一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物及應(yīng)用，以重量份計，該藥物組合物由包括如下組分的原料制備得到：枸杞10?20份，川芎8?12份，燈盞細辛8?12份，黃芪10?20份，女貞子10?20份，牛膝8?12份；中醫(yī)理論認為，慢性高眼壓導(dǎo)致視神經(jīng)損傷的主要病機是肝腎虧損，神水淤積，氣血失和，脈絡(luò)不通，目中玄府閉塞，基于“滋補肝腎、益氣活血”的治法，提出了本發(fā)明的藥物組合物，該藥物組合物對慢性高眼壓引起的視神經(jīng)損傷具有良好的療效。
【專利說明】
一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物及應(yīng)用， 具體地，涉及一種用于治療/預(yù)防/緩解視神經(jīng)損傷的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，用于保護視神經(jīng)損傷的方法包括藥物治療、基因療法、干細胞移植以及視網(wǎng) 膜移植等，它們通過不同的原理機制針對青光眼視神經(jīng)損傷的不同環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。藥物仍 然是臨床上最基本和最常見的治療手段，用于促進視神經(jīng)損傷修復(fù)的藥物主要包括以下幾 種:①鈣通道阻滯劑:眼壓升高，導(dǎo)致較多鈣離子自細胞外流入細胞內(nèi)，此時視網(wǎng)膜細胞Ca 2+ 超負荷，導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷。鈣通道阻滯劑通過抑制Ca2+通道和細胞內(nèi)Ca2+釋放來阻斷興奮性 氨基酸介導(dǎo)的毒性，同時還能抑制自由基，增加血流，穩(wěn)定細胞膜，因而減輕視網(wǎng)膜的損傷。 ②維生素類藥物:維生素C和維生素E合用有協(xié)同作用，可有效地防止脂類過氧化。維生素C 能清除細胞內(nèi)外的氧自由基，是細胞間質(zhì)生成所必需，能夠促進細胞間質(zhì)的合成B族維生 素。當VitB缺乏時，糖代謝障礙，能量供應(yīng)減少，故神經(jīng)功能易受累。所以適量補充B族維生 素和維生素E大劑量維生素C有助于保護損傷的視神經(jīng)，有利于神經(jīng)修復(fù)。③神經(jīng)營養(yǎng)因子： 視神經(jīng)損傷后，給予外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠保護神經(jīng)，抑制神經(jīng)元凋亡，促進神經(jīng)軸突 再生和神經(jīng)細胞功能恢復(fù)。近年來，研究較多的神經(jīng)營養(yǎng)因子有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀 神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、堿性成纖維細胞生 長因子等。④其他:NMDA受體拮抗劑、自由基清除劑、前列腺素類藥物、脫水劑、血管擴張劑 等。然而在臨床上，現(xiàn)有的視神經(jīng)保護藥物的治療效果卻并不十分理想，究其原因可能是視 神經(jīng)損傷是多種因素共同作用的結(jié)果，而這些藥物治療靶點單一，導(dǎo)致療效不佳。
[0003] 中藥在視神經(jīng)損傷治療中起著重要作用，臨床實踐表明，中藥能保護視神經(jīng)，甚至 可能挽救部分瀕臨死亡的神經(jīng)細胞，擴大視野，從而提高患者的視功能。目前研究的單味中 藥主要有葛根素、燈盞花、三七總苷、銀杏葉、刺蒺藜等。中藥復(fù)方有當歸補血煎、補陽還五 湯、益陰明目合劑等。雖然中藥對青光眼視功能保護作用的研究已取得很大進展，但同時也 存在著對視神經(jīng)損傷治療干預(yù)的機制還不夠明確，研究不夠深入的不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對中藥在視神經(jīng)損傷治療中存在的不足，提供一種用于治療/ 預(yù)防/緩解視神經(jīng)損傷的藥物組合物，該藥物組合物對慢性高眼壓引起的視神經(jīng)損傷具有 良好的效果。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：
[0006] -種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物，以重量份計，由包括如下組分制備得到：枸杞 10-20份，川考8-12份，燈盞細辛8-12份，黃芪10-20份，女貞子10-20份，牛膝8-12份。
[0007] 優(yōu)選地，由包括如下組分制備得到：枸杞13-17份，川考8-12份，燈盞細辛8-12份， 黃芪13-17份，女貞子13-17份，牛膝8-12份。
[0008] 進一步優(yōu)選地，各組分的用量為:枸杞15份，川芎10份，燈盞細辛10份，黃芪15份， 女貞子15份，牛膝10份。
[0009] 其中，所述重量份為本領(lǐng)域公知的邱，11^4，1^等重量單位，或為其倍數(shù)，如1/1〇〇， 1/10，10 倍，100 倍。
[0010] 中醫(yī)理論認為，慢性高眼壓導(dǎo)致視神經(jīng)損傷的主要病機是肝腎虧損，神水淤積，氣 血失和，脈絡(luò)不通，目中玄府閉塞，基于"滋補肝腎、益氣活血"的治法，提出了本發(fā)明的藥物 組合物，該藥物組合物中，所述枸杞指的是枸杞子(果實），枸杞子性甘、平，具有養(yǎng)肝、滋腎、 潤肺的功效枸杞;川芎味辛，性溫，具有活血行氣、祛風止痛功效;燈盞細辛別名燈盞花，辛、 微苦、溫，具有散寒解表、活血舒筋、止痛、消積的功效;黃芪性甘，微溫，具有增強機體免疫 功能、保肝、利尿等功效;女貞子性甘、苦、涼，具有補益肝腎、名目、清虛熱功效;牛膝性苦、 甘、酸、平，具有逐瘀通經(jīng)、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引血下行等功效，上述各組分復(fù)配使 用時，本方共六味藥，重用枸杞、女貞子、牛膝三味歸肝腎經(jīng)，滋補肝腎之品，其中以枸杞、女 貞子補肝腎明目為君藥。另加黃芪補氣健脾，益衛(wèi)固表。四藥補益正氣取其"正氣存內(nèi)，邪不 可干"之意，扶助正氣以驅(qū)邪外出。全方在補益基礎(chǔ)上，用牛膝及燈盞細辛活血，黃芪利水， 川芎行氣，一使氣行則血行，二使全方補而不滯。川芎、燈盞細辛、黃芪、牛膝四藥為臣藥。全 方補通兼施，使目竅通暢，氣血調(diào)和，則諸癥倶解。
[0011] 本發(fā)明所述的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料，載體和/或輔料 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，本發(fā)明對此不做特殊限定。
[0012] 本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型為片劑、散劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑中的一種，各 劑型可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段制備得到。
[0013] 作為本發(fā)明的技術(shù)方案之二，本發(fā)明同時提供上述各藥物組合物的制備方法，包 括將各組分制備成浸膏的步驟:用相當于各組分重量之和7-9倍的水于煎煮提取2-3次，每 次0.5_2h，合并提取液并濃縮成浸膏。
[0014] 優(yōu)選地，所述浸膏的制備方法為：先用相當于各組分重量之和8倍的水煎煮提取 1.5h，再用相當于各組分重量之和6倍的水煎煮提取lh，過濾，合并兩次濾液，濃縮成浸膏即 得。
[0015] 以浸膏為起始原料，采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，可將其制備成各種劑型，如片劑、 散劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑等。
[0016] 本發(fā)明的技術(shù)方案之三是:上述任一項所述的藥物組合物或方法制備得到的藥物 組合物在制備治療視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明所述的視神經(jīng)損傷優(yōu)選是由高眼壓引起的損傷，進一步優(yōu)選是由慢性高眼 壓引起的損傷。
[0018] 本發(fā)明的藥物組合物能夠調(diào)控Wnt信號通路、視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞、熱休克蛋白途 徑，從而實現(xiàn)對慢性高眼壓引起的視神經(jīng)損傷起到保護作用，具體地，使用本發(fā)明藥物組合 物能夠調(diào)控Wnt信號通路、抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞表明抗原0X42的表達及IL-lftnRNA的釋 放，促進熱休克蛋白表達，從而改善視神經(jīng)損傷狀況。
[0019] 本發(fā)明具有的優(yōu)勢和有益效果是：
[0020] 1、慢性高眼壓視神經(jīng)損傷發(fā)病機制復(fù)雜，本發(fā)明的中藥復(fù)方從視神經(jīng)損傷的整體 病機出發(fā)，辨證論治，彌補了西藥及單味中藥治療靶點單一的不足；
[0021] 2、對本發(fā)明的中藥復(fù)方對慢性高眼壓視神經(jīng)保護的機制進行了較為深入的實驗 研究，證明了其有效作用。
[0022]本發(fā)明涉及到的原料或試劑均可市購獲得。
[0023]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，即得本發(fā)明各較佳 實施例。
【附圖說明】
[0024] 圖1為空白組(A組)光鏡下大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)圖；
[0025] 圖2中，A，B，C，D，E分別為為成膜后第2周模型組(B組）、青光安II號(C組）、青光安 II號(D組）、青光安II號(E組）、益脈康分散片組(F組)光鏡下大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)圖；
[0026] 圖3中，六，8，(：，0，￡分別為成膜后第4周模型組、青光安11號方低劑量組、青光安11 號方中劑量組、青光安n號方高劑量組、益脈康分散片組光鏡下大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)圖；
[0027]圖4為正常視網(wǎng)膜0X42蛋白表達圖；
[0028] 圖5中，A，B，C，D，E分別為成膜后第2周，B組、C組、D組、E組、F組視網(wǎng)膜上0X42蛋白 表達圖；
[0029] 圖6中，A，B，C，D，E分別為成膜后第4周，B組、C組、D組、E組、F組視網(wǎng)膜上0X42蛋白 表達圖；
[0030] 圖7、8分別為青光安n號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜上GSK-3&HRNA相對表達量的 影響的擴增曲線和溶解曲線；
[0031] 圖9、1〇分別為青光安11號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜0-(^仏111111111?^相對表達 量的影響的擴增曲線和溶解曲線；
[0032] 圖11、12分別為青光安n號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜PAX6 mRNA相對表達量的 影響的擴增曲線和溶解曲線；
[0033] 圖13、14分別為青光安n號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜上Ngnl mRNA相對表達量 的影響的擴增曲線和溶解曲線；
[0034] 圖15、16分別為青光安n號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜Ngn2 mRNA相對表達量的 影響的擴增曲線和溶解曲線；
[0035]圖17、18分別為青光安11號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜11-1細1?嫩相對表達量的 影響的擴增曲線和溶解曲線。
[0036] 圖19、20分別為0-actin mRNA的擴增曲線和溶解曲線。
【具體實施方式】
[0037] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0038] 實施例1
[0039] -種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物，由如下組分制備得到：枸杞15g，川芎10g，燈 盞細辛10g，黃芪15g，女貞子15g，牛膝10g。
[0040] 實施例2
[00411 一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物，由如下組分制備得到:枸杞12g，川芎8g，燈盞 細辛9g，黃芪llg，女貞子12g，牛膝8g。
[0042] 實施例3
[0043] 一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物，由如下組分制備得到：枸杞20g，川芎12g，燈 盞細辛12g，黃芪19g，女貞子18g，牛膝12g。
[0044] 實施例4
[0045] 該實施例提供實施例1所述藥物組合物的制備方法，具體為:加水提取2次，一煎加 8倍量水提取1.5h;二煎加6倍量水提取lh;合并提取液，過濾，濃縮，制成浸膏即得。
[0046] -、動物實驗
[0047] 1.1.1實驗動物
[0048]健康雄性SD大鼠60只，體重180-200g，SPF級，遠交系，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗 中心提供。實驗前檢查雙眼眼部情況無異常，排除全身病變。動物置于18-20°C，相對濕度 60-70%，通風干燥的SPF動物實驗室，予以經(jīng)嚴格消毒的實驗鼠生長顆粒料及m級清潔飲 用水飼養(yǎng)，每隔2日清洗消毒籠具、飲水器具。
[0049] 1.1.2實驗藥品
[0050] 復(fù)方中藥青光安II號(本發(fā)明藥物組合物）：按照枸杞15g、川芎10g、燈盞細辛10g、 黃芪15g、女貞子15g、牛膝10g的比例采購生藥，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提 供，按照實施例4的方法制備成浸膏。
[0051 ]益脈康分散片:湖南湘雅制藥有限公司，國藥準字:Z20080073。
[0052] 妥布霉素地塞米松滴眼液:齊魯制藥有限公司，國藥準字:H20020497。
[0053] 妥布霉素地塞米松眼膏：s.a.ALC0N-C0UREUR n.v.進口藥品注冊證號:H20130743
[0054] 1.1.3主要實驗試劑
[0055] 4%多聚甲醛:湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實驗室提供。Harris蘇木素：北京中杉金橋生 物技術(shù)公司提供。伊紅:北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供。3 %過氧乙酸:北京中杉金橋生物 技術(shù)公司提供。0X42抗體:shaybio公司提供。常規(guī)化學(xué)試劑:北京化學(xué)試劑公司。逆轉(zhuǎn)錄試 劑盒:北京康為世紀提供。EDTA: Sigma公司提供。Tris: Sigma公司提供。Trizol: Invitrogen 公司提供。Taq酶:Genstar公司提供。引物：南京金斯瑞公司提供。DEPC: Sigma公司提供。 DL2000 DNA Marker:Genstar公司提供。dNTP:Genstar公司提供。E.B. :Sigma公司提供。 SYBGREEN PCR Mix: Invitrogen公司提供。
[0056] 1.1.4主要實驗器材
[0057] Tono-Pen:美國Reichert公司，型號：AVIA。
[0058] 輪轉(zhuǎn)石蠟切片機:徠卡，型號:RM2235。
[0059]數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng):深圳市深沅恒科技有限公司，型號:Motic 6.0。
[0060] 搖床:其林貝爾公司，型號:TS-92。
[0061 ] 臺式冷凍離心機:eppendorf公司，型號：TGL_18R。
[0062] 熒光定量RCP儀:Thermo公司，型號:PIK0 REAL 96〇
[0063] 熒光PCR板：Thermo公司，型號：SPL0960。
[0064] 恒溫水浴箱:河南金博公司，型號:HH-S2。
[0065] 旋渦混合器:其林貝爾公司，型號:QL-901。
[0066]電泳儀:Bio-rad公司，型號：164-5050。
[0067] 水平瓊脂糖電泳槽:北京六一公司，型號:DYCP-31DN。
[0068] 普通冰箱：榮事達公司，型號:BCD-245F。
[0069] -80。(：冰箱：中科美菱公司，型號:DW-HL388。
[0070] 電磁爐：美的公司，型號:MC-EP186。
[0071] 精密PH計:雷磁公司，型號:E-201-C。
[0072] 電子天平:民橋公司，型號:FA_N。
[0073]電動玻璃勻漿器:新芝公司，型號:DY89-1。
[0074]實驗方法
[0075] 1.2.1分組
[0076]動物購回常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字法將40只大鼠分為6組，分別為:A組：空白 組;b組:模型組;c組:青光安n號低劑量組;d組:青光安n號中劑量組;e組:青光安n號高 劑量組;f組:益脈康分散片組。
[0077] 1.2.2造模
[0078]造模前1天，除空白組外，其余所有兔術(shù)前8h禁水禁食。選用對眼壓無明顯影響的 1 %苯巴比妥鈉3.5mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，用眼壓計測得雙眼基礎(chǔ)眼壓并記錄。 參照文獻方法，在顯微鏡下將雙眼2條鼻側(cè)表淺鞏膜靜脈(位于上直肌附近)和1條顳側(cè)表淺 鞏膜靜脈(在外直肌附近)與周圍組織分離，用眼科一次性標準燒灼器小心燒灼選擇的表淺 鞏膜靜脈直至血流中斷，避免損傷鄰近組織，術(shù)畢涂典必舒眼膏，第2天開始每天滴典殊眼 藥水1滴，每日3次，共1周時間。術(shù)后眼壓均持續(xù)在25mmHg以上視為造模成功，若術(shù)后眼壓未 見上升，或上升后回降，則進行二次造模，方法為:再一次燒灼2根鞏膜表面靜脈。若二次造 模再次失敗，則將造模失敗鼠眼剔除本次實驗研究范圍。
[0079] 1.2.3術(shù)后眼壓監(jiān)測
[0080] 于術(shù)后第1、2、3、5天及第1、2、3、4、5、6、7、8周測量每只大鼠雙眼眼壓。每次檢查盡 量在同一時間、地點、濕度、溫度、照明亮度及使用儀器相同的情況下完成。
[0081] 1.2.4給藥方法
[0082]維持高眼壓狀態(tài)8w后開始灌胃。
[0083] A、B組以生理鹽水12mL/kg灌胃。
[0084] C、D、E組(青光安n號方組）：制作出的青光安n號方浸膏，每毫升約合生藥2.25g。 C組灌胃量為6.75g/Kg d(按"人-動物體表面積等效劑量比值表"折算，相當于成人等效劑 量）。D組為13.5g/Kg d (按"人-動物體表面積等效劑量比值表"折算，相當于成人2倍效劑 量）i組為27g/Kg d(相當于成人4倍效劑量）。
[0085]益脈康分散片組：用生理鹽水配制成濃度為20g/L的益脈康分散片混懸液，F(xiàn)組每 只灌胃0.22g/Kg d。
[0086] 所有動物給藥劑量按"人-動物體表面積等效劑量比值表"折算，折算系數(shù)W = 0.018,折算公式:W*成人用量(g)/動物體重(kg)。
[0087] 1.2.5取材
[0088]取材時相分別為灌胃后第2周、第4周。
[0089] 1 %苯巴比妥鈉3.5mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，摘除雙眼球。每個時相分別 在每組選取1只眼球，保存于4%多聚甲醛溶液中，行常規(guī)病理切片及免疫組化檢測。其余眼 球在解剖顯微鏡下去除眼前節(jié)，用顯微鑷子剝離出視網(wǎng)膜組織，保存于-80°C冰箱中，供 qPCR檢測視網(wǎng)膜GSK-3ftnRNA、0-catenin mRNA、PAX6 mRNA、Ngnl mRNA、Ngn2 mRNA、IL-10 mRNA的相對表達量，Western blot檢測HSP27、HSP60、HSP70的表達。
[0090] 1.2.6檢測過程
[0091 ]①視網(wǎng)膜組織形態(tài)檢查
[0092] HE染色步驟：
[0093] (1)從固定液中取出標本。
[0094] (2)脫水浸蠟:將標本分別在濃度為75 %、85 %、95 %的酒精中進行乙醇梯度脫水 12h，100%的酒精中脫水14h;將脫水后的標本用先后用二甲苯I溶液浸泡lh，二甲苯n溶液 浸泡2h;然后將標本置于石蠟I中l(wèi)h，石蠟n中2h。
[0095] (3)包埋:將已浸蠟好的標本放置注有溶化石蠟的蠟槽內(nèi)，至石蠟冷卻。
[0096] (4)切片：用切片機將包埋好的標本石蠟塊用切片機連續(xù)切片，切成約5wii厚，然后 將其在水溶箱中展開，撈片，曬干，烤干成石蠟切片。
[0097] (5)脫錯:分別于二甲苯I、二甲苯n溶液中浸泡lOmin，然后在濃度為100%、95 %、 85 %、75 %的酒精中分別浸泡5min，自來水中浸泡3min，蒸餾水中浸泡3min。
[0098] (6)常規(guī)HE染色:蘇木精浸泡5min，自來水浸洗lmin，l%鹽酸酒精分化30s，自來水 浸洗2min，蒸餾水浸洗lmin，伊紅溶液浸泡2min，自來水浸洗3min，85 %、90 %的酒精中浸泡 30s，95%的酒精中浸泡lmin，100%的酒精中浸泡2min，二甲苯I、二甲苯II溶液中分別浸泡 2min，最后用中性樹脂封固。
[0099]在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色標本視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。
[0100]②免疫組化法檢測視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞表面抗原0X42表達
[0101] (1)經(jīng)上述步驟脫蠟、復(fù)水后，3 %H202室溫處理lOmin以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶， PBS 沖洗2minX3次。
[0102] (2)抗原熱修復(fù):將切片置于裝有枸櫞酸鹽緩沖液的玻璃容器(耐高溫）中，放入微 波爐內(nèi)，容器內(nèi)液體溫度達到沸騰后斷電，連續(xù)三次。待冷卻后，PBS沖洗3minX 3次。
[0103] (3)血清封閉：滴加山羊血清封閉液，置于室溫下30分鐘。PBS沖洗2min X 3次。
[0104] (4)滴加一抗:0X42兔抗鼠單克隆抗體(稀釋度為1:200 )，4°C冰箱過夜，PBS沖洗 3min X 3次。
[0105] (5)滴加二抗：山羊抗兔IgG抗體，37°C孵育30min，PBS沖洗3minX3次。
[0106] (6)加SABC:滴加SABC，放置37°C恒溫箱中20分鐘，PBS沖洗5minX3次。
[0107] (7)加顯色劑:取A(DAB)、B(H202)、C(磷酸緩沖液)三種試劑各1滴，蒸餾水lml，加 入DAB試劑盒中，將其混合均勻后滴加至載玻片組織上，鏡下觀察至顯色，用蒸餾水洗滌。
[0108] (8)復(fù)染:將載玻片置于蘇木素中復(fù)染。在顯微鏡下觀察掌握染色程度，待出現(xiàn)陽 性染色顆粒時，立即放入清水漂洗終止顯色。
[0109] (9)封片:將玻片樣本周圍擦干，放置到第二天待樣本干燥后二甲苯透明l_2s，濾 紙吸干，中性樹脂封片，鏡檢。
[0110] (10)結(jié)果判定 高倍鏡下觀察0X42蛋白的表達情況，判斷標準：免疫組化反應(yīng)后陽性標記的細胞 胞漿著色呈棕色或深棕色。高倍鏡下隨機選取5個視網(wǎng)膜視野，用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分 析處理。
[0112]③qPCR檢測視網(wǎng)膜GSK-3ftnRNA、0-catenin mRNA、PAX6mRNA、NgnlmRNA、Ngn2mRNA、 IL-lftnRNA的相對表達量，Western blot檢測HSP27、HSP60、HSP70的表達。
[0113]溶液配制：
[0114] (1)10\丁厶￡:1^8(麗121.14):48.4 8;乙酸：11.421^;
[0115] 0.5M EDTA(pH8.0):20mL;最后用蒸餾水定容至1L，高溫滅菌后室溫下保存。
[0116] (2) 10 X 核酸電泳加樣緩沖液:pH8.0EDTA:pH8.0EDTA;甘油：50% ;溴酚藍:0.25%
[0117] (3)RNaseA母液（10mg/mL) :RNaseA:0. lg; 15mM NaCl: 10mL; 10mM Tris-HCl調(diào)節(jié) pH7 ? 5; 5分裝至1 ? 5mL管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0118] (4)Agar〇se凝膠:瓊脂糖:0.2g; 1 X TAE: 20mL;微波爐加熱至瓊脂糖溶解，冷卻至 60°C，加入8yL EB染料，倒入膠槽，冷卻20min左右至凝固。
[0119] (5)無酶水:DEPC: 1ml;超純水：1L;搖勻16h，調(diào)至pH8，濕熱滅菌（121°C，20min)，分 裝4 °C保存?zhèn)溆?br>[0120] RNA 提取
[0121] (1)實驗前準備
[0122] 121°C，20min濕熱滅菌三蒸水中1L加入lml的DEPC，搖勻16h，即為0.1 %DEPC水;將 所有提RNA所需器械及耗材如:Axygen無酶tip頭、離心管，勻漿器等，浸泡于1%DEPC水中過 夜。第二天將所有浸泡于〇. 1 %DEPC中的器械撈起，用報紙包裝好，121°C，60min濕熱滅菌 后，即可用。
[0123] (2)Trizol 提取細胞總 RNA
[0124] 1)取保存在Trizol中的組織約0.02g，加入lmlTrizol于勾衆(zhòng)器中充分研磨勾衆(zhòng)， 混勻后室溫裂解3min。加入0.2倍體積的三氯甲烷，振蕩，室溫靜置3-5min。
[0125] 2)離心，12000rpm，15min。取上層液相，加入等體積的異丙醇，-20°C靜置20min。
[0126] 3)12000rpm，15min低溫離心，去上清，沉淀中加入lml75%乙醇(無菌DEPC處理水 配制），儀器震蕩。
[0127] 4) 12000rpm，5min低溫離心，去上清，空氣干燥5~10min。加入50iil無菌無酶水溶 解沉淀。
[0128] 5)紫外分光光度計測定濃度，吸取2ul RNA溶液于石英比色杯中，用無酶水定容至 100ul，在260nm與280nm處測其吸光度值，并計算其濃度跟純度。RNA濃度(ng/ul)=A260*稀 釋倍數(shù)*40，濃度在500ng/ul-1000ng/ul，RNA純度= 0D260/0D280，比值在 1 ? 8-2 ? 0之間均 可。
[0129] (3)RNA的瓊脂糖凝膠電泳
[0130]電泳槽用3 %的雙蒸水（滅菌DEPC處理水配制）處理0.5h;配制1 %變性瓊脂糖凝 膠，0.2g瓊脂糖，20ml無菌DEPC處理水，加熱至瓊脂糖溶解，冷至60 °C，加入0.5ylEB(10mg/ ml)，混勾后倒膠;取2yl提取的RNA，按1:5的比例與1 oading buff er premix混勾，170V恒壓 電泳，溴酚藍前沿迀移至凝膠總長2/3處停止電泳;凝膠成像系統(tǒng)下觀察。
[0131] RNA反轉(zhuǎn)錄
[0132] 以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系、操作步驟和逆轉(zhuǎn)錄條件參見下表：
[0133] (1)反應(yīng)體系
[0135] (2)渦旋振蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
[0136] (3)42°C孵育30-50min，85°C孵育5min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
[0137] (4)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于-20 °C長期保存。
[0138] qPCR實驗方法：SYBR法
[0139] (1)引物設(shè)計
[0140]在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer5軟件設(shè)計引物，有南京金斯瑞合成引 物。
[0162] (2)體系組成：
[0163]實時定量PCR(每個樣本每個指標3個孔，共30ul體系，每孔lOul)
[0165] (3)定量PCR擴增程序：
[0167] ④用Western blot法檢測HSP27、HSP60、HSP70的表達
[0168] 溶液配制
[0169] l.〇mol/L Tris ? HC1


[0196] 第一步:樣品制備
[0197] 剪取0.25g組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入300ulRIPA裂解液于勻漿器中反復(fù)研磨 組織直至看不見組織塊；
[0198] 冰上，蛋白裂解30分鐘；
[0199] 4°C，12000rpm離心15min。（提前開離心機預(yù)冷）；
[0200]將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中，部分用于實驗多余的存于-20°C;
[0201] 第二步:蛋白濃度檢測
[0202] 按照BCA蛋白定量試劑盒(We 1 lbio)使用說明操作，測定蛋白濃度。
[0203] 根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液， 充分混勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。
[0204] 完全洛解蛋白標準品，濃度為2mg/ml。蛋白樣品在什么洛液中，標準品也宜用什么 溶液稀釋。
[0205] 將標準品按0，1，2，3，4，5，6lil加到96孔板的標準品孔中，加用于稀釋標準品的溶 液補足到2〇yl。
[0206] 加適當體積樣品（樣品制備中步驟4的部分上清液)到96孔板的樣品孔中，加用于 稀釋標準品的溶液到20yl。
[0207] 各孔加入200yl BCA工作液，37°C放置30min。
[0208]測定A562，540-595nm之間的波長也可接受。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度，樣品 濃度范圍在9-10ug/ul。僅供下一步實驗作為參考。
[0209]第三步：Western blot [0210](一)電泳
[0211] 配8%、10%分離膠，加入1￡1^后立即搖勻即可灌膠。灌膠后，用異丙醇封膠。
[0212]當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去 膠上層異丙醇并用吸水紙將其吸干。
[0213]配4%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將 梳子插入濃縮膠中。
[0214]電泳樣品準備，使每個樣品總蛋白上50ug-lOOug計算各個樣品所需取樣量，并與 5*loading buffer混勾，沸水煮5min，放入冰盒中速冷。
[0215]根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，每空上樣5ul已變性蛋白，開始電泳。濃縮膠電泳電壓為 80V，分離膠電泳電壓為120V。待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。
[0216] (二)轉(zhuǎn)膜
[0217] 分別切膠HSP27(27KD)，HSP60(60KD)，HSP70(95KD)，0-actin(42KD)。
[0218] 準備6張與膠同樣大小的濾紙和1張PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸濕，然后與濾紙 一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，至完全浸透。
[0219]按照3張濾紙，膜，膠，另3張濾紙的順序依次放好，要求中間沒有氣泡。
[0220] 蓋上儀器，接通電源，轉(zhuǎn)膜 300mA，HSP60 約 80min，HSP27 約 45min，HSP70 約 120min， 0-actin約lh。
[0221] 轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入1*TBST中洗1次，時間5min。
[0222] 用麗春紅染膜，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜的效率。用1*TBST將麗春紅洗凈。
[0223] (三)封閉
[0224] 用1*TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置1小時。
[0225] (四）一抗孵育
[0226] 用1*TBST將一抗按照一定比例稀釋(具體比例見下表），將膜與一抗一起孵育，4度 過夜。孵育結(jié)束，1*TBST洗3次，每次15min。（注:大部分CST的抗體需要用5 %BSA的1*TBST稀 釋）
[0228] (五)二抗孵育
[0229] 用1*TBST稀釋HRP標記的二抗(Proteintech)，稀釋比例1:3000,將稀釋后的二抗 與膜共同孵育45-60min。孵育結(jié)束，1*TBST洗3次，每次15min。
[0230] (六)顯色/曝光
[0231] ECL顯色曝光:使用ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo)與膜孵育3min，用吸水紙吸盡液體，用 保鮮膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X膠片曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘;顯影沖洗。
[0232]實驗結(jié)果
[0233] 3.1燒灼鞏膜表淺靜脈的方法對眼壓的影響
[0234] 手術(shù)后8w，81 %的大鼠維持在高眼壓狀態(tài)。
[0235] 表1造模后各組眼壓情況(.sc±::s,單位:mmHg)
[0237] 注:#P<0.05,表示術(shù)后同一時期各組的眼壓值與正常組(A組）眼壓值比較，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義;*P<〇.05,表示術(shù)后不同時期各組的眼壓值與本組的術(shù)前眼壓值進行比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0238] 從上表中可得出以下結(jié)論：
[0239] (1)手術(shù)前6組大鼠眼壓值組間比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
[0240] (2)術(shù)后第1天，各組大鼠眼壓值與同一時期A組大鼠眼壓值比較，P〈0.01，差異有 顯著統(tǒng)計學(xué)意義，說明手術(shù)后第1天，各組大鼠眼壓均有明顯上升。
[0241] (3)手術(shù)后8周，各組大鼠眼壓值與同時期A組比較，P〈0.01，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意 義，說明術(shù)后8周，各組大鼠眼壓值仍持續(xù)在較高水平。
[0242] (4)手術(shù)后不同時期各組眼壓值與該組術(shù)前比較：
[0243] B、C、D、E、F組大鼠眼壓值在術(shù)后第1天和術(shù)后第8周與術(shù)前比較，P〈0.01，差異有顯 著統(tǒng)計學(xué)意義，術(shù)后第1天和術(shù)后第8周比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明B、C、D、E、F 組大鼠造模后第1天、造模后第8周較手術(shù)前眼壓值明顯上升，且維持在高眼壓狀態(tài)。
[0244] 3.2光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)
[0245] 空白組(A組）：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層，內(nèi)、外核層等各層結(jié)構(gòu)排列有序，形態(tài)規(guī)則 (附圖1)。
[0246] 成t旲后弟2周：
[0247] 模型組(B組）：視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，排列疏松，形態(tài)欠規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞 層及內(nèi)核層細胞減少(附圖2中A圖）。
[0248] 青光安II號方組（C、D、E組）及益脈康分散片組(F組）：視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層稍有水 月中，排列較疏松，形態(tài)尚規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層細胞較空白組有所減少(分別 對應(yīng)附圖2中B，C，D，E圖）。
[0249]成模后第4周：
[0250]模型組:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫加重，排列疏松，形態(tài)不規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞 層及內(nèi)核層萎縮，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞明顯減少(附圖3中A圖）。
[0251 ]青光安n號方低、中劑量組:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫稍有減輕，排列較整齊，形態(tài) 較規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層未見明顯萎縮，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量較2周前無明顯減少 (分別對應(yīng)附圖3中B，C圖）。
[0252] 青光安n號方高劑量組:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫明顯減輕，視網(wǎng)膜各層排列較整 齊，形態(tài)較規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層未見萎縮，神經(jīng)節(jié)細胞較2周前未見減少(附 圖3中D圖）。
[0253] 益脈康分散片組:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫未見明顯加重，視網(wǎng)膜各層排列較整齊， 形態(tài)尚規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層未見明顯萎縮，神經(jīng)節(jié)細胞較2周前略有減少 (附圖3中E圖）。
[0254] 3.3青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜上0X42蛋白表達的影響
[0255] 正常視網(wǎng)膜中，在神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)叢狀層有少量0X42蛋白陽性表 達(附圖4)。成模后第2周:B組視網(wǎng)膜上0X42蛋白陽性表達明顯增多，并逐漸向外叢狀層迀 移（附圖5中A圖）<X、D、E、F組視網(wǎng)膜上0X42蛋白陽性表達較空白組略有增多，但較模型組 少，C、D、E、F組比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(附圖5中8，(：，0，￡圖）。成模后第4周 :各組與辟且比 較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組0X42蛋白表達持續(xù)增高，用藥后各組0X42蛋白的表 達均減少。C、D、E組與F組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比較，P<0.05,差 異有統(tǒng)計學(xué)意義。C組與D組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（附圖6中A，B，C，D，E圖）（表 2) 〇
[0256] 表2各組0X42蛋白平均光密度結(jié)果
[0258] 注:*P〈0.05，術(shù)后第2周，各組0X42蛋白平均光密度值與模型組(B組）比較，差異有 統(tǒng)計學(xué)意義。
[0259] 3.4青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜上GSK-3ftnRNA相對表達量的影響
[0260] SD大鼠慢性高眼壓模型后灌胃14天六、(：、〇4小各組631(-3&111?嫩表達與8組631(-30 mRNA表達比較，B組GSK-3ftnRNA表達明顯高于其他五組，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D、 E、F組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。成模后灌胃28天C、D、E、F各組GSK-3f3mRNA表達下 調(diào)明顯，與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D、E組GSK-3ftiRNA表達與F組比較，P< 〇. 05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明灌藥28天后， 高劑量青光安II號方在抑制GSK-3ftiRNA表達釋放的作用上優(yōu)于低、中劑量。C組與D組比較， P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（表3)
[0261] 表3各組GSK-3ftnRNA相對表達量（[土 s)
[0263] 注:各組GSK-3f3mRNA相對表達量比較，灌胃后第14天，*P<0.05，各組與B組比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。灌胃后第28天，▲?<0.05,各組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。#P< 0.05，C、D、E組與F組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AP<0.05，C、D組與E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。擴增曲線(附圖7)熔解曲線(附圖8)
[0264] 3.5青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜P-catenin mRNA相對表達量的影響
[0265] SD大鼠慢性高眼壓模型后灌胃14天各組各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。C、D、E、F組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。成模后4周各組與B組比較，P<0.05,差 異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D、E組與F組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比較，P< 0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明灌藥28天后，青光安n號方高劑量在促進e-catenin釋放的 作用上優(yōu)于低、中劑量。C組與D組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（表4)
[0266]表4各組0-catenin mRNA相對表達量(.x..±..s.)
[0268] 注:各組f3-catenin mRNA相對表達量比較，灌胃后第14天，*P<0.05，各組與B組比 較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。灌胃后第28天，▲?<0.05,各組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義4P <0.05，C、D、E組與F組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AP<0.05，C、D組與E組比較，差異有統(tǒng)計 學(xué)意義。擴增曲線(附圖9)熔解曲線(附圖10)
[0269] 3.6青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜PAX6 mRNA相對表達量的影響
[0270] SD大鼠慢性高眼壓模型成模灌胃14天后，各組PAX6 mRNA表達量與B組比較，P〈 〇.〇5,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D、E、F組組間比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SD大鼠慢性高 眼壓模型成模灌胃28天后，C、D、E組與F組比較，P〈0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比 較，P〈0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C組與D組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明灌藥28天 后，青光安II號方高劑量在促進PAX6釋放的作用上優(yōu)于低、中劑量及益脈康分散片。（表5)
[0271] 表5各組PAX6 mRNA相對表達量(x±s)
[0273] 注:各組PAX6 mRNA相對表達量比較，灌胃后第14天，*P<0.05，各組與B組比較，差 異有統(tǒng)計學(xué)意義。灌胃后第28天，▲?<0.05,各組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。#P< 0.05，C、D、E組與F組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AP<0.05，C、D組與E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。擴增曲線(附圖11)熔解曲線(附圖12)
[0274] 3.7青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜上Ngnl mRNA相對表達量的影響
[0275] SD大鼠慢性高眼壓模型成模灌胃14天后，各組Ngnl mRNA表達量與B組比較，P〈 〇.〇5,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D、E、F組組間比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SD大鼠慢性高 眼壓模型成模灌胃28天后，C、D、E組與F組比較，P〈0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比 較，P〈0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C組與D組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明灌藥28天 后，青光安II號方高劑量在促進Ngnl釋放的作用上優(yōu)于低、中劑量及益脈康分散片。（表6)
[0276] 表6各組Ngnl mRNA相對表達量（x:±s:)
[0278] 注:各組Ngnl mRNA相對表達量比較，灌胃后第14天，*P<0.05，各組與B組比較，差 異有統(tǒng)計學(xué)意義。灌胃后第28天，▲?<0.05,各組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。#P< 0.05，C、D、E組與F組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AP<0.05，C、D組與E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。
[0279]擴增曲線（附圖13)熔解曲線（附圖14)
[0280] 3.8青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜Ngn2mRNA相對表達量的影響
[0281] SD大鼠慢性高眼壓模型成模灌胃14天后，各組Ngn2mRNA表達量與B組比較，P〈 〇.〇5,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D、E、F組組間比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SD大鼠慢性高 眼壓模型成模灌胃28天后，C、D、E組與F組比較，P〈0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比 較，P〈0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C組與D組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明灌藥28天 后，青光安II號方高劑量在促進Ngn2釋放的作用上優(yōu)于低、中劑量及益脈康分散片。（表7)
[0282] 表7各組Ngn2mRNA相對表達量（7±s)
[0284] 注:各組Ngn2mRNA相對表達量比較，灌胃后第14天，*P<0.05，各組與B組比較，差 異有統(tǒng)計學(xué)意義。灌胃后第28天，▲?<0.05,各組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。#P< 0.05，(：、0、￡組與？組較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。厶？<0.05，(：、0組與￡組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。擴增曲線(附圖15)熔解曲線(附圖16)
[0285] 3.9青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜IL-lftnRNA相對表達量的影響
[0286] 成模后2周各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D、E、F組比較，P> 0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。成模后4周各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D、E組 與F組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C、D組與E組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說 明灌藥4周后，青光安n號方高劑量在抑制IL-1P釋放的作用上優(yōu)于低、中劑量。C組與D組比 較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（表8)
[0287] 表8各組IL-lftnRNA相對表達量（7±S)
[0289] 注:各組IL-lf3mRNA相對表達量比較，術(shù)后第2周，*P<0.05，各組與B組比較，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后第4周，▲P<0.05,各組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。即<0.05，(：、0、 E組與F組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AP<0.05, C、D組與E組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。擴增 曲線（附圖17)熔解曲線（附圖18)，內(nèi)參P-actin mRNA擴增曲線（附圖19)溶解曲線（附圖 20)〇
[0290] 3.10青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜HSP27表達的影響 [0291 ]各組大鼠視網(wǎng)膜HSP27表達的相對灰度值結(jié)果比較：
[0292]大鼠慢性高眼壓模型成模后灌胃2周，各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意 義;C組與F組、D組F組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;E組與F組比較，P<0.05,差異具有 統(tǒng)計學(xué)意義。C、D、E組兩兩比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠慢性高眼壓模型成模后 灌胃4周，各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D、E組與F組比較，P<0.05,差異 有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D組與E組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D組比較，P>0.05,差異無 統(tǒng)計學(xué)意義。說明受視神經(jīng)損傷的影響，視網(wǎng)膜HSP27會應(yīng)激性升高;青光安n號方及益脈 康分散片灌胃均可促進EIOP大鼠視網(wǎng)膜HSP27的表達，其中以青光安II號方高劑量組效果 最優(yōu)。（見表9)
[0293] 表9:各組大鼠視網(wǎng)膜HSP27表達的相對灰度值(無±s, %)
[0296] 注：同一時期，各組HSP27表達的相對灰度值比較:*P<0.05，各組與B組比較，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義。即<0.05，(：、04組與？組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。厶？<0.05，(：、0組與￡組 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義?！?<〇. 05, C、D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0297] 3.11青光安II號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜HSP60表達的影響
[0298] 各組大鼠視網(wǎng)膜HSP60表達的相對灰度值結(jié)果比較：
[0299] 大鼠慢性高眼壓模型成模后灌胃2周，各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意 義;C、D、E、F組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠慢性高眼壓模型成模后灌胃4周，各 組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D、E組與F組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意 義;C、D組與E組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；C、D組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意 義。說明受視神經(jīng)損傷的影響，視網(wǎng)膜HSP60會應(yīng)激性升高;青光安n號方及益脈康分散片 灌胃均可促進EI0P大鼠視網(wǎng)膜HSP60的表達，其中以青光安n號方高劑量組效果最優(yōu)。（見 表10)
[0300] 表10:各組大鼠視網(wǎng)膜HSP60表達的相對灰度值(-〒±s, %)
[0302] 注：同一時期，各組HSP60表達的相對灰度值比較:*P < 0.0 5，各組與B組比較，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義。即<0.05，(：、04組與？組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。厶？<0.05，(：、0組與￡組 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義?！?<〇. 05, C、D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0303] 3.12青光安n號方對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達的影響
[0304]各組大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達的相對灰度值結(jié)果比較：
[0305]大鼠慢性高眼壓模型成模后灌胃2周，各組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意 義;C、D、E、F組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠慢性高眼壓模型成模后灌胃4周，各 組與B組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D、E組與F組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意 義;C組與E組比較，P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;D組與E組比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意 義;C、D組比較，P >0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明受視神經(jīng)損傷的影響，視網(wǎng)膜HSP70會應(yīng) 激性升高，青光安n號方及益脈康分散片灌胃均可促進EI0P大鼠視網(wǎng)膜HSP70的表達，其中 以青光安n號方高、中劑量組效果最優(yōu)。（見表11)
[0306] 表11:各組大鼠視網(wǎng)膜HSP70表達的相對灰度值(i ±s:, %)
[0309] 注：同一時期，各組HSP70表達的相對灰度值比較:*P < 0.0 5，各組與B組比較，差異 有統(tǒng)計學(xué)意義。即<0.05，(：、04組與？組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。厶？<0.05，(：、0組與￡組 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義?！?<〇. 05, C、D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0310]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種視神經(jīng)保護作用的藥物組合物，其特征在于：以重量份計，由包括如下組分的原 料制備得到：枸杞10-20份，川考8-12份，燈盞細辛8-12份，黃芪10-20份，女貞子10-20份，牛 膝8_12份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于：由包括如下組分的原料制備得到： 枸杞13-17份，川考8-12份，燈盞細辛8-12份，黃芪13-17份，女貞子13-17份，牛膝8-12份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于:各組分的用量為：枸杞15份，川 芎1 〇份，燈盞細辛1 〇份，黃芪15份，女貞子15份，牛膝10份。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的藥物組合物，其特征在于:還包括藥學(xué)上可接受的載 體和/或輔料。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的藥物組合物，其特征在于:所述藥物組合物的劑型為 片劑、散劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑中的一種。6. 制備權(quán)利要求1-5任一項所述的藥物組合物的方法，其特征在于:包括將各組分制備 成浸膏的步驟，具體為：用相當于各組分重量之和7-9倍的水煎煮提取2-3次，每次0.5-2h， 合并提取液并濃縮即得浸膏。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:先用相當于各組分重量之和8倍的水煎煮 提取1.5h，再用相當于各組分重量之和6倍的水煎煮提取lh，過濾，合并兩次濾液，濃縮即得 浸膏。8. 權(quán)利要求1-5任一項所述的藥物組合物或權(quán)利要求6-7任一項所述的方法制備得到 的藥物組合物在制備治療視神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述視神經(jīng)損傷由慢性高眼壓引起。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，所述視神經(jīng)損傷是由Wnt信號通路阻斷、或視網(wǎng)膜 小膠質(zhì)細胞增多、熱休克蛋白減少引起的。
【文檔編號】A61P25/00GK105853593SQ201610325299
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】彭清華, 彭俊, 譚涵宇, 周亞莎
【申請人】湖南中醫(yī)藥大學(xué)