免疫原性組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包括來自腦膜炎奈瑟菌血清群X的莢膜多糖的一種免疫原性多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物，以及用來制備所述結(jié)合物的方法。本發(fā)明涉及由結(jié)合反應(yīng)制備的腦膜炎奈瑟菌X糖-載體蛋白質(zhì)結(jié)合物。因此，本發(fā)明涉及多價(jià)腦膜炎球菌多糖蛋白質(zhì)結(jié)合組合物，其包括來自血清群X的莢膜糖和來自A、C、W135、Y中的至少一個(gè)莢膜糖，其中：i)多糖A C W135 X被機(jī)械地分級(jí)，而多糖Y被化學(xué)地分級(jí)；ii)，通過具有氰基化結(jié)合化學(xué)物質(zhì)(cyanylation conjugation chemistry)的連接體(linker)將全部的糖都結(jié)合到載體蛋白；iii)在最終的結(jié)合物中所有的糖與蛋白質(zhì)的比例為0.2-0.6；并且iv)使用選自TT、DT和CRM197至少兩種不同的載體蛋白質(zhì)。
【專利說明】免疫原性組合物

【背景技術(shù)】
[0001] 腦膜炎奈瑟菌（腦膜炎球菌）（Neisseriameningitidis(meningococcus))是革 蘭氏陰性人類病原體。其寄生在咽部，引起腦膜炎并且偶爾在不引起腦膜炎的情況下引起 敗血癥。腦膜炎球菌與淋球菌（N.gonorrhoeae)非常相近，盡管腦膜炎球菌有別于淋球菌 的一個(gè)特征為存在多糖莢膜，這是一種在所有致病性腦膜炎球菌中都出現(xiàn)的多糖莢膜。基 于生物體的莢膜多糖，已經(jīng)確定了腦膜炎奈瑟菌（N.meningitidis)的十二個(gè)血清群（A、B、 C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。
[0002] 血清群A("MenA"）是在非洲撒哈拉以南地區(qū)流行病的最常見的病因。血清群B&C 是造成發(fā)達(dá)國家的大多數(shù)病例的原因，其余的情況是由血清群W135&Y引起的。
[0003] 僅利用多糖（PS)的疫苗具有相對(duì)低的免疫原性。為了克服多糖的相對(duì)低的免疫 原性，將PS疫苗與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，以增加免疫原性，并提供對(duì)年幼兒童的長期保護(hù)。許多 腦膜炎球菌結(jié)合疫苗已經(jīng)被批準(zhǔn)并推向全世界市場。這種疫苗的例子，已知的被稱為〃腦 膜炎奈瑟菌結(jié)合物"的為單價(jià)腦膜炎球菌A結(jié)合物（MenAfriVac)、單價(jià)腦膜炎球菌C結(jié)合 物（Meningitec)和四價(jià)ACYW腦膜炎球菌結(jié)合疫苗（Menveo&Menactra)。
[0004] 和用于分類一樣，莢膜多糖已經(jīng)被用于預(yù)防接種。一種來自血清群A、C、Y&W135的 莢膜多糖的可注射四價(jià)疫苗已公知多年，并且被獲準(zhǔn)使用于人類。雖然對(duì)青少年和成人是 有效的，但是其引起弱的免疫反應(yīng)和短期的保護(hù)，并且不能用于嬰兒。一旦MencevaxACWYtm 和Menomune?從它們的凍干形式中被重構(gòu)，就都包含50yg的純化多糖。血清群A、C、W135&Y 的莢膜糖也已經(jīng)以結(jié)合物的形式被結(jié)合，獲得四價(jià)疫苗，例如無佐劑的Menactra?產(chǎn)品。并 且，結(jié)合的血清群A多糖已經(jīng)被批準(zhǔn)作為MenAfriVac?供人類使用，血清群C低聚糖已經(jīng)被 批準(zhǔn)作為Menjugate?、Meningitec? 和NeisVac-C? 供人類使用。
[0005] 腦膜炎奈瑟菌血清群X菌株在二十世紀(jì)六十年代首次被描述，并且已經(jīng)從北美、 歐洲、澳大利亞和中國的幾例侵入性腦膜炎球菌病中分離出來。腦膜炎奈瑟菌血清群X 菌株的爆發(fā)已經(jīng)在尼日爾、肯尼亞西部和北部加納被報(bào)道。，在當(dāng)中，腦膜炎奈瑟菌血清群 X菌株被報(bào)道能十分高效的寄生在英國的新兵中。參見=AbdullahKilic等，Neisseria meningitidisSerogroupXSequenceType767inTurkey;JournalOfClinical Microbiology，2010 年 11 月，第 4340 - 4341 頁；第 48 期，第 11卷。。
[0006] 據(jù)報(bào)道，在許多非洲國家的重復(fù)大量的疫苗接種可能會(huì)促進(jìn)血清群X菌株寄生和 由于血清群X血清群X菌株的腦膜炎球菌疾病，并可能導(dǎo)致腦膜炎球菌病的特點(diǎn)發(fā)生改變。 參見：Gagneux,S.P等，ProspectivestudyofaserogroupXNeisseriameningitidis outbreakinnorthernGhana.J.Infect.Dis. 185:618 - 626 ;2002〇
[0007] 血清群B、C、Y和W135腦膜炎球菌的莢膜多糖由唾液酸衍生物組成。血清群B 和C腦膜炎球菌分別表達(dá)（α2-8)_連接的和（α2-9239)連接的聚唾液酸，同時(shí)D-葡 萄糖或D-半乳糖與唾液酸的交錯(cuò)序列由血清群Y和W135腦膜炎奈瑟菌表達(dá)。與此相 反的是，血清群A腦膜炎球菌的莢膜由（α1-6)-連接的N-乙酰甘露糖胺6-磷酸組成， 同時(shí)腦膜炎奈瑟菌血清群X合成（α1-4)-連接的N-乙酰甘露糖胺1-磷酸的莢膜聚合 物° 參見：Yih-LingTzeng等；GeneticBasisforBiosynthesisofthe(134)-Linked N-Acetyl-D-Glucosamine1-PhosphateCapsuleofNeisseriameningitidisSerogroup X!InfectionAndImmunity, 2003 年 12 月，第 6712 - 6720 頁；第 71 期，第 12 卷。
[0008] 現(xiàn)有的腦膜炎球菌結(jié)合疫苗基于ACYW135多糖。在過去5年里非洲腦膜炎地帶中 MenX疾病的發(fā)生率的增長[1，4]使得在該地區(qū)的選定區(qū)域開發(fā)和引入MenX多糖結(jié)合疫苗 以防止并控制未來的流行變得必要。盡管在早些時(shí)候已經(jīng)被報(bào)道。盡管全面的血清陽性率 和腦膜炎球菌X的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)是可獲得的，但是由于在凈化、結(jié)合與制劑穩(wěn)定性方面的成功 是極其有限的，因此含有X多糖的商業(yè)上可行的結(jié)合疫苗仍待開發(fā)。這為成功地處理和控 制各項(xiàng)參數(shù)，尤其是當(dāng)使用可擴(kuò)展的結(jié)合方法用于大規(guī)模生產(chǎn)含有腦膜炎奈瑟菌X多糖的 腦膜炎奈瑟菌結(jié)合物提供了額外的挑戰(zhàn)。
[0009] 本發(fā)明源自以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)：通過利用可擴(kuò)展的且高效的結(jié)合方法使得制備 基于來自血清群X的腦膜炎球菌多糖結(jié)合物的單價(jià)或多價(jià)免疫原性組合物成為可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明涉及由結(jié)合反應(yīng)制備的腦膜炎奈瑟菌X糖載體蛋白結(jié)合物，所述結(jié)合反應(yīng) 包括：i)對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)；ii)對(duì)具有IOOKda至150Kda平均分子量的分級(jí)多糖，在9至9. 5 的pH下進(jìn)行基于CPPT的活化；iii)在2-3分鐘的持續(xù)時(shí)間后添加ADH，然后培養(yǎng)4-20小 時(shí)；iv)滲濾，以去除未反應(yīng)的ADH;以及V)在MES緩沖液和EDAC存在下，將ADH活化的多 糖與純化的未活化載體蛋白以0. 75-1. 5的比例進(jìn)行反應(yīng)，然后培養(yǎng)3-4小時(shí)，特征在于：所 述結(jié)合反應(yīng)在2-8°C的溫度下進(jìn)行獲得20%到約30%的結(jié)合物產(chǎn)量，并且在最終的結(jié)合物 中的糖與蛋白比例為0. 2到0. 6。
[0011] 另外，腦膜炎奈瑟菌糖載體蛋白結(jié)合物也可以通過以下的結(jié)合反應(yīng)來制備：i)對(duì) 多糖進(jìn)行分級(jí)；ii)對(duì)具有IOOKda至150Kda平均分子量的分級(jí)多糖，在9至9. 5的pH下 進(jìn)行基于CPPT的活化；iii)在2-3分鐘后以糖：蛋白質(zhì)為0. 5-2的比例添加ADH活化的蛋 白質(zhì)，然后培養(yǎng)2-20小時(shí)，特征在于：所述結(jié)合反應(yīng)在22°C-25°C進(jìn)行獲得5 %到約10 %的 結(jié)合物產(chǎn)量。
[0012] 因此，本發(fā)明涉及多價(jià)腦膜炎球菌多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物組合物，其包括來自血清群X 的莢膜糖和來自血清群A、C、W135、Y中的至少一個(gè)莢膜糖，其中：i)多糖ACW135X被機(jī)械 地分級(jí)，而多糖Y被化學(xué)地分級(jí)；ii)，通過具有氰基化結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的連接體將全部的糖 都結(jié)合到載體蛋白；iii)在最終的結(jié)合物中所有的糖與蛋白質(zhì)的比例為〇. 2-0. 6 ;并且iv) 使用選自TT、DT和CRM197至少兩種不同的載體蛋白質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為在MenXPs(215KDa)結(jié)合到肼衍生的TT時(shí)的結(jié)合反應(yīng)的疊加圖；
[0014] 圖2為在MenXPs(215KDa)結(jié)合到肼衍生的TT時(shí)的純化結(jié)合物；
[0015] 圖3為在MenXPs(326KDa)結(jié)合到ADH衍生的TT時(shí)結(jié)合反應(yīng)的疊加圖；
[0016] 圖4為在MenXPs(326KDa)結(jié)合到ADH衍生的TT時(shí)的純化結(jié)合物；
[0017] 圖5為在MenXPs(120KDa)結(jié)合到ADH衍生的TT時(shí)結(jié)合反應(yīng)的疊加圖；
[0018] 圖6為在MenXPs(120KDa)結(jié)合到ADH衍生的TT時(shí)的純化結(jié)合物；
[0019] 圖7為本地腦膜炎球菌X多糖的色譜圖；
[0020] 圖8為在用ADH活化的MenXPs(510KDa)結(jié)合到純化的TT時(shí)結(jié)合反應(yīng)的疊加 圖；
[0021] 圖9為在用ADH活化的MenXPs(510KDa)結(jié)合到純化的TT時(shí)的純化結(jié)合物；
[0022] 圖10為在用ADH活化的MenXPs(250KDa)結(jié)合到純化的TT時(shí)結(jié)合反應(yīng)的疊加 圖；
[0023] 圖11為在用ADH活化的MenXPs(250KDa)結(jié)合到純化的TT時(shí)的純化結(jié)合物。

【具體實(shí)施方式】
[0024] "多價(jià)免疫原性組合物"是指：
[0025] 組合物1包括：(a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的 結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；（c) (i)血 清群Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)白喉類毒素的結(jié)合物；(d) (i)血清群W135腦膜炎奈 瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；以及（d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜 糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物。
[0026] 組合物2包括：(a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的 結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c) (i)血清群 Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟 菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii) CRM197的結(jié)合物。
[0027] 組合物3包括：（a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物； (b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c) (i)血清群Y腦膜炎 奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜 糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類 毒素的結(jié)合物，其特征在于：含有破傷風(fēng)類毒素作為載體蛋白質(zhì)的結(jié)合物被發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng) 含有CRM197作為載體蛋白質(zhì)的結(jié)合物的免疫原性。
[0028] 組合物4包括：(a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的 結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c) (i)血清群Y 腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜 糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類 毒素的結(jié)合物。
[0029] 組合物5包括：（a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物； (b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c) (i)血清群Y腦膜炎奈 瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii) CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié) 合物。
[0030] 因此在第一實(shí)施例中，所述組合物可以包括，含量為每0.5毫升劑量中 0· 5-10μg、0. 5-5μg或 0· 5-2μg的血清群A、C、Y、W135 以及X糖。
[0031] 第一實(shí)施例的另一個(gè)方面為，所述組合物可以包括：1〇μg的血清群A糖、5μg的 血清群C糖、5μg的血清群Wl35糖、5μg的血清群Y糖以及5μg的血清群X糖。
[0032] 替換的，所述多價(jià)免疫原性組合物可以包括：5μg的血清群A糖、5μg的血清群C 糖、5μg的血清群Wl35糖、5μg的血清群Y糖以及5μg的血清群X糖。
[0033] 因此在第二實(shí)施例中，所述一個(gè)或多個(gè)腦膜炎奈瑟菌糖結(jié)合物可以被選擇性地吸 附到氫氧化鋁、磷酸鋁或二者的混合物上，或者不被吸附到佐劑上。
[0034] 第二實(shí)施例的一個(gè)方面為，所述鋁鹽佐劑可以每0. 5毫升劑量中Al+++為 20-300μg、20-200μg、25-150μg的量添加。
[0035] 第二實(shí)施例的另一個(gè)方面為，所述鋁鹽佐劑可以每0. 5毫升劑量中Al+++為 25-125μg的量添加。
[0036] 本發(fā)明的第三實(shí)施例為，所述組合物可以包括選自硫柳汞和2-苯氧基乙醇的防 腐劑。
[0037] 第三實(shí)施例的一個(gè)方面為，所述組合物可以進(jìn)一步包括：磷酸鈉、氯化鈉或或其組 合。
[0038] 本發(fā)明的第四實(shí)施例為，所述多價(jià)免疫原性組合物可以為緩沖液體的形式或凍干 的形式。
[0039] 第四實(shí)施例的一個(gè)方面為，所述凍干免疫原性組合物可以包含選自以下的穩(wěn)定 劑組合：a) 2至5% (w/v)的海藻糖、0.25至0.75 %的朽1檬酸鈉；b) 2至5% (w/v)的鹿糖 和0· 25至0· 75%的檸檬酸鈉；c)2至5% (w/v)的蔗糖、2至5% (w/v)的乳糖和0· 25至 0. 75%的檸檬酸鈉；以及d) 2至5% (w/v)的海藻糖、2至5% (w/v)的乳糖和0. 25至0. 75% 檸檬酸鈉。
[0040] 第四實(shí)施例的另一個(gè)方面為，所述凍干免疫原性組合物可以進(jìn)一步包含選自三羥 甲基氨基甲烷和磷酸鹽中的緩沖劑。
[0041] 因此，在第五實(shí)施例中，所述多糖ACW和X可以被機(jī)械地分級(jí)，從而具有 100-600Kda、100-400Kda、優(yōu)選100-200Kda、最優(yōu)選100-150Kda的平均分子量。優(yōu)選諸如均 質(zhì)化、高壓微射流細(xì)胞粉碎的機(jī)械分級(jí)方法。
[0042] 在第五實(shí)施例的另一個(gè)方面中，可以通過選自酸水解、堿性降解、高碘酸鹽氧 化、臭氧分解、酶促水解、超聲處理、電子光束破裂的方法，來將所述多糖Y分級(jí)為具有 90-110KDa的平均分子量。優(yōu)選地，化學(xué)分級(jí)是通過利用溫度為從60°C到80°C的醋酸鈉進(jìn) 行的。
[0043] 在第六實(shí)施例中，通過具有氰基化結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的異源或同源雙功能連接體，將 每種腦膜炎奈瑟菌糖結(jié)合到載體蛋白上。
[0044] 在第六實(shí)施例的一個(gè)方面中，通過利用選自以下、但不限制于以下的氰基化試劑 來活化所述分級(jí)的多糖：1_氰基-4-(二甲氨基）_吡啶四氟硼酸鹽（"CDAP"）、p_硝基苯 基氰酸鹽和N-氰基三乙胺四氟硼酸鹽（"CTEA"）。在優(yōu)選的結(jié)合方法中，除了⑶PA的氰 基化試劑可以從以下中選擇：1_氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸鹽（CPPT)、1-氰基-咪唑 (I-Cl)、1-氰基苯并三唑（I-CBT)、或2-氰基噠嗪-3 (2H)-酮（2-CP0)，及其功能性衍生物 或或修飾物。
[0045] 在第六實(shí)施例的另一個(gè)方面中，將所述活化多糖或載體蛋白，尤其是多糖，與酰 肼、碳酰肼、酰肼氯化物、二酰肼及其混合物進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選與己二酸二酰肼進(jìn)行反應(yīng)。
[0046] 可以使用碳化二亞胺反應(yīng)，通過蛋白質(zhì)上的天冬氨酸和谷氨酸殘基的羧基基團(tuán)來 將酰肼基團(tuán)引入到蛋白質(zhì)中，例如，在存在EDC的情況下，通過與酰肼、碳酰肼、琥珀二酰 肼、己二酸二酰肼、酰肼氯化物（例如，二鹽酸肼）或任何其他二酰肼進(jìn)行反應(yīng)。使用EDC 作為催化劑來活化并修飾具有酰肼或二酰肼的蛋白質(zhì)反應(yīng)物。任何水溶性碳化二亞胺，包 括EDC都可以用作催化劑。EDC催化蛋白質(zhì)通常具有聚合和沉淀的傾向。參見：Schneerson 等，Infect.Immun.，1986,80, 519-528;Shafer等，Vaccine，2000,18 (13) : 1273-1281 ;以及 Inman等，Biochemistry,1969 ;8:4074-4082。
[0047] 在第七實(shí)施例中，所述多價(jià)腦膜炎球菌多糖蛋白質(zhì)結(jié)合物組合物包含：分別結(jié)合 到兩種或更多種不同類型的載體蛋白的來自A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、Y和Z的多糖。 所述莢膜糖選自腦膜炎球菌血清群A、C、W135Y和X，使得所述組合物包括來自1、2、3、4或 5這五個(gè)血清群的糖。具體的組合物包括來自以下的糖：血清群A&X;血清群X&W135 ;血清 群X&Y;血清群C&X;血清群AY&X;血清群C、X&W135 ;血清群X、Y&W135 ;血清群A、C&X;血 清群Y、C&X;血清群A、W&X;血清群Y&W135&C&X;血清群Y&W135&A&X;血清群C&W135&A&X; 血清群Y&C&A&X;血清群A&C&Y&W135&X。優(yōu)選至少包含血清群X的組合物，并且最優(yōu)選包含 來自所有五個(gè)血清群的糖的組合物。
[0048] 在第七實(shí)施例的一個(gè)方面中，可以從以下、但不限于以下中選擇所述載體蛋白：CRM197、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素百日咳類毒素、大腸桿菌（E.coli)LT、E:coliST、以 及來自綠膿桿菌的外毒素A、外膜復(fù)合物c(OMPC)、孔蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血 素、肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附蛋白（PsaA)、肺炎鏈球菌表面蛋白BVH-3 和BVH-11、炭疽桿菌的保護(hù)性抗原（PA)、炭疽桿菌的脫毒水腫因子（EF)和致死因子（LF)、 卵清蛋白、鎖孔血藍(lán)蛋白（KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白（BSA)以及結(jié)核菌素（PPD)的 純化蛋白衍生物。優(yōu)選地，所要利用的蛋白質(zhì)載體的組合包括：破傷風(fēng)類毒素&白喉類毒 素、CRM197&破傷風(fēng)類毒素。
[0049] 在第三實(shí)施例的一個(gè)方面中，結(jié)合反應(yīng)利用選自己二酸二酰肼、氨基己酸、氯 己醇二甲縮醛、D-葡醛內(nèi)酯、胱胺以及P-硝基苯基氰酸鹽的連接體。
[0050] 在結(jié)合后，可以通過以下任何標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將結(jié)合物從未反應(yīng)的蛋白質(zhì)純化和多糖 中純化，所述技術(shù)包括：尤其是，尺寸排阻色譜法、密度梯度離心法、超濾法、疏水作用色譜 法或硫酸銨分級(jí)分離法。參見：例如，Ρ.W.Anderson等，（1986)，Immunol, 137 :1181-1186, 進(jìn)一步參見：H.J.Jennings和C.Lugowski(1981),Immunol, 127 :1011_1018。
[0051]在第八實(shí)施例中，本發(fā)明的所述免疫原性組合物可以進(jìn)一步包括額外的非腦膜 炎球菌多糖蛋白結(jié)合物，其中，用于使用的所述多糖和低聚糖選自，但不局限于：血清群1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F以及 33F的肺炎球菌多糖；b型流感嗜血桿菌磷酸多核核糖（Haemophilusinfluenzaetypeb polysaccharidepolyribosylribitolphosphate)、血清型III和V的B群鏈球菌多糖以 及傷寒桿菌Vi多糖。肺炎球菌和B群鏈球菌血清型的其它多糖也適合用于本發(fā)明，不依賴 T的多糖和低聚糖抗原也一樣適用，例如，來自A群鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、克雷伯氏肺 炎桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、炭疽桿菌的多糖或低聚糖。雖然特別優(yōu)選的是細(xì)菌多糖和低 聚糖，但是也可以使用革蘭氏（_)細(xì)菌脂多糖和脂寡醣體及它們的多糖和低聚糖衍生物、 以及病毒多糖（viralpolysaccharides)和低聚糖。
[0052] 可以以各種方式呈現(xiàn)并組裝發(fā)明的組合物?？梢詫⑺鼋M合物放置在瓶（vials) 中，或者可以將它們放置在方便填充的注射器（ready-filledsyringes)中。注射器可以提 供針頭或不提供針頭。一支注射器可包括單次劑量的組合物，而一個(gè)瓶可以包括單次或多 次劑量。可注射的組合物通常是液體溶液或懸浮液。替換的，它們也可以以固體形式存在 (例如，凍干），用于在注射前在液態(tài)載體中溶解或懸浮。
[0053] 實(shí)施例：
[0054] 實(shí)施例1 :
[0055] 腦膜炎球菌X多糖的制備
[0056] a)腦膜炎球菌X多糖的發(fā)酵和純化
[0057] 在最佳發(fā)酵條件下的連續(xù)分批補(bǔ)料發(fā)酵模式中利用合適的發(fā)酵培養(yǎng)基來從腦膜 炎奈瑟菌菌株（8210&9601)中獲取腦膜炎球菌X多糖。進(jìn)一步的，腦膜炎球菌X多糖通常 由包含以下步驟的方法來制備：基于CTAB的沉淀、乙醇（96% )處理然后深層過濾、碳濾、 CaCl2沉淀、乙醇（96% )處理以及超濾。
[0058] b)腦膜炎球菌X多糖的分級(jí)
[0059] 將純化的腦膜炎球菌X多糖在大約30_40kpsi的壓力下在WFI中進(jìn)行1-2遍的機(jī) 械分級(jí)（定常系統(tǒng)細(xì)胞破碎儀）。
[0060] 實(shí)施例2 :
[0061] 將腦膜炎球菌X多糖結(jié)合到載體蛋白質(zhì)
[0062] a)將平均分子量變化的腦膜炎球菌X多糖結(jié)合到肼衍生的破傷風(fēng)類毒素（TT)
[0063] 第一，利用90mg的CDAP(以100mg/ml溶解在氰化甲燒中）來活化（30mg/ml) 45mg 的在SECHPLC上的平均分子量為215kD的均質(zhì)化的X(菌株9601)多糖，利用IM氫氧化鈉 將混合物的pH值調(diào)整到9. 5。3分鐘后向反應(yīng)中加入67. 5的肼活化的TT(30mg/ml，在IM氯 化鈉中）。在HPLC上監(jiān)測反應(yīng)并且反應(yīng)一直持續(xù)到18小時(shí)。18小時(shí)后，通過加入甘氨酸對(duì) 反應(yīng)進(jìn)行淬滅，并且通過在IOmMPH7. 2的三羥甲基氨基甲烷（Tris)中用300kDTFF膜進(jìn) 行滲濾以對(duì)粗結(jié)合物進(jìn)行純化。使用PBS作為流動(dòng)相以Iml/分鐘流速的連續(xù)流過Shodex 柱SB-804HQ和SB-805HQ。通過磷分析法和改良的Lowry分析法分別測定多糖濃度和蛋白 質(zhì)濃度。
[0064] 第二，利用150mg的CPPT(以114mg/ml溶解在氰化甲燒中）來活化（24mg/ml，在 2M氯化鈉中）60mg的在SECHPLC上的平均分子量為326kD的X(菌株8210)多糖，并且利 用2. 5M氫氧化鈉將混合物的pH值調(diào)整到9. 5。3分鐘后向反應(yīng)中加入37. 5mg的ADH活化 的TT(37mg/ml，在2M氯化鈉中），并且在HPLC上監(jiān)測反應(yīng)并且反應(yīng)一直持續(xù)到5小時(shí)。5 小時(shí)后，通過加入甘氨酸對(duì)反應(yīng)進(jìn)行淬滅，并且在IOmMPBS中使用500kDTFF膜進(jìn)行滲濾、 隨后使用IOmMpH7. 2三羥甲基氨基甲烷（Tris)，對(duì)粗結(jié)合物進(jìn)行純化。
[0065] 進(jìn)一步的，利用400mg的CPIP(以114mg/ml溶解在氰化甲燒中）來活化（20mg/ ml，在IM氯化鈉中）200mg的在SECHPLC上具有120kD平均分子量的X(菌株8210)多糖， 并且利用IM氫氧化鈉將混合物的pH值調(diào)整到9. 5。3分鐘后向反應(yīng)中加入150mg的ADH 活化的TT(30mg/ml)。在HPLC上監(jiān)測反應(yīng)并且反應(yīng)一直持續(xù)到4小時(shí)。4小時(shí)后，通過加 入甘氨酸對(duì)反應(yīng)進(jìn)行淬滅，并且通過在IOmMPBS中使用300kDTFF膜進(jìn)行滲濾、隨后使用 IOmMpH7. 2三羥甲基氨基甲烷（Tris)，對(duì)粗結(jié)合物進(jìn)行純化。
[0066]b)利用ADH活化具有變化的平均分子量的腦膜炎球菌X多糖并將其結(jié)合到非活化 的破傷風(fēng)類毒素（TT)上
[0067] 第一，利用400mg的CPPT(以114mg/ml溶解在氰化甲烷中）來活化（27mg/ml，在 2M氯化鈉中）200mg的在SECHPLC上具有平均分子量為5IOkD的X(菌株8210)多糖，并且 利用2. 5M氫氧化鈉將混合物的pH值調(diào)整到9. 5。3分鐘后加入I. 5g的ADH(100mg/ml，在 碳酸鹽緩沖液中），并且反應(yīng)一直持續(xù)到4小時(shí)。4小時(shí)后，加入甘氨酸并且在8kDTFF膜 上對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行滲濾。進(jìn)一步的，濃縮ADH-腦膜炎球菌X多糖。向44mg的這種多糖 (7.511^/1111)加入純化的1'1'(37.511^/1111，在0.9%氯化鈉中）和1^3?!16.0緩沖液，使得最 終MES的緩沖劑強(qiáng)度為IOOmM,接著加入37. 5mg的EDAC(溶解于IOOmMMES，pH6. 0)。在 HPLC上監(jiān)測反應(yīng)并且反應(yīng)一直持續(xù)到4小時(shí)。通過在Akta色譜系統(tǒng)（GEAmersham)上使 用ToyopearlHW65樹脂，由凝膠過濾色譜法移除未結(jié)合的多糖。基于峰形和糖-蛋白質(zhì)比 率收集并集中饋分（fractions)。
[0068] 第二，將具有在SECHPLC上的平均分子量為250kD的X(菌株8210)多糖濃縮為 18mg/ml，在2M氯化鈉中。利用296mg的CPPT(以114mg/ml溶解在氰化甲烷中）來活化 200mg質(zhì)量的這種多糖，并且利用2. 5M氫氧化鈉將混合物的pH值調(diào)整到9. 5。3分鐘后加 入I. 12g的ADH(100mg/ml，在碳酸鹽緩沖劑中），并且反應(yīng)一直持續(xù)到4小時(shí)。4小時(shí)后，力口 入甘氨酸并且在8kDTFF膜上滲濾反應(yīng)混合物。然后濃縮ADH-腦膜炎球菌X多糖。進(jìn)一 步向20〇11^的這種多糖（7.511^/1111)加入純化1'1'(36.711^/1111，在0.9%氯化鈉中）和1^3?!1 6. 0緩沖液，使得最終MES的緩沖液的強(qiáng)度為IOOmM,接著加入200mg的EDAC(溶解于IOOmM MES，pH6. 0)。在HPLC上監(jiān)測反應(yīng)并且反應(yīng)一直持續(xù)到4小時(shí)。通過在IOmMPBS中使用 500kDTFF膜滲濾、隨后使用IOmMpH7. 2三羥甲基氨基甲烷，對(duì)粗結(jié)合物進(jìn)行純化。
[0069] 表1腦膜炎球菌X多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種免疫原性組合物，包括腦膜炎奈瑟菌（N. meningitidis) X多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物， 其中，所述莢膜X糖源于選自8210和9601的腦膜炎奈瑟菌X菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，至少一種額外的糖結(jié)合物源于血清 群A、B、C、W135和Y的腦膜炎奈瑟菌莢膜糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述腦膜炎奈瑟菌X菌株選自8210、 9601、9592、9554 和 2526。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫原性組合物，其中，通過使用至少兩種不同的載體蛋白 質(zhì)來結(jié)合全部5種多糖，所述組合物包括腦膜炎奈瑟菌血清群A、C、W-135、Y&X的每種莢膜 多糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的免疫原性組合物，其中，將每種腦膜炎奈瑟菌糖結(jié)合到載 體蛋白質(zhì)上，所述載體蛋白質(zhì)選自TT、DT、CRM197、TT的片段C、蛋白質(zhì)D、OMPC以及肺炎球 菌溶血素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫原性組合物，其中，將每種腦膜炎奈瑟菌糖結(jié)合到選自 TT、DT、CRM197的載體蛋白質(zhì)上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫原性組合物，其中，將每種腦膜炎奈瑟菌糖結(jié)合到選自 TT和DT的載體蛋白質(zhì)上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括：(a) (i)血清群A腦 膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢 膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；（c) (i)血清群Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)白喉 類毒素的結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合 物；以及（d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括：(a) (i)血清群A腦 膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii) CRM197的結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與 (ii)CRM197的結(jié)合物；(c) (i)血清群Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié) 合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii) CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i)血 清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物，其特征在于：含有破傷風(fēng)類 毒素作為載體蛋白質(zhì)的結(jié)合物被發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)含有CRM197作為載體蛋白質(zhì)的結(jié)合物的免 疫原性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括：(a)(i)血清群A 腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的 莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c) (i)血清群Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類 毒素的結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii) CRM197的結(jié)合物；以及 (d) (i)血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括：(a)(i)血清群A 腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的 莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c)⑴血清群Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的 結(jié)合物；（d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i) 血清群X腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括：(a)(i)血清群A 腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii) CRM197的結(jié)合物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖 與（ii)CRM197的結(jié)合物；（c)⑴血清群Y腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物； (d) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)CRM197的結(jié)合物；以及（d) (i)血清群X 腦膜炎奈瑟菌的莢膜糖與（ii)破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，每種莢膜多糖具有100到600Kda的 平均分子量大小。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的免疫原性組合物，其中，每種莢膜多糖具有100到300Kda 的平均分子量大小。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫原性組合物，其中，每種莢膜多糖具有100到200Kda 的平均分子量大小。
16. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，來自血清群A、C、W135和X的至少 三種的腦膜炎奈瑟菌多糖在分級(jí)后（post-sizing)具有在100到150Kda之間的平均大小。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述分級(jí)是通過使用高壓細(xì)胞粉 碎系統(tǒng)進(jìn)行的。
18. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，來自血清群Y的腦膜炎奈瑟菌多糖 在化學(xué)分級(jí)后（post-chemical sizing)具有在90到llOKda之間的平均大小。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的免疫原性組合物，其中，所述化學(xué)分級(jí)是通過使用溫度為 從60°C到80°C的醋酸鈉進(jìn)行的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，通過具有氰基化結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的異 源或同源雙功能連接體，來將每種腦膜炎奈瑟菌糖結(jié)合到載體蛋白上。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫原性組合物，其中，所述連接體為ADH。
22. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述氰基化試劑選自： 1-氰基-4-吡咯烷基吡啶四氟硼酸鹽（CPPT)、1-氰基-咪唑（1-C1)、1-氰基苯并三唑 (1-CBT)、或2-氰基噠嗪-3 (2H)-酮（2-CP0)，及其功能性衍生物或修飾物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫原性組合物，其中，所述腦膜炎奈瑟菌X糖-破傷風(fēng)類 毒素結(jié)合物通過結(jié)合反應(yīng)制備，所述結(jié)合反應(yīng)包括：i)對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)；ii)對(duì)具有l(wèi)OOKda 至150Kda平均分子量的分級(jí)多糖，在9至9. 5的pH下進(jìn)行基于CPPT的活化；iii)在2-3 分鐘的持續(xù)時(shí)間后添加 ADH，然后培養(yǎng)4-20小時(shí)；iv)滲濾，以去除未反應(yīng)的ADH ;以及v) 在MES緩沖液和EDAC存在下，將ADH活化的多糖與純化的未活化載體蛋白以0. 75-1. 5的 比例進(jìn)行反應(yīng)，然后培養(yǎng)3-4小時(shí)，其特征在于：所述結(jié)合反應(yīng)在2-8°C的溫度下進(jìn)行，并且 在最終的結(jié)合物中的糖與蛋白比例為〇. 2到0. 6。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫原性組合物，其中，所述腦膜炎奈瑟菌X糖-破傷風(fēng) 類毒素結(jié)合物由結(jié)合反應(yīng)制備，所述結(jié)合反應(yīng)包括：i)對(duì)多糖進(jìn)行分級(jí)；ii)對(duì)具有l(wèi)OOKda 至150Kda平均分子量的分級(jí)多糖，在9至9. 5的pH下進(jìn)行基于CPPT的活化；iii)在2-3 分鐘后，以糖：蛋白質(zhì)為〇. 5-2的比例添加 ADH活化的蛋白質(zhì)，然后培養(yǎng)2-20小時(shí)，其特征 在于：所述結(jié)合反應(yīng)在22°C _25°C進(jìn)行，并且在最終的結(jié)合物中的糖與蛋白比例為0. 2到 0· 6〇
25. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，包括：含量為每0. 5毫升劑量中 0· 5-10 μ g、0. 5-5 μ g 或 0· 5-2 μ g 的血清群 A、C、Y、W135 和 X 糖。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的免疫原性組合物，包括：10 μ g的血清群A糖、5 μ g的血清 群C糖、5 μ g的血清群W135糖、5 μ g的血清群Y糖以及5 μ g的血清群X糖。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的免疫原性組合物，包括：5 μ g的血清群A糖、5 μ g的血清 群C糖、5 μ g的血清群W135糖、5 μ g的血清群Y糖以及5 μ g的血清群X糖。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的免疫原性組合物，其中，所述一個(gè)或多個(gè)腦膜炎奈瑟菌糖 結(jié)合物可以被選擇性地吸附到氫氧化鋁、磷酸鋁或二者的混合物上，或者不被吸附到佐劑 上。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的免疫原性組合物，包括以每0. 5毫升劑量中A1+++為 20-300 μ g、20-200 μ g、25-150 μ g的量添加鋁鹽佐劑的步驟。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的免疫原性組合物，包括以每0. 5毫升中A1+++為25-125 μ g 的量添加鋁鹽佐劑的步驟。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的免疫原性組合物，進(jìn)一步包括選自從硫柳汞和2-苯氧基乙 醇的防腐劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括：磷酸鈉、氯化鈉 或其組合。
33. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中，所述糖結(jié)合物為緩沖液體 的形式。
34. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中，所述糖結(jié)合物為凍干的形 式。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的凍干免疫原性組合物，其中，穩(wěn)定劑組合選自：a)2至5% (w/v)的海藻糖、0.25至0.75%的檸檬酸鈉；b) 2至5% (w/v)的蔗糖和0.25至0.75%的 檸檬酸鈉；c) 2至5 % (w/v)的蔗糖，2至5 % (w/v)的乳糖和0· 25至0· 75 %的檸檬酸鈉； 以及d) 2至5% (w/v)的海藻糖，2至5% (w/v)的乳糖和0.25至0.75%朽1檬酸鈉。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的凍干免疫原性組合物，進(jìn)一步包含選自三羥甲基氨基甲烷 和磷酸鹽中的緩沖劑。
37. -種使人類宿主對(duì)由腦膜炎奈瑟菌感染引起的疾病具有免疫力的方法，包括對(duì)所 述宿主施用免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-36所述的免疫原性組合物或疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/116GK104302315SQ201380017781
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月30日
【發(fā)明者】蘇布哈什·維納亞克·卡普雷, 薩姆哈吉·尚卡爾·皮薩爾 申請(qǐng)人:印度血清研究所公司