專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫原性組合物和疫苗，更具體而言，但不限于初免-加 強(qiáng)免疫策略中使用的免疫原性組合物、疫苗和試劑盒。本發(fā)明還涉及使 用所述免疫原性組合物、疫苗或試劑盒產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
疫苗傳統(tǒng)上由減活的病原體、完全滅活的生物體或滅活的毒素構(gòu)成。 在多數(shù)情況下，這些疫苗能成功誘導(dǎo)基于抗體介導(dǎo)的應(yīng)答的免疫保護(hù)。
然而，很多感染和惡性疾病，例如，HIV、 HCV、 TB、癌和瘧疾，需要 誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)。盡管研發(fā)疫苗的新方法已有進(jìn)展，如重組蛋 白亞基、合成肽、蛋白多糖復(fù)合物、DNA疫苗和使用模擬傳染性致病劑 的抗原性的重組病毒載體，但是普遍的問(wèn)題是疫苗的免疫原性通常很差。 因此，持續(xù)需要研發(fā)增強(qiáng)疫苗免疫原性的方法。
初免-加強(qiáng)接種通常用于增強(qiáng)疫苗免疫原性，即，對(duì)個(gè)體接種超過(guò)一 次，以引起再次免疫應(yīng)答。在初免-加強(qiáng)接種中，"初免"階段，即，第一 次接種步驟，包括將抗原提呈到初始免疫細(xì)胞，并產(chǎn)生記憶性B細(xì)胞和 T細(xì)胞。沒有后續(xù)的抗原提呈，這些記憶性細(xì)胞的數(shù)量會(huì)減少。此外， 單次免疫經(jīng)常誘導(dǎo)很小的應(yīng)答以至于還要額外免疫。因此，為了提高產(chǎn) 生免疫應(yīng)答的能力，需要補(bǔ)加"加強(qiáng)"接種，以產(chǎn)生更多的記憶性B細(xì)胞 和T細(xì)胞，如果接種的個(gè)體接下來(lái)接觸抗原，就可以提供增強(qiáng)和加速的 再次應(yīng)答。
初免-加強(qiáng)策略已應(yīng)用很多年，例如用于接種麻疹和腮腺炎疫苗。最 近，異源初免-加強(qiáng)接種，即在加強(qiáng)中使用不同抗原，顯示出在誘導(dǎo)CMI 應(yīng)答方面比使用一種載體更有效。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的目的是，提供一種用于加強(qiáng)疫苗中的免疫原
7性組合物，其能提供比無(wú)論本文是否提及的本領(lǐng)域公開的疫苗更大的效 力，還提供一種提高初免-加強(qiáng)接種功效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原 性組合物，所述組合物包括抗原和對(duì)淋巴居住的樹突狀細(xì)胞特異性的靶 向部分。
本發(fā)明者已確定，盡管初始和記憶性殺傷(CD8+) T細(xì)胞均能應(yīng)答淋 巴居住的樹突狀細(xì)胞(DC)提呈的病毒性抗原，但令人驚異的是，只有初 始細(xì)胞能有效應(yīng)答組織來(lái)源的DC。雖然記憶性殺傷T細(xì)胞能有效應(yīng)答淋 巴居住的DC提呈的抗原，但是應(yīng)答組織來(lái)源的DC提呈的抗原卻很差。 因此，本發(fā)明者提出，使抗原靶向淋巴居住的DC會(huì)提高加強(qiáng)接種的效 率。這尤其令人驚異，因?yàn)橐恢闭J(rèn)為記憶性T細(xì)胞比初始T細(xì)胞對(duì)刺激 能更好應(yīng)答且更敏感。
在第二方面，本發(fā)明提供一種含有根據(jù)本發(fā)明第一方面的免疫原性 組合物的加強(qiáng)疫苗。
在第三方面，本發(fā)明提供一種包括第一疫苗和含有根據(jù)本發(fā)明第一 方面的免疫原性組合物的加強(qiáng)疫苗的試劑盒。
在第四方面，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)個(gè)體中免疫應(yīng)答的方法，所述方 法包括給予所述個(gè)體含有根據(jù)本發(fā)明第一方面的免疫原性組合物的加強(qiáng) 接種。
在第五方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第一方面的免疫原性組合物在 制造用于給予個(gè)體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
在第六方面，本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原 性組合物，所述組合物包括抗原和對(duì)組織來(lái)源的樹突狀細(xì)胞特異性的靶 向部分。
本發(fā)明者認(rèn)為，只有初始細(xì)胞才能有效應(yīng)答組織來(lái)源的DC，這使他 們提出，使抗原耙向組織來(lái)源的DC可針對(duì)病原體提供增強(qiáng)的保護(hù)。如 果病原體通常誘導(dǎo)不擅于識(shí)別和抵抗病原體的特異性，則通過(guò)使適當(dāng)類
8型的抗原耙向組織來(lái)源的DC，即可促進(jìn)新特異性的擴(kuò)增，而不必由原(無(wú) 效的)特異性競(jìng)爭(zhēng)。
在第七方面，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)個(gè)體中免疫應(yīng)答的方法，所述方 法包括給予個(gè)體初免或加強(qiáng)接種，所述接種含有根據(jù)本發(fā)明第六方面的 免疫原性組合物。
在第八方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第六方面的免疫原性組合物在 制造用于給予個(gè)體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物中的用途。


圖la顯示了表達(dá)活化標(biāo)記CD25、 CD69、 CD44和CD62L的初始和 記憶性CD8+ T細(xì)胞的表型分析。
圖lb顯示了用對(duì)HSV糖蛋白B (gB)特異性的初始或記憶性gBT-I CD8+ CSFE-標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞培養(yǎng)的DC亞群的T細(xì)胞增殖分析的結(jié) 果。該DC亞群來(lái)源于之前3天感染W(wǎng)SN-gB的小鼠。
圖lc顯示了用CFSE-標(biāo)記的內(nèi)源性記憶性CD8+ T細(xì)胞培養(yǎng)的DC 亞群的T細(xì)胞增殖分析的結(jié)果。記憶性T細(xì)胞來(lái)源于之前3個(gè)月感染 WSN-gB的小鼠(上圖)或之前6個(gè)月感染HKx31/PR8的小鼠(下圖)。
圖2a顯示了用對(duì)HSV糖蛋白B (gB)特異性的初始gBT-I CD8+ CSFE-標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞培養(yǎng)的DC的T細(xì)胞增殖分析的結(jié)果。DC亞 群來(lái)源于在不同時(shí)間感染W(wǎng)SN-gB的小鼠。
圖2b是通過(guò)直接體外分析繪制的由純化的DC亞群提呈到T細(xì)胞的 抗原提呈程度的示意圖。該圖還顯示了圖2c和圖2d中應(yīng)用的方案。
圖2c顯示了轉(zhuǎn)移到未感染的小鼠(中間圖)或之前10天感染W(wǎng)SN-gB 的小鼠(上圖)或之前3天感染W(wǎng)SN-gB的小鼠(下圖)中的CFSE-標(biāo)記的初 始或記憶性gBT-I CD8+ T細(xì)胞分化的流式細(xì)胞法分析。
圖3a和圖3b顯示了初始和記憶性T細(xì)胞的混合培養(yǎng)物對(duì)肺部DC (圖3a)和淋巴居住的DC(圖3b)的應(yīng)答。
圖3c顯示了病毒感染3天后，初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)來(lái)自縱膈淋巴結(jié)(MLN)的不同DC亞型混合物的應(yīng)答。
圖3d顯示了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)SSIEFARL肽涂布的來(lái)自MLN 的CD8 DC和CDllbT)C的應(yīng)答。
圖3e顯示了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)SSIEFARL肽涂布的來(lái)自皮膚引 流LN的CD8+和CD8T)EC205+ (Langerhans細(xì)胞和真皮的)DC的應(yīng)答。
圖3f顯示了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)SSIEFARL肽涂布的來(lái)自流感感 染小鼠的淋巴結(jié)居住的DC和肺部來(lái)源的DC的CD8+和CD8X:Dllb—DC
的應(yīng)答。
每個(gè)圖均顯示了流式細(xì)胞法計(jì)數(shù)的增殖的gBT-ICD8+T細(xì)胞。每個(gè) 數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。
圖4顯示了 CD8+ DC (黑線)和肺部來(lái)源的DC (CD8-CDllb'，灰色) 的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)輪廓圖，這兩種DC均富集自之前3天感染流感HKx31 病毒的小鼠的縱膈LN。用抗CDllc、CDllb和CD8的抗體以及抗B7-H1、 B7-H2、 B7-DC、 B7-RP、 B7-l、 B7-2或BTLA-4的抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。
圖5顯示了純化的CD8aDC或CDllbX:D8l巿部來(lái)源的DC，它們來(lái) 自在CD70的1 mg/ml阻斷性單克隆抗體(克隆體FR70)存在或不存在的 條件下用CFSE-標(biāo)記的初始或記憶性gBT-I培養(yǎng)的WSN-gB感染小鼠的 縱膈淋巴結(jié)。60h后，通過(guò)流式細(xì)胞法來(lái)估算增殖。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于同 型對(duì)照增殖的降低，并從3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)來(lái)收集數(shù)據(jù)。需要指出的是，因 為記憶性T細(xì)胞不應(yīng)答肺部來(lái)源的DC，所以沒有測(cè)定(n.d.)該值。
圖6顯示了在與小鼠的記憶性或初始T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中增殖的記憶性 或初始T細(xì)胞的數(shù)量，該小鼠鼻內(nèi)感染W(wǎng)SN-gB并在10天后進(jìn)行組織分析 (圖6a 圖6c)，或靜脈內(nèi)感染并在8天后分析(圖6d)。每個(gè)圖的上方列出了 競(jìng)爭(zhēng)群對(duì)應(yīng)答群。y軸的數(shù)字示出了在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測(cè)的應(yīng)答群的數(shù)量。 x軸的數(shù)字示出了加到小鼠中的競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞的數(shù)量。所示數(shù)據(jù)顯示了各個(gè)實(shí) 驗(yàn)的結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)至少兩個(gè)小鼠。在圖6e中，小鼠未經(jīng)處理(左凰， 沒^)或用2.2x106 CD44highCD62higH^l^ftCD8+ T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移，該細(xì)胞 從之前至少12周感染流感HKx31的小鼠純化得到(左房，記憶絲潘應(yīng)；-
勒。24h后，使小鼠鼻內(nèi)感染HKx31。
IO天后，對(duì)脾臟進(jìn)行對(duì)DbNP366-374或DbpA224-233特異性的內(nèi)源性(左勒或轉(zhuǎn)移的記憶性(吝勒CD8+ T細(xì)胞的
數(shù)量分析。從4個(gè)實(shí)驗(yàn)收集數(shù)據(jù)，每個(gè)圓形代表一個(gè)小鼠。在圖6f中，小 鼠未經(jīng)處理(左厫，沒茍或用2.2x106 0044^1^0621^記憶性008+ T細(xì)胞 過(guò)繼轉(zhuǎn)移，該細(xì)胞從之前至少12周感染流感HKx31的小鼠純化得到(左
記/Z絲潘應(yīng)；^席勒。24h后，使小鼠靜脈內(nèi)感染HKx31。 8天后， 對(duì)脾臟進(jìn)行對(duì)DbNP^.^或DbpA^.^特異性的內(nèi)源性(左房/玄勒或轉(zhuǎn)移 的記憶性(勿坊勤CD8+T細(xì)胞的數(shù)量分析。初始未感染的小鼠的數(shù)值(吝 勒。從2個(gè)實(shí)驗(yàn)收集數(shù)據(jù)，每個(gè)圓形代表一個(gè)小鼠。
圖7顯示了用對(duì)gB特異性的gBT-I CD8+ CFSE-標(biāo)記的初始CD8+ T 細(xì)胞(上排)或不同類型的記憶性轉(zhuǎn)基因CD8+ T細(xì)胞(中間兩排)或內(nèi)源性 CD8+ T細(xì)胞(下排)共培養(yǎng)的純化DC的流式細(xì)胞法分析。矩形圖代表具 有相似結(jié)果的2個(gè)實(shí)驗(yàn)并顯示了 T細(xì)胞群的增殖。每個(gè)圖的增殖細(xì)胞的 百分比和數(shù)量(括號(hào))也被示出。
具體實(shí)施例方式
參與T細(xì)胞應(yīng)答的DC首先捕獲外周組織的抗原，然后遷移到引流 淋巴的器官，為T細(xì)胞初免提呈抗原。DC是免疫系統(tǒng)所用的最有效的抗 原提呈細(xì)胞(APC)。
DC是由多個(gè)亞群構(gòu)成的異源細(xì)胞類型。有些DC永久存在于淋巴器 官內(nèi)(淋巴居住的)，而有些DC(組織來(lái)源的)卻被發(fā)現(xiàn)是在非淋巴組織內(nèi) 并且只有在抗原捕獲過(guò)程中才遷移到局部淋巴結(jié)內(nèi)。
DC是幾種免疫應(yīng)答的有效APC。不同發(fā)育或活化階段的不同DC 亞群和DC表達(dá)不同的表面分子，并且分泌細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子選擇 性地決定誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型。例如，肺部感染流感病毒后，兩類樹突 狀細(xì)胞負(fù)責(zé)活化初始病毒特異性的殺傷T細(xì)胞[Bdz, GT.等人，PNAS, vol. 101, no. 23 p 8670-8675]。這些樹突狀細(xì)胞經(jīng)鑒定為CD205+CD1 lb-CD8oT (肺部來(lái)源的)和CD205+CDllb'CD8a+ (淋巴居住的)樹突狀細(xì)胞。
因?yàn)閾?jù)報(bào)道，記憶性T細(xì)胞的共刺激需求比初始T細(xì)胞少，所以本 發(fā)明者研究在肺部感染流感病毒過(guò)程中，記憶性T細(xì)胞是否可以應(yīng)答初
11始T細(xì)胞識(shí)別的兩種類型之外的DC亞群。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)記憶性T 細(xì)胞沒有初始T細(xì)胞應(yīng)答的范圍寬。記憶性T細(xì)胞不能應(yīng)答肺部來(lái)源的 DC (CD8')的抗原提呈而增殖，但是的確應(yīng)答淋巴居住的DC (CD8+)的抗 原提呈。無(wú)論通過(guò)接觸病毒感染在體外或體內(nèi)產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞，都是 這種情形。
為定量評(píng)價(jià)肺部來(lái)源的DC對(duì)初始和記憶性T細(xì)胞剌激能力的差異 而進(jìn)行了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)揭示了記憶性T細(xì)胞對(duì)肺部來(lái)源的DC的 敏感性減少了大約10倍。因而，盡管肺部來(lái)源的DC在感染過(guò)程中不能 刺激記憶性T細(xì)胞對(duì)流感病毒作出應(yīng)答，但卻不能將此歸因于DC細(xì)胞 群完全不能活化記憶性T細(xì)胞，而是因?yàn)榇碳つ芰p少了 10倍。然而， 實(shí)際上，這種差異可能意味著當(dāng)在肺部來(lái)源的DC上提呈時(shí)，大多數(shù)自 然刺激對(duì)刺激記憶性T細(xì)胞無(wú)效。
本發(fā)明者考慮過(guò)是否這些發(fā)現(xiàn)可擴(kuò)展到肺部來(lái)源的DC之外的DC。 他們將其與皮膚來(lái)源的DC的抗原提呈相比較，再次發(fā)現(xiàn)，盡管淋巴居 住的DC刺激初始和記憶性細(xì)胞的程度相同，但是皮膚來(lái)源的DC刺激記 憶性T細(xì)胞的有效程度要少10倍。
本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在競(jìng)爭(zhēng)性記憶性細(xì)胞時(shí)，遷移的(組織來(lái)源的) DC對(duì)初始T細(xì)胞刺激至關(guān)重要。這就解釋了為何盡管存在預(yù)先形成的對(duì) 肺部流感病毒感染的記憶，但是還可以檢測(cè)到初始T細(xì)胞應(yīng)答。
因此，本發(fā)明者提出，加強(qiáng)疫苗應(yīng)當(dāng)使抗原靶向淋巴居住的DC以 便刺激記憶性T細(xì)胞。因?yàn)橛洃浶訲細(xì)胞應(yīng)答遷移的DC的能力弱，組 織來(lái)源的DC處理的抗原將不能刺激記憶性T細(xì)胞，所以任何針對(duì)非淋 巴居住的DC的抗原在加強(qiáng)疫苗中均被大大浪費(fèi)。本發(fā)明提高了加強(qiáng)接 種中的效率。
研究還顯示出，初始T細(xì)胞比記憶性T細(xì)胞對(duì)組織來(lái)源的DC的刺 激更敏感，與初始T細(xì)胞應(yīng)答淋巴居住的DC的程度相同。這就質(zhì)疑了 長(zhǎng)久以來(lái)的觀點(diǎn)，即記憶性T細(xì)胞的共刺激需求比初始T細(xì)胞少。
本發(fā)明者提出，本發(fā)明的相反角度也可能是正確的，即盡管之前已 產(chǎn)生了對(duì)抗原的初免免疫應(yīng)答并且存在記憶性細(xì)胞，但是特異性地使淋巴居住的DC不附著抗原，而使抗原靶向組織來(lái)源的DC，可有效產(chǎn)生初
始免疫應(yīng)答。如果抗原(例如病原體)通常誘導(dǎo)不擅于識(shí)別和抵抗病原體的 特異性，則可能特別有利。
本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物。本文所述的免疫原性組合物是任 何能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物或制劑。
免疫應(yīng)答是機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原的反應(yīng)。這種應(yīng)答可中和或消除抗原并 對(duì)未來(lái)遭遇的微生物或毒素提供保護(hù)性免疫。
本文可交替使用的術(shù)語(yǔ)"免疫應(yīng)答"或"免疫"，指的是誘導(dǎo)體液的(即，
B細(xì)胞)和/或細(xì)胞的(即，T細(xì)胞)應(yīng)答。適當(dāng)?shù)兀赏ㄟ^(guò)測(cè)量對(duì)抗原引入 宿主作出應(yīng)答的、免疫動(dòng)物血清內(nèi)存在的抗原特異性抗體，來(lái)評(píng)價(jià)體液 免疫應(yīng)答?？赏ㄟ^(guò)免疫哺乳動(dòng)物血清的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，或通過(guò)免疫 動(dòng)物血清的微量中和試驗(yàn)，來(lái)評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答?？衫肅TL試驗(yàn)來(lái)測(cè)量從 免疫動(dòng)物脾臟或其他器官分離出來(lái)的淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明的免疫原性組合物提供殺傷T細(xì)胞或CTL應(yīng)答，并可任選地 提供輔助性T細(xì)胞應(yīng)答。還可提供體液應(yīng)答。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，體液應(yīng)答(抗體應(yīng)答)是通過(guò)產(chǎn)生B 細(xì)胞而產(chǎn)生免疫保護(hù)，B細(xì)胞在應(yīng)答抗原的過(guò)程中分泌抗體(與免疫細(xì)胞 的直接作用或細(xì)胞免疫應(yīng)答不同)。抗體是B細(xì)胞在應(yīng)答抗原過(guò)程中產(chǎn)生 的分子。當(dāng)抗體附著抗原時(shí)，它們幫助破壞帶有抗原的病原體(中和應(yīng)答)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是免疫細(xì)胞直 接作用而提供的免疫保護(hù)。細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答包括指導(dǎo)或參與免疫防御的T 細(xì)胞，SP，白血細(xì)胞(也稱為T淋巴細(xì)胞)。T細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(也 稱為殺傷T細(xì)胞或Tk細(xì)胞)，其可破壞外來(lái)抗原感染的機(jī)體細(xì)胞。另一 個(gè)T細(xì)胞亞群為輔助性T細(xì)胞或TH細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞行使信使的功能。 它們對(duì)啟動(dòng)抗體產(chǎn)生、活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞和引發(fā)多種其他免疫功能很 重要。
本文所述的初免免疫應(yīng)答是個(gè)體第一次接觸外來(lái)抗原產(chǎn)生的適應(yīng)性 應(yīng)答。與第二次或再后接觸產(chǎn)生的應(yīng)答相比，初免應(yīng)答的特征是動(dòng)力學(xué)
相對(duì)緩慢和數(shù)量級(jí)小。
13本文所述的再次免疫應(yīng)答是個(gè)體第二次接觸外來(lái)抗原發(fā)生的適應(yīng)性 應(yīng)答。與初免應(yīng)答相比，通常再次應(yīng)答的特征是動(dòng)力學(xué)較快和數(shù)量級(jí)較 大。
因此，通過(guò)接種對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行初免免疫。接種是給予疫苗形式的 抗原制劑，以誘導(dǎo)針對(duì)帶有該抗原的微生物所引起的感染的保護(hù)性免疫。
初免是給予用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫記憶的初始過(guò)程疫苗；然后可 給予后期疫苗劑量，稱為加強(qiáng)。
初免還可在免疫系統(tǒng)接觸傳染性致病劑如病毒的過(guò)程中發(fā)生。
加強(qiáng)是為了增強(qiáng)免疫應(yīng)答，在初免劑量后給予的第二次或再后的疫 苗劑量。加強(qiáng)疫苗可與初免疫苗相同，或不同(異源初免-加強(qiáng))。
初免-加強(qiáng)是一種疫苗方案，其中，進(jìn)行初免疫苗注射之后，在某一 后面時(shí)間用相同或不同(異源初免-加強(qiáng))的疫苗制劑進(jìn)行加強(qiáng)注射。初免-加強(qiáng)組合可誘導(dǎo)比初免免疫所看到的更強(qiáng)的免疫應(yīng)答或類型不同的免疫 應(yīng)答。
初始細(xì)胞是之前沒有遭遇過(guò)抗原的成熟B或T淋巴細(xì)胞，但不是抗
原剌激的成熟淋巴細(xì)胞的后代。當(dāng)初始淋巴細(xì)胞受抗原剌激時(shí)，它們分
化為效應(yīng)性淋巴細(xì)胞，如分泌抗體的B細(xì)胞或輔助性T細(xì)胞和殺傷性T 淋巴細(xì)胞(CTL)。初始淋巴細(xì)胞具有與之前活化的淋巴細(xì)胞不同的表面標(biāo) 記和再循環(huán)模式。
記憶性細(xì)胞是B或T淋巴細(xì)胞，它們介導(dǎo)對(duì)第二次和再后接觸抗原 的快速和增強(qiáng)的應(yīng)答，即，記憶性(或回憶)應(yīng)答。記憶性B和T細(xì)胞通 過(guò)初始淋巴細(xì)胞的抗原刺激而產(chǎn)生，并且在消除抗原后可以功能性靜態(tài) 存活很多年。
樹突狀細(xì)胞是由多亞群構(gòu)成的異源細(xì)胞類型。本文所述的淋巴居住 的DC是永久居住于淋巴器官內(nèi)的樹突狀細(xì)胞，尤其是在小鼠的脾臟和 淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的CD8+CD205+亞群。組織來(lái)源的DC或遷移的DC是在非 淋巴組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)的并且在抗原捕獲過(guò)程中(或自發(fā)地)遷移到淋巴結(jié)的 DC。組織來(lái)源的DC包括肺部和皮膚中存在的DC。
14在實(shí)施例中，以流感病毒作為抗原來(lái)描述本發(fā)明。本發(fā)明者提出， 本發(fā)明同樣適用于增強(qiáng)對(duì)其他病毒性抗原的免疫應(yīng)答，還適用于增強(qiáng)對(duì) 癌或腫瘤抗原以及來(lái)自病毒、細(xì)菌、真菌或其他來(lái)源的任何病原體的抗 原的免疫應(yīng)答。
本文所述的抗原是在適當(dāng)條件下使受試者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的任何物 質(zhì)，包括但不限于多肽、肽、蛋白、糖蛋白和多糖。
可用于本發(fā)明的免疫原性組合物的抗原包括來(lái)自動(dòng)物、植物、病毒、 原生動(dòng)物、寄生蟲、細(xì)菌的抗原，或與疾病狀態(tài)如癌有關(guān)的抗原，例如 腫瘤抗原，或相同或不同來(lái)源的抗原組合。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括一種以上的抗原。
抗原可以是來(lái)源于病毒的任何病毒性肽、蛋白、多肽或其片段，包 括但不限于流感病毒性蛋白(例如，流感病毒神經(jīng)氨糖酸苷酶、流感病毒
紅血球凝集素)、呼吸道合胞體病毒(RSV)-病毒性蛋白(例如，RSVF糖蛋 白、RSVG糖蛋白)、單純皰疹病毒(HSV)病毒性蛋白(例如，單純皰疹病 毒糖蛋白，包括例如gB、 gC、 gD和gE)。細(xì)菌抗原的例子包括衣原體 MOMP和PorB抗原。可用于本發(fā)明的免疫原性組合物的致病性病毒的 抗原包括腺病毒科病毒(例如，哺乳動(dòng)物腺病毒和禽腺病毒)、皰疹病毒科 病毒(例如，單純皰疹病毒l型、單純皰疹病毒2型、單純皰疹病毒5型 和單純皰疹病毒6型)、光滑噬菌體科病毒(例如，光滑噬菌體病毒、腸桿 菌噬菌體MS2、 allolevirus)、痘病毒科病毒(例如，脊椎動(dòng)物痘病毒、副 痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、豬痘病毒、軟疣痘病毒和 昆蟲痘病毒)、乳多空病毒科病毒(例如，多瘤病毒和乳頭瘤病毒)、副粘 病毒科病毒(例如，禽副粘病毒、副流感病毒1型)、麻疹病毒屬病毒(例 如，麻疹病毒)、腮腺炎病毒屬病毒(例如，腮腺炎病毒)、肺病毒亞科病 毒(例如，肺病毒屬病毒、人呼吸道合胞體病毒)、偏肺病毒屬病毒(例如， 雞肺炎病毒和人偏肺病毒屬病毒)、小RNA病毒科病毒(例如，腸道病毒、 鼻病毒)、肝病毒屬病毒(例如，人甲肝病毒)、心病毒屬病毒、鵝口瘡病 毒屬病毒、呼腸孤病毒科病毒(例如，正呼腸孤病毒屬病毒、環(huán)狀病毒屬 病毒、輪狀病毒、質(zhì)型多角體病毒屬病毒、斐濟(jì)病毒屬病毒、植物呼腸 孤病毒屬病毒和水稻病毒屬病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒(例如，哺乳動(dòng)物B型逆轉(zhuǎn)錄病毒、哺乳動(dòng)物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、D型逆
轉(zhuǎn)錄病毒組、BLV-HTLV逆轉(zhuǎn)錄病毒)、慢病毒(例如，人類免疫缺陷病 毒1型和人類免疫缺陷病毒2型)、泡沫病毒屬病毒、黃病毒科病毒(例如， 丙型肝炎病毒)、肝病毒科病毒(例如，乙型肝炎病毒)、披膜病毒科病毒(例 如，甲病毒屬病毒(例如，辛德畢斯病毒)和風(fēng)疹病毒屬病毒(例如，風(fēng)疹 病毒))、彈狀病毒科病毒(例如，水皰病毒屬病毒、狂犬病毒屬病毒、短 暫熱病毒屬病毒、質(zhì)型彈狀病毒屬病毒和核型彈狀病毒屬病毒)、沙粒病 毒科病毒(例如，沙狀病毒屬病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、愛皮 病毒和拉沙熱病毒)和冠狀病毒科病毒(例如，冠狀病毒屬病毒和曲狀病毒 屬病毒)。
抗原可以是傳染性致病劑，包括但不限于流感病毒紅血球凝集素、 人呼吸道合胞體病毒G糖蛋白、登革病毒的核心蛋白、基質(zhì)蛋白或其他 蛋白、麻疹病毒紅血球凝集素、單純皰疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰質(zhì) 炎病毒I型VP1、 HIVI型包膜糖蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、 鏈球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋白、偽狂犬病病毒g50 (gpD)、偽狂犬 病病毒II型(gpB)、偽狂犬病病毒gIII (gpC)、偽狂犬病病毒糖蛋白H、 偽狂犬病病毒糖蛋白E、傳染性胃腸炎糖蛋白195、傳染性胃腸炎基質(zhì)蛋 白、豬輪狀病毒糖蛋白38、豬小病毒衣殼蛋白、蛇形螺旋體保護(hù)性抗原、 牛病毒性腹瀉糖蛋白55、新城疫病毒紅血球凝集素-神經(jīng)氨糖酸苷酶、豬 流感紅血球凝集素、豬流感神經(jīng)氨糖酸苷酶、口蹄疫病毒、豬霍亂病毒、 豬流感病毒、非洲豬瘟病毒、Liy叩neutiioniae支原體、牛傳染性鼻氣管 炎病毒(例如，牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)、傳染性喉氣 管炎病毒(例如，傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白1)、克羅斯病毒 糖蛋白、初生犢牛腹瀉病毒、委內(nèi)瑞拉馬傳染性腦脊髓炎病毒、龐塔托 魯病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白 和/或乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或其衍生物、馬流感病毒或馬皰疹 病毒抗原(例如，馬流感病毒A型/Alaska 91神經(jīng)氨糖酸苷酶、馬流感病 毒A型/Miami 63神經(jīng)氨糖酸苷酶、馬流感病毒A型/Kentucky 81神經(jīng)氨 糖酸苷酶、馬皰疹病毒1型糖蛋白B和馬皰疹病毒1型糖蛋白D)、牛呼 吸道合胞體病毒或牛副流感病毒抗原(例如，牛呼吸道合胞體病毒附著蛋 白(BRSVG)、牛呼吸道合胞體病毒融合蛋白(BRSVF)、牛呼吸道合胞體
16病毒核衣殼蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白和牛副流感病毒3 型紅血球凝集素神經(jīng)氨糖酸苷酶)、牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48或糖蛋 白53。
抗原還可以是癌抗原或腫瘤抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何癌或 腫瘤抗原可用于本發(fā)明中，包括但不限于KS 1/4泛-癌抗原、卵巢癌抗原 (CA125)、前列腺酸性磷酸鹽、前列腺特異性抗原、黑色素瘤相關(guān)的抗原 p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺 特異性膜抗原、腫瘤胚抗原(CEA)、多態(tài)性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球 蛋白抗原、結(jié)直腸腫瘤相關(guān)的抗原如CEA、 TAG-72、 LEA、 Burkitt的 淋巴瘤抗原-38.13、 CD19、人B-淋巴瘤抗原-CD20、 CD33、黑色素瘤特 異性抗原如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2、神經(jīng) 節(jié)苷脂GM3、腫瘤特異性移植型細(xì)胞-表面抗原(TSTA)如病毒誘導(dǎo)的腫 瘤抗原，包括T-抗原DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒的外被抗原、腫瘤 胚抗原-a-胎蛋白如結(jié)腸CEA、膀胱腫瘤胚抗原、分化抗原如人肺癌抗原 L6、 L20、纖維肉瘤抗原、人白血病T細(xì)胞抗原-Gp37、擬糖蛋白、神經(jīng) 鞘脂類、乳腺癌抗原如EGFR (上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)、HER2抗原 (pl85HER2)、多態(tài)性上皮粘蛋白(PEM)、惡性人淋巴細(xì)胞抗原-APO-l、 分化抗原如胎兒性紅血球、原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的I類抗原、成人性紅血球、 植入前胚胎中發(fā)現(xiàn)的I類抗原、胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的I(Ma)、乳腺上皮中發(fā)現(xiàn) 的M18、 M39、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1、結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)的VEP8、 VEP9、 Myl、 VIM-D5、 Du56-22、 TRA-1-85 (血型H)、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn) 的C14、肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3、胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6、 Y半抗原、胚胎性癌 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的LeY、 TL5(血型A)、 A431細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的EGF受體、胰腺 癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血型B)、胚胎性癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的FC10.2、胃腺癌抗 原、腺癌中發(fā)現(xiàn)的CO-514(血型Lea)、腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-IO、 CO-43 (血 型Leb)、 A431細(xì)胞的EGF受體中發(fā)現(xiàn)的G49、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的MH2 (血型ALeb/Ley)、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) 的TsA7、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24、胚胎性癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的4.2、 GD3、 Dl.l、 OFA-l、 GM2、 OFA-2、 GD2禾tl Ml: 22: 25: 8、以及4~8細(xì)胞 階段胚胎中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3和SSEA-4。抗原可以包括病毒，需要免疫應(yīng)答來(lái)對(duì)抗病毒。病毒可以是重組或 嵌合病毒。病毒可被減毒。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)方法可進(jìn)行 重組、嵌合和減毒病毒的生產(chǎn)。本發(fā)明包括活的重組病毒性抗原或滅活 的重組病毒性抗原。
優(yōu)選的重組病毒是對(duì)被給予的受試者呈非致病性的那些病毒?？紤] 到此點(diǎn)，將基因工程病毒用于疫苗時(shí)，可能需要這些菌株存在減毒特征。
將適當(dāng)突變(例如，缺失)引入轉(zhuǎn)染所用的模板可為新病毒提供減毒 特征。例如，與溫度敏感性或冷適應(yīng)相關(guān)的特異性錯(cuò)義突變可產(chǎn)生缺失 突變。這些突變應(yīng)該比與冷或溫度敏感性突變體相關(guān)的點(diǎn)突變更穩(wěn)定， 并且回復(fù)頻率應(yīng)該非常低。
可選擇地，可構(gòu)建具有"自殺"特征的嵌合病毒以用于本發(fā)明的免疫 原性組合物。所述病毒在宿主內(nèi)只經(jīng)歷一輪或幾輪復(fù)制。當(dāng)用作疫苗時(shí)， 重組病毒經(jīng)歷有限的復(fù)制周期并誘導(dǎo)足夠水平的免疫應(yīng)答，但是在人宿 主內(nèi)不會(huì)進(jìn)一步發(fā)展并引起疾病。
可選擇地，滅活的(殺死的)病毒可用作抗原?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)"殺死" 嵌合病毒來(lái)制備滅活的疫苗制劑。滅活的疫苗是"死亡的"，指的是其傳 染性已被破壞。理想的是，病毒的傳染性被破壞但不影響其免疫原性。 為制備滅活的疫苗，可使嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)液或雞胚胎的尿囊中生長(zhǎng)， 通過(guò)區(qū)帶超速離心法純化，用甲醛或-丙內(nèi)酯滅活，然后收集。
在某些實(shí)施方案中，可將完全外源的表位(包括源自其他病毒或非病 毒性病原體的抗原)通過(guò)工程方法用于本發(fā)明的免疫原性組合物。例如，
可將無(wú)關(guān)的病毒，如HIV(gp160、 gpl20、 gp41)寄生蟲抗原(例如，瘧疾)、 細(xì)菌或真菌的抗原或腫瘤抗原，工程改造成減毒的菌株。
抗原可包括經(jīng)疾病控制中心鑒定的一種以上的選定病原體和毒素。 在具體實(shí)施方案中，免疫原性組合物可包括來(lái)自葡萄球菌腸毒素B、肉
毒桿菌毒素、炭疽熱保護(hù)性抗原和鼠疫耶爾森氏菌的一種以上的抗原。 另外的抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的抗原。
本發(fā)明的免疫原性組合物可包括來(lái)自一種菌株或來(lái)自多種菌株的抗 原。例如，如果抗原為流感病毒抗原，則免疫原性組合物可含有取自多達(dá)三種以上病毒性菌株的抗原。僅僅是作為例子，流感疫苗制劑可含有 來(lái)自甲型流感的一種以上菌株的抗原以及來(lái)自乙型流感的一種以上菌株
的抗原。流感菌株的例子是甲型流感/Texas/36/91 、甲型流感 /Nanchang/933/95和乙型流感/Harbin/7/94的菌株。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性組合物包括流感病毒抗原。在一 個(gè)實(shí)施方案中，流感病毒抗原是含有嵌入神經(jīng)氨酸酶莖部的HSV的 gB498-5G5K、限制性表位的重組流感WSN_gB (H1N1) (Blaney等人，1998 J.
Virol. 12:9567-74)。其他適合的抗原包括市售的流感疫苗FLUZONE , 它是減毒的流感疫苗(Connaught Laboratories, Swiftwater, Pa.)。 FLUZONE 是三價(jià)亞病毒疫苗，其含有15 pg/劑量的來(lái)自甲型流感/Texas/36/91 (NINI)、甲型流感/Beijing/32/92 (H3N2)和乙型流感/Panama, 45/90病毒的 每一種HA。使用的抗原可以是HSV (SSIEFARL)的gB498.5。5 Kb-限制性表 位。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)識(shí)別出用于本發(fā)明的適合的流感病毒抗原。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面和如本文所述，對(duì)淋巴居住的樹突狀細(xì)胞特 異性的靶向部分是能將與之相關(guān)的抗原優(yōu)先于組織來(lái)源的DC而導(dǎo)向淋 巴居住的DC的部分。使用術(shù)語(yǔ)"特異性的"不用于指靶向部分只能耙向淋 巴居住的DC,而是優(yōu)先于任何其他DC，靶向淋巴居住的DC，即，靶向 部分對(duì)淋巴居住的DC具有選擇性。這種部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。
相比于組織來(lái)源的DC，靶向部分可2倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15 倍、20倍、30倍、50倍或更多倍地對(duì)淋巴居住的樹突狀細(xì)胞優(yōu)先。
淋巴居住的DC群可通過(guò)表面分子在DC上的不同表達(dá)被靶向?？墒?用產(chǎn)生這些分子的抗體將抗原運(yùn)送到淋巴居住的DC亞群。將要被靶向的 淋巴居住的DC的基本亞群是CD8+淋巴居住的DC，更尤其是 CDllc+CD8+CD205+CDllbT亞群。可利用抗體-抗原復(fù)合物來(lái)使這些亞群 被靶向，其中抗體被靶向到CD8oc或被這種亞群優(yōu)先表達(dá)的其他表面抗 原。適合的靶向部分可包括Sca-l (Spangmde等人，J. Imm皿ol. 141:3697-707， 1988)、 Sca-2 (Spangrude等人，J. Immunol. 141:3697-707, 1988)、 CDldl (Renukaradhya等人,J. Immunol. 175:4301-8, 2005)、 CD36 (Belz等人，J. Immunol. 168:6066-70,2002)、 CD52、 CD8a、 Gprl05 (Moore 等人，Brain Res Mol Brain Res 118:10-23,2003)、 G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員、Micl (Marshall等人，J Biol Chem 279:14792-802, 2004)和其他C型外 源凝集素和C型外源凝集素樣分子、Igsf4 (Galibert等人，J Biol Chem 280:21955-64, 2005)、 Treml4和Ig超家族的其他成員以及含有Ig結(jié)構(gòu)域的 分子。其他適合的靶向部分包括nec12 (Galibert等人，2005,同上)、Pslcl (Qin H.等人，Immunology, 117:419-30, 2006)、 synCaM (Furuno等人，J Immunol 174:6934-42, 2005)和sglgsf (Furuno等人，J Immunol 174:6934-42, 2005)。
優(yōu)選地，靶向部分與淋巴居住的DC上的標(biāo)記結(jié)合或與其以其他方式 關(guān)聯(lián)，由此使抗原與淋巴居住的DC接近，以進(jìn)行抗原處理。
淋巴居住的DC可被靶向的另一個(gè)途徑是使用優(yōu)先于任何其他細(xì)胞 或組織類型，而對(duì)淋巴細(xì)胞特異性的靶向部分。該方法也能實(shí)現(xiàn)使抗原 與淋巴居住的DC接近，以進(jìn)行抗原處理。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面和本文所述，對(duì)組織來(lái)源的樹突狀細(xì)胞特異 性的靶向部分是能將與之相關(guān)的抗原優(yōu)先于淋巴居住的DC而導(dǎo)向組織 來(lái)源的DC的部分。使用術(shù)語(yǔ)"特異性的"不用于指耙向部分只能耙向組織 來(lái)源的DC，而是優(yōu)先于任何其他DC，靶向組織來(lái)源的DC。這種耙向部 分是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。組織來(lái)源的DC群可通過(guò)表面分子在DC上的 不同表達(dá)被靶向?？墒褂卯a(chǎn)生這些分子的抗體將抗原運(yùn)送到組織來(lái)源的 DC亞群。將要被靶向的組織來(lái)源的DC的基本亞群是肺部的 CD8-CD205+CD1 lbT亞群或皮膚的CD8-CD205+CD1 lb+亞群(也稱作真皮 樹突狀細(xì)胞和Langerhans細(xì)胞)?？衫每贵w-抗原復(fù)合物來(lái)使這些亞群被 靶向，其中抗體被靶向組織來(lái)源的DC的特異性標(biāo)記，如Langerin (Valladeau等人,Immunity 12:7181, 2000)、 CDllb (Kurzinger K等人,J. Biol. Chem 257:12412-8, 1982)、 Flrt3 (Lacy SE等人，Genomics. 1999 62:417-26)、干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白l (Ishii K等人，Immunol Lett. 2005 98:280-90)、 G蛋白偶聯(lián)受體68 (Radu CG等人,Proc Natl Acad Sci USA. 2005 102:1632-7)、趨化因子(C-X-C基元)受體4 (Okutsu M等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005, 288:R591-9)。
相比于淋巴居住的DC，靶向部分可2倍、4倍、5倍、8倍、10倍、15 倍、20倍、30倍、50倍或更多倍地對(duì)組織來(lái)源的樹突狀細(xì)胞優(yōu)先。
20靶向部分可與抗原關(guān)聯(lián)或與抗原結(jié)合。
正如蛋白化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到的，通過(guò)很多方法可將抗原 與靶向部分結(jié)合。
這些方法的例子包括
1) 親和偶聯(lián)，如抗原-配體融合，其中配體對(duì)靶向抗體(配體的例子 可以是鏈球菌蛋白G、鏈球菌蛋白A、消化鏈球菌蛋白L)或特異性抗體
具有親和性，從而使抗原與靶向部分交聯(lián)。
2) 化學(xué)交聯(lián)。有很多公知的交聯(lián)方法，包括高碘酸鹽-硼氫化物法、 碳二酰亞胺法、戊二醛法、光親和標(biāo)記法、環(huán)氧乙烷法和各種琥珀酰亞 胺酯法(如馬來(lái)酰亞胺苯甲?；?琥珀酰亞胺酯法)。這些物質(zhì)中很多易于
商購(gòu)得到，例如從Pierce, Rockford,IL, USA等商購(gòu)得到。交聯(lián)技術(shù)有很 多參考資料，包括Hermanson GT "Bioconjugate Techniques" Academic Press, San Diego 1996; Lee YC, Lee RT. Conjugation of glycopeptides to proteins. Methods Enzymol. 1989;179:253-7; Wong SS "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking" CRC Press 1991; Harlow E & Lane D "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Marriott G, Ottl J. Synthesis and applications of heterobifunctional photocleavable cross-linking reagents. Methods Enzymol. 1998;291:155-75 。
3) 基因融合。這些可被制成重組抗體-抗原融合蛋白(在細(xì)菌、酵母、 昆蟲或哺乳動(dòng)物體系內(nèi))，或用于DNA免疫，在抗體和抗原之間可以有 連接子或者沒有。關(guān)于免疫球蛋白與其他分子的融合有很多出版物。與 抗原如流感血凝素的融合已為本領(lǐng)域所知，參見，例如，Deliyannis G， Boyle JS, Brady JL, Brown LE, Lew AM. "A fusion DNA vaccine that targets antigen-presenting cells increases protection from viral challenge." Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2000 97:6676-80。還可將短序列插入免疫球蛋白分子本 身[Lunde E， Western KH, Rasmussen IB, Sandlie I, Bogen B. "Efficient delivery of T cell epitopes to APC by use of MHC class 11-specific Troybodies." J Immunol. 2002 168:2154-62]。抗體分子的縮短形式(例如Fv片段)也可 用于基因融合[Reiter Y, Pastan I. "Antibody engineering of recombinant Fvimmunotoxins for improved targeting of cancer : disulfide-stabilized Fv immunotoxins." Clin. Cancer Res. 1996 2:245-52]。
靶向部分和抗原可直接結(jié)合或通過(guò)連接子接合到構(gòu)建體中。連接子 可以是合成的連接子。連接子可以是共價(jià)鍵?？梢匀诤系鞍椎男问教峁?抗原和耙向部分(及可選的連接子)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以核酸構(gòu)建體的形式提供免疫原性組合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分別但彼此關(guān)聯(lián)地提供靶向部分和抗原，以 使抗原靶向適當(dāng)?shù)腄C。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的免疫原性組合物可用于加強(qiáng)疫苗，并且可任 選地連同初免疫苗一起以試劑盒的形式提供。盡管優(yōu)選使用相同的抗原， 但是初免疫苗和加強(qiáng)疫苗可含有不同抗原。
疫苗可以是活疫苗、減毒疫苗、滅活或"殺死的"疫苗、亞單位疫苗、 類毒素疫苗、組合疫苗、DNA疫苗或重組載體疫苗。疫苗研發(fā)領(lǐng)域的技 術(shù)人員將易于理解這些術(shù)語(yǔ)中每一個(gè)的含義。
在有些優(yōu)選的實(shí)施方案中，以下列形式制備本發(fā)明的疫苗以給予哺 乳動(dòng)物受試者，例如，液體、粉末、氣霧劑、片劑、膠囊、腸溶包衣片 或腸溶包衣膠囊、或栓劑。給予途徑包括但不限于胃腸外給予、腹膜內(nèi) 給予、靜脈內(nèi)給予、肌內(nèi)給予、皮下給予、皮內(nèi)給予、口服給予、局部 給予、鼻內(nèi)給予、肺內(nèi)給予、直腸給予、陰道給予等。所有這些途徑均 適于給予這些組合物，并可取決于受治患者和病情以及相似因素，由主 治醫(yī)師來(lái)選擇途徑。
治療使用的疫苗有效劑量取決于，例如，治療目的、給予途徑和受 試者病情。因此，治療專家必須根據(jù)需要滴定劑量和更改給予途徑以獲 得最佳治療效果。取決于輸送模式，通常的日劑量可為約l mcg/kg至l mg/kg以上。
疫苗的劑量水平通常為約50 mcg 約5 mg/kg體重，優(yōu)選劑量為約 0.1 mg 約1 mg/kg體重/天(約0.5 g 約3 g/患者/天)。取決于受治的宿主 和給予的特定模式，與載體材料組合而產(chǎn)生單劑型的活性成分的用量各 有不同。劑型單位形式通常含有約5mg 500 mg的活性成分。
22然而，可以理解的是，任意特定患者的具體劑量水平取決于多種因 素，包括使用的具體化合物的活性、年齡、體重、 一般健康情況、性別、 飲食情況、給予時(shí)間、給予途徑、排泄率、聯(lián)合用藥和進(jìn)行治療的特定 疾病的嚴(yán)重程度。
在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知范圍內(nèi)選擇和上調(diào)或下調(diào)有效劑量。第一方 面的本發(fā)明允許耙向加強(qiáng)接種，因此希望，只需較低劑量的加強(qiáng)接種即 能達(dá)到與使用非靶向的抗原所能獲得的相同水平的免疫應(yīng)答。
優(yōu)選在給予初免疫苗約4周~約32周后，將任意加強(qiáng)疫苗給予患者。
可以經(jīng)由與初免疫苗步驟相同的途徑和相同的劑量給予加強(qiáng)疫苗，或以 不同劑量或經(jīng)由不同途徑給予加強(qiáng)疫苗。
優(yōu)選將疫苗配制為藥物制劑。這種制劑包括與藥學(xué)上可接受的載體 組合的抗原和/或耙向部分，該載體例如是無(wú)菌水或滅菌等滲壓鹽水。適 合的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，并且在很大程度上取決 于給予途徑。這種制劑包括但不限于混懸劑、溶液、油或水介質(zhì)中的乳 液、糊劑和可植入的緩釋或可生物降解的制劑。這種制劑可進(jìn)一步包括 一種以上的額外成分，包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑或分散劑。在用于 胃腸外給予的制劑的一個(gè)實(shí)施方案中，在胃腸外給予復(fù)水組合物之前，
以干燥(s卩，粉末或顆粒)形式提供活性成分，以便用適合的介質(zhì)(例如，
滅菌的無(wú)熱原質(zhì)的水)進(jìn)行復(fù)水。其他有用的可胃腸外給予的制劑包括含 有微晶形式、脂質(zhì)體制劑形式活性成分的那些制劑，或含有作為可生物 降解的聚合物體系組分的活性成分的那些制劑。用于緩釋或植入的制劑 可包括藥學(xué)上可接受的聚合或疏水材料，如乳液、離子交換樹脂、微溶 聚合物或微溶鹽。
還可存在于制劑中的額外成分是佐劑、防腐劑、化學(xué)穩(wěn)定劑或其他 抗原蛋白。通常，對(duì)穩(wěn)定劑、佐劑和防腐劑進(jìn)行優(yōu)化以確定對(duì)靶向的人 或動(dòng)物有效的最好制劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、 山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸酯類、乙基香草醛、 甘油、苯酚和對(duì)氯苯酚?？墒褂玫倪m合的穩(wěn)定成分包括，例如，酸水解
酪蛋白、蔗糖、凝膠、酚紅、N-Z胺、二磷酸一鉀、乳糖、乳白蛋白水 解物和干乳。常規(guī)的佐劑被用于吸引白細(xì)胞或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這些佐劑包括MPL.TM. (3-0-去?；鶈瘟柞；|(zhì)A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.)、礦物油和水、氫氧化鋁、愛菲金(Amphigen)、阿夫 立定(Awidine)、 L121/角鯊烯、D-丙交酯-聚丙交酯/葡萄糖苷、復(fù)合多元 醇、胞壁酰二肽、滅活的博德特氏菌、皂角苷(如Quil A或Stimulon.TM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.))以及霍亂毒素 (野生型或突變體形式，例如，其中，在氨基酸位置29處的谷氨酸被另 一個(gè)氨基酸，優(yōu)選被組氨酸取代，根據(jù)國(guó)際專利申請(qǐng)No. PCT/US99/22520)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑，如果被注射，則在注射位置幾乎沒 有或沒有不良的或不希望的反應(yīng)，例如，皮膚刺激、腫脹、皮疹、壞疽、 皮膚過(guò)敏。
此外，本發(fā)明預(yù)期了一種制備藥物制劑的方法，其包括使本發(fā)明的 免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑、介質(zhì)或載體和任選的其他成 分混合。
本發(fā)明還包括用于誘導(dǎo)增強(qiáng)的加強(qiáng)免疫應(yīng)答的試劑盒。這種試劑盒 優(yōu)選包括初免疫苗組分和加強(qiáng)疫苗組分。
試劑盒的其他組件包括用于給予各組合物的施藥器。作為本文所用 的術(shù)語(yǔ)，術(shù)語(yǔ)"施藥器"指的是任何裝置，包括但不限于皮下注射器、基 因槍、噴霧器、滴管、氣管鏡、栓劑、用于給予藥物組合物的很多公知 類型的裝置，即用于通過(guò)任何適合的途徑將DNA疫苗成分和/或蛋白疫 苗成分給予人或獸患者的裝置。另一個(gè)組件包括試劑盒的使用說(shuō)明書。
可將本發(fā)明的免疫原性組合物給予個(gè)體以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。優(yōu)選地， 相對(duì)于只給予抗原(沒有耙向部分)所得到的免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答被增強(qiáng) (即，更大)。
通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法可測(cè)定免疫應(yīng)答水平，并因此可測(cè) 定免疫原性組合物或疫苗的效力。這些可包括測(cè)量CTL應(yīng)答、抗體應(yīng)答 或輔助性T細(xì)胞應(yīng)答。通過(guò)體內(nèi)殺傷T細(xì)胞分析(ColesRM等人，J Immunol. 2002;168:834-8)、特異性CTL的四聚體染色(Altaian J.D.等人， Science.l996;274:94-6)、體外重刺激和51-Cr釋放分析(Bennett， S.R.等人，J.
24Exp. Med. 1997;186:65-70)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析(ELISpot) (Yamamoto M. 等人，J. Immunol. 1993;150:106-14)或通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(Smith等 人，Nat. Immunol. 2004;5:1143-8)可測(cè)量CTL應(yīng)答。通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析 (Czerkinsky CC等人，J Immunol Methods.l983;65:109-21)、或酶聯(lián)免疫吸 附分析(ELISA) (Engvall E和Perlmann R J Immunol. 1972; 109:129-35)可測(cè) 量抗體應(yīng)答。通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析(Taguchi T.等人，J Immunol Methods. 1990;128:65-73)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(Andersson U.和Matsuda T. Eur J Immunol. 1989 Jun;19(6):l 157-60)或細(xì)胞因子的酶聯(lián)免疫吸附分析 (Mosmann T. J Immunol Methods.l983;65:55-63)可測(cè)量輔助性T細(xì)胞應(yīng)答。
本文所用的術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"指的是人和非人靈長(zhǎng)類(例如大猩猩、短尾猴、 狨猴)、家畜動(dòng)物(例如綿羊、牛、馬、驢、豬)、寵物(例如狗、貓)、實(shí)驗(yàn) 室試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、大頰鼠)、圈養(yǎng)野生動(dòng)物(例 如狐貍、鹿)和可受益于本發(fā)明的免疫原性組合物的任何其他生物體?？?受益于本發(fā)明描述的免疫原性組合物的動(dòng)物類型不受限制。本發(fā)明最優(yōu) 選的受試者為家畜動(dòng)物和人。無(wú)論個(gè)體是否為人或非人，個(gè)體均可以稱 作患者、受試者、個(gè)體、動(dòng)物、宿主或接受者。
在本說(shuō)明書中，除非上下文另有需要，措詞"包括"或其變型如"含有 "或"包含"，可理解為暗示包含所述要素或整數(shù)或一組要素或整數(shù)，但不 排除任何其他要素或整數(shù)或一組要素或整數(shù)。
應(yīng)該理解的是，除非另有說(shuō)明，本發(fā)明不限于具體治療組分、制造 方法、劑量方案等，這些均可改變。還應(yīng)該理解的是，本文所用的術(shù)語(yǔ) 只是用于描述具體實(shí)施方案而不用于限制本發(fā)明。
還必須指出的是，除非上下文另外清楚地說(shuō)明，在本說(shuō)明書中所用 的單數(shù)形式"一種"、"一個(gè)"和"這種"包括復(fù)數(shù)情況。
實(shí)施例
通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)例，進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明 只是為了說(shuō)明才提供這些實(shí)施例，而不是用于限制本發(fā)明。因此，本發(fā) 明包括由本文提供的教導(dǎo)所得到的任何和所有明顯的變型。
25實(shí)施例1:
因?yàn)閾?jù)報(bào)道，記憶性T細(xì)胞的共刺激需求比初始T細(xì)胞少(Croft,M. 等人，J. Immunol. 1994;152:2675-85) (Byrne, J.A.等人，J. Immunol. 1988;141:3249-57)，所以我們質(zhì)疑在肺部感染流感病毒過(guò)程中，記憶性T 細(xì)胞是否可應(yīng)答被初始T細(xì)胞識(shí)別的兩種類型之外的DC亞群。為檢驗(yàn) 這一點(diǎn)，我們通過(guò)用抗原體外剌激初始TCR轉(zhuǎn)基因CD8+ T細(xì)胞并與 IL-15 —起培養(yǎng)至少14天來(lái)產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞(圖la)。
然后，我們使用這些細(xì)胞作為從病毒感染小鼠的肺部-引流淋巴結(jié)體 外分離得到的DC的應(yīng)答子。在這些實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)單純皰疹病毒糖蛋 白B (gB)的MHC I-限制性表位的重組WSN流感病毒用作傳染性致病劑， 命名為WSN-gB，將來(lái)自gB特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞gBT-I用 作應(yīng)答CTL。鼻內(nèi)感染3天后，在抗原提呈高峰時(shí)，從縱膈淋巴結(jié)中將 CDll+cDC分離出來(lái)，去除包括漿細(xì)胞樣DC(pDC)在內(nèi)的各種細(xì)胞，通 過(guò)表達(dá)CDllb和CD8a來(lái)分離。肺部來(lái)源的DC是CDllb'CD8— (CDllb— DC)，而負(fù)責(zé)將病毒性抗原提呈到初始T細(xì)胞的那些淋巴居住的DC是 CDllb'CD8+(CD8+DC)。剩余的CDllb+DC不好界定，但是極有可能代 表其他類型的淋巴居住的DC。
出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)記憶性T細(xì)胞沒有初始T細(xì)胞應(yīng)答的范圍寬， 雖然對(duì)淋巴居住的CD8+ DC保持活性，但不能針對(duì)肺部來(lái)源的DC提呈 抗原而增殖(圖lb)。值得注意的是，當(dāng)我們?cè)谥辽?個(gè)月前使宿主接觸 病毒感染，然后從正常T細(xì)胞庫(kù)體內(nèi)產(chǎn)生真正的記憶性T細(xì)胞時(shí)，也出 現(xiàn)這種情形(圖lb)，這說(shuō)明，該發(fā)現(xiàn)顯示了記憶性CD8+T細(xì)胞的一致性 質(zhì)，與它們的產(chǎn)生方法無(wú)關(guān)。在其后的實(shí)驗(yàn)中，基于CD45RA和CD8的 表達(dá)來(lái)分離DC，雙陰性組(DNDC)內(nèi)含有肺部來(lái)源的DC， CD45RA+DC 代表pDC。
方法
V、嵐由The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research的動(dòng)物研究 院獲得C57BL/6 (H-2b)、 B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ (Ly5.1)、 gBT-I (H-2b) (Mueller, S.等人，Immunol. Cell Biol. 80:156-63, 2002)小鼠，并在無(wú)特異性 病原體的條件下保存它們。根據(jù)墨爾本董事會(huì)動(dòng)物倫理委員會(huì)(Melboume Directorate Animal Ethics Committee)的規(guī)定，當(dāng)所有小鼠為5~ 10周齡時(shí)， 才能開始用它們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
瘋毒感染
用甲氧基熒烷麻醉小鼠，然后用含有嵌入神經(jīng)氨酸酶莖部的HSV (SSIEFARL)的gB498.505 Kb-限制性表位的重組流感WSN-gB (H1N1) (Blaney, J.E.等人，J. Virol. 72:9567-74,1998)的非致命性致敏感染小鼠。對(duì) 于鼻內(nèi)感染，小鼠接受稀釋于25 plPBS中的10"PFU WSN-gB，而對(duì)于 靜脈內(nèi)感染，小鼠接受稀釋于100 ^ PBS中的102'95 WSN-gB 。
DC分薯、分橋浙潛蕎
如前所述，進(jìn)行由脾臟或LN純化DC、分析和制備性流式細(xì)胞法和 體外DC培養(yǎng)(Belz, G.T.等人，J.Exp.Med. 196:1099-104， 2002; Belz, G.T.等 人，J. Immunol. 172:1996-2000, 2004; Belz, G.T.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:8670-5， 2004; Allan, R.等人，Science 301:1925-8, 2003; Smith, C.M.等人，Nature Immunol. 5:1143-8, 2004)。
<^^五-標(biāo)記游0^+ r潘應(yīng)游劍備
如前所述，通過(guò)去除非008+ T細(xì)胞，由收集的淋巴結(jié)(腹股溝的、 腋窩的、臂的、淺頸的和腸系膜的淋巴結(jié))純化初始。08+ gBT-I (H-2Kb-限制性anti-gB495.505)轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞(Belz， GT.等人,J.Exp.Med. 196:1099-104， 2002; Belz, G.T.等人,J. Immunol. 172:1996-2000, 2004)。根 據(jù)流式細(xì)胞法測(cè)定，T細(xì)胞群常規(guī)上為85-95% CD8+Vot2+。用5,6-CFSE 來(lái)標(biāo)記初始和記憶性CD8+ T細(xì)胞(Belz, G.T.等人，J.Exp.Med. 196:1099-104， 2002; Belz, G.T.等人，J. Immunol. 172:1996-2000, 2004)，或 不標(biāo)記就使用。培養(yǎng)60h后，對(duì)增殖進(jìn)行定量。用CD8特異性mAb來(lái)
27標(biāo)記gBT-I細(xì)胞，并重懸于含有2><104空白校正粒子的100 pL平衡鹽溶 液(BSS)/30/。 v/v FCS中(BD Biosciences Pharmingen)。在LSR (Beckton Dickinson)上通過(guò)流式細(xì)胞法分析樣品，由每5xl03顆珠的分裂細(xì)胞數(shù)來(lái) 計(jì)算活的分裂的淋巴細(xì)胞(Pr"CFSE'。w)總數(shù)。
記憶絲CX>S+ r潘應(yīng)薦游產(chǎn)主
使用中樞記憶性T細(xì)胞體外分化的建立模型來(lái)產(chǎn)生記憶性CD8+ T 細(xì)胞(Belz, G.T.等人，Eur. J. Immunol. 36:327-35， 2006; Manjunath， N.等人, J. Clin. Invest. 108:871-8, 2001; Klebanoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:9571-6， 2005; Klebanoff, C.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1969-74, 2004; Wong, P.禾口 Palmer E.G. Immunity 18:499-511, 2003)。在 37。C下，使初始gBT-I轉(zhuǎn)基因CD8+T細(xì)胞涂布lpMgB肽1小時(shí)。然后， 在用小鼠滲張性RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640含有10%FCS、50 pM 2ME、 2mML-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100叫/ml鏈霉素，完全培 養(yǎng)基)于1.7xl()S細(xì)胞/ml下培養(yǎng)之前，將細(xì)胞在含有2.5% FCS的Hepes Earl培養(yǎng)基中洗滌兩次。2天后，洗滌細(xì)胞并補(bǔ)充重組hlL15 (20 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis,畫55413 USA)。每3-4天更換一次含有 WL15的完全培養(yǎng)基，開始培養(yǎng)14~20天后使用細(xì)胞。
結(jié)果
圖1示出了初始而不是記憶性CD8+ T細(xì)胞在應(yīng)答來(lái)自流感病毒感染 的小鼠縱膈LN的肺部來(lái)源的(CD8'CDllb.) DC的過(guò)程中增殖。圖la示 出了初始和記憶性CD8+T細(xì)胞的表型。初始gBT-I細(xì)胞在體外直接分離， 對(duì)體外活化17天的細(xì)胞(記憶性)分析活化標(biāo)記CD25、 CD69、 CD44和 CD62L的表達(dá)，從而證實(shí)細(xì)胞的發(fā)育表型為活化的效應(yīng)性細(xì)胞或記憶性 細(xì)胞。
鼻內(nèi)感染400 PFU WSN-gB 3天后，由小鼠縱膈LN分離常規(guī)的 CD8+CDllb-DC、 CD8-CDllb-DC禾n CD8-CDllb+DC。在使用流式細(xì)胞 法分析之前，將純化的0(3與對(duì)§8特異性的€08+ CFSE-標(biāo)記的初始或 記憶性轉(zhuǎn)基因CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)60h。圖lb示出的矩形圖是具有相似結(jié)果的4個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表。
流感病毒感染后，DC對(duì)初始T細(xì)胞的體外抗原提呈隨時(shí)間變化的 檢驗(yàn)顯示出，盡管淋巴居住的CD8 DC只在前7大提呈病毒性抗原，但 是肺部來(lái)源的DC (圖lc所用的DN DC組中也含有)可提呈抗原至少9天 (圖2a)。在感染后的不同時(shí)間(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)20個(gè)供體小鼠)，進(jìn)行由MLN 分離DC、對(duì)CD8和CD45RA染色和將其分類為CD45RA+ DC (pDC)或 CD45RA- DC，艮卩CD8+ (CD8 DC)或CD8- (DN DC)。將這些DC與對(duì)單 純皰疹病毒性糖蛋白B (gB)特異性的初始gBT-I CD8+ CFSE-標(biāo)記的轉(zhuǎn)基 因T細(xì)胞一起培養(yǎng)。60h后，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行T細(xì)胞增殖分析，通過(guò)稀釋 CFSE來(lái)測(cè)量。在同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)完成感染3、 5、 7和9天后的分析。進(jìn)行兩 次該實(shí)驗(yàn)得到相似的發(fā)現(xiàn)，如圖2a所示。在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)表達(dá)CD45RA 和CD8來(lái)分離DC,雙陰性組(DNDC)內(nèi)含有肺部來(lái)源的DC， CD45RA+ DC代表pDC。如果，如以上數(shù)據(jù)所揭示的，記憶性T細(xì)胞只能應(yīng)答淋 巴居住的CD8+DC，則當(dāng)只有肺部來(lái)源的DC提呈病毒性抗原時(shí)，初始T 細(xì)胞，而不是記憶性T細(xì)胞，應(yīng)該在7天后的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)答。為 檢驗(yàn)這一點(diǎn)，使小鼠鼻內(nèi)感染W(wǎng)SN-gB，然后10天后注射CFSE-標(biāo)記的 初始或記憶性gBT-I細(xì)胞，從而在60h后體內(nèi)檢驗(yàn)增殖(圖2b、圖2c)。 作為陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)淋巴居住的DC應(yīng)該能剌激初始和記憶性T細(xì)胞時(shí)， 在感染的第3天也注射CFSE-標(biāo)記的T細(xì)胞(圖2b、圖2d)。與我們的看 法一致的是，當(dāng)在第3天注射時(shí)，兩種T細(xì)胞群均作出應(yīng)答(圖2c，下圖)， 但是在第10天，只有初始T細(xì)胞增殖(圖2c，上圖)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我 們的體外發(fā)現(xiàn)，顯示出在體內(nèi)，雖然肺部來(lái)源的DC能活化初始T細(xì)胞， 但是它們不能刺激記憶性T細(xì)胞。記憶性T細(xì)胞在第3天的應(yīng)答能力(圖 2c，下圖)，以及第IO天轉(zhuǎn)移后在LN中能檢測(cè)到這些細(xì)胞(圖2c，中間 圖)，均證實(shí)了該細(xì)胞群能返回到淋巴結(jié)。
因此，肺部來(lái)源的DC延長(zhǎng)的抗原提呈使初始而不是記憶性的抗原 特異性CD8+T細(xì)胞在感染后體內(nèi)擴(kuò)增。
對(duì)此觀察的一個(gè)一般解釋是，記憶性T細(xì)胞殺死肺部來(lái)源的DC或 抑制它們的功能，避免它們誘導(dǎo)增殖。這可通過(guò)共培養(yǎng)肺部來(lái)源的DC 與初始和記憶性T細(xì)胞的混合物而得到檢驗(yàn)(圖3a)。這顯示出，盡管如所期望的，記憶性T細(xì)胞不能應(yīng)答，但是初始T細(xì)胞仍能增殖。與之對(duì)
比，當(dāng)一起培養(yǎng)時(shí)，淋巴居住的CD8+DC既刺激初始T細(xì)胞也刺激記憶 性T細(xì)胞(圖3b)。
相反，為確定是否可通過(guò)DC本身提供的抑制因子來(lái)解釋記憶性T 細(xì)胞對(duì)肺部來(lái)源的DC的較差應(yīng)答，我們將記憶性T細(xì)胞在肺部來(lái)源的 DC存在或不存在時(shí)對(duì)淋巴結(jié)居住的DC的應(yīng)答進(jìn)行了比較(圖3c)。
圖3示出了 DC亞型剌激初始和記憶性CD8+T細(xì)胞的能力。圖3a、 圖3b示出了初始和記憶性T細(xì)胞的混合培養(yǎng)物對(duì)不同DC亞型的應(yīng)答。 圖3c示出了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)來(lái)自MLN的CD8 DC和CDllb' DC 的混合物的應(yīng)答。圖3d示出了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)肽涂布的來(lái)自MLN 的CD8 DC和CDllb'DC的應(yīng)答。圖3e示出了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)肽 涂布的來(lái)自皮膚引流LN的CD8+和CD8T)EC205+ (Langerhans細(xì)胞和真 皮的)DC的應(yīng)答。在圖3d、圖3e中，用滴定濃度的SSIEFARL肽涂布 DC (5xl03) 60min，洗滌3次，然后與5xl04 CFSE-標(biāo)記的CD8+ gBT-I轉(zhuǎn) 基因T細(xì)胞一起培養(yǎng)60。通過(guò)流式細(xì)胞法對(duì)增殖的gBT-I CD8+ T細(xì)胞計(jì) 數(shù)。每個(gè)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)均是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。肺部來(lái)源的DC沒 有削弱對(duì)淋巴結(jié)居住的DC的應(yīng)答，這揭示了明顯的抑制機(jī)制并沒有被 啟動(dòng)。
為了能更加定量地評(píng)價(jià)肺部來(lái)源的DC對(duì)初始和記憶性T細(xì)胞刺激 能力的差異，我們從未感染的小鼠分離淋巴居住的CD8 DC和肺部來(lái)源 的DC，用各種濃度的gB肽對(duì)其進(jìn)行涂布，并檢驗(yàn)其刺激初始和記憶性 gBT-IT細(xì)胞的能力(圖3d)。這揭示了初始和記憶性T細(xì)胞對(duì)淋巴居住的 DC同等程度的應(yīng)答，但是記憶性T細(xì)胞對(duì)肺部來(lái)源的DC的敏感性減少 了大約10倍。當(dāng)使用來(lái)自病毒感染的小鼠的DC時(shí)，很明顯有相似的結(jié) 果(圖3f)。因此，盡管肺部來(lái)源的DC在感染過(guò)程中不能剌激記憶性T 細(xì)胞對(duì)流感病毒作出應(yīng)答，但卻不能將此歸因于DC細(xì)胞群完全不能活 化記憶性T細(xì)胞，而應(yīng)該歸因于刺激能力減少了 IO倍。然而，實(shí)際上， 這種差異可能意味著當(dāng)在肺部來(lái)源的DC上提呈時(shí)，大多數(shù)自然刺激對(duì) 刺激記憶性T細(xì)胞無(wú)效。
可將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到肺部來(lái)源的DC之外的DC,通過(guò)與皮膚來(lái)源的
30DC的肽提呈相比較，可再現(xiàn)該發(fā)現(xiàn)(圖3e)。此外，盡管淋巴居住的DC 刺激初始和記憶性細(xì)胞的程度相同，但是皮膚來(lái)源的DC (由真皮的DC 和Langerhans細(xì)胞的混合物組成)刺激記憶性T細(xì)胞的有效程度要少10 倍。
實(shí)施例2:
既然已經(jīng)確定組織來(lái)源的DC (來(lái)自肺部或皮膚)刺激初始T細(xì)胞可 比記憶性T細(xì)胞更有效，于是我們提出，當(dāng)存在大量競(jìng)爭(zhēng)性記憶性細(xì)胞 時(shí)，它們是否可引發(fā)初始應(yīng)答。如果，例如來(lái)源于交叉-反應(yīng)感染的預(yù)先 存在的記憶性群沒有特別的保護(hù)性，則這種情形可能是有利的。通過(guò)以 下方法對(duì)此進(jìn)行檢驗(yàn)，艮卩，注射少量(5xl0"的初始gBT-IT細(xì)胞(應(yīng)答群)， 并在滴定量的記憶性gBT-I細(xì)胞(競(jìng)爭(zhēng)子群)存在下檢驗(yàn)它們?cè)趹?yīng)答 WSN-gB感染過(guò)程中的體內(nèi)擴(kuò)增(圖4a-圖4d)。肺部感染W(wǎng)SN-gB之后， 在初始競(jìng)爭(zhēng)子和初始應(yīng)答子CD8+T細(xì)胞之間(圖4a)、初始競(jìng)爭(zhēng)子和記憶 性應(yīng)答子CD8+T細(xì)胞之間存在競(jìng)爭(zhēng)(圖4b)，但在記憶性競(jìng)爭(zhēng)子和初始應(yīng) 答子CD8+T細(xì)胞之間不存在競(jìng)爭(zhēng)(圖4c)。在靜脈內(nèi)感染W(wǎng)SN-gB之后， 在記憶性競(jìng)爭(zhēng)子和初始應(yīng)答子CD8+T細(xì)胞之間可觀察到競(jìng)爭(zhēng)，其中，沒 有組織來(lái)源的DC提呈抗原。在這些實(shí)驗(yàn)中，滴定量的初始或記憶性CD8+ T細(xì)胞(競(jìng)爭(zhēng)子)連同5><104初始或記憶性應(yīng)答子CD8+ T細(xì)胞一起過(guò)繼轉(zhuǎn) 移到初始宿主中。使小鼠鼻內(nèi)感染(圖4a-圖4c) WSN-gB并在10天后分 析它們的組織，或者使它們靜脈內(nèi)感染(圖4d)并在8天后分析，通過(guò)流 式細(xì)胞法分析在感染過(guò)程中產(chǎn)生的gB特異性CD8+應(yīng)答子細(xì)胞的數(shù)量。 所示數(shù)據(jù)顯示了各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)至少兩個(gè)小鼠。
通過(guò)Ly5同種異型標(biāo)記來(lái)鑒定應(yīng)答群，并在第8-10天估算在應(yīng)答感 染過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量。作為對(duì)照，我們首先顯示了初始T細(xì)胞與其 他初始T細(xì)胞的激烈競(jìng)爭(zhēng)(圖4a)。作為第二對(duì)照，我們顯示了初始T細(xì) 胞與記憶性T細(xì)胞應(yīng)答群更為激烈的競(jìng)爭(zhēng)，避免它們過(guò)量時(shí)還擴(kuò)增(圖 4b)。這正是所期望的，因?yàn)橛洃浶訲細(xì)胞應(yīng)該只能識(shí)別DC上的抗原， 該DC還可提呈抗原到初始T細(xì)胞，即淋巴居住的DC。然而，重要的是， 當(dāng)我們對(duì)數(shù)量增加的記憶性T細(xì)胞與初始應(yīng)答群的競(jìng)爭(zhēng)能力進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)記憶性T細(xì)胞盡管明顯存在，但是它們卻不能競(jìng)爭(zhēng)(圖4c)。
為支持此觀點(diǎn)，S卩，這是因?yàn)檫w移的DC提呈病毒性抗原到初始T細(xì)胞而不是記憶性T細(xì)胞，我們檢驗(yàn)了遷移的DC不參與情況下的競(jìng)爭(zhēng)。靜脈內(nèi)病毒性感染導(dǎo)致了只淋巴居住的CD8+DC進(jìn)行提呈，同等程度地刺激了記憶性和初始T細(xì)胞(圖3)。與肺部感染對(duì)比(圖4c)，當(dāng)小鼠靜脈內(nèi)感染W(wǎng)SN-gB時(shí)(圖4d)，數(shù)量增加的記憶性T細(xì)胞能避免初始應(yīng)答?？傊@些數(shù)據(jù)說(shuō)明，當(dāng)存在競(jìng)爭(zhēng)性記憶性細(xì)胞時(shí)，遷移的DC對(duì)初始T細(xì)胞刺激至關(guān)重要。這就解釋了為何盡管存在對(duì)肺部感染流感病毒的已形成的記憶，仍可檢測(cè)到初始T細(xì)胞應(yīng)答。
為了使用真正的(而不是轉(zhuǎn)基因的)T細(xì)胞驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，我們從感染HKx31流感病毒至少12周后的B6丄y5.1小鼠分離CD44hiCD62Lhi中樞記憶性T細(xì)胞，并且通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移到B6小鼠，將它們用作競(jìng)爭(zhēng)子。隨后使這些小鼠鼻內(nèi)(圖6e)或靜脈內(nèi)(圖6f)感染流感病毒，然后我們通過(guò)對(duì)病毒性NP和PA特異性的內(nèi)源性的和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)應(yīng)答。與使用轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的研究一致的是，研究顯示出記憶性CD8 T細(xì)胞在靜脈內(nèi)感染后避免了初始內(nèi)源性T細(xì)胞對(duì)流感病毒的應(yīng)答，但在肺部感染后卻不如此?？傊?，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，當(dāng)存在競(jìng)爭(zhēng)性記憶性細(xì)胞時(shí)，組織來(lái)源的DC為初始T細(xì)胞刺激提供了優(yōu)先途徑。
這些數(shù)據(jù)提供了其他重要結(jié)論。初始008+ T細(xì)胞顯示出比記憶性CD8+ T細(xì)胞對(duì)組織來(lái)源的DC的刺激更敏感，而與初始T細(xì)胞應(yīng)答淋巴居住的DC的程度相同(圖3)。這就質(zhì)疑了長(zhǎng)久以來(lái)的觀點(diǎn)，即記憶性T細(xì)胞的共刺激需求比初始T細(xì)胞少，至少是在組織來(lái)源的DC被用作抗原提呈細(xì)胞時(shí)。雖然我們排除了在表達(dá)包括B7-H1、 B7-H2、 B7-DC、 B7-RP、B7-l、 B7-2和BTLA-4在內(nèi)的各種共刺激分子上的明顯差異，但是仍不清楚是如何在分子水平上實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)(圖4)?；贒C亞群在其使用CD70中的差異，我們檢驗(yàn)了該分子在我們研究中的作用。有趣的是，淋巴居住的CD8ot DC誘導(dǎo)的應(yīng)答對(duì)初始和記憶性T細(xì)胞來(lái)說(shuō)均取決于CD70，而肺部來(lái)源的DC對(duì)初始T細(xì)胞的刺激不取決于CD70 (圖5)。這暗示了肺部來(lái)源的DC使用了可供選擇的但仍未確定的共刺激分子來(lái)有效地刺激初始T細(xì)胞，但是該信號(hào)不能有效地刺激記憶性T細(xì)胞。實(shí)施例3:
體內(nèi)和體外來(lái)源的記憶性T細(xì)胞的應(yīng)答與內(nèi)源性記憶性T細(xì)胞相似(圖7)。在鼻內(nèi)感染400 PFU WSN-gB 3天后，從小鼠的縱膈1^分離008+DC、 CD11K DC^BCDllb+ DC。在通過(guò)流式細(xì)胞法分析之前，將純化的DC與對(duì)gB特異性的gBT-I CD8+ 0 8￡-標(biāo)記的初始或記憶性轉(zhuǎn)基因〔08+T細(xì)胞共培養(yǎng)60h。通過(guò)3種不同方法來(lái)產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，(第二排)將初始§8丁-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移到鼻內(nèi)感染\^^88的1^￡1-/-小鼠體內(nèi)，8~10周后，收集它們的脾臟，純化記憶性gBT-ICD8+T細(xì)胞。第三排，如以上方法所述，通過(guò)體外肽抗原刺激和使用重組人IL-15維持，來(lái)制備記憶性gBT-I細(xì)胞。下排，使B6小鼠鼻內(nèi)感染W(wǎng)SN-gB， 8~10周后，純化內(nèi)源性非轉(zhuǎn)基因008+ T細(xì)胞。
結(jié)果如圖7所示。矩形圖是具有相似結(jié)果的2個(gè)實(shí)驗(yàn)，顯示了T細(xì)胞群的增殖(1/3是孔收集的)。每個(gè)圖的增殖細(xì)胞的百分比和數(shù)量(括號(hào))也被示出。
我們的發(fā)現(xiàn)暗示了，因?yàn)橛洃浶訲細(xì)胞應(yīng)答遷移的DC的能力削弱，所以它們高度取決于淋巴居住的DC的提呈。當(dāng)可用的是針對(duì)早期病毒而產(chǎn)生的弱交叉-反應(yīng)性和無(wú)效的記憶性T細(xì)胞時(shí)，這種不同的應(yīng)答可能很重要。因?yàn)槟艿挚垢腥镜某跏糡細(xì)胞也有機(jī)會(huì)受到刺激，所以我們這里描述的機(jī)制提供了一種使支配性而不是無(wú)效的記憶性T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的方法。交聯(lián)-反應(yīng)性對(duì)于兩種不同類的病原體來(lái)說(shuō)可能很少見，但是對(duì)于能使T細(xì)胞表位變異的病毒來(lái)說(shuō)可能是常見的，如流感病毒(Voeten, J.T.等人，J. Virol. 74:6800-07, 2000)、 HIV (Phillips, R.E.等人，Nature 354:453-9,1991)和丙型肝炎病毒(Weiner, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:2755-9, 1995)，雖然這兩種情形均已有文獻(xiàn)記載。
我們研究的重點(diǎn)在于記憶性和初始CD8+ T細(xì)胞與DC亞群相互作用的方式上的差異，從而提供了對(duì)照性證據(jù)，即，初始T細(xì)胞的活化需求可能比記憶性T細(xì)胞少。這些發(fā)現(xiàn)不僅證明了進(jìn)一步詳細(xì)研究個(gè)體DC亞群確切功能的必要性，而且為疫苗發(fā)展的新策略提供了見解。很明顯，
在初免-加強(qiáng)策略中，使加強(qiáng)抗原靶向淋巴居住的DC會(huì)很有益處。
權(quán)利要求
1. 一種用于產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，所述組合物包括抗原和對(duì)淋巴居住的樹突狀細(xì)胞特異性的靶向部分。
2. 如權(quán)利要求l所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是病毒性抗原、癌或腫瘤抗原、或來(lái)自病毒、細(xì)菌、真菌或其他來(lái)源的任何病原體 的抗原。
3. 如權(quán)利要求l所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是病毒、來(lái) 源于病毒的病毒性肽、蛋白、多肽或其片段。
4. 如權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述病毒選自流感病 毒、呼吸道合胞體病毒(RSV)、衣原體、腺病毒科病毒、哺乳動(dòng)物腺病毒、 禽腺病毒、皰疹病毒科病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、 單純皰疹病毒5型、單純皰疹病毒6型、光滑噬菌體科病毒、光滑噬菌 體病毒、腸桿菌噬菌體MS2、 allolevirus、痘病毒科病毒、脊椎動(dòng)物痘病 毒、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、豬痘病毒、軟疣痘 病毒、昆蟲痘病毒、乳多空病毒科病毒、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、副粘 病毒科病毒、禽副粘病毒、副流感病毒1型、麻疹病毒屬病毒、麻疹病 毒、腮腺炎病毒屬病毒、腮腺炎病毒、肺病毒亞科病毒、肺病毒屬病毒、 偏肺病毒屬病毒、雞肺炎病毒、人偏肺病毒屬病毒、小RNA病毒科病毒、 腸道病毒、鼻病毒、肝病毒屬病毒、人甲肝病毒、心病毒屬病毒、鵝口 瘡病毒屬病毒、呼腸孤病毒科病毒、正呼腸孤病毒屬病毒、環(huán)狀病毒屬 病毒、輪狀病毒、質(zhì)型多角體病毒屬病毒、斐濟(jì)病毒屬病毒、植物呼腸 孤病毒屬病毒、水稻病毒屬病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒、哺乳動(dòng)物B型逆 轉(zhuǎn)錄病毒、哺乳動(dòng)物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、D型逆轉(zhuǎn)錄 病毒組、BLV-HTLV逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、人類免疫缺陷病毒l型、人 類免疫缺陷病毒2型、泡沫病毒屬病毒、黃病毒科病毒、丙型肝炎病毒、 肝病毒科病毒、乙型肝炎病毒、披膜病毒科病毒、甲病毒屬病毒、辛德 畢斯病毒、風(fēng)疹病毒屬病毒、風(fēng)疹病毒、彈狀病毒科病毒、水皰病毒屬病毒、狂犬病毒屬病毒、短暫熱病毒屬病毒、質(zhì)型彈狀病毒屬病毒、核 型彈狀病毒屬病毒、沙粒病毒科病毒、沙狀病毒屬病毒、淋巴細(xì)胞性脈 絡(luò)叢腦膜炎病毒、愛皮病毒、拉沙熱病毒、冠狀病毒科病毒、冠狀病毒 屬病毒和曲狀病毒屬病毒。
5. 如權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述病毒性肽、蛋白、 多肽或其片段選自流感病毒神經(jīng)氨糖酸苷酶、流感病毒紅血球凝集素、 呼吸道合胞體病毒(RSV)-病毒性蛋白、RSVF糖蛋白、RSVG糖蛋白、 單純皰疹病毒(HSV)病毒性蛋白、單純皰疹病毒糖蛋白gB、 gC、 gD和 gE、以及衣原體MOMP和PorB抗原。
6. 如權(quán)利要求l所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是傳染性致 病劑，選自流感病毒紅血球凝集素、人呼吸道合胞體病毒G糖蛋白、登 革病毒的核心蛋白、基質(zhì)蛋白或其他蛋白、麻疹病毒紅血球凝集素、單 純皰疹病毒2型糖蛋白gB、脊髓灰質(zhì)炎病毒I型VP1、 HIV I型包膜糖 蛋白、乙型肝炎表面抗原、白喉毒素、鏈球菌24M表位、淋球菌菌毛蛋 白、偽狂犬病病毒g50 (gpD)、偽狂犬病病毒II型(gpB)、偽狂犬病病毒 gIII (gpC)、偽狂犬病病毒糖蛋白H、偽狂犬病病毒糖蛋白E、傳染性胃 腸炎糖蛋白195、傳染性胃腸炎基質(zhì)蛋白、豬輪狀病毒糖蛋白38、豬小 病毒衣殼蛋白、蛇形螺旋體保護(hù)性抗原、牛病毒性腹瀉糖蛋白55、新城 疫病毒紅血球凝集素-神經(jīng)氨糖酸苷酶、豬流感紅血球凝集素、豬流感神 經(jīng)氨糖酸苷酶、口蹄疫病毒、豬霍亂病毒、豬流感病毒、非洲豬瘟病毒、 Liyopneutiioniae支原體、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛傳染性鼻氣管炎病 毒糖蛋白E、糖蛋白G、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒糖 蛋白G或糖蛋白I、克羅斯病毒糖蛋白、初生犢牛腹瀉病毒、委內(nèi)瑞拉 馬傳染性腦脊髓炎病毒、龐塔托魯病毒、小鼠白血病病毒、小鼠乳腺腫 瘤病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或其 衍生物、馬流感病毒或馬皰疹病毒抗原，包括馬流感病毒A型/Alaska91 神經(jīng)氨糖酸苷酶、馬流感病毒A型/Miami63神經(jīng)氨糖酸苷酶、馬流感病 毒A型/Kentucky 81神經(jīng)氨糖酸苷酶、馬皰疹病毒1型糖蛋白B和馬皰 疹病毒1型糖蛋白D，牛呼吸道合胞體病毒或牛副流感病毒抗原、牛呼吸道合胞體病毒附著蛋白(BRSV G)、牛呼吸道合胞體病毒融合蛋白 (BRSV F)、牛呼吸道合胞體病毒核衣殼蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3 型融合蛋白、牛副流感病毒3型紅血球凝集素神經(jīng)氨糖酸苷酶、牛病毒 性腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53。
7. 如權(quán)利要求l所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是癌抗原或 腫瘤抗原。
8. 如權(quán)利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述癌或腫瘤抗原選 自KSl/4泛-癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸性磷酸鹽、前列腺 特異性抗原、黑色素瘤相關(guān)的抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量 黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特異性膜抗原、腫瘤胚抗原(CEA)、 多態(tài)性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球蛋白抗原、結(jié)直腸腫瘤相關(guān)的抗原、 CEA、 TAG-72、 LEA、 Burkitt的淋巴瘤抗原-38.13、 CD19、人B-淋巴瘤 抗原-CD20、 CD33、黑色素瘤特異性抗原、神經(jīng)節(jié)苷脂GD2、神經(jīng)節(jié)苷 脂GD3、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、腫瘤特異性移植型細(xì)胞-表面抗原(TSTA)、病毒誘導(dǎo)的腫瘤抗原、T-抗原DNA腫瘤病毒、RNA 腫瘤病毒的外被抗原、腫瘤胚抗原-a-胎蛋白、結(jié)腸CEA、膀胱腫瘤胚抗 原、分化抗原、人肺癌抗原L6、 L20、纖維肉瘤抗原、人白血病T細(xì)胞 抗原-Gp37、擬糖蛋白、神經(jīng)鞘脂類、乳腺癌抗原、EGFR(上皮細(xì)胞生長(zhǎng) 因子受體)、HER2抗原(pl85HER2)、多態(tài)性上皮粘蛋白(PEM)、惡性人淋 巴細(xì)胞抗原-APO-l、分化抗原，包括胎兒性紅血球，原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的 I類抗原、成人性紅血球、植入前胚胎中發(fā)現(xiàn)的I類抗原、胃腺癌中發(fā)現(xiàn) 的I(Ma)、乳腺上皮中發(fā)現(xiàn)的M18、 M39、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1、 結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)的VEP8、 VEP9、 Myl、 VIM-D5、 Du56-22、 TRA-1-85 (血 型H)、結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的C14、肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3、胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6、 Y半抗原、胚胎性癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的LeY、 TL5 (血型A)、 A431細(xì)胞中發(fā) 現(xiàn)的EGF受體、胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血型B)、胚胎性癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) 的FC10.2、胃腺癌抗原、腺癌中發(fā)現(xiàn)的CO-514(血型Lea)、腺癌中發(fā)現(xiàn) 的NS-IO、 CO-43 (血型Leb)、 A431細(xì)胞的EGF受體中發(fā)現(xiàn)的G49、結(jié) 腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的MH2(血型ALeb/Ley)、結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9、胃癌粘蛋白、骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的TsA7、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24、胚胎性癌細(xì)胞中 發(fā)現(xiàn)的4.2、 GD3、 Dl.l、 OFA-l、 GM2、 OFA-2、 GD2禾QM1: 22: 25: 8、以及4~8細(xì)胞階段胚胎中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3和SSEA-4。
9. 如權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其包括重組或嵌合病毒。
10. 如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中所述病毒包括活的 重組病毒性抗原或滅活的重組病毒性抗原。
11. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述抗原包括來(lái)自 葡萄球菌腸毒素B、肉毒桿菌毒素、炭疽熱保護(hù)性抗原和鼠疫耶爾森氏 菌的一種以上的抗原。
12. 如權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其包括來(lái)自一種病毒菌 株或來(lái)自多種菌株的抗原。
13. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述抗原包括流感 病毒抗原。
14. 如權(quán)利要求13所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是含有嵌 入神經(jīng)氨酸酶莖部的HSV的gB^'^Kb-限制性表位的重組流感WSN-gB (H1N1)，或含有來(lái)自甲型流感/Texas/36/91 (NINI)、甲型流感/Beijing/32/92 (H3N2)和乙型流感/Panama, 45/90病毒的HA。
15. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述抗原是HSV (SSIEFARL)的gB498-5()5 &-限制性表位。
16. 如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述靶向部分選自 Sca-l、 Sca-2、 CDldl、 CD36、 CD52、 CD8a、 Gprl05、 G-蛋白偶聯(lián)受體 超家族成員、Micl和其他C型外源凝集素和C型外源凝集素樣分子、 Igsf4、 Treml4和Ig超家族的其他成員以及含有Ig結(jié)構(gòu)域的分子、necl2、Pslcl、 synCaM禾卩sglgsf。
17. —種加強(qiáng)疫苗，其含有如權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述的免疫原 性組合物。
18. —種試劑盒，其包括第一疫苗和加強(qiáng)疫苗，所述加強(qiáng)疫苗含有 如權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物。
19. 一種誘導(dǎo)個(gè)體中免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述個(gè)體如權(quán)利要 求17所述的加強(qiáng)疫苗。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括殺傷T細(xì)胞 應(yīng)答。
21. 含有抗原的免疫原性組合物中對(duì)淋巴居住的樹突狀細(xì)胞特異性 的靶向部分的用途，所述用途用于提高含有所述免疫原性組合物的加強(qiáng) 接種的效率，從而與只使用所述抗原相比在加強(qiáng)接種中產(chǎn)生再次免疫應(yīng)答。
22. —種用于產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，所述組合 物包括抗原和對(duì)組織來(lái)源的樹突狀細(xì)胞特異性的靶向部分。
23. 如權(quán)利要求22所述的免疫原性組合物，其中對(duì)組織來(lái)源的樹突 狀細(xì)胞特異性的靶向部分選自Langerin、 CDllb、 Flrt3、干擾素誘導(dǎo)的跨 膜蛋白1、 G蛋白偶聯(lián)受體和趨化因子(C-X-C基元)受體4。
24. —種疫苗，其含有如權(quán)利要求22或23所述的免疫原性組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，該組合物包括抗原和對(duì)淋巴居住的樹突狀細(xì)胞特異性的靶向部分。本發(fā)明還提供該免疫原性組合物在疫苗中的應(yīng)用和使用該組合物加強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。另一方面，本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，該組合物包括抗原和對(duì)組織來(lái)源的樹突狀細(xì)胞特異性的靶向部分，還涉及含有所述組合物的疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101489589SQ200780026608
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者加布里埃勒·特雷澤·貝爾茲, 威廉·羅斯·希思 申請(qǐng)人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學(xué)研究院