專利名稱：超聲微泡介導(dǎo)的基因遞送系統(tǒng)的制作方法
第1/11頁(yè)超聲微泡介導(dǎo)的基因遞送系統(tǒng)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將局部超聲介導(dǎo)的荷有基因/化學(xué)藥物的含氣(gas filled)微泡系統(tǒng)用于腹膜疾病的方法。若干出版物通過括號(hào)內(nèi)的阿拉伯?dāng)?shù)字被引作本文的參考。這些參 考文獻(xiàn)的完整引文可在本說明書的結(jié)尾處找到。本文所引用的參考文 獻(xiàn)，包括專利和已公開的專利申請(qǐng)?jiān)趦?nèi)，均通過參考結(jié)合到本文中。 發(fā)明背景盡管病毒型載體業(yè)已顯示有效將治療性DNA遞送至包括心血管 系統(tǒng)、肺、腎和腫瘤在內(nèi)的各種組織中，但是主要的顧慮仍然在于使 用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的安全性，這些病毒可能會(huì)引起免疫應(yīng)答和具 有插入突變潛在性[1,2]。為了克服這些缺點(diǎn)，業(yè)已報(bào)道了幾種非病毒 方法，包括脂質(zhì)型載體體系和電穿孔法。最近，我們和其它研究者已 報(bào)道超聲微泡在腎、心血管組織和腫瘤中顯著提高基因轉(zhuǎn)染率[3-12]。 然而，將超聲微泡介導(dǎo)的基因/藥物治療用于腹膜疾病(包括腹膜纖維 化，術(shù)后腹膜粘連，腹膜炎和腹膜腫瘤)還沒有報(bào)道過。超聲本身被認(rèn)為是對(duì)人體無害的，廣泛用于許多臨床目的，包括 物理治療，診斷，指導(dǎo)深部器官活檢，局部藥物遞送和遺傳物質(zhì)遞送， 在美國(guó)專利第5,190，766號(hào)中已有描述。根據(jù)在美國(guó)專利中所描述， 大部分微泡造影劑還是安全的試劑且廣泛應(yīng)用于臨床，其中包括含氣 脂類(美國(guó)專利第5,580,575號(hào))和白蛋白微泡如Optison[13-16]。大部 分微泡在室溫都為液態(tài)，但體溫中它們變成具有平均3lam直徑的含氣 微泡。微泡有彈性且可壓縮，是超聲的有效反射物。微泡通過在超聲束中共振；根據(jù)聲波的壓力變化快速收縮和膨脹 來發(fā)揮作用。微泡可通過自身和作為攜帶藥物或遺傳物質(zhì)的媒介幫助4藥物送遞，用于位點(diǎn)特異性治療和基因治療[13-16]。利用超聲微泡技術(shù)轉(zhuǎn)移基因的明確機(jī)制仍基本未知。它可與聲孔效應(yīng)、超聲機(jī)械指數(shù)和超聲頻率[15， 16]有關(guān)?；诔暤牟呗栽?是使用超聲造影劑降低由超聲能量引起的空化閾值。利用微泡和包被 物質(zhì)的物理性質(zhì)，可將基因引入(incorporate)超聲造影劑中[13, 14]。可經(jīng)靜脈內(nèi)或局部注射荷有基因的微泡，再將超聲能量施用到所 述靶區(qū)域。隨著微泡進(jìn)入超聲作用區(qū)域，它們空化并局部釋放 DNA[13， 14]。空化也有可能引起局部沖擊波增加細(xì)胞通透性，從而 提高細(xì)胞內(nèi)的DNA攝取[13-16]。掃描電鏡術(shù)也可證明，超聲連同微 泡(Optison)在細(xì)胞表面瞬時(shí)形成在24小時(shí)內(nèi)不再能檢測(cè)的孔(< 5 |im) [17]。在患有晚期腎病并接受最方便價(jià)廉的腎臟替代療法:持續(xù)腹膜透 析(PD)的患者中，腹膜炎/纖維化是常見的并發(fā)癥。它是PD技術(shù)失效 的主要原因，導(dǎo)致這些PD患者改換更昂貴的血液透析。另外，腹膜 粘連也是一種纖維化病變，其發(fā)生在相當(dāng)大比例的接受腹部外科的患 者中，并促使各種并發(fā)癥包括腸梗阻、女性不育癥和慢性腹痛，導(dǎo)致 高發(fā)病率和死亡率以及造成衛(wèi)生保健的高額支出。我們已經(jīng)表明，腹 膜纖維化由稱為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P (TGF-p)的纖維生成介質(zhì)通過其下游 信號(hào)通路激活Smad2/3來介導(dǎo)。本發(fā)明提供了由超聲觸發(fā)的、荷有基 因的微泡來局部釋放名為Smad7的抗纖維化和抗炎基因，以特異性抑 制TGF-p/Smad信號(hào)途徑，從而抑制腹膜纖維化以及在各種疾況下與 長(zhǎng)期腹膜纖維化相關(guān)的腹膜炎。 發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了一種方法，用于將一種或多種基因、DNA分子或質(zhì) 粒遞送至患者腹膜區(qū)來治療其中的腹膜疾病，該方法包括提供含有一 種或多種用來治療腹膜疾病的基因、DNA分子或質(zhì)粒的微泡來源；向 患者腹膜區(qū)灌注所述微泡；將充足超聲能量提供給腹部區(qū)，以使所述 一種或多種基因、DNA分子或質(zhì)粒從微泡轉(zhuǎn)染至腹膜區(qū)，以滲透其中構(gòu)成的腹膜組織。 附圖簡(jiǎn)述通過閱讀以下優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述以及附圖，本發(fā)明進(jìn)一步的特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的，所述附圖為

圖1顯示顯微照片和功能數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的超聲微泡治療腹膜組 織的安全性。圖2顯示超聲微泡介導(dǎo)的Smad7轉(zhuǎn)基因在腹膜組織中表達(dá)的效 率，其通過抗-flag-m2Smad7免疫染色和RT-PCR(B)證明，其中U表 示尿毒癥，PD表示腹膜透析，CV表示對(duì)照載體。圖3通過蛋白印跡和RT-PCR，證明超聲微泡介導(dǎo)的Smad7基因 療法阻斷腹膜TGF-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(p-Smad2/3)的激活而不阻斷其表達(dá) 的沖幾制。圖4揭示了超聲微泡介導(dǎo)的Smad7基因療法在腹膜透析期間促進(jìn) 腹膜功能的療效。圖5顯示組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的顯微照片，通過Mason三色染 液(藍(lán)色)染色和膠原蛋白I免疫染色(棕色)，表明超聲微泡介導(dǎo)的 Smad7基因療法抑制與尿毒癥大鼠中腹膜透析相關(guān)的腹膜纖維化。圖6是半定量數(shù)據(jù)，顯示了在腹膜透析期間超聲微泡介導(dǎo)的 Smad7基因療法通過抑制膠原蛋白I和膠原蛋白III的mRNA和蛋白 表達(dá)，來阻滯腹膜纖維化。圖7是半定量數(shù)據(jù)，顯示了在腹膜透析期間超聲微泡介導(dǎo)的 Smad7基因療法通過阻斷cc -SMA+肌成纖維細(xì)胞和纖連蛋白表達(dá)來抑 制腹膜纖維化。圖8顯示了在超聲微泡介導(dǎo)的Smad7基因治療之后，組織學(xué)和免 疫組化的顯微照片。根據(jù)Mason三色染液(藍(lán)色)和膠原蛋白I免疫染 色(棕色)表明，該療法抑制了與術(shù)后腹膜粘連相關(guān)的腹膜纖維化。圖9是定量實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)，顯示了超聲微泡介導(dǎo)的Smad7基因 療法通過阻斷膠原蛋白I、膠原蛋白III、 a-SMA和纖連基因表達(dá)來6抑制與術(shù)后腹膜粘連相關(guān)的腹膜纖維化。 優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供了 一種方法，用于將一種或多種基因、DNA分子或質(zhì) 粒遞送遞送至患者腹膜區(qū)來治療患者腹膜疾病，該方法包括提供含 有一種或多種用于治療腹膜疾病的基因、DNA分子或質(zhì)粒的微泡來 源；將微泡灌注至患者腹膜區(qū)；給予腹部區(qū)充足超聲能量，以使所述 一種或多種基因、DNA分子或質(zhì)粒微泡破裂，允許其穿透其中構(gòu)成 的腹膜組織。優(yōu)選所述微泡為大量成膜蛋白(filmogenic protein)包裹的不溶性 微泡，并充有不溶性全氟化碳?xì)怏w，例如(不限于)全氟曱烷，全氟乙 烷，全氟丙烷，全氟丁烷或全氟戊烷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微泡 直徑為約l-約5微米。所述超聲能量應(yīng)優(yōu)選按約0.5-約5MHz的頻率給予腹膜區(qū)，且應(yīng) 足以使患者腹膜腔(包括腹膜壁和腸系膜在內(nèi))中的所述微泡破裂。普 通技術(shù)人員應(yīng)能理解，應(yīng)對(duì)所施用的超聲能量的量進(jìn)行調(diào)整，使之足 夠降解、脹裂、破裂或分裂微泡，而不造成對(duì)腹膜區(qū)或包裹在微泡內(nèi) 的DNA的損傷。所述DNA應(yīng)能從微泡釋放至鄰近腹膜組織，在那里 它能被病變細(xì)胞和其它細(xì)胞吸收，而該DNA或其自身可摻入到或轉(zhuǎn) 染至宿主細(xì)胞基因組。利用本發(fā)明可治療的腹膜疾病包括腹膜腔內(nèi)的炎癥、纖維化、術(shù) 后腹膜粘連或癌癥。腹膜疾病可由腹膜輸注/透析、手術(shù)、創(chuàng)傷、感染、 遺傳或系統(tǒng)性疾病引起或與它們相關(guān)。重要的是，所述一種以上DNA分子或質(zhì)粒包括寡核苷酸、DNA、 DNA質(zhì)粒、siRNA、 shiRNA和微小RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 DNA分子是SMAD7轉(zhuǎn)基因，而在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DNA分子 為SMAD7 cDNA。因此，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療腹膜疾病(如腹膜炎/纖維化 和術(shù)后腹膜粘連)新方法，其利用超聲介導(dǎo)并涉及使靶基因從含氣微泡7局部釋放至腹膜組織。本發(fā)明有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。超聲微泡介導(dǎo)基因療法用于腹膜纖維化是安全的，因?yàn)樗炔粫?huì) 造成可檢測(cè)的組織學(xué)和功能上的損傷，也不會(huì)對(duì)正常腹膜組織有細(xì)胞毒性。將小DNA分子連同造影劑注射進(jìn)腹膜腔中，隨后以lMHz、 2 W/cn^的物理治療水平進(jìn)行經(jīng)皮膚超聲。此外，在進(jìn)行超聲輻照時(shí)通 過將溫度控制在約37°C,避免超聲誘導(dǎo)的熱量對(duì)組織的損傷也是可行 的。我們發(fā)現(xiàn)，能量輸出為2W/cm2、輻照間隔時(shí)間為30秒、總時(shí)間 為4-6分鐘，對(duì)于超聲直接輻照皮膚而言是安全的。本發(fā)明的重要優(yōu)點(diǎn)在于超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移至腹膜組織是暫時(shí) 的或瞬時(shí)的，所述轉(zhuǎn)染的Smad7基因在該腹膜組織中3-4周內(nèi)將會(huì)逐 漸降解，在14天時(shí)再次進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移以維持高水平Smad7是可行的。這表明與基于病毒的技術(shù)介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)所不同的是，超聲可不 將靶基因引入基因組。這可解釋為什么超聲介導(dǎo)的是暫時(shí)轉(zhuǎn)基因表 達(dá)。同樣地，就根據(jù)先前報(bào)道[l, 2]的插入誘變潛在性而言，病變組 織中Smad7轉(zhuǎn)基因的瞬時(shí)表達(dá)表明超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移比基于病毒 的方法更安全。高基因轉(zhuǎn)染率是超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的第二個(gè)優(yōu) 點(diǎn)。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)超過80。/。的腹膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染有Smad7基因，這與 我們之前報(bào)道一致，即在正常和患病大鼠腎的不同細(xì)胞類型中超聲使 基因轉(zhuǎn)染率顯著增至約1000倍[10-12]。使用本發(fā)明基因療法的另 一重要優(yōu)點(diǎn)是利用本發(fā)明中闡述的誘 導(dǎo)型基因療法來將病變組織中所轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)控制在治療水平內(nèi)， 并且不產(chǎn)生副作用。例如，雖然Smad7基因的過表達(dá)能夠阻斷 TGF-p/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和阻滯組織瘢痕化，但是據(jù)表明由多西環(huán)素 (doxycycline)誘導(dǎo)的Smad7在腎中的加強(qiáng)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡和 急性腎損傷。因此，將Smad7基因表達(dá)水平控制在治療水平，而在嘗 試過表達(dá)Smad7時(shí)使副作用最小化是至關(guān)重要的。本發(fā)明的另 一 方面是以下的局部療法通過直接注射Smad7基因 和微泡造影劑的混合物至腹膜腔，隨后經(jīng)由腹部皮膚直接進(jìn)行超聲局部治療。這顯著增強(qiáng)了局部療效，同時(shí)使經(jīng)靜脈途徑系統(tǒng)給予藥物或 基因所致的副作用最小化。對(duì)于腹膜疾病而言，從荷有基因的微泡至局部腹膜組織的超聲介 導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是安全有效的療法。作為液體或白蛋白形式的含氣微泡(直徑3pm)能攜帶藥物/基因以形成荷有藥物/基因的微泡[13-16]。微泡有 彈性、可壓縮并且是超聲的有效反射物。微泡通過在超聲束中共振； 根據(jù)聲波的壓力變化快速收縮和膨脹來發(fā)揮作用，導(dǎo)致由超聲能量引 起的空化閾值的降低[13-16]?？山?jīng)靜脈內(nèi)或局部注射荷有基因的微泡 并將超聲能量施用到耙區(qū)域。隨著微泡進(jìn)入超聲作用區(qū)域，它們空化 并局部釋放DNA和藥物。空化也有可能造成增加細(xì)胞通透性的局部 沖擊波，因而提高細(xì)胞內(nèi)攝取DNA[13-16]。在本研究中，將pcDNA3中的于NH2端具有flag標(biāo)簽(m2)的鼠 Smad7 cDNA亞克隆至四環(huán)素誘導(dǎo)型載體pTRE中，得到 pTRE-m2Smad7。為了實(shí)現(xiàn)多西環(huán)素(四環(huán)素衍生物)誘導(dǎo)Smad7轉(zhuǎn)基 因表達(dá)，使pTRE-m2Smad7和改良的pTet-on載體pEFpurop-Tet-on 共轉(zhuǎn)染至腹膜腔。在試點(diǎn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后第二天觀察到 外源Smad7在腹膜組織中的基因表達(dá)高峰，且轉(zhuǎn)基因表達(dá)以時(shí)間依賴 的形式減少。為了確保轉(zhuǎn)染的有效性，在PD的第1天和第14天將外 源Smad7施用到尿毒癥大鼠的腹膜腔中。接受了無Smad7插入的空 載體的PD尿毒癥大鼠作為治療對(duì)照。轉(zhuǎn)染的過程如下。使大鼠吸入 異氟烷進(jìn)行麻醉。將質(zhì)粒和樣i泡(Optison, Amersham Health Inc., Princeton, NJ， USA或者SonoVue， Bracco International B.V" Amsterdam, Netherlands)的混合物按1: 1體積比制備。然后立即將含有l(wèi)OOug質(zhì) 粒的混合溶液注射至腹膜腔。然后將介導(dǎo)超聲的凝膠施用到祛毛的腹 部皮膚。超聲換能器(Sonitron 2000, Rich-Mar Corp., Inola, Oklahoma, USA)以輸入頻率1 MHz、輸出強(qiáng)度2W/cm2、工作比(duty cycle) 20% 間隔30s總時(shí)為4分鐘直接施用到腹膜壁上。在所述基因轉(zhuǎn)移步驟之 后，注射1毫升的多西環(huán)素(500 pg/ml, Sigma)至腹膜腔以誘導(dǎo)Smad7轉(zhuǎn)基因表達(dá)，隨后飲用水中以200嗎/ml多西環(huán)素來維持轉(zhuǎn)基因表達(dá) 的誘導(dǎo)作用。用于腹膜纖維化的超聲微泡介導(dǎo)的基因療法的安全性是本發(fā)明 的最重要方面。用于腹膜纖維化的超聲微泡介導(dǎo)的基因療法是安全 的，因?yàn)樗欠乔忠u性的；通過將小DNA分子與造影劑注射進(jìn)腹膜 腔中，隨后以1 MHz、 2 W/cr^的物理治療水平進(jìn)行4分鐘經(jīng)皮膚的 超聲處理，既不會(huì)造成可檢測(cè)的組織學(xué)和功能上的損傷，也不會(huì)對(duì)正 常腹膜組織有細(xì)胞毒性。超聲本身被認(rèn)為是對(duì)人體無害的，并廣泛用 于許多臨床目的，包括物理治療、診斷、指導(dǎo)深部器官活檢、局部遞 送藥物和遺傳物質(zhì)[13-16]。所述微泡造影劑也是安全的，且廣泛應(yīng)用 于臨床。業(yè)已充分證明的是，微泡能通過自身幫助藥物遞送，并作為 攜帶藥物或遺傳物質(zhì)的試劑用于位點(diǎn)特異性治療和基因療法[13-16]。 此外，腹膜腔內(nèi)注射小DNA也是安全的。在進(jìn)行超聲輻照時(shí)通過將 溫度控制在約37°C避免由超聲引起的對(duì)組織的熱損傷也是可行的。 我們發(fā)現(xiàn)能量輸出在2 W/cm2、輻照間隔時(shí)間為30秒、持續(xù)至多6分 鐘對(duì)于超聲直接輻照皮膚而言是安全的。如圖l所示，不存在可檢測(cè) 到的、與超聲微泡治療有關(guān)的組織學(xué)或功能損傷。最重要的是，我們 還發(fā)現(xiàn)進(jìn)入腹膜組織的超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是暫時(shí)性的，這與臨床治 療相似。經(jīng)轉(zhuǎn)染的Smad7基因在該腹膜組織中于3-4周內(nèi)逐漸降解， 因其實(shí)用且無侵襲性，在14天時(shí)再次進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染以維持高水平 Smad7是可行的。這表明，與基于病毒的技術(shù)介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)不 同的是，超聲可不將靶基因引入基因組中。這可解釋為什么超聲介導(dǎo) 暫時(shí)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。同樣地，就插入突變的潛在性而言[l, 2]，病變 組織中Smad7轉(zhuǎn)基因的瞬時(shí)表達(dá)表明，超聲介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移比基于病 毒的方法更安全。總體而言，所述超聲微泡基因治療方法是安全的。由超聲微泡系統(tǒng)介導(dǎo)的高基因轉(zhuǎn)染率是本發(fā)明的另 一個(gè)顯著優(yōu) 點(diǎn)。長(zhǎng)期以來業(yè)已表明，低基因轉(zhuǎn)染率是使用非病毒型基因遞送系統(tǒng) 例如棵DNA和脂質(zhì)體時(shí)的主要缺點(diǎn)。通過超聲引發(fā)使基因從微泡中結(jié)果得以證實(shí)超過80%的表面間皮細(xì) 胞層腹膜細(xì)胞和亞間皮細(xì)胞(submesothelial cell)呈flag-M2 Smad7轉(zhuǎn)基 因陽(yáng)性(圖2A)，導(dǎo)致Smad7的顯著上調(diào)(圖2B),這是抗腹膜纖維化 的關(guān)鍵機(jī)制，因?yàn)镾mad7的過表達(dá)可通過抑制Smad2/3磷酸化來阻斷 TGF-卩/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活(圖3C)。利用超聲微泡技術(shù)來預(yù)防和治療腹膜纖維化的有效性是本發(fā)明 的關(guān)鍵方面。盡管腹膜纖維化是使腹膜透析技術(shù)失效的主要原因和共 同特征，但尚無專一且有效的療法可用來預(yù)防和治療該疾病。本發(fā)明 已表明，超聲介導(dǎo)的Smad7基因從白蛋白型微泡中釋放，能夠基本抑 制臨床特征為晚期腎病的尿毒癥大鼠中與腹膜透析相關(guān)的腹膜纖維 化的發(fā)展。如圖1-7所示，由超聲微泡介導(dǎo)基因療法致使的腹膜Smad7 過表達(dá)，導(dǎo)致Smad2/3活性的基本抑制(圖3C),從而阻滯膜膜透析相 關(guān)的腹膜纖維化(由保留腹膜功能來說明(圖4));減弱腹膜纖維增厚(圖 5);通過抑制膠原蛋白I和膠原蛋白m、纖連蛋白和cx-SMA表達(dá)來 阻止腹膜纖維化(圖6， 7)。此外，本發(fā)明還證明了超聲介導(dǎo)的Smad7基因表達(dá)能夠阻滯大鼠 中的與術(shù)后腹膜粘連/纖維化相關(guān)的腹膜纖維化(圖8)。事實(shí)上，外科 擦傷(surgical abrasion)四周后，該大鼠出現(xiàn)明顯腹膜粘連，包括a -SMA、膠原I和III、纖連蛋白的過表達(dá)。TGF-|3的表達(dá)增強(qiáng)和 TGF-J3/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化被超聲微泡介導(dǎo)的Smad7轉(zhuǎn)染阻斷(圖8， 9)。因此，經(jīng)超聲微泡介導(dǎo)系統(tǒng)來阻斷TGF-p/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑展 現(xiàn)了用于預(yù)防術(shù)后腹膜粘連的安全新型療法。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是如本文所述，利用誘導(dǎo)型基因療法 來將病變組織中轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)控制在治療水平內(nèi)卻不引起副作用； 而且這已應(yīng)用于基因治療。例如，雖然Smad7的過表達(dá)能夠阻斷 TGF-(3/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和阻滯組織瘢痕化，但是我們之前的結(jié)果也表 明由高濃度多西環(huán)素誘導(dǎo)的Smad7在腎中的過高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致大量細(xì) 胞凋亡和急性腎損傷[IO]。因此，將Smad7轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平控制在治ii療水平，而在嘗試使Smad7過表達(dá)時(shí)將副作用最小化是至關(guān)重要的。 利用直接腹膜注射荷有Smad7的微泡，再將局部超聲施用到病變 皮膚的局部療法是最有價(jià)值的一種。這避免了使用全身治療。事實(shí)上， 傳統(tǒng)腹膜疾病治療依靠全身用藥。這種方法通常不是有效的且可能造 成不良副作用。本發(fā)明已克服這一缺點(diǎn)，并大大提高了負(fù)性TGF-p信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad7局部表達(dá)有效性，從而抑制TGF-(3/Smad介導(dǎo)的腹 膜纖維化。
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權(quán)利要求
1.一種方法，用于將一種或多種用于治療腹膜疾病的基因、DNA分子或質(zhì)粒遞送至患者腹膜區(qū)，以治療其中的腹膜疾病，所述方法包括提供含有一種或多種用于治療腹膜疾病的基因、DNA分子或質(zhì)粒的微泡來源；向所述患者腹膜區(qū)灌注所述微泡；和給予足夠的超聲能量給所述腹部或腹膜區(qū)，以使所述一種或多種基因、DNA分子或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至患者腹部或腹膜組織。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微泡包含大量成膜蛋白包裹的不 溶性微泡。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述微泡充有不溶性全氟化碳?xì)怏w。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述全氟化碳?xì)怏w為全氟甲烷、全氟 乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述微泡直徑為1-5微米。
6. 權(quán)利要求3的方法，其中所述超聲能量以約0.5-約5MHz的頻 率給予。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述超聲能量造成微泡在腹膜組織內(nèi) 破裂。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述腹膜組織包括患者腹膜腔、腹壁 和腸系膜區(qū)內(nèi)的組織。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述腹膜疾病包括腹膜腔內(nèi)炎癥、纖 維化、術(shù)后腹膜粘連或腫瘤。
10. 權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種基因、DNA分子或 質(zhì)粒包括寡核苷酸、DNA、 DNA質(zhì)粒、siRNA、 shiRNA和微小RNA。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中所述腹膜疾病由腹膜輸注/透析、手 術(shù)、創(chuàng)傷、感染、遺傳或系統(tǒng)性疾病引起或與它們相關(guān)。
12. 權(quán)利要求l的方法，其中所述DNA分子是包括Smad7肽和 蛋白的SMAD7轉(zhuǎn)基因。
13. 權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA分子為SMAD7cDNA、 Smad7 ODN、 Smad7 siRNA和Smad7微小RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法，該方法具體利用由超聲觸發(fā)的荷有誘導(dǎo)型Smad7基因的微泡系統(tǒng)破裂來遞送諸如基因、質(zhì)粒和其他活性DNA相關(guān)分子等的藥劑，用于治療包括腹膜纖維化和術(shù)后腹膜粘連在內(nèi)的腹膜疾病。
文檔編號(hào)A61P41/00GK101600460SQ200780038602
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2007年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月14日
發(fā)明者藍(lán)輝耀, 黎嘉能 申請(qǐng)人:香港大學(xué)