白質(zhì)的大腸桿菌培養(yǎng)物并將相同量的對比大腸桿菌pT7-7和大腸桿菌Btt/gp64 pFAV10分別與相同量的利馬豆食料混合以保持相同濃度的蛋白質(zhì)。使粉紋夜蛾的新生幼蟲吃這些食料，六天后記錄由毒性造成的死亡率。對比pT-7顯示出34%死亡率，而表達125KD Btt/gp64融合蛋白質(zhì)的pFAV10顯示出55%死亡率。這些試驗僅用一種高劑量完成的。當(dāng)觀察時，在Btt/gp64融合食料上生存的幼蟲比較少，有病并且是昏睡的。這些生存的幼蟲照片示于圖11。我們還在相襯光顯微鏡下察看了某些生存的幼蟲的中腸，并在與對比的喂pT7-7的幼蟲比較時，在喂Btt/gp64的幼蟲中觀察到中腸的廣泛損傷，表明了嵌合的Btt/gp64毒素已經(jīng)穿過膜相互作用并干擾了離子流。正在進行組織病理學(xué)的研究以確定腸損傷的確切本質(zhì)。此外，有關(guān)略低濃度Btt/gp64融合蛋白質(zhì)的較早的毒性生物檢定試驗也顯示了這一毒性。這些試驗清楚地表明，Btt/gp64融合蛋白質(zhì)已對鱗翅目幼蟲帶來了新的毒性并可能已使腸造成損傷。
b)用提純的Btt-gp64融合蛋白質(zhì)的內(nèi)含體進行了對煙芽夜蛾(Heliothis Virescens)幼蟲的毒性生物檢定。在大量培養(yǎng)基(5升)中生長相應(yīng)的含有Btt-gp64表達質(zhì)粒pSX12T、pFAV10、pFX7和pFAC13的大腸桿菌細胞。使細胞變成球丸，用pH6.0的0.2M磷酸鈉緩沖液洗滌，并再懸浮于15ml磷酸鹽緩沖液和1mM PMSF中。在French Pressure槽中于11000 Psi下使細胞溶解，并通過用SS34轉(zhuǎn)動體于15000Xg下將不溶的蛋白質(zhì)造球30分鐘使可溶的蛋白質(zhì)分離。將球丸再懸浮在30ml含1mM PMSF的磷酸鹽緩沖液中，在冰上培養(yǎng)5分鐘，并再次離心分離。將內(nèi)含體球丸再懸浮在Renograffin溶液(被稀釋1.8倍)中并將該Renograffin梯度溶液在SW28轉(zhuǎn)動體中以30000Xg離心分離1小時。將Renograffin溶液傾倒通過粗布以除去頂部膠質(zhì)層，將該梯度溶液的上清液用至少2體積冷的10mM EDTA(pH8.0)稀釋。將試樣以15000Xg離心分離30分鐘(SS34轉(zhuǎn)動體)，隨后用10mM EDTA洗滌三次，蒸餾水洗滌一次，將最后的內(nèi)含體球丸重新懸浮在水中以進行毒性生物檢定。
通過布來得福特(Bradford)分析測定各個Btt-gp64融合蛋白質(zhì)內(nèi)含體的蛋白質(zhì)濃度。將40毫克各種蛋白質(zhì)試樣(32.2mg pFAV10)再懸浮在1.0ml水中并加4.0g食料。將新生煙芽夜蛾幼蟲放置在食料上并在28℃培養(yǎng)5天。將各個動物稱重并確定平均重量。
試樣蛋白質(zhì) 平均體重水(對比) 56.2mgpSX12T(對比) 54.8mgpFAV10融合蛋白質(zhì) 16.3mgpFX7 30.7mgpFAc13 38.3mg這些結(jié)果表明，Btt-gp64融合蛋白質(zhì)對鱗翅目煙芽夜蛾幼蟲有毒并且其中pFAV10毒性最大(見圖23)。應(yīng)該注意，在所有融合蛋白質(zhì)內(nèi)含體制劑(pFAV10、pFX7和pFAc13)中，由于蛋白質(zhì)的降解，只有總蛋白質(zhì)的15%是未降解的全長融合的蛋白質(zhì)分子。然而，在對比的pSX12T未融合Btt蛋白質(zhì)中，大約總蛋白質(zhì)的80%是未降解的全長Btt蛋白質(zhì)分子(見圖24)。因而，Btt-gp64融合蛋白質(zhì)對鱗翅目幼蟲比未融合鞘翅目Btt毒素蛋白質(zhì)具有更高的毒性。必須進行附加的精密蛋白質(zhì)工程以進一步提高Btt-gp64融合蛋白質(zhì)對鱗翅目幼蟲的毒性。因此這些試驗證明了這樣的概念，即結(jié)合蛋白質(zhì)領(lǐng)域的昆蟲中腸可增大殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍。
實施例2嵌合BT Cry-Cyt基因的構(gòu)成a.Cry ⅣD基因的克隆化制備大量(maxipreps)的質(zhì)粒pM1[Galjart et al.，Curr.Microbiol.16，171-174(1987)]，然后按照標準方法在CsCl梯度提純(Maniatis.，Supra.)。在滲析后，進行電泳和分光光度分析以保證沒有降解并測定樣品中質(zhì)粒DNA的濃度。然后，使用供應(yīng)商所推薦的緩沖液首先將10μg DNA于37℃(20μl×5)在含50單位EcoRⅤ(Boehringer Mannheim)中消化3小時。在用緩沖液調(diào)節(jié)試樣體積至30μl后，使用供應(yīng)商(Boehringer Mannheim)所推薦的緩沖液將試樣與50μl ClaⅠ在37℃下消化3小時。通過用酚-氯仿-異戊醇的混合物處理以除去蛋白質(zhì)并用冷乙醇在-80℃將試樣DNA沉淀30分鐘(Maniatis et al.Supra)，然后將該DNA以濃度為100ng/μl重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。然后以類似的方式用EcoRⅤ和ClaⅠ將10μl質(zhì)粒pBR322消化。在酚-氯仿-異戊醇萃取和沉淀后，將DNA重新懸浮在20μl無菌二次蒸餾水中。通過在供應(yīng)商(Boehringer Mannheim)所推薦的緩沖液中在37℃培養(yǎng)15分鐘，在50℃培養(yǎng)30分鐘，使用3單位牛犢腸堿性磷酸酶以最終體積為50μl進行DNA片段終端的脫磷酸作用。在再添加3單位酶后，重復(fù)培養(yǎng)周期。通過3次酚-氯仿-異戊醇萃取除去酶，用冷乙醇沉淀DNA并以濃度為100ng/μl重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。使用T4DNA連接酶(Boer-hinger Mannheim)于12℃進行連接15小時。在插入物(被EcoRⅤ和ClaⅠ所消化的pM1)和載體(被EcoRⅤ和ClaⅠ所消化的pBR322)之間的摩爾比為5。通過瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測連接。制備感受的細菌細胞(大腸桿菌菌株JM105)，并使用標準方法用連接質(zhì)粒使其轉(zhuǎn)化。然后使該細菌生長1小時，并在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB-瓊脂培養(yǎng)基(Maniatis et al.Supra)上平板培養(yǎng)。將細菌在37℃下生長15小時，個別地收集重組體克隆并在相同位置在含有LB瓊脂和氨芐青霉素的平皿上，和在含有LB瓊脂和四環(huán)素(15μg/ml)的另一平皿上平板培養(yǎng)。由于克隆化位點是位于抗四環(huán)素基因范圍內(nèi)，所以載有插入物的克隆是對四環(huán)素敏感的。個別地生長四環(huán)素敏感-抗氨芐青霉素克隆。使用標準方法得到少量質(zhì)粒DNA(“minipreps”)。通過用EcoRⅠ消化和用EcoRⅤ和ClaⅠ二次消化，篩分這些DNA以選擇載有含基因Cry IVD的片段的重組體pBR322質(zhì)粒。稱作pBGG35的所選擇的克隆通過大量制備(maxiprep)步驟而大量提純并在-20℃下貯存。
b.Cyt A基因的克隆化使用類似于上述對這一酶所利用的推薦的緩沖液的步驟和條件，用EcoRⅠ將質(zhì)粒pM1消化。在用酚-氯仿-異戊醇分離蛋白質(zhì)后，用冷乙醇沉淀DNA，并以100ng/μl的濃度重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。用EcoRⅠ消化大腸桿菌質(zhì)粒載體pBLUESCRIPT KS(Stratagene)，并如上述將該末端脫除磷酸。在萃取蛋白質(zhì)和沉淀DNA后，將DNA以濃度為100ng/μl重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。按著上述步驟進行細菌的連接和轉(zhuǎn)化，不同的是在這一場合所用的菌株是大腸桿菌菌株XLI Blue。通過添加X GAL(40μg/ml)和IPTG(1μM)進行重組體克隆的選擇。由于該聚合銜接物位于Lac Z基因范圍內(nèi)，含有重組體質(zhì)粒的細菌在有IPTG存在時降低了其降解X GAL的能力，因而會產(chǎn)生白色的菌落，而不是用天然質(zhì)粒得到蘭色菌落。在分離每種重組體克隆后，制得少量(minipreps)DNA，并通過利用類似上述的那些條件，每次使用所推薦的緩沖液，用BamHⅠ，EcoRⅤ和PstⅠ(Boehinger Mannheim)消化使克隆篩分。將在二個不同定向上載有含基因CytA的EcoRⅠ插入物的二種重組體克隆命名為pBBLe14e和pBBLe15e，通過大量制備(maxiprep)方法大量制備這兩種克隆的DNA。然后用10單位EcoRⅤ消化2μg克隆pBBLe15e以除去EcoRⅠ插入物的非必要片段，然后按上面所述進行連接而不用任何預(yù)先的脫除磷酸步驟。其后，采用相同的步驟用連接的質(zhì)粒使XL1 Blue大腸桿菌細菌轉(zhuǎn)化并在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂上平板培養(yǎng)。通過用EcoRⅤ和BamHⅠ消化(如上所述)鑒別一種不含EcoRⅤ片段的克隆并命名為pBBLe15e RV。通過大量制備步驟提純這一重組體質(zhì)粒。
c.pBLUESCRIPT KS中截形Cry ⅣD基因的克隆化利用供給酶的緩沖液用50單位HaeⅢ(Boehringer Mannheim)/20μl(5Ⅹ)在37℃將10μg量的質(zhì)粒pBG35消化3小時。在用瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測消化后，用酚-氯仿-異戊醇混合液萃取蛋白質(zhì)并用冷乙醇沉淀DNA。然后將DNA以濃度為100ng/ml重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。這一用HaeⅢ對pBG35的消化產(chǎn)生大量的片段，一種載有Cry ⅣD基因的約3.5kbp的片段在終止密碼子以及這一基因的啟動子的上游截去32bp。將10μg pBLUES-CRIPT KS以20μl(5Ⅹ)用50單位SmaⅠ于25℃消化3小時，然后用酚-氯仿-異戊醇處理并用冷乙醇沉淀DNA。如前所述進行脫磷酸作用并最終將DNA以濃度100ng/μl重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。使用上述步驟，將DNA插入物(用HaeⅢ消化的pBG35)在載體(用SmaⅠ消化的pBLUESCRIPT KS)中連接，使用插入物和載體之間的摩爾比為5。該重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成感受的XLI Blue大腸桿菌。將該細菌置于含有氨芐青霉素、IPTG和XGAL的LB瓊脂上平板培養(yǎng)。單獨收集該處的白色菌落并小量制備。通過用StyⅠ(這一酶不截割pBLUESCRIPT KS，但在Cry ⅣD基因ORF上有其一個分裂位點)和EcoRⅠ消化而篩分這些重組體克隆，以監(jiān)測定向。在這一基礎(chǔ)上選擇名為pBBLh13S的一種克隆并通過大量制備方法制得DNA。
d.Cry ⅣD3′末端和SmaⅠ消化的pBLUESCRIPT KS的5′末端之間融合的定序為了保證Cry ⅣD基因和pBLUESCRIPT KS之間的融合是在編碼組中。利用鏈終止方法使DNA定序。所用的定序體系是SEQUENASE型2.0(美國生化公司)。使用隨酶提供的小冊子中所述方法用雙線DNA進行定序。使用定序M13逆引子(5′-AACAGCTATGACCATG-3′)以引發(fā)用dATP-35S(Amersham)標記的補充線的合成。用BRL型S2定序設(shè)備分離這些片段。將干燥凝膠放置在Kodax X-OMAT底片上并在曝光過夜后讀出序列。在補充線上讀得的序列如下5′-∥-CCTGCAGCCCCCGATTCTTTT-∥-3′。這一序列相應(yīng)于序列5′-∥-AAAAGAATCGGGGGCTGCAGG-∥-3′的相反線，在此時5′-∥-GGGGG-∥3′相應(yīng)于HaeⅢ位點(5′-GG/CC-3′)和SmaⅠ位點(5′-CCC/GGG-3′)之間的融合。
e.Gyt A克隆成含Cry Ⅳ D碼組中的pBLUESCRIPT KS。
將10μg量的pBBLe15eRV在供應(yīng)商(Boehinger Mannheim)所推薦的緩沖液中用50單位HaeⅢ/20μl(5X)在37℃消化3小時。按已述方法進行酚萃取和DNA沉淀，并將DNA以濃度為100ng/μl重新懸浮在無菌二次蒸餾水中。將10μg pBBLh13 S在類似于上述的以及為酚萃取乙醇沉淀和脫除磷酸作用的條件下，用50單位EcoRV于20μl(5X)中消化。重新懸浮在無菌二次蒸餾水中的DNA最終濃度也為100ng/μl。使用2單位T4DNA連接酶和所推薦的緩沖液在12℃下進行連接15小時。插入物(用HaeⅢ消化的pBBLe15e RV)和載體(用SmaⅠ消化的pBBLh 13S)之間的摩爾比為5。通過瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測連接，并如上所述使感受的XL1 Blue大腸桿菌轉(zhuǎn)化并在含氨芐青霉素的LB瓊脂上平板培養(yǎng)。在由供應(yīng)商(Boehringer Mannheim)專門說明的條件下使用Sty Ⅰ.PstⅠ和BamHⅠ將在正確定向上載有Cry ⅣD和Cyt A的重組體克隆篩分。
盡管已經(jīng)提到了特別的實施方案，但應(yīng)當(dāng)理解，不能認為本發(fā)明限于這些方案。保護范圍只應(yīng)該根據(jù)待批的權(quán)利要求法律上的范圍來限定。
權(quán)利要求
1.一種增大殺蟲蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域的宿主范圍或毒性的方法，通過在其宿主范圍內(nèi)與昆蟲的腸上皮相互作用發(fā)揮其活性，該方法包括借助于可結(jié)合在靶昆蟲的腸上皮上的靶蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域，將所述殺蟲蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域傳送給所述的靶昆蟲的腸上皮。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域是從除蘇蕓金芽孢桿菌以外的來源產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶昆蟲是在所述殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍內(nèi)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶昆蟲是在所述殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍以外。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的殺蟲蛋白質(zhì)是一種殺蟲結(jié)晶蛋白質(zhì)或具有殺蟲活性的片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的殺蟲蛋白質(zhì)是蘇蕓金芽孢桿菌(B.thuringiensis)的結(jié)晶蛋白質(zhì)，或其具有殺蟲活性的片段。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的殺蟲蛋白質(zhì)是鞘翅目種的蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的殺蟲蛋白質(zhì)是蘇蕓金芽孢桿菌亞種tenebriosis結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述的靶蛋白質(zhì)是病毒表面蛋白質(zhì)或其具有結(jié)合昆蟲腸能力的片段。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的病毒表面蛋白質(zhì)是一種核多角體病病毒胞外態(tài)的表面糖蛋白。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的表面糖蛋白是苜宿銀紋夜蛾核多角體病病毒(Ac NPV)胞外態(tài)的gp 64的糖蛋白。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述的病毒蛋白質(zhì)是一種植物病毒的表面外殼蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的植物病毒是一種luteovirus。
14.一種增大殺蟲蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域的宿主范圍或毒性的方法，通過在其宿主范圍內(nèi)與昆蟲的腸上皮相互作用發(fā)揮其活性，該方法包括借助于對膜的脂類組分具有高親和性的靶細菌蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域?qū)⑺鰵⑾x蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域傳送給靶昆蟲的腸上皮。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的殺蟲蛋白質(zhì)是一種蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片段。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的殺蟲蛋白質(zhì)包括蘇蕓金芽孢桿菌tenebriosis結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述的細菌蛋白質(zhì)是一種蘇蕓金芽孢桿菌的約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)或其對膜的脂類組分具有高親合性的片段。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的細菌蛋白質(zhì)蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約25-KDA Cyt A蛋白質(zhì)，約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的抗蛋白酶區(qū)域。
19.權(quán)利要求1或14的方法，其中以包含所述殺蟲蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域和所述靶蛋白質(zhì)的嵌合蛋白質(zhì)形式將所述的殺蟲蛋白質(zhì)傳送給所述靶昆蟲的腸上皮。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)包括蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片段以及核多角體病病毒胞外態(tài)的表面糖蛋白或其具有結(jié)合腸能力的片段。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)包括蘇蕓金芽孢桿菌tenebriosis結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域和苜宿銀紋夜蛾核多角體病病毒(AcNPV)胞外態(tài)的gp64糖蛋白。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)包括蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域和蘇蕓金芽孢桿菌的約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)或其對膜的脂類組分具有高親和性的片段。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)包括蘇蕓金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域和和蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約25-KDA Cyt A 蛋白質(zhì)，約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的抗蛋白酶區(qū)域。
24.DNA，包括一起編碼一種嵌合蛋白質(zhì)的第一和第二DNA片段，該嵌合蛋白質(zhì)包括被所述第一DNA片段編碼的，在其宿主范圍內(nèi)通過與昆蟲腸上皮相互作用發(fā)揮所具有的殺蟲活性的第一蛋白質(zhì)區(qū)域和第二，被所述第二DNA片段編碼的，能結(jié)合在靶昆蟲的所述腸上皮上的蛋白質(zhì)區(qū)域，被所述第一DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)區(qū)域不能或不能有效地結(jié)合在該腸上皮上。
25.權(quán)利要求24的DNA，其中所述第一DNA片段編碼一種殺蟲結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片段。
26.權(quán)利要求25的DNA，其中所述第一DNA片段編碼一種蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片段。
27.權(quán)利要求26的DNA，其中所述第一DNA片段編碼鞘翅目種蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
28.權(quán)利要求27的DNA，其中所述第一DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種tenebriosis結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
29.權(quán)利要求28的DNA，其中所述的第二DNA片段編碼核多角體病毒胞外態(tài)的表面糖蛋白或其具有結(jié)合昆蟲腸能力的片段。
30.權(quán)利要求29的DNA，其中所述的第二DNA片段編碼苜宿銀紋夜蛾核多角體病病毒(AcNPV)胞外態(tài)的gp64糖蛋白。
31.權(quán)利要求24的DNA，其中所述的第一DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis的約72KD結(jié)晶蛋白質(zhì)。
32.權(quán)利要求31的DNA，其中所述的第一DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis的約72KD結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
33.權(quán)利要求32的DNA，其中所述的第二DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)或其對細胞膜的脂類組分具有強親和性的片段。
34.權(quán)利要求33的DNA，其中所述的第二DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni約25-KDA Cyt A蛋白質(zhì)，約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的抗蛋白酶區(qū)域。
35.一種表達載體，包括一個含權(quán)利要求24DNA的表達盒。
36.權(quán)利要求35的表達載體，其中所述的表達盒在轉(zhuǎn)錄方向上包括一個啟動子區(qū)，所述第一和第二DNA片段的融合，和一個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，所述表達盒的片段是操作結(jié)合的。
37.權(quán)利要求36的表達載體，其中所述的啟動子和所述的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是細菌或噬菌體起源的。
38.權(quán)利要求37的表達載體，其中所述的第一DNA片段編碼一種殺蟲結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片段。
39.權(quán)利要求38的表達載體，其中所述的第一DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片斷。
40.權(quán)利要求39的表達載體，其中所述的第一DNA片斷編碼鞘翅目種蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
41.權(quán)利要求40的表達載體，其中所述的第一DNA片斷編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種tenebriosis結(jié)晶蛋白質(zhì)的毒性區(qū)域。
42.權(quán)利要求39的表達載體，其中所述的第一DNA片段編碼核多角體病病毒胞外態(tài)的表面糖蛋白或其具有結(jié)合腸能力的片段。
43.權(quán)利要求42的表達載體，其中所述的第二DNA片段編碼苜宿銀紋夜蛾核多角體病病毒(AcNPV)胞外態(tài)的gp64糖蛋白。
44.權(quán)利要求43的表達載體，另外還包括可使其在細菌中復(fù)制和選擇的序列。
45.權(quán)利要求44的表達載體，選自由質(zhì)粒pFAV10、pFX7和pFAC13組成的組。
46.權(quán)利要求43的表達載體，其中所述的第二DNA片段編碼植物病毒的表面外殼蛋白質(zhì)。
47.權(quán)利要求46的表達載體，其中所述的植物病毒是luteo-virus。
48.權(quán)利要求39的表達載體，其中所述的第二DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約27.3-KDA溶解細胞蛋白質(zhì)或其對膜的脂類組分具有高親合性的片段。
49.權(quán)利要求48的表達載體，其中第二DNA片段編碼蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約25-KDA Cyt A蛋白質(zhì)，約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的抗蛋白酶區(qū)域。
50.權(quán)利要求49的表達載體，另外包括可使其在細菌中復(fù)制和選擇的序列。
51.嵌合蛋白質(zhì)，包括第一蛋白質(zhì)節(jié)片，該節(jié)片在其宿主范圍內(nèi)通過與昆蟲的腸上皮相互作用具有發(fā)揮的殺蟲活性，以及可以結(jié)合在所述第一蛋白質(zhì)節(jié)片不能或不能有效結(jié)合在靶昆蟲腸上皮上的第二靶蛋白質(zhì)節(jié)片。
52.權(quán)利要求51的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述的第一蛋白質(zhì)節(jié)片是蘇蕓金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白質(zhì)或其具有殺蟲活性的片段。
53.權(quán)利要求52的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述的第二蛋白質(zhì)節(jié)片是核多角體病病毒胞外態(tài)的表面糖蛋白或其具有結(jié)合昆蟲腸能力的片段。
54.權(quán)利要求53的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述的表面糖蛋白是苜宿銀紋夜蛾核多角體病病毒(ACNPV)胞外態(tài)的gp64糖蛋白。
55.權(quán)利要求54的嵌合蛋白質(zhì)，具有示于圖16、圖17或圖18的氨基酸序列以及等位基因，氨基酸缺失，插入，替代，轉(zhuǎn)化或其外加變異體。
56.嵌合蛋白質(zhì)，包括一蛋白質(zhì)節(jié)片，該節(jié)片在其宿主范圍內(nèi)通過與昆蟲的腸上皮相互作用而具有發(fā)揮的殺蟲活性，以及第二，對膜的脂類組分具有高親合性的靶細菌蛋白質(zhì)節(jié)片。
57.權(quán)利要求56的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述的第二靶蛋白質(zhì)節(jié)片是蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)或其對膜的脂類組分具有高親合性的片段。
58.權(quán)利要求57的嵌合蛋白質(zhì)，其中所述的第二蛋白質(zhì)節(jié)片是蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis或morrisoni的約25-KDACyt A蛋白質(zhì)，約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的抗蛋白酶區(qū)域。
59.權(quán)利要求58的嵌合蛋白質(zhì)，是一種通過由蘇蕓金芽孢桿菌亞種morrisoni的Cry IVD基因編碼的約72-KDa蛋白質(zhì)與蘇蕓金芽孢桿菌亞種israelensis的約25-KDa Cyt A蛋白質(zhì)，約27.3-KDA細胞溶解蛋白質(zhì)的抗蛋白酶區(qū)域融合得到的約97-KDa蛋白質(zhì)。
60.制備權(quán)利要求51或權(quán)利要求56嵌合蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在一個重組體宿主細胞中表達包括一起編碼所述嵌合蛋白質(zhì)的第一和第二DNA片段的DNA序列，所述重組體宿主細胞是微生物或用含所述DNA序列的一種表達載體轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)物。
61.權(quán)利要求60的方法，另外包括回收所述嵌合蛋白質(zhì)的步驟。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述的微生物是細菌。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述的細菌是大腸桿菌。
64.用權(quán)利要求35的表達載體轉(zhuǎn)化的重組體微生物。
65.權(quán)利要求64的重組體微生物是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及增大殺蟲蛋白質(zhì)的宿主范圍或毒性的方法，通過在其宿主范圍內(nèi)昆蟲的腸上皮相互作用發(fā)揮其活性，該方法通過借助于另外的可結(jié)合在靶昆蟲的腸上皮上的靶蛋白質(zhì)將殺蟲蛋白質(zhì)傳送到靶昆蟲的腸上皮上。靶蛋白質(zhì)例如可以是病毒源或有選擇地可以是細菌蛋白質(zhì)或?qū)毎さ闹惤M分具有高親合性的蛋白質(zhì)區(qū)域。
文檔編號C07K14/325GK1059760SQ91103590
公開日1992年3月25日 申請日期1991年5月3日 優(yōu)先權(quán)日1990年5月3日
發(fā)明者納塔拉珍·西瓦蘇布拉馬尼安, 布賴恩·A·費代里奇 申請人:加州大學(xué)評議會