專利名稱：：用于治療眼疾和眼病的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及結(jié)合鞘氨醇-l-磷酸(S1P)的制劑，尤其是涉及在生理?xiàng)l件下與S1P具有特異反應(yīng)活性的人源化單克隆抗體、抗體片段、以及抗體衍生物。這樣的制劑可以通過遞送包含這樣的制劑的藥物組合物而用于治療和/或預(yù)防各種疾病或紊亂。以下描述包括對(duì)理解本發(fā)明有用的信息。這不是承認(rèn)本文中提到的任何信息、或本文中引用的明確指出的或暗示的任何公開是本申請(qǐng)要求保護(hù)的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)，或者甚至特別相關(guān)的。
背景技術(shù)：
：生物活性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)脂質(zhì)脂類和它們的衍生物目前被認(rèn)為是用于醫(yī)學(xué)研究的重要對(duì)象，而不僅^f又是細(xì)胞"莫中的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)元件或用于P-氧化、糖酵解或其他代謝過程的能量來源。尤其是，某些生物活性脂類在動(dòng)物和人類疾病中發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)物。盡管質(zhì)膜的大多數(shù)脂類僅起結(jié)構(gòu)性作用，但是它們中的少部分涉及將胞外刺激傳遞到細(xì)胞內(nèi)。"脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，，是指利用細(xì)胞膜的脂類作為第二信使的多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的任一種，以及是指脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子與自己的特定受體的直接相互作用。脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過各種各樣的胞外刺激(范圍為/人生長(zhǎng)因子到炎癥細(xì)月包因子)^皮激活并調(diào)節(jié)細(xì)月包命運(yùn)決定如凋亡、分化和增殖。隨著越來越多的生物活性脂類被鑒定以及它們的行為被表征，對(duì)于生物活性脂類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究是一項(xiàng)重要的科學(xué)研究。生物活性脂質(zhì)的實(shí)例包括類花生酸類(包括大麻素、白三烯、前列腺素、脂氧素、環(huán)氧花生四烯酸以及異類花生酸)、非類花生酸大麻素遞質(zhì)、磷脂以及它們的衍生物如磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)、血小才反活化因子(PAF)和心磷脂，以及溶血^粦脂素類如溶血磷脂酰膽堿(LPC)和各種溶血磷脂酸(LPA)。生物活性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)脂類遞質(zhì)還包括鞘脂類如鞘A粦脂、神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺-l-石粦酸、鞘氛西事、鞘氛醇石粦酸膽減(sphingosylphosphorylcholine)、二氫鞘氨醇、二氫鞘氨醇-l-磷酸(二氫-SlP)和鞘氨醇-l-磷酸。鞘脂類以及它們的衍生物代表了一組對(duì)重要細(xì)胞過程具有多效作用的胞外和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。生物活性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)脂類的其他實(shí)例包括石粦脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、石粦脂酰乙醇胺(PEA)、二乙?；视王?DG)、石克苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和腦苷脂。7鞘脂類由于它們最初神秘的特性而是獨(dú)特的一類在Sphinx之后命名的脂類。鞘脂類最初表征為細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分，但近來的研究表明，鞘脂類也用作細(xì)i包信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子(Hannun，etal.，Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Speigel，etal.，F(xiàn)ASEBJ.10:1388-1397，1996;Igarashi，J.Biochem122:1080-1087，1997;Hla，T.(2004).S謹(jǐn)"Ce〃Dev腸/,15，513-2;Gardell,S.E.,Dubin,A.E.&Chun,J.(2006).7>ewfeMo/Med,12，65-75)。鞘脂類是細(xì)胞月莫的主要結(jié)構(gòu)成分，其也用作細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子(HannunandBell,Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Igarashi，J.Biochem122:1080-1087，1997)。鞘脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)遞質(zhì)，神經(jīng)酰胺(CER)、鞘氨醇(SPH)和鞘氨醇-l-磷酸(SIP)已被最廣泛地研究，并且最近已經(jīng)認(rèn)識(shí)到它們?cè)谛难芟到y(tǒng)、血管發(fā)生和腫瘤生物中的作用(Claus,etal.,CurrDrugTargets1:185-205,2000;Levade,etal"Circ.Res.89:957-968,2001;Wang,etal"J.Biol.Chem.274:35343-50，1999;WascholowskiandGiannis，DrugNewsPerspect.14:581-90,2001;Spiegel,S.&Milstien，S.(2003).Sphingosine-1-phosphate:anenigmaticsignalinglipid.淑AevMo/Ce〃腸/，4，397-407)。對(duì)于鞘月旨代謝的綜述，參見Liu,etal"CritRev.Clin.Lab.Sci.36:511-573，1999。對(duì)于鞘磷脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的綜述，參見Hannun，etal"Adv.LipidRes.25:27-41,1993;Liu,etal"Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.36:511-573,1999;Igarashi,J.Biochem.122:1080-1087，1997;Oral,etal"J.Biol.Chem.272:4836-4842，1997;andSpiegeletal"Biochemistry(Moscow)63:69-83,1998。S1P是一種細(xì)胞增殖的遞質(zhì)并通過激活生存途徑而防止細(xì)胞凋亡(Maceyka,"a/.(2002)，BBA，vol.1585):192-201，andSpiegel,"a/.(2003),NatureReviewsMolecularCellBiology,vol.4:397-407)。已經(jīng)提出，CER/SPH水平和SIP之間的平衡提供了一種決定細(xì)胞是否導(dǎo)入死亡途徑或者#:防止凋亡的可調(diào)4幾制。該可調(diào)4幾制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶是鞘氨醇激酶(SPHK),其作用是將促進(jìn)死亡的生物活性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)脂類(CER/SPH)轉(zhuǎn)換成促進(jìn)生長(zhǎng)的S1P。S1P具有兩種命運(yùn)S1P可以通過S1P裂解酶降解，該S1P裂解酶是一種將S1P切割為磷酸乙醇胺和十六醛(hexadecanal)，或者更少見的，通過S1P磷酸酶水解為SPH。S1P的多效生物學(xué)活性通過G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)家族(最初稱為內(nèi)皮分化基因(EDG))介導(dǎo)。5種GPCR已被鑒定為高親和力S1P受體(S1PR):SlPi/EDG-l、SlP2/EDG-5、SlP3/EDG-3、SlP4/EDG-6、以及直到1998年才^皮鑒定的SlP5/EDG-8(Lee,etal.,1998)。由SIP引發(fā)的許多反應(yīng)偶聯(lián)于不同的異源三聚體G蛋白(Gq.、Gi、G12—13)以及Rho家力矣的小GTP酶(Gardell,etal.，2006)。在成人中，S1P乂人血小4反(Murataetal.,2000)和月巴大細(xì)胞釋放以生成游離SIP的局部脈沖(足夠超過SIPR的Kd)，用于促進(jìn)傷口愈合以及參與炎性反應(yīng)。在正常條件下，血漿中的總SIP相當(dāng)高(300-500nM);然而，假設(shè)了大多數(shù)SIP可以通過血清蛋白，尤其是脂蛋白(例如HDL>LDL>VLDL)和白蛋白"緩沖"，使得生物可利用的SIP(或SIP的游離部分)不足以可測(cè)到地活化SIPR(Murataetal.，2000)。如果不是這種情況，則會(huì)導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)难馨l(fā)生和炎癥。SIP的胞內(nèi)行為也已經(jīng)^Hf了(參見例如SpiegelS,KolesnickR(2002)，Leukemia,vol.16:1596-602;Suomalainen,etal(2005)，AmJPathol,vol.166:773-81)。細(xì)胞表面SIP受體的廣泛表達(dá)允許SIP影響各種細(xì)胞反應(yīng)譜，包括增殖、粘附、收縮、運(yùn)動(dòng)性、形態(tài)發(fā)生、分化和存活。這種反應(yīng)"i普似乎依賴于細(xì)月包和組織系統(tǒng)內(nèi)的S1P受體的重疊或不同表達(dá)類型。另外，最近已經(jīng)證實(shí)了在SIP和生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的串?dāng)_(crosstalk),包括血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(參見例如Baudhuin,etal.(2004),FASEBJ，vol.18:341-3)。各種涉及SIP的細(xì)9胞過程的調(diào)節(jié)對(duì)其中的神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管調(diào)節(jié)、傷口愈合、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、增殖、以及心血管功能具有特定影響。這些系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)源性S1P水平的變化可以具有有害作用，激發(fā)若干種病理情況，包4舌癌癥、炎癥、血管發(fā)生、心臟病、哞喘和自身免疫疾病。用來治療各種疾病和紊亂(包4舌心血管疾病、腦血管疾病和各種癌癥)的最新方法涉及降〗氐生物可利用的S1P水平，單獨(dú);也或與其他治療聯(lián)合。盡管已經(jīng)提出了靶向鞘磷脂代謝途徑的關(guān)鍵酶例如SPHK的以鞘磷脂為基礎(chǔ)的治療策略，但是直到最近才強(qiáng)調(diào)脂質(zhì)遞質(zhì)S1P本身的干擾，很大程度上是因?yàn)橹苯訙p輕這種脂質(zhì)靶標(biāo)存在測(cè)該抗體上。最近，描述了對(duì)S1P特異的抗體的產(chǎn)生。參見例如，共同擁有的美國專矛J中"i青序歹U號(hào)20070148168;WO2007/053447。這才羊的4元體，其可以例如選^奪性地從血清吸附S1P,充當(dāng)分子海綿以中和胞外S1P。還參見共同擁有的美國專利號(hào)6,881,546和6，858，383以及美國專利申請(qǐng)序列號(hào)10/029,372。SPHINGOMABTM,由Lpath,Inc.開發(fā)并在上面列出的某些專利或?qū)＠暾?qǐng)中描述的鼠類單克隆抗體(mAb),已被證實(shí)在人類疾病的模型中是有效的。在一些情形下，人源化抗體可以優(yōu)選是針對(duì)鼠類抗體的，尤其是對(duì)于人類的治療用途，其中人-抗-小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)可能出現(xiàn)。這樣的反應(yīng)可以通過中和結(jié)合活性和/或快速從身體血液循環(huán)清除該抗體而降低抗體的效力。HAMA反應(yīng)還可以在給予小鼠抗體之后引起毒性?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了人源化抗-SlP抗體并在本文中進(jìn)行描述。依據(jù)在結(jié)合S1P、中和S1P以及調(diào)節(jié)與S1P相關(guān)的疾病狀態(tài)中的歲文力，這種抗體預(yù)期具有鼠類mAb的所有優(yōu)點(diǎn)，但是當(dāng)用于人類環(huán)境時(shí)沒有鼠類mAb的任何潛在缺點(diǎn)。如在下文實(shí)施例中描述的，這種10人源化抗體(稱為L(zhǎng)T1009或sonepcizumab)實(shí)際上已顯示出比疾病動(dòng)物^:莫型中的親代(鼠類)抗體更大的活性。定乂在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，將限定在本發(fā)明上下文中使用的多個(gè)術(shù)語。除了這些術(shù)語之外，根據(jù)需要其他的術(shù)語在說明書其他地方進(jìn)行限定。除非在本文中另外明確限定，本i兌明書中^f吏用的4支術(shù)術(shù)語具有它們?cè)诒绢I(lǐng)域公認(rèn)的含義。如果矛盾，本說明書，包括定義起作用。"免疫源性部分"包括任何抗體(Ab)或免疫J求蛋白(Ig)，并且是指任何形式的來源于免疫球蛋白基因、仿造或由免疫球蛋白基因編碼的肽或多肽，或能夠結(jié)合抗原或表位的這些肽或多肽的片4殳(參見侈寸^口Immunobiology,5thEdition,Janeway,Travers，Walport，Shlomchiked.(editors),GarlandPublishing(2001))。在本發(fā)明中，抗原是生物活性脂質(zhì)分子。"抗-SlP抗體"或"與S1P具有反應(yīng)活性的免疫源性部分"是指結(jié)合SIP的任何抗體或抗體來源分子。如才艮據(jù)這些定義應(yīng)該理解的，抗體或免疫源性部分可以是多克隆或單克隆的，并且可以通過各種途徑產(chǎn)生，和/或可以/人動(dòng)物，包括人類對(duì)象中分離。"生物活性脂質(zhì)"是指脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。通常，當(dāng)發(fā)揮其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用時(shí)，生物活性脂質(zhì)不會(huì)存在于生物膜中，也就是說，雖然這樣的脂質(zhì)種類可以存在于生物膜(例如，細(xì)胞膜，細(xì)胞器的膜等)中的某個(gè)點(diǎn)，當(dāng)與生物膜相連時(shí)，其不是"生物活性脂質(zhì)"，而是"結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)"分子。生物活性脂類與結(jié)構(gòu)性脂類(例如膜結(jié)合磷脂)的區(qū)別在于，它們介導(dǎo)胞外和/或胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而涉及通過調(diào)節(jié)分化、遷移、增殖、分泌、存活和其他過程而控制多種類11型的細(xì)胞的功能。在體內(nèi)，生物活性脂類可以在胞外液體中找到，其中它們可與其他分子絡(luò)合，例如血清蛋白，如白蛋白和脂蛋白，或者為"游離"形式，即沒有與另種類一分子絡(luò)合。作為胞外遞質(zhì)，一些生物活性脂類通過活化膜結(jié)合離子通道或G-蛋白偶聯(lián)受體而改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這又會(huì)激活導(dǎo)致細(xì)胞功能或存活發(fā)生改變的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。作為胞內(nèi)遞質(zhì)，生物活性脂類可以通過直接與胞內(nèi)成分如酶和離子通道相互作用而發(fā)揮它們的作用。生物活性脂類的代表性實(shí)例包括LPA和S1P。術(shù)語"治療劑，，是指用來減輕血管發(fā)生和/或新生血管形成的試劑，例如，CNV和BV成熟化，水腫，血管通透性以及與眼病和眼疾相關(guān)的或其潛在病理學(xué)的部分的纖維化、纖維形成和結(jié)疤。術(shù)語"組合治療"是指包括提供至少兩種不同治療以實(shí)現(xiàn)指定療歲丈的治療方案。例^。，《且合治療可以涉及《合予兩種或更多種^:學(xué)上不同的活性組分，例如抗-LPA抗體和抗-SlP抗體?？商鎿Q地，組合治療可以包括給予對(duì)生物活性脂質(zhì)具有反應(yīng)性的免疫源性部分和纟會(huì)予一種或多種其^Mt學(xué)治療劑?？蒦弄4奐i也，組合治療可以包括與給予另一治療如方文射治療和/或手術(shù)一起纟會(huì)予抗-脂質(zhì)抗體。而且，組合治療可以包括與一種或多種其他生物學(xué)試劑(例如抗-VEGF,TGFp，PDGF或bFGF試劑)、4匕學(xué)治療劑以及另一種治療如》文射和/或手術(shù)一起纟合予抗-脂質(zhì)抗體。在4吏用兩種或更多種化學(xué)上不同的活性組分的聯(lián)合治療的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，活性組分可以作為相同組合物的一部分或作為不同組合物力。以給藥。當(dāng)作為單獨(dú)的組合物給藥時(shí)，包含不同活性組分的組合物可以在同一時(shí)間或不同時(shí)間鄉(xiāng)會(huì)藥，通過相同或不同途徑，4吏用相同或不同劑量方案，所有這些才艮據(jù)具體情況的要求并由主治醫(yī)師確定。類似地，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)抗-脂質(zhì)抗體種類，例如抗-LPA抗體，單獨(dú)地或聯(lián)合一種或多種化療劑與例如》文射和/或手術(shù)組合時(shí)，藥物可以在手術(shù)或》欠射治療之前或之后遞送。12'抗-SlP劑"是指與SIP具有特異反應(yīng)活性的任何試劑，并且來源《;》"半抗原，，是指適于結(jié)合至半抗原的分子，由此使得該半抗原具有免疫原性。半抗原分子的代表性的非限制性種類是蛋白質(zhì)，其實(shí)侈'J包4舌白蛋白、4月孑L血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin)、血細(xì)月包凝集素(hemaglutanin)、石皮傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素。適合依這些、以及后來發(fā)現(xiàn)的或發(fā)明的天然或合成半抗原，可以適合依照本發(fā)明使用。術(shù)語"化學(xué)治療劑(或化療劑)"是指抗癌和其他抗-過度增生試劑。簡(jiǎn)單地i兌，"化療劑"是指用來石皮壞細(xì)胞和組織的化學(xué)物質(zhì)。這樣的試劑包括但不限于(1)DNA損傷試劑和抑制DNA合成的試劑蒽環(huán)類(多柔比星，donorubicin、表柔比星)，烷基化劑(苯達(dá)莫司汀、白消安、卡鉑、卡莫司汀、順鉑、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴喚、六曱蜜胺、異環(huán)磷酰胺(ifosphamide)、洛莫司汀、氮芥、美法侖、米托坦、絲裂霉素C、，派泊溴烷、丙卡巴肼、鏈脲菌素、噻替派、以及曲他胺)，鉑衍生物(順柏，卡柏，順二氯化二氨亞鉑)，端沖立末端轉(zhuǎn)移酶和拓樸異構(gòu)酶抑制劑(Camptosar,鹽酸伊立替康)；(2)微管蛋白-解聚合試劑紫杉烷(紫杉醇，多西紫杉醇，BAY59-8862);(3)抗-代謝物如卡培他濱，2-氯脫氧腺香，阿糖胞苷(及其活化形式，ara-CMP)，胞嘧咬，阿糖胞苦，達(dá)卡巴，秦(dacabazine)，氟尿苷，氟達(dá)4立濱，5-氟尿嘧"定，5-DFUR,吉西他濱，羥基脲，6-巰噤呤，曱氨蝶呤，噴司他丁，三曱曲沙和6-石克代鳥嘌呤；(4)抗-血管生成(阿瓦斯丁、沙立度胺、舒尼替尼、來那度胺(lenalidomide))，血管石皮裂劑(類黃酉同/黃酮、DMXAA、考布他汀衍生物如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等)；(5)生物制產(chǎn)品如抗體或抗體片l殳(赫賽汀、阿瓦斯丁、Panorex、Rituxan、澤娃靈、麥羅》荅、Campat、Bexar、愛必妥、Lucentis);以及(6)內(nèi)分泌治療芳香酶抑制劑(4-氫#_烯二酮(4-hydroandrostendione)、依西美坦、氨基才各魯米特(aminoglutehimide)、阿那曲峻、來曲峻(letozole))，抗-雌激素(他莫昔芬、托瑞米芬(Toremifine)、雷洛昔芬(Raoxifene)、Faslodex)，甾類如地塞米+>;(7)免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子如IFN-(3和IL-2，整聯(lián)蛋白的抑制劑，其他粘著蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶；(8)組蛋白脫乙?；敢种苿?9)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，如酪氨酸激酶抑制劑，例如伊馬替尼(Gleevec);(10)熱休克蛋白抑制劑；(11)類視色素如所有反式類維生素A酸(retinoicacid);(12)生長(zhǎng)因子受體抑制劑或生長(zhǎng)因子本身；(13)抗-有絲分裂化合物，如諾維本(navelbine)、紫杉醇、泰素帝(taxotere)、長(zhǎng)春石威、長(zhǎng)春新》威、長(zhǎng)春J也辛和長(zhǎng)春瑞濱；(14)抗發(fā)炎化合物如COX抑制劑；以及(15)細(xì)力包周期調(diào)節(jié)劑，例如4企查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑和端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑。如本文使用的，術(shù)語"鞘脂"是指在本領(lǐng)域稱為鞘脂類的一類^f匕合物，包括一旦不限于以下4b合物(參見http〃www.lipidmaps.org,該網(wǎng)站包含通過以下括號(hào)內(nèi)的字母數(shù)字串指示的鏈接，該鏈接包含相應(yīng)化合物的化學(xué)式、結(jié)構(gòu)信息等)鞘氨基醇石成基[SP01]革肖氨醇(Sphing-4-enines)(Sphingosines)[SP0101]二氫鞘氨醇[SP0102]4-羥基二氫鞘氨醇(植物鞘氨醇)[SP0103]鞘氨基醇》咸類似物和變體[SP0104]鞘氨基醇石威l-磷酸[SP0105]溶血鞘疇脂和溶血^唐苷神經(jīng)鞘脂[SP0106]N-甲基化鞘氨基醇?jí)A[SP0107]鞘氨基醇》威類似物[SP0108〗神經(jīng)酰胺[SP02]14N-?；拾贝?神經(jīng)酰胺)[SP0201〗N-?；淝拾贝?二氫神經(jīng)酰胺)[SP0202]N一?；?-羥基二氬鞘氨醇(植物鞘氨醇)[SP0203]酰基神經(jīng)酰胺[SP0204;j神經(jīng)酰胺1-磷酸[SP0205]鞘石粦脂[SP03]神經(jīng)酰胺磷酸膽堿(鞘磷脂)[SP0301]神經(jīng)酰胺磷酸氨基乙醇[SP0302]神經(jīng)酰胺磷酸肌醇[SP0303]磷?；试轮?Phosphonosphingolipids)[SP04〗中性糖苦神經(jīng)鞘脂[SP05]簡(jiǎn)單Glc系列(GlcCer,LacCer等)[SP0501]GalNAcbl-3Galal-4Galbl-4Glc-(Globo系列)[SP0502]GalNAcbl-4Galbl-4Glc-(Ganglio系列)[SP0503]Galbl-3GlcNAcbl-3Galbl-4Glc-(Lacto系列)[SP0504]Galbl-4GlcNAcbl畫3Galbl-4Glc畫(Neolacto系列)[SP0505]GalNAcbl畫3Galal-3Galbl畫4Glc畫(Isoglobo系列)[SP0506]GlcNAcbl-2Manal-3Manbl-4Glc-(Mollu系列)[SP0507]GalNAcbl-4GlcNAcbl-3Manbl-4Glc-(Arthro系列)Gal國(Gala系列)[SP0509]其他[SP0510]酸性4唐苷神經(jīng)鞘脂[SP06]神經(jīng)節(jié)苷脂[SP0601]好4t神經(jīng)鞘類脂(^克苷脂)[SP0602]15葡糖醛酸鞘脂[SP0603]石粦酸糖苦神經(jīng)鞘脂(Phosphoglycosphingolipid)[SP0604]其他[SP0600]石威性4唐苷鞘脂[SP07]兩性4唐苷鞘脂[SP08]偶砷基鞘脂[SP09]。本發(fā)明提供了抗鞘脂S1P劑，它對(duì)于治療或預(yù)防過度增生紊亂如癌癥和心血管或腦血管疾病和紊亂以及各種眼疾4艮有用，如在下文更詳細(xì)描述的。更具體地，本發(fā)明注意到S1P及其變體，包括但不限于鞘氨醇-l-磷酸[sphingene-l-磷酸；D-赤式-鞘氨醇-l-磷酸；鞘氨醇-l-磷酸；(E，2S,3R)-2-氨基-3-羥基-十八烷-4-烯氧基]膦酸(AS26993-30-6)，DHS1P定義為二氫鞘氨醇-l-磷酸[二氫鞘氨醇-l-磷酸];[(2S，3R)-2-氨基-3-羥基-十八烷氧基]膦酸；D-赤式-二氫-D-鞘氨醇-l-磷酸(CAS19794-97-9)];SPC是神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿、溶血鞘磷脂、鞘氨醇磷酸膽堿、鞘氨醇磷酰膽堿、氯化三曱基銨乙酰肼(ethanaminium)、2-((((2-氨基-3-羥基-4-十八烯基)氧基)羥基氧膦基)氧基)-N,N，N-三曱基-氯化物、(R-(R*，S*-(E)))，2-[[(E,2R,3S)-2-氨基_3_羥基_十八烷_4_烯氧基]_羥基_磷酰基]氧乙基_三甲基_氯化銨(CAS10216-23-6)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，除非另有指明，術(shù)語"表位"或"抗原決定簇"是指抗-SlP劑與其反應(yīng)的S1P的區(qū)域。術(shù)語"過度增生紊亂"是指與不受控制的細(xì)胞增生相關(guān)的疾病和紊亂，包招vf旦不限于導(dǎo)致癌癥或瘤形成和良性腫瘤的不受控制的器官和組織細(xì)胞生長(zhǎng)。與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的過度增生紊亂可以導(dǎo)致血管發(fā)生的疾病，如血管瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、肥胖、老年性黃斑退化癥和各種^L網(wǎng)膜病變，以及由于在治療動(dòng)脈粥樣硬化中》文入支架16而引起再狹窄結(jié)果的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增生。涉及成纖維細(xì)胞的過度增生紊亂(例如纖維形成)包括但不限于過度結(jié)疤的紊亂(例如纖維化)，如老年性黃斑退化癥、心臟重建(cardiacremodeling)和與心月幾梗死相關(guān)的障石尋，如通常作為手術(shù)或損傷結(jié)果出現(xiàn)的過度傷口愈合、疤痕疙瘩，以及纖維樣瘤和植入支架。本發(fā)明的組合物用于鞘脂堿基治療。"治療"是指疾病、紊亂或身體創(chuàng)傷的預(yù)防和/或治療。"心血管治療"包4舌心臟治療以及與心血管系統(tǒng)相關(guān)的其4也疾病如心臟病的預(yù)防和/或治療。術(shù)語"心臟病"包4舌涉及心臟或心月幾組織的疾病、紊亂、創(chuàng)傷或手術(shù)治療中的4壬一種類型。其中特別感興趣的是涉及心力幾組織擊夾氧和/或在夾血和/或心力衰竭的心臟疾病?？梢杂扇毖獙?dǎo)致的一種心臟病是再灌注損傷，如在可在治療中使用抗-凝藥、血才全;容解劑、或抗-絞痛藥物治療時(shí)發(fā)生，或者當(dāng)心臟血管系統(tǒng)通過血管成形術(shù)或冠狀動(dòng)脈移植術(shù)手術(shù)打開時(shí)發(fā)生。本發(fā)明涉及的另一種心臟病是冠脈疾病(CAD)，其可以由動(dòng)脈石更化，特別是動(dòng)脈粥樣硬化(一種常見的缺血原因)引起。CAD具有諸如穩(wěn)定或不穩(wěn)、定心絞痛的癥狀，并且可以導(dǎo)致心月幾梗死(MI)和心臟性猝死。特別感興趣的病癥包括但不限于心肌缺血；急性心肌梗死(AMI);冠脈疾病(CAD);急性冠脈綜合征(ACS);心臟細(xì)胞和組織損傷可能在具有或沒有放入支架的經(jīng)皮血管重建(冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù))過程中或作為其結(jié)果發(fā)生；冠狀動(dòng)脈旁路移才直(CABG)或者可能引起缺血或人缺血/再灌注損傷的其他手術(shù)或醫(yī)療方法或治療；以及心血管創(chuàng)傷。術(shù)語"心力衰竭"涵蓋急性心肌梗死、心肌炎、心肌病、充血性心力衰竭、感染性休克、心臟創(chuàng)傷和特發(fā)性心力衰竭。導(dǎo)致心力衰竭的缺血性病癥譜稱為急性冠脈綜合征(ACS)。術(shù)語"心臟病治療劑"是指對(duì)由心臟和心月/L疾病及紊亂引起或相關(guān)的疾病和紊舌L具有治療作用的試劑。"腦血管治療"是指4十對(duì)與腦缺血和/或擊夾氧相關(guān)的疾病和紊亂的預(yù)防和/或治療的治療。其中特別感興趣的是由心臟病(包括但不限于心力衰竭)引起的全腦缺血所導(dǎo)致的腦缺血和/或缺氧。術(shù)語"鞘脂代謝物"是指形成鞘脂的化合物，以及特定鞘脂降解得到的化合物。換句話說，"鞘脂代謝物"是涉及鞘脂代謝途徑的化合物。代謝物包括代謝前體和代謝產(chǎn)物。術(shù)語"代謝前體，，是指形成鞘脂的化合物。特別感興趣的代謝前體包括但不限于SPC、鞘磷脂、二氫鞘氨醇、二氫神經(jīng)酰胺和3-酮基二氫鞘氨醇。術(shù)語"代謝產(chǎn)物"是指由鞘脂降解產(chǎn)生的化合物，如磷酰膽堿(例如磷,旦堿)、脂肪酸，包括游離脂肪酸，以及十六醛(例如棕櫚醛)。如本文使用的，術(shù)語"治療或治療性的"包括疾病或紊亂治療的所有內(nèi)涵(fillspectrum)。本發(fā)明的"治療，，劑可以預(yù)防性或防止性方式起作用，包括設(shè)計(jì)成靶向可以鑒定處于危險(xiǎn)中的個(gè)體的并入程序的方式(藥物遺傳學(xué))；或者以緩和或治愈性的方式起作用；或者可以用來減i差所治療疾病或紊亂的至少一種癥狀進(jìn)展的速度或程度；或者可以用來使所需的時(shí)間最少、使任何不適或疼痛的發(fā)生或程度最小化，或者與疾病、紊亂或身體創(chuàng)傷的恢復(fù)相關(guān)的身體局限最少；或者可以用作其他療法和治療的佐劑。"治療"是指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施。需要治療的主體包括已經(jīng)具有該紊亂的主體以及需要預(yù)防該紊亂的主體。術(shù)語"組合療法"是指涉及提供至少兩種不同治療以實(shí)現(xiàn)指定療歲丈的治療方案。例3口，組合療法可以涉及鄉(xiāng)合予兩種或更多種^:學(xué)上不同的活性組分,例如抗-LPA抗體和抗-SlP抗體?？商鎿Q地，18組合療法可以包括-纟合予與生物活性脂質(zhì)反應(yīng)性的免疫源性部分和纟會(huì)予一種或多種其他化療劑。可替換地，組合療法可以涉及與纟合予另一治療如放射治療和/或手術(shù)一起給予抗-脂質(zhì)抗體。而且，組合療法可以涉及與一種或多種其他生物學(xué)試劑(例如抗-VEGF,TGFP，PDGF或bFGF試劑)、化療劑以及另一種治療如》文射和/或手術(shù)一起給予抗-脂質(zhì)抗體。在使用兩種或更多種化學(xué)上不同的活性組分的耳關(guān)合治療的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，活性組分可以作為相同組合物的一部分或作為不同組合物加以給藥。當(dāng)作為單獨(dú)的組合物給藥時(shí)，包含不同活性組分的組合物可以在同一時(shí)間或不同時(shí)間給藥，通過相同或不同途徑，4吏用相同或不同劑量方案，所有這些才艮據(jù)具體情況要求并由主治醫(yī)師確定。類似i也，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)4元-脂質(zhì)4元體物種，例如抗-LPA抗體，單獨(dú)地或聯(lián)合一種或多種化療劑與例如》文射和/或手術(shù)組合時(shí)，藥物可以在手術(shù)或放射治療之前或之后遞送。"單一療法"是指基于給予一種治療有效化合物的治療方案，無i侖是以單次劑量或隨時(shí)間的多次劑量《會(huì)藥。"瘤形成"或"癌癥"是指異常和不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)。"瘤形成，，或胂瘤或癌癥是細(xì)胞生長(zhǎng)的異常、不受調(diào)節(jié)且紊亂性增殖，并且通常稱為癌癥。瘤形成可以是良性的或惡性的。如果具有石皮壞性生長(zhǎng)、侵入和轉(zhuǎn)移性質(zhì)，則瘤形成是惡性的或癌性的。侵入性是指瘤形成通過滲入或破壞周圍組織的局部蔓延，局部地破壞限定組織邊界的基底層(basallaminas)，從而經(jīng)常進(jìn)入身體循環(huán)系統(tǒng)。轉(zhuǎn)移通常是指腫瘤細(xì)胞通過淋巴管或血管的傳播。轉(zhuǎn)移還指肺瘤細(xì)胞通過直接延伸通過漿液腔、或蛛網(wǎng)膜下腔或其他空間的遷移。通過轉(zhuǎn)移過程，腫瘤細(xì)胞遷移至身體的其他區(qū)域而在遠(yuǎn)離初始出現(xiàn)部位的區(qū)域中形成。19用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"是指^f壬^r歸類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包^舌人類、家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、以及動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸?，如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人類。"天然抗體，，和"天然免疫J求蛋白，，通常是大約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白，由兩個(gè)相同輕(L)鏈和兩個(gè)相同重(H)鏈構(gòu)成。每一個(gè)輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接至重鏈，而鍵接在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵的數(shù)量在變化。每一個(gè)重量和輕《連還具有^見則間隔開的鏈內(nèi)二錄u化4建橋。每一個(gè)重鏈具有在一個(gè)末端的可變結(jié)構(gòu)域(Vh),接著是凄t個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。每一個(gè)輕鏈具有在一個(gè)末端的可變結(jié)構(gòu)域(VJ和在另一末端的恒定結(jié)構(gòu)域；輕《連的恒定結(jié)構(gòu)i或與重鏈的第一'l"亙定結(jié)構(gòu)i或相^f，并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域相對(duì)。認(rèn)為特定的氨基酸殘基形成輕鏈可變結(jié)構(gòu)i或和重鏈可變結(jié)構(gòu)i或之間的界面。術(shù)語"可變，，區(qū)包含框架和CDR(另稱為高度可變區(qū))，并且是指這樣的事實(shí)，即抗體中的某些部分的可變結(jié)構(gòu)域的序列在很大然而，可變化性在整個(gè)抗體的可變結(jié)構(gòu)i或上不是均勻分布的。其集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的稱為高變區(qū)的三個(gè)片段中。可變結(jié)構(gòu)域的相對(duì)高度保守的部分稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈每一個(gè)的可變結(jié)構(gòu)i成包含4個(gè)FR(分別是FR1、FR2、FR3和FR4),4艮大程度上采用(3-片層結(jié)構(gòu)，通過3個(gè)高變區(qū)連接，其形成環(huán)連接的P-片層結(jié)構(gòu)，并且在一些情況下形成P-片層結(jié)構(gòu)的一部分。每一個(gè)鏈中的高變區(qū)通過FR緊密接近地保持在一起，并且利用來自其他鏈的高變區(qū)，組成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat，etal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)，pages647-669)。恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，如在抗體依賴性細(xì)胞毒性中抗體的參與。20當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語"高變區(qū)"是指負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。該高變區(qū)包含來自"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);以上參見Kabat,etal.(1991))和/或來自"高變環(huán)"的那些殘基(例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)i或中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3),以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。"框架"或"FR"殘基是不同于如本文定義的高變區(qū)殘基的那些可變結(jié)構(gòu)i或殘基。抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片,殳，以及殘基"Fc"片革殳，"Fab"片,殳每一個(gè)具有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，"Fc"片段其名稱反映了其易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍然能夠交聯(lián)的抗原的F(ab')2片段。"Fv"是包含完全的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片萃殳。這個(gè)區(qū)i或由以緊密非共〗介結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體構(gòu)成。正是在這種構(gòu)造中，每一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用而限定在Vh-Vl二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？偲饋碚f，六個(gè)高變區(qū)給抗體賦予抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)高變區(qū)的Fv的一半)具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管以比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力降低。Fab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一'l"亙定結(jié)構(gòu)域(CH1)。通過在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端插入一些殘基包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，F(xiàn)ab，片段不同于Fab片段。Fab，-SH在本文中特指Fab，，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基帶有21游離硫醇基團(tuán)。F(ab，)2抗體片段初始作為其間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab，片段對(duì)而產(chǎn)生?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。來自任何脊推動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可以被歸類為兩個(gè)基于它們的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而明顯不同的類型之一，稱、為K和人。依據(jù)它們的重4連恒定結(jié)構(gòu)i或的氨基酸序列，免疫^求蛋白可以歸為不同種類。目前有5個(gè)主要的免疫球蛋白種類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且這之中的多個(gè)可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同免疫球蛋白種類的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為a、S、s、y和ia。不同免疫J求蛋白種類的亞單4立結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是熟知的。本文中的術(shù)語"抗體，，以最廣含義〗吏用，并且特別包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異抗體(例如雙特異抗體、抗體片l殳，以及采用親代抗體的CDR(或其保持抗原結(jié)合活性的變體)的結(jié)合劑?？贵w在本文中定義為保持親代抗體的至少一種期望活性。期望活性可以包括特異性結(jié)合抗原的能力、抑制體外增生的能力、抑制體內(nèi)血管發(fā)生的能力、以及改變體外細(xì)胞因子種類的能力。"抗體片段"包含全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合或可變結(jié)構(gòu)域。抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙特異抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異抗體。如本文中使用的，術(shù)語"單克隆抗體，，是指從基本上同源抗體群中獲得的抗體，例如包含該群的單個(gè)抗體是相同的，除了可以少量存在的可能的天然突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，相比于通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑，每一個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。改良的"單克隆，，表明抗體作為獲自基本上同源抗體群的特性，并且不被解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過最先由Kohler，etal.,Nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法制得，或者可以通過重組DNA方法制得(參見例如美國專利No.4,816,567)。"單克隆抗體"也可以使用例如在Clackson，etal"Nature352:624-628(1991)andMarksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技術(shù)乂人噬菌體抗體文庫分離。本文中的單克隆抗體特別包括"嵌合"抗體(免疫^求蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體序列中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的活性(美國專利No.4,816,567;以及Morrison,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。非人(例如鼠類)抗體的"人源化，，形式是包含來源于非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗體。對(duì)于大部分，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)殘基被來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替代，具有期望的特異性、親和力和能力。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含在接受者抗體或供者抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。形成這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。一般地，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個(gè)并且典型地兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的高變區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變區(qū)，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體可選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫J求蛋白的至少一部分。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見Jones,etal.，Nature321:522-525(1986);23Reichmann,etal.，Nature332:323-329(1988》andPresta，Curr,Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)andHansen,WO2006105062。"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包含抗體Vh和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域以單個(gè)多肽鏈存在。通常，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含在Vh和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連4妄區(qū)，其能夠-使sFv形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)片勾。只十于sFv的綜述，參見PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。術(shù)語"雙特異抗體"是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，這種片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)連接于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的重鏈可變結(jié)構(gòu)i或(VH)。通過利用太短而不允i午相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接子(linker)，這些結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙特異抗體更充分地描述于例長(zhǎng)口EP404,097;WO93/11161;以及Hollinger,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。當(dāng)在本申請(qǐng)通篇中使用時(shí)，術(shù)語"線性抗體"是指在Zapata，etal.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中描述的抗體。簡(jiǎn)而言之，這些抗體包含形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)i或的一對(duì)串聯(lián)Fd節(jié)賴二(VH-CH1-VH-CH1)。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。"變異"抗-鞘脂抗體在本文中是指借助于在親代抗體序列中插入、缺失、和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基且4呆持親^U元-結(jié)合抗體的至少一種期望活性，使得氨基酸序列不同于"親代"抗鞘脂抗體氨基酸序列的分子。期望活性可以包括特異性結(jié)合抗原的能力、抑制增生的能力、抑制體內(nèi)血管發(fā)生的能力、以及在體外改變細(xì)胞因子種類(profile)的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，變體包含在親代i抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。例如，變體24可以包含在親代j元體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中的至少一個(gè)，例》口約1至約10個(gè)，并且優(yōu)選地為約2至約5個(gè)取代。一般地，變體將具有與親代抗體重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列有至少50%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%，并且最優(yōu)選至少95%序列同一性的氨基酸序列。關(guān)于這個(gè)序列的同一性或同源性在本文中定義為，候選序列中與親代抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，如果需要在對(duì)齊序列和引入間隙之后，以獲得最大百分比序列同一性?？贵w序列中的N-末端、C-末端、或內(nèi)部延伸、缺失或插入中任一個(gè)都不解釋為影響序列同一性或同源性。變體保持結(jié)合鞘脂的能力，并且優(yōu)選地具有優(yōu)于親代抗體的期望活性。例如，變體可以具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力，加強(qiáng)的減少血管發(fā)生和/或停止腫瘤進(jìn)展的能力。為了分析這樣的期望性能(例如，更低免疫原性、更長(zhǎng)半衰期，增強(qiáng)的穩(wěn)、定性，增強(qiáng)的歲丈力)，必須《于比變體的Fab形式和親^U元體的Fab形式，或者對(duì)比變體的全長(zhǎng)形式和親代抗體的全長(zhǎng)形式，例如，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)抗-鞘脂抗體的形式影響其在本文4皮露的生物學(xué)活性測(cè)定中的活性。本文中特別感興趣的變異抗體可以是顯示至少約5%,伊乙選i也至少約10%、25%、59%或更高的至少一種期望活性的變體。當(dāng)相比于親代抗體時(shí)，優(yōu)選的變體是具有如體外測(cè)定的優(yōu)異生物物理性能或如體外或體內(nèi)測(cè)得的優(yōu)異生物學(xué)活性的變體。本文中的"親代"抗體是由用于制備變體的氨基酸序列編碼的抗體。優(yōu)選地，親代抗體具有人框架并且如果存在的話具有人抗體恒定區(qū)。例如，親代抗體可以是人源化或人抗體。"分離的"抗體是已被鑒定且從其自然環(huán)境的成分分離和/或回收的抗體。其自然環(huán)境的污染成分是會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)溶解物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該抗體將純化為(1)如通過Lowry法確定的，高于該抗體按重量計(jì)的95%,并且最伊乙選地高于4安重量i十的99%;(2)通過4吏用自i走^r、序歹ll分沖斤4義(spinningcupsequenator)，足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或(3)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選地銀染色，通過在還原或非還原條件下的SDS-PAGE測(cè)定的同質(zhì)性。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)樵摽贵w自然環(huán)境的至少一個(gè)成分將不會(huì)存在。然而，通常地，分離的抗體將通過至少一個(gè)純化步-驟進(jìn)4于制備。當(dāng)在本文中使用時(shí)，詞語"標(biāo)記(物)"是指直4妻或間-接結(jié)合至抗體的可檢測(cè)化合物或組合物。標(biāo)記本身通過自身是可以檢測(cè)的(例如放射性同位素或熒光標(biāo)記)，獲在酶促標(biāo)記的情況下，可以催化可檢測(cè)的基底化合物或組合物的化學(xué)變化。"固相"是指本發(fā)明的抗體可以粘附到其上或該抗體或其他抗-S1P結(jié)合劑另外可以固定到其上的非水基質(zhì)。本發(fā)明包括的固相的實(shí)例包括那些部分或整體由玻璃(例如控制孔隙玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和石圭樹脂形成的。在某些實(shí)施方式中，才艮據(jù)內(nèi)容，固相可以包括測(cè)定4反的孔，而在其他情況下，其是純化柱(例如，親和性色i普柱)。該術(shù)語還包4舌分散顆粒的不連續(xù)固相，如在美國專利No.4,275,149中描述的那些。"脂質(zhì)體，，是有各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的小嚢泡，其對(duì)于將藥物(如本文中披露的抗-鞘脂抗體以及可選地化療劑)遞送至哺乳動(dòng)物4艮有用。脂質(zhì)體的成分通常以雙層形成4非列，類似于生物膜的脂質(zhì)排列。"分離的"核酸分子是指^皮鑒定且分離自至少一種污染核酸分子的核酸分子，其通常與抗體核酸的天然來源相關(guān)。分離的核酸分子通常不是在自然中發(fā)現(xiàn)的形式或位置。因子，其中例如核酸分子在不同于天然細(xì)胞的染色體位置中。26表達(dá)"控制序列"是指對(duì)于特定宿主有4幾體中的可操作連^妄的編碼序列的表達(dá)必需的DNA序列。適合于原核細(xì)胞的控制序列例如包括啟動(dòng)子，可選地操作子序列以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核細(xì)胞已知利用啟動(dòng)子、多腺苷化信號(hào)和增強(qiáng)子。當(dāng)置于與另一核酸序列的功能關(guān)系時(shí)，核酸是"可操作地連接的"。例如，如果作為參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)，則前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA可才喿作地連接于多肽的DNA;如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可纟乘作地連接于該編碼序列；或者如果祐L定位以i"更有利于翻譯，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作i也連接于編石馬序列。一般地，"可操作地連接"是指連接的核酸分子是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，為連續(xù)的且在讀碼框中。然而，增強(qiáng)子不一定是連續(xù)的。連接是通過在方便限制位點(diǎn)處的接合而完成的。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則合成的寡核苷酸適配子(adaptor)或連4妄子(linker)依照傳統(tǒng)實(shí)踐〗吏用。如本文使用的，表達(dá)"細(xì)胞"、"細(xì)胞系，，和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換使用，并且所有這樣的名稱包括后代。因此，詞語"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化細(xì)胞，，包括原代主體細(xì)胞和源于其的培養(yǎng)物，而不管接種轉(zhuǎn)移的次^t。還應(yīng)理解，所有子^在DNA含量上可以不是4青確相同的，這是由于故意或無意的突變。包括具有與初始轉(zhuǎn)化細(xì)月包相同的功能或生物學(xué)活性的突變后代。其中使用了不同的名稱，這根據(jù)上下文將會(huì)很清楚。根據(jù)本發(fā)明"可專利的"的組合物、方法、機(jī)器或制品是指，主題滿足在進(jìn)行分析時(shí)對(duì)于可專利性的所有法律要求。例如，對(duì)于新穎性、創(chuàng)造性等，如果后續(xù)審查表明，一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求涵蓋了一個(gè)或多個(gè)否定新穎性、創(chuàng)造性等的實(shí)施方式，則所述權(quán)利要求具體地排除不可專利的實(shí)施方式。而且，所附權(quán)利要求應(yīng)解釋為揭^供最寬的合理范圍，以及保持它們的有效性。此外，如果從本申請(qǐng)27提交時(shí)或者作為專利授權(quán)公告時(shí)，一個(gè)或多個(gè)所附權(quán)利要求的有效性被置疑時(shí)，修改了一個(gè)或多個(gè)對(duì)于可專利性的法律要求或者如果對(duì)于評(píng)〗介是否滿足可專利性的特定法律要求的標(biāo)準(zhǔn)改變，則#又利要求應(yīng)以以下方式進(jìn)行解釋(l)保持它們的有效性；和(2)在各種情形下提供最寬的合理解釋。術(shù)語"藥用鹽"是指保持本發(fā)明的試劑或化合物的生物學(xué)效用和性能且不是生物學(xué)或其他方面不期望的鹽。在許多情況下，本發(fā)明的試劑和化合物能夠借助于帶電基團(tuán)，例如帶電氨基和/或羧基或者類似基團(tuán)的存在而形成酸和/或堿性鹽。藥用酸加成鹽可以用無機(jī)或有才幾酸制得，而藥用石咸加成鹽可以從無4幾或有枳〃喊制得。對(duì)于藥用鹽的鄉(xiāng)宗述參見Berge，"a/.(1977)J.Pharm.Sci.，vol.66，1-19。"多個(gè)"是指多于一個(gè)。術(shù)語"分開的"、"純化的"、"分離的，，等是指含有容納樣品的容器中的樣品的一個(gè)或多個(gè)成分在該容器中存在的一個(gè)或多個(gè)其他樣品成分存在下^皮物理地移出或稀釋。在分開或純化步-驟期間可以被移出或稀釋的樣品成分包括化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物、未反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、以及未結(jié)合的分子。術(shù)語"種類"在本文不同上下文中4吏用，例如4匕療劑的特定種類。在每一種上下文中，該術(shù)語是指在該特定上下文中提及的種類不同的化學(xué)分子種群。"特異性地相關(guān)"和"特異相關(guān)聯(lián)"等是指兩個(gè)分子之間的特定非隨機(jī)相互作用，該相互作用取決于允許這些分子之間的合適化學(xué)或分子相互作用的結(jié)構(gòu)、疏水/親水、和/或靜電特征的存在。28"受試者，，或"患者"是指需要通過本發(fā)明分子能夠奇效的被治療的動(dòng)物?？梢勒毡景l(fā)明治療的動(dòng)物包括脊推動(dòng)物，其中哺乳動(dòng)物如牛、犬、馬、貓、羊、豬、和靈長(zhǎng)類(包括人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)動(dòng)物是特別優(yōu)選的實(shí)例。"治療有效量"(或"有效量")是指活性組分，例如根據(jù)本發(fā)明的一種試劑，當(dāng)^^予一個(gè)受試者或患者時(shí)足以^吏治療有歲丈的量。因此，什么量構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明組合物的治療有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在眼部治療的上下文中，"治療有效量，，是這樣的量，其在與眼疾或眼病治療相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)上產(chǎn)生客觀才企測(cè)變化，包括與該眼疾或眼病相關(guān)聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)上的增加或降〗氐、細(xì)力包凋亡或其他細(xì)力包死亡途徑的"i秀導(dǎo)、癥狀的臨床改進(jìn)、異常新血管形成或炎癥的減少等。當(dāng)然，治療有效量4奪才艮據(jù)特定受試者和治療的癥狀、受試者的體重和年齡、疾病癥狀的嚴(yán)重度、所選擇的具體化合物、依照的給藥方案、給藥時(shí)間安排、給藥方式等，所有這些可通過本領(lǐng)域i支術(shù)人員容易地確定。應(yīng)當(dāng)J里解，在組合療法的情況下，什么量構(gòu)成特定活性成分的治療有歲丈量可以不同于當(dāng)作為單一治療(即，僅采用一種化學(xué)物質(zhì)作為活性組分)給藥時(shí)，構(gòu)成活性組分的治療有效量的量。術(shù)語疾病或紊亂的"治療"或"處理"包括4十^J"該疾病或紊亂的預(yù)防或防止(即，使臨床癥狀不進(jìn)展)；抑制該疾病或紊亂(即，阻止或抑制臨床癥狀的發(fā)展)；和/或減緩疾病或紊亂(即引起臨床癥狀的消退)。如將理解的，"預(yù)防"與"抑制"一種疾病或紊亂不總是可以區(qū)分開，因?yàn)樽罱K的誘發(fā)事件或多個(gè)事件可能是未知的或潛伏的。因此，術(shù)語"預(yù)防"應(yīng)理解為構(gòu)成包4舌"預(yù)防"和"抑制"的一種"治療"。因而，術(shù)語"治療"包括"預(yù)防"。術(shù)語"治療方案"是指使用化療藥物、放射治療、手術(shù)、基因治療、DNA疫苗和治療、反義基因治療包括siRNA治療、抗血管29生成治療、免疫治療、骨髓移4直、核酸適體(aptamer)和其〗也生物i式劑3口^t體和4元體變體、受體"i秀斜(receptordecoy)以及其4也以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療劑的任何疾病或紊亂的治療。
發(fā)明內(nèi)容依據(jù)本發(fā)明，提供了可專利的方法，用于通過給予一種藥物組合物來治療眼疾或眼病，該藥物組合物包含與生物活性脂質(zhì)(鞘氨醇-"磷酸)或其變體具有反應(yīng)活性的免疫源性部分(例如，抗體)，以便降低有效濃度，以使所耙向的生物活性脂質(zhì)完全或部分地被抑制以免引起不期望的作用或效應(yīng)。在該具體實(shí)施方式中，免疫源性部分是與脫脂脂質(zhì)(lysolipid)S1P具有反應(yīng)活性的單克隆抗體或變體的人源化形式。還纟是供了用于減少或預(yù)防異常纖維形成、纖維化或結(jié)應(yīng)；炎癥；異常心血管形成；調(diào)節(jié)眼睛的手術(shù)和創(chuàng)造性傷口愈合反應(yīng)；或用于減弱眼免疫反應(yīng)的方法。進(jìn)一步提供的是用于減少靶標(biāo)生物活性脂質(zhì)的有效眼部濃度或活性的方法。S1P的^表性變體包括鞘氨醇基磷酸膽堿、二氫鞘氨醇-l-磷酸。本發(fā)明的另一方面涉及可專利的藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)組合物，包括用于眼部給藥的那些組合物，其包含載體和分離的與生物活性脂質(zhì)具有反應(yīng)活性的免疫源性部分，例如單克隆抗體或抗體片段、變體或衍生物。優(yōu)選的載體包括藥用載體，尤其是當(dāng)該組合物打算用于人類的治療應(yīng)用時(shí)?！酚谟诜侨酥委煈?yīng)用(例々。在治療4半侶動(dòng)物、家畜、魚或家禽)，可以采用獸醫(yī)學(xué)可4婁受的載體。^^據(jù)本發(fā)明的免疫源性部分，優(yōu)選地作為治療組合物的一部分的示例性給藥方式，包括全身性給藥、腸胃外給藥(例如經(jīng)由靜月永內(nèi)、月幾內(nèi)或皮下方式的注射)、經(jīng)皮、皮內(nèi)或跨粘月莫遞送、目艮內(nèi)或眼周圍注射、粘月莫或局部菱會(huì)藥或通過吸入。本發(fā)明的這些和其他方面以及實(shí)施方式將在后續(xù)章節(jié)更加詳細(xì)地進(jìn)行討論。本發(fā)明的前述和其他方面才艮據(jù)以下的詳細(xì)描述、附圖以及權(quán)利要求將變得更加清楚。本發(fā)明的這些和其他方面以及實(shí)施方式將在后續(xù)章節(jié)更加詳細(xì)地進(jìn)行討論。本發(fā)明的前述和其他方面才艮據(jù)以下的詳細(xì)描述、附圖以及權(quán)利要求將變得更加清楚。盡管與本文中所述描述的類似或等同的方法和材料在本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中可以使用，但是以下描述了合適的方法和材料。另夕卜，以下的材料、方法和實(shí)施例^又是舉例說明性的而不用于限制。本申請(qǐng)包含至少一幅彩色圖。具有彩色圖的本申請(qǐng)的復(fù)印件在經(jīng)過請(qǐng)求和繳納必要費(fèi)用之后提供。每一個(gè)附圖的簡(jiǎn)短概括^是供如下圖1:圖1有兩幅圖A和B。A圖用曲線描述了S1P、SPH、LPA、SPC和其他結(jié)構(gòu)類似的生物脂類在竟?fàn)幧锼亟Y(jié)合的^1-S1P單克隆抗體的竟?fàn)幮訣LISA結(jié)果。這些結(jié)果表明，該抗體對(duì)于S1P是特異性的且敏感的，并且不識(shí)別結(jié)構(gòu)類似的生物活性脂類。如以下實(shí)施例1所描述的，結(jié)合的抗體通過結(jié)合有HRP的第二抗體(對(duì)于小鼠或人類IgG是特異性的)檢測(cè)。檢測(cè)顯色反應(yīng)并報(bào)告光學(xué)密度(OD)。用于竟?fàn)幍闹惖臐舛仍赬-軸上標(biāo)注。未能檢測(cè)到第二抗體與僅S1P涂覆的基質(zhì)之間的相互作用(數(shù)據(jù)未示出)。B圖示出了類似于在A圖中列出的SIP的生物活性脂類的結(jié)構(gòu)。圖2:該圖示出了多種嵌合和重組人源化抗-SlP抗體變體的結(jié)合性能。嵌合抗體(pATH10+pATH50)與S1P的結(jié)合在ELISA結(jié)合測(cè)定中與兩種形式的人源化抗-SlP單克隆抗體(pATH201+31pATH308)和(pATH201+pATH309)進(jìn)行比較。pATH308是具有5個(gè)鼠類回復(fù)突變的人源化輕鏈，而pATH309是框架區(qū)中具有3個(gè)回復(fù)突變的人源化輕鏈。人源化重鏈(pATH201)在框架區(qū)中僅包含一個(gè)鼠類回復(fù)突變。圖3是一個(gè)曲線圖，示出了SPHINGOMAB對(duì)于S1P是高度特異性的。該曲線(其婆t據(jù)是利用竟?fàn)幮訣LISA得到的)證實(shí)了相比于其他生物活性脂類，SPHINGOMAB對(duì)于SIP的特異性。SPHINGOMAB表明對(duì)于鞘氨醇(SPH)沒有交叉反應(yīng)性，其中鞘氨醇是SIP或溶血磷脂酸(LPA)的中間代謝前體，鞘氨醇(SPH)是結(jié)構(gòu)和功能類似于SIP的一種重要胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。SPHINGOMAB沒有識(shí)別其他結(jié)構(gòu)類似的脂類和代;射物，包括神經(jīng)酰胺-l-磷酸(C1P)、二氫鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、或鞘磷脂(SM)。SPHINGOMAB與二氫鞘氨醇-l-磷酸(DH-S1P)以及在更小的程度與鞘氨醇基磷酸膽堿(SPC)發(fā)生交叉反應(yīng)。SPHINGOMAB對(duì)于SIP的親和力(Kd)低于100pM，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大多數(shù)治療用抗體，尤其是其他分子海綿。圖4:圖4由兩個(gè)部分A和B。得出圖中表示的數(shù)據(jù)的實(shí)一驗(yàn)在以下實(shí)施例4中具體描述。簡(jiǎn)而言之，這些凄t據(jù)表明，SPHINGOMAB減少了眼部病變的CNV和皰形成。小鼠用SPHINGOMAB或同種型匹配的非特異性單克隆抗體進(jìn)行治療。CNV病變通過Bruch膜的激光破裂加以誘導(dǎo)。示出了來自用于血管生成(A)的羅丹明結(jié)合R.普通凝集素I或用于月交原痣形成(B)的馬才架三色(Masson，sTrichrome)染色的每一個(gè)治療組的病變的曲線和代表性照片。圖4A示出了在鼠類CNV病變形成模型中，在Bruch膜的激光誘發(fā)破裂之后的14天和28天，SPHINGOMAB顯著減弱了脈絡(luò)膜心血管形成。圖4B示出了，在Bruch膜的激光"i秀發(fā)破裂之后的14天和28天，SPHINGOMAB顯著減少了與CNV病變形成相關(guān)的纖維化。32圖5:圖5具有兩幅圖A和B。在圖A中，i正實(shí)SlP通過i秀導(dǎo)HUVEC管形成和遷移而促進(jìn)新血管形成，其被SPHINGOMAB減少。圖5A示出了在基底月莫上4妄種并孵育6h以評(píng)價(jià)管形成的HUVEC的4幅顯微照片。圖5B示出了在基底膜侵入小室中用1jliMSIP±SPHINGOMAB(ljug/ml)處理6h的HUVEC的凄t才居。遷移至基底月莫膜的細(xì)胞數(shù)在5個(gè)獨(dú)立視野中計(jì)數(shù)。圖6:圖6包含對(duì)于以下實(shí)施例6中描述的實(shí)驗(yàn)的多張照片(A)和柱狀圖(B和C),所述實(shí)'驗(yàn)利用SPHINGOMAB實(shí)施。SPHINGOMAB中和或無效SIP-、VEGF-和bFGF-i秀導(dǎo)的新血管形成。圖6A示出了來自基底月莫才全子(Matrigelplugs)士指定生長(zhǎng)因子的部分的多個(gè)^表性FITC-染色血管的照片。圖6B示出了S1P刺激內(nèi)皮細(xì)胞(EC)滲入。圖6C表示作為新血管形成指示的來自用VEGF或bFGF刺激的基底膜栓子的相對(duì)熒光的定量。S1P、VEGF和bFGF的作用在用1或25mg/kg的SPHINGOMAB全身性治療小鼠時(shí)^皮承卩制。圖7:圖7示出了5個(gè)4主狀圖，標(biāo)為A-E以及兩幅彩色照片。該凄t據(jù)是利用抗S1P單克隆抗體SPHINGOMAB產(chǎn)生的。對(duì)于實(shí)一驗(yàn)細(xì)節(jié)參見以下的實(shí)施例7。簡(jiǎn)而言之，這些凄t據(jù)表明，SPHINGOMAB中和或無歲文S1P刺;敫的疤形成。在這些實(shí)馬全中，成纖維細(xì)月包是無血清的，然后用0、0.1、0.5或lpMSIP+/國lpg/mLSPHINGOMAB處理12-24h。該凄t據(jù)表明SIP刺激的Swiss3T3成纖維細(xì)月包增生，如通過3H-胸苷并入4全測(cè)的(A)、刮擦測(cè)定中的鼠類心臟成纖維細(xì)胞遷移(B)、來自表達(dá)膠原-GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠的分離心臟成纖維細(xì)胞中的膠原基因表達(dá)(相對(duì)熒光)(C)、以及如通過降低的細(xì)胞增生和增加的a-SMA表達(dá)測(cè)得的WI-38細(xì)胞分4^為"幾纖維細(xì);!包(D)。SPHINGOMAB中和了這些SIP作用的每一個(gè)。SPHINGOMAB減少了永久心肌梗死鼠類才莫型中的體內(nèi)血管周纖維化(E)。圖8:圖8具有三幅圖8A、8B和8C。這些數(shù)據(jù)表明，S1P促進(jìn)眼表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)J包轉(zhuǎn)化成收縮性、產(chǎn)生疤組織的肌成纖維細(xì)胞。如以下實(shí)施例8中所描述的，考察了S1P對(duì)多個(gè)人眼細(xì)胞系的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。發(fā)現(xiàn)S1P刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(圖8A)和人結(jié)膜成纖維細(xì)胞(圖8B)的oc-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA;—種肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物)的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)第一次表明，S1P是促進(jìn)眼表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成收縮性、產(chǎn)生耙組織的肌成纖維細(xì)胞的因子之一。還考察了S1P對(duì)人結(jié)膜成纖維細(xì)胞中的纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑(PAI-1)的表達(dá)的作用。增加的PAI-1表達(dá)與結(jié)締組織的蛋白水解降解的降^f氐相關(guān)，并且在涉及增加結(jié)疤的多種纖維變性疾病中相關(guān)地^故上調(diào)。如圖8C所示，S1P以劑量依賴性方式刺激PAI-1表達(dá)。圖9:圖9示出了兩個(gè)柱狀圖A和B,示出了利用稱為SPHINGOMAB的抗-SIP單克隆抗體得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。SPHINGOMAB減少了體內(nèi)免疫細(xì)胞傷口滲入。小鼠經(jīng)受MI,在手術(shù)后用鹽水或25mg/kgSPHINGOMAB處理48h，然后在第4天殺死。SPHINGOMAB減少了巨噬細(xì)胞(A)和肥大細(xì)胞(B)滲入到傷口中。數(shù)據(jù)用比鹽水處理值降低的倍數(shù)表示。圖10:圖IO具有兩個(gè)圖IOA和10B。每一圖示出了用于鼠類抗-SlP單克隆抗體Vl和VH結(jié)構(gòu)域表達(dá)的克隆載體的圖示。圖10A是用于Vl結(jié)枸域克隆的pKNIOO載體的圖示。圖10B是用于VH結(jié)構(gòu)域克隆的pGlD200載體的圖示。圖11:圖11提供了表明多種鼠類、嵌合和重組的人源化抗-SlP抗體的結(jié)合性能的數(shù)據(jù)。對(duì)小鼠(muMAbSIP;由方形數(shù)據(jù)點(diǎn)生成的曲線)和嵌合(chMAbSIP;由直角三角形數(shù)據(jù)點(diǎn)生成的曲線)的SIP的結(jié)合在ELISA結(jié)合測(cè)定中與人源化的抗體的第一形式(pATH200+pATH300;由倒三角形凄史才居點(diǎn)生成的曲線)進(jìn)4亍比專交。34圖12:圖12具有兩圖A和B，其示出了來自利用多個(gè)人源化單克隆抗體變體實(shí)施的體外細(xì)胞測(cè)定的數(shù)據(jù)。A圖示出了人源化mAb能夠組織SIP保護(hù)SKOV3細(xì)胞發(fā)生泰素(Taxol)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。如以下實(shí)施例16中所描述的，在有或-殳有濃度為lpg/mL的huMAbHCLC3(309)、huMAbHCLC5(308)、muMAbSIP(muMAb)、或非特異性igGl(NS)的500nMSIP下，SKOV3細(xì)胞用500nM泰素(Tax)處理48h。值表示平均值士SEM(n=3),其中每一個(gè)凄t據(jù)點(diǎn)一式三份地操作。"NT，，是指沒有處理的，而"Veh"表示僅有介質(zhì)。B圖示出了在用SIP以及多個(gè)不同抗-SIP單克隆抗體之一或?qū)φ諉慰寺】贵w處理的卵巢癌(OVCAR3)細(xì)胞中的IL-8分泌情況。在以下實(shí)施例16詳細(xì)描述的實(shí)-驗(yàn)中，100,000OVCAR3細(xì)胞/無血清孔過夜，并將luMSIP單獨(dú)加入到培養(yǎng)基或用lug/ml的非特異性抗體(NS)、pATH201+pATH309(LC3)、pATH201+pATH308(LC5)、pATH207+pATH309(cysLC3)、pATH207+pATH308(cysLC5)、和0.1ug/ml(MO.l)、lug/ml(Ml)或10ug/ml(M10)的抗-S1P鼠類抗體預(yù)先孵育。在孵育22h之后，收集細(xì)月包上清液并4吏用R&DsystemQuantikinehumanCXCL8/IL-8試劑盒通過ELISA才金測(cè)IL-8分泌。在該圖中，"NT"是指未處理的細(xì)胞。圖13:圖13示出了在CNV動(dòng)物沖莫型中，相比于小鼠抗-SlP單克隆抗體和對(duì)照，多種人單克隆抗體變體的體內(nèi)效力。如以下實(shí)施例17中所描述的，在這些實(shí)驗(yàn)中，小鼠通過玻璃體內(nèi)給藥以0.5ug給藥兩次(第O天和第6天)的鼠類(Mu)抗-SlP單克隆抗體、多種人源化抗-SlP單克隆抗體變體(即，變體LC3，LC5,HCcysLC3和HCcysLC5)、或非特異性單克隆抗體(NS)，然后進(jìn)行Bruch膜的激光破裂。小鼠在激光手術(shù)后14天殺死。鞏膜-RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體切片并用羅丹明結(jié)合的R普通凝集素I抗體進(jìn)行染色。CNV病變體積以平均值士SEM表示。35K^實(shí)施方式1.化合物本發(fā)明描述某些抗-SlP劑，特別是那些免疫原性部分，包括抗體，其與生物活性脂質(zhì)S1P是特異反應(yīng)性的；換句話說，與抗S1P反應(yīng)的生物活性脂質(zhì)是S1P?？贵w分子或免疫球蛋白是分子量約為150kDa的大糖蛋白分子，通常由兩個(gè)不同的多肽鏈構(gòu)成。一個(gè)多肽鏈，稱為"重"鏈(H),約為50kDa。另一個(gè)多肽，稱為"輕"鏈(L),約為25kDa。每一個(gè)免疫球蛋白分子通常由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈構(gòu)成。兩個(gè)重鏈通過二石危H波此連接，其凄史量在不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間變化。每一個(gè)輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接至重鏈。在任何給定的天然抗體分子中，兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈?zhǔn)窍嗤?，包含兩個(gè)相同的抗原結(jié)合^立點(diǎn)，因而凈皮稱為是二i"介的，即具有同時(shí)結(jié)合至兩個(gè)相同分子的能力?；谒鼈兊暮愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊推動(dòng)物物種的抗體分子的"輕"鏈可歸為兩個(gè)明顯不同類型k和X之一。兩種類型的輕鏈的比率才艮據(jù)物種發(fā)生變化。作為實(shí)例，平均的k與X比率在小鼠中為20:1，而在人中其為2:1，并且在牛中為1:20?；谒鼈兊暮愣ńY(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊推動(dòng)物物種的抗體分子的"重"鏈可以歸為5種明顯不同類型(稱為同種型)之一。一些同種型具有多種亞型。免疫5求蛋白的五個(gè)主要類別為免疫球蛋白M(IgM)、免疫5求蛋白D(IgD)、免疫J求蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。IgG是最豐富的同種型并且具有多種亞類(人中的IgGl、2、3和4)。Fc片段和鉸鏈區(qū)在不同同種型的4元體中不相同，由此確定它們的功能性質(zhì)。然而，結(jié)構(gòu)域的整體組織結(jié)構(gòu)在所有同種型中類似。術(shù)語"可變區(qū)"是指抗體分子或其片段的N-末端部分。一般地，四個(gè)鏈中的每一個(gè)在其氨基末端部分中具有可變(V)區(qū)，以及恒定(C)區(qū)，可變(V)區(qū)組成抗原結(jié)合位點(diǎn)，恒定(C)區(qū)決定該同種型。輕《連通過許多非共價(jià)相互作用或通過二石克4建結(jié)合至重鏈，并且重鏈和輕鏈的V區(qū)在抗體分子的每個(gè)臂中配對(duì)，從而生成兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。認(rèn)為一些氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面[參見Kabat,etal.(1991)，S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda，Md.andClothiaetal.(1985)，J.Mol.Biol,vol186:651]。值得注意的是，變化在整個(gè)抗體的可變結(jié)構(gòu)域中不是均勻分布的，而是集中在的三個(gè)節(jié)段，稱為在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的"補(bǔ)體決定區(qū)"(CDR)或"高變區(qū)"?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守部分稱為"才匡架區(qū)"(FR)。天然重4連和輕鏈每一個(gè)的可變結(jié)構(gòu)i或包含通過三個(gè)CDR連4妄的4個(gè)FR區(qū)。每一個(gè)鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密靠近地保持在一起，并利用來自其他鏈的CDR形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)[參見Kabat，etal.(1991),SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.]。概括地，這6個(gè)CDR構(gòu)成了抗體分子對(duì)抗原的結(jié)合性能。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或Fv的一半，4義包含對(duì)抗原特異的三個(gè)CDR)具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力[參見Pluckthun(1994),inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer畫Verlag,NewYork,pp.269-315]。術(shù)語"恒定結(jié)構(gòu)域"是指抗體重鏈或輕鏈的C-末端區(qū)域。一般地，恒定結(jié)構(gòu)域不直接涉及抗體分子與抗原的結(jié)合性能，但表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，如抗體參與的抗體依賴的細(xì)力包毒性。這里，"效應(yīng)37功能"是指通過Fc結(jié)構(gòu)域和免疫學(xué)的蛋白之間的分子相互作用使免疫細(xì)胞聚集所介導(dǎo)的抗體的不同生理作用(例如，調(diào)理作用，細(xì)胞溶解，肥大細(xì)胞，嗜石威性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫粒、以及其他過程)。重鏈的同種型決定抗體的功能特性。它們的不同功能特性由重鏈的羧基末端部分賦予，其中它們與輕鏈無關(guān)。如本文使用的，"抗體片段"是指包括抗原結(jié)合位點(diǎn)的完整抗體的一部分或者完整抗體的可變區(qū)，其中該部分可以沒有完整抗體Fc區(qū)的恒定重鏈結(jié)構(gòu)i或(例如，CH2、CH3和CH4)?？?#4奐;也，恒定重鏈結(jié)構(gòu)域的部分(例如，CH2、CH3和CH4)可以包括在"抗體片段"中。抗體片段的實(shí)例是那些仍然與抗原結(jié)合的那些片段，并包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd和Fv片段；雙特異抗體；三特異抗體；單鏈抗體分子(sc-Fv);微型抗體(minibody);納米抗體；以及由抗體片段形成的多特異抗體。以舉例方式，F(xiàn)ab片段還包含輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。術(shù)語"變體"是指與抗體的天然氨基酸序列在至少一個(gè)氨基酸殘基或〗奮飾上不相同的氨基酸序列。天然或親代或野生型氨基酸序列是指在自然界發(fā)現(xiàn)的抗體的氨基酸序列?？贵w分子的"變體"包括但不限于輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)，包括高變區(qū)或CDR區(qū)、Fc區(qū)、Fab區(qū)、CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、以及鉸鏈區(qū)的改變。術(shù)語"特異的"是指抗體與其靶表位的選擇性結(jié)合。通過在給定的條件下，將該抗體與期望抗體結(jié)合以及將該抗體與不相關(guān)抗原或類似物抗原或抗原混合物的結(jié)合進(jìn)行比較而可以測(cè)試抗體分子的結(jié)合特異性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體與不相關(guān)抗原，或者甚至耙抗原的類似物缺少顯著的結(jié)合。這里，術(shù)語"抗原"是指由結(jié)合抗原的抗體分子或免疫源性部分識(shí)別且結(jié)合的分子。由抗體結(jié)合的抗原的特定部分稱為"表位"。"半抗原"是指在大多數(shù)情況下，38僅當(dāng)附著至載體分子，例如蛋白質(zhì)、聚乙二醇(PEG)、膠體金、硅樹脂珠等時(shí)可以引發(fā)免疫反應(yīng)(即，充當(dāng)抗原)的小分子。載體可以是也不會(huì)通過自身引發(fā)免疫反應(yīng)的載體。術(shù)語"抗體，，使用其最寬泛的含義，并且包括單克隆、多克隆、多特異性(例如，二特異性，其中抗體的每一個(gè)臂與不同表位或者與相同或不同抗原具有反應(yīng)活性的)、微型抗體、異質(zhì)結(jié)合物(heteroconjugate)、雙特異抗體、三特異抗體、嵌合和合成抗體，以及以期望的結(jié)合性能和/或生物學(xué)活性特異結(jié)合抗原的抗體片段。術(shù)語"單克隆抗體"(mAb)是指獲自基本上同源抗體種群的抗體或類似抗體種群，并且不一皮解釋為需要通過任何特定方法來產(chǎn)生該4元體。例3口，單克隆4元體可以通過由KohlerandMilstein(1975),Nature,vol256:495-497首次4苗述的雜交瘤方法或者通過重纟且DNA方法制得。術(shù)語"嵌合"抗體(或免疫球蛋白)是指包含與來源于特定物鏈和/或輕鏈的分子，同時(shí)所述鏈的剩余部分與來源于另一物種或?qū)儆诹硪?元體種類或亞類的相應(yīng)序列相同或類^f以，以及這才羊的4元體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性[Cabillyetal.(1984)，infra;Morrisonetal"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851]。術(shù)語"人源化抗體"是指包含來自非人(例如鼠類)抗體以及人類抗體的序列的抗體形式。人源化抗體可以包括保守性氨基酸取代或不顯著改變其結(jié)合和/或生物活性的來自相同或不同物種的非天然殘基。這樣的抗體是包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對(duì)于大部分來說，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中來自該受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被具有期望特性的來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、駱駝、牛、羊、或兔的CDR的殘基取代。此外，人源化抗體可以包含在接受體抗體和供體抗體以及框架序列中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基?？梢孕纬蛇@些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)和最大化抗體特性。因此，一4殳地，人源化抗體將包含所有的至少一個(gè)，以及一方面兩個(gè)的可變結(jié)構(gòu)i或，其中戶斤有或所有的高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，并且所有或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體可選地還將包含至少人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分、或者人免疫J求蛋白的一部分。參見，例如Cabilly等的美國專利No.4,816,567;Cabilly等的歐洲專矛JNo.0,125,023Bl;Boss等的美國專矛JNo.4,816，397;Boss等6勺歐浙l專禾"No.0，120，694B1;Neuberger,M.S.等的WO86/01533;Neuberger，M.S.等的歐洲專利No.0，194，276Bl;Winter美國專利No.5,225,539;Winter歐洲專利No.0，239，400Bl;Padlan，E.A.等的歐洲專利申讀-No.0,519,596Al;Queenetal.(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA，vol86:10029-10033)。術(shù)語"雙特異抗體，，可以指具有至少兩個(gè)不同表位的結(jié)合特性的抗體或單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，表位來自相同抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，表位來自兩個(gè)不同的抗原。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，雙特異性抗體可以利用兩個(gè)免疫;求蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共表達(dá)重組地生產(chǎn)?？商娌艎J地，^又特異抗體可以利用化學(xué)鍵接制備。雙特異抗體包括雙特異抗體片段。術(shù)語"異源結(jié)合抗體，，可以指兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體。這樣的抗體可以利用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法，包括使用交聯(lián)劑制得。如本文中使用的，術(shù)語"結(jié)合物"是指通過一個(gè)或多個(gè)抗體片段或結(jié)合部分與一個(gè)或多個(gè)聚合物分子的共^f介連4妄而形成的分子。術(shù)語"生物學(xué)活性的"是指能夠結(jié)合期望表位并以一定方式施加生物作用的抗體或抗體片^a。生物學(xué)作用包括^a不限于生長(zhǎng)信號(hào)40的調(diào)節(jié)、抗-細(xì)胞凋亡信號(hào)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡信號(hào)的調(diào)節(jié)、效應(yīng)功能級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)、以及其他配體相互作用的調(diào)節(jié)。術(shù)語"重組DNA"是指已被人為遺傳改造、形成或修飾的從其表達(dá)的核酸和基因產(chǎn)品。"重組"多肽或蛋白質(zhì)是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)，例如來自通過編碼期望多肽或蛋白質(zhì)的外源性DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。"合成"多肽或蛋白質(zhì)是通過化學(xué)合成制備的那些多肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語"表達(dá)盒"是指能夠影響與這樣的序列相容的宿主中的結(jié)構(gòu)基因(即，蛋白質(zhì)編碼序列，如本發(fā)明的抗體)表達(dá)的核苷酸分子。表達(dá)盒至少包括可操作地與多肽-編碼序列，以及可選地與其他序列例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)連接的啟動(dòng)子。也可以4吏用在實(shí)現(xiàn)表達(dá)中必需或有幫助的其他調(diào)節(jié)元件，例如增強(qiáng)子。因此，表達(dá)盒包括質(zhì)粒、表達(dá)載體、重組病毒、任何形式重組"棵露DNA"載體等?？贵w的來源不限于本文中列舉的這些(例如鼠類和人源化鼠類抗體)?？贵w可以在許多物種中產(chǎn)生，包括哺乳動(dòng)物物種(例如，小鼠、大鼠、駝、牛、山羊、馬、豚鼠、倉鼠、綿羊和兔)以及鳥種。例3。，XenoMouseTM(Abgenix,Inc.，F(xiàn)remontCA)產(chǎn)生完全人類單克隆抗體。對(duì)于某些目的，可以4吏用天然人類抗體，如4十對(duì)S1P的自身抗體，分離自可以表現(xiàn)出這樣的S1P自身抗體效價(jià)的個(gè)體。可替換地，2.應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)用于治療或預(yù)防某些疾病和病癥的組合物和方法，其中使用改變一種或多種不期望生物活性脂類、或其前體或代謝物的活性或濃度的一種或多種治療劑。本發(fā)明的治療方法和組合物通41過改變某些不期望生物活性脂類的有效濃度，即絕對(duì)、相對(duì)、有效和/或可利用濃度而起作用。降低生物活性脂質(zhì)的有效濃度可以說成"中和或無效，，靶脂質(zhì)或其不期望作用，包括下游作用。這里"不期望"是指不期望的生物活性脂質(zhì)由于涉及疾病過程，例如作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子或者當(dāng)過量存在時(shí)其促成疾病的不希望的生物活性脂質(zhì)的量。不希望受任4可特定理i侖的限制，i人為S1P和/或其4^i射物或下游效應(yīng)子的不恰當(dāng)濃度可以？1起或促4吏各種疾病和病癥的形成。同沖羊，所述組合物和方法可以用來治療這些疾病和紊亂，特別是通過降低特定耙脂質(zhì)例如S1P或其變體的體內(nèi)有效濃度。更具體地，認(rèn)為本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療至少部分i也^NN正在于異常新血管形成、血管發(fā)生、纖維形成、纖維化、結(jié)疤、發(fā)炎和免疫反應(yīng)的疾病。才艮據(jù)本發(fā)明治療的幾類疾病的實(shí)例描述在下面。應(yīng)當(dāng)理解，許多疾病和病癥至少部分地特4正在于多發(fā)性病理過考呈(例如，病理性新血管形成和結(jié)皰)，并且本文中4是供的分類是為了描述方〗更而不用于限制本發(fā)明。S1P和過度增生紊亂本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于治療過度增生紊亂的方法。這些方法包括向已知或懷疑患有S1P相關(guān)的過度增生紊亂的哺乳動(dòng)物(例如，牛、犬、馬、羊、或豬動(dòng)物，特別是人)給予治療有效量的一種組合物，該組合物包含干擾S1P活性的試劑，優(yōu)選地在藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體中，如期望的應(yīng)用需要的。S1P相關(guān)的過度增生紊亂包括瘤形成、與內(nèi)皮細(xì)胞增生相關(guān)的紊亂、以及與纖維形成相關(guān)的紊亂。最常見的，瘤形成將是癌癥。典型的與內(nèi)皮細(xì)胞增生相關(guān)的典型紊亂是血管發(fā)生依賴性紊亂，例如由實(shí)體瘤引起的癌42癥、血液瘤、以及老年性黃斑退化癥。與纖維形成相關(guān)的紊亂包括涉及異常心臟重建的那些紊亂，如心力衰竭。存在許多已知的過度增生紊亂，其中各種組織和器官的細(xì)胞表現(xiàn)出異常的生長(zhǎng)、增生、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、衰老和死亡的特征。盡管已經(jīng)開發(fā)了大量治療方法以解決一些這樣疾病，^旦是利用現(xiàn)有4支術(shù)許多仍然不可治療，同時(shí)在其他情況下，盡管可以治療，4旦是它們經(jīng)常不是最佳的并且很少是治愈性的。癌癥可能代表最廣泛識(shí)別的一類過度增生紊亂。癌癥是一類破壞性疾病，并且，它們具有l(wèi)又次于心血管病的第二死亡率。許多癌癥在分子水平上并沒有完全了解。因此，癌癥是美國JJ文府和制藥^^司研究和開發(fā)項(xiàng)目的主要焦點(diǎn)。結(jié)果是以投入空前的研發(fā)工作并且生產(chǎn)許多有價(jià)值的治療劑以有助于攻克癌癥。不幸地，大量癌癥研究沒有足以克服由癌癥引起的嚴(yán)重?fù)p傷。僅在美國每年仍然診斷超過一百萬新的癌癥病例以及超過五十萬例死亡。這是一個(gè)顯著的i正實(shí)，即4吏J寸出了大量努力開發(fā)用于癌癥的新療法，^旦用于抗擊疾病的有效治療劑仍然難以找到。癌癥現(xiàn)在主要用一種治療或三種類型的治療的組合手術(shù)、方文射和化療進(jìn)行治療。手術(shù)涉及患病組織的大量去除。雖然手術(shù)有時(shí)在去除位于某些部位例如乳房、結(jié)腸和皮膚的腫瘤中是有效的，但是它不能用于治療位于其他區(qū)域如骨架中的腫瘤，或者不能用于治療彌漫性瘤形成病癥如白血病?！肺纳渲委熒婕盎罱M織暴露于《1起暴露細(xì)胞死亡或損傷的離子化輻射。；改射治療的副作用可以是急性和暫時(shí)的，盡管其他可能是不可逆的。化療涉及破壞細(xì)胞復(fù)制或細(xì)胞代謝。43進(jìn)一步的結(jié)果是，目前的治療劑通常會(huì)有在毒性和嚴(yán)重副作用方面對(duì)患者的嚴(yán)重缺陷。因此，許多小組最近已開始尋找攻克癌癥的新方法。這些新的所謂"創(chuàng)造性治療，，包括基因治療以及治療蛋白質(zhì)，如單克隆抗體。在臨床使用的用于治療癌癥的第一個(gè)單克隆抗體是Rituxan(利妥昔單抗)(rituximab),其是在1997年開發(fā)的，并且已經(jīng)證明了其作為治療劑的生物特異性單克隆抗體的作用。因此，不出預(yù)4牛地，之后十六種其4也單克隆抗體已#:批準(zhǔn)用于臨床，包括指定用于癌癥的六種單克隆抗體。這些產(chǎn)品的成功，以及相比于小分子，開發(fā)單克隆抗體減少的成本和時(shí)間佳_得單克隆抗體治療劑成為小分子之后的第二大的藥物候選類別。而且，相比于小分子治療劑，抗體的嚴(yán)格特異性已證實(shí)是在效力和毒性方面的主要優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于單獨(dú)的癌癥，目前有超過270種工業(yè)抗體研發(fā)項(xiàng)目，其中超過50個(gè)公司涉及開發(fā)新的癌癥抗體治療劑。因此，單克隆抗體預(yù)計(jì)成為癌癥治療的主要角色并且估計(jì)它們會(huì)占據(jù)癌癥治療市場(chǎng)的更大份額。促進(jìn)肺瘤生長(zhǎng)和存活的力包外遞質(zhì)的識(shí)別是在發(fā)現(xiàn)減少癌癥發(fā)病率和死亡率的治療干預(yù)中的關(guān)4建步驟。如以下所述的，鞘氨醇-l-磷酸(S1P)(鞘脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵成分)被認(rèn)為是一個(gè)多效的腫瘤發(fā)生的生長(zhǎng)因子。S1P通過刺激細(xì)胞增生、細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移而促進(jìn)肺瘤生長(zhǎng)。S1P還通過支持內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和存活而促進(jìn)肺瘤生成血管，如它們?cè)谀[瘤內(nèi)形成新血管。綜合在一起，S1P引發(fā)有助于癌癥進(jìn)展的增生、促血管生成和抗凋亡一系列的事件。因此，調(diào)節(jié)并且尤其是減少體內(nèi)S1P水平的治療在癌癥治療中將是有步丈的。研究已表明，鞘氨醇激酶(SPHK)是一種最近確認(rèn)的癌基因，其產(chǎn)生促進(jìn)肺瘤生長(zhǎng)的胞外鞘脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子鞘氨醇-l-磷酸(S1P)。與腫瘤細(xì)月包增生和4爭(zhēng)移相關(guān)的S1P生長(zhǎng)因子4乍用、以及S1P促生成血管作用直接和間接地促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)。本申請(qǐng)人已經(jīng)生產(chǎn)出了可以用作治療用分子海綿以選擇性吸附SIP的生物特異性單克隆抗-SlP抗體(抗-SlPmAb),由此降低這種腫瘤生長(zhǎng)因子的胞外濃度，預(yù)期其會(huì)減小腫瘤體積和轉(zhuǎn)移潛力并且同時(shí)阻斷將會(huì)另外供應(yīng)生長(zhǎng)胂瘤的新血管形成。分子吸附概念的預(yù)期成功將代表一種治療癌癥的創(chuàng)造性方法。如以下段落將證實(shí)的，本申請(qǐng)人已經(jīng)開發(fā)了一種針對(duì)重要腫瘤生長(zhǎng)因子鞘氨醇-l-磷酸(SIP)的mAb。申請(qǐng)人認(rèn)為，這種抗體在減少與許多癌癥類型相關(guān)的增生、轉(zhuǎn)移潛力和血管發(fā)生方面可以是有歲文的，并且因此一般的癌癥以及4半隨疾病的月中瘤血管形成方面也是有歲文的。鞘磷脂酶(nSMase)的中性形式是鞘脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一種關(guān)鍵早期成分(Chatterjee，Adv.LipidRes.26:25-46,1993;Liu,Obein,andHanmm，Semin.CellDev.Biol.8:311-322，1997)。nSMase只是已被鑒定的至少5類SMase中的一種，包括石咸性、酸性、酸性鋅依賴性、中性4美依賴性、以及中性4美非依賴性(Liu,Obein，andHannun,Semin.CellDev.Biol.8:311-322，1997)。nSMase種類通常與表面膜相關(guān)(Das,Cook，andSpence，BiochimBiophysActa777:339-342，1984;Dobrowsky，CellSignal12:81-90.，2000)并且可以通過各種刺激物激活以引起細(xì)胞凋亡，如促發(fā)炎細(xì)胞因子、肺瘤壞死因子a(TNFoc)(S化ui,etal"J.Clin.Invest,畫143-151，2001)、T細(xì)胞受體(Tonnetti，etal.，J.Exp.Med189:1581-1589，1999)、電離輻射(Haimovitz-Friedman，etal"J.Exp.Med180:525-535,1994)以及蒽環(huán)類抗生素抗瘤形成試劑(Andrieu-Abadie，etal.,FASEBJ.13:1501-1510，1999)。腫瘤壞死因子ot(TNFoc)是一種熟知的在許多細(xì)月包類型包4舌癌細(xì)月包系(Andrieu-Abadie,etal"FASEBJ.13:1501-1510,1999;Han畫andObein,TrendsinBiol.Sci.20:72-76，1995;Kolesnick，trendsBiochemSci24:224-5，1999;Obeid,etal"Science259:1769-1771,1993)中的nSMase(Adam，etal.，J.BioChem271:14617-14622，1996;Dressier,Mathias,andKolesnick,Science45255:1715-1718,1992;Kim，etal"J.Biol.Chem.266:1:484-489，1991;Kronke,ChemPhysLipids102:157-66.，1999;YanagaandWatson,FEBSLetters314:297-300，1992)、CER產(chǎn)生(Kronke,ChemPhysLipids102:157-66.，1999)以及纟田胞凋亡(RathandAggarwal，J.Clin.Immuno.19:350-364，1999;Robaye，etal"AmJPathol138:447-453,1991;Takedaetal.,Int.Immunol.5:691-694，1993)的激活劑，并且已經(jīng)表明nsMase的活4匕乂于于TNFa諸導(dǎo)的細(xì)月包凋亡是關(guān)鍵性的(Luberto，etal"J.Biol.Chem.277:41128-41139，2002;S6gui,etal"J.Clin.Invest.108:143-151,2001)。因此，nSMase已凈皮提出作為用于藥物發(fā)現(xiàn)的草巴標(biāo)(WascholowskiandGiannis，DrugNewsPerspect.14:581-90,2001)。鞘脂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SIP通過鞘氨醇激酶(SPHK)的作用從SPH產(chǎn)生。已鑒定了該激酶的兩種亞型SPHK1和SPHK2(Liu,JBiolChem275:19513-20,2000;Nava,etal"ExpCellRes281:115-127，2002)。雖然CER和SPH通常與細(xì)胞凋亡相關(guān)，但相反地，SIP是細(xì)胞增殖以及存活途徑激活的一種遞質(zhì)(An,AnnNYAcadSci905:25-33,2000;Maceyka，etal"BBA1585:193-201，2002;Zhang,etal"J.CellBiol.114:155-167,1991)。最近理解為胞外遞質(zhì)，其可活化一組屬于S1P/LPA受體家族的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),以前稱為Edg受體(An,AnnNYAcadSci905:25-33,2000;An,Goetzl，andLee，J.cellbiochem30/31:147-157，1998;Lee，etal"Science279:1552-1555,1998;Okamoto，etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.260:203-208，1999);然而，還才是到了SIP的月包內(nèi)作用(VanBrocklyn,etal.，J.CellBiol.142:229-240，1998)。^匕夕卜，已纟至表曰月，CER/SPH以免凋亡的可變才幾制(Kwon,etal"JBiolChem276:10627-10633，2001;Maceyka,etal"BBA1585:193-201,2002;Pyne,BiochemJ.349:385—402，2000)。該可變機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶是SPHK,其作用是將死亡促進(jìn)性鞘脂(CER/SPH)轉(zhuǎn)換成生長(zhǎng)促進(jìn)SIP。46首次提出SPHK作為癌基因的劃時(shí)代研究由來自Adelaide的研究組公布，表明穩(wěn)定地用該激酶轉(zhuǎn)染的NIH-3T3成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)月包增生，4半隨增加的S1P產(chǎn)生(VadasandGamble,Circ.Res.79:1216-1217,1996;Xiaetal.，CurrBiol10:1527-1530,2000)。另外，SPHK過表達(dá)物逃脫接觸抑制，一種通過通常由轉(zhuǎn)化細(xì)胞表現(xiàn)出來的性能。這個(gè)觀察結(jié)果與最近的表明SIP增強(qiáng)所選人癌細(xì)胞系的凈爭(zhēng)移潛力的才艮道一致(Igarashi，Ann.N.Y.Acad.Sci.845:19-31，1998;Takuwa，BiochimBiophysActa.1582:112-120，2002)。ot匕夕卜，當(dāng)皮下注入NOD/SCID小鼠時(shí)，轉(zhuǎn)染者產(chǎn)生肺瘤。這些最近表明腹膜內(nèi)(i.p.)給予的SPHK小分子抑制劑可以減少SCID小鼠(接受JC哺乳動(dòng)物腺癌細(xì)胞的皮下注射)中的腫瘤體積的研究結(jié)果被確認(rèn)(French,etal.,CancerRes63:5962-5969，2003)。重要地，SPHK可以是新型癌基因的概念通過發(fā)現(xiàn)SPHK在許多實(shí)體瘤，如乳房、結(jié)腸、肺、卵巢、胃、子宮、腎和直腸中的那些腫瘤中過表達(dá)而提出(Frenchetal.(2003)，above)。另外，已經(jīng)證實(shí)，多個(gè)人類胂瘤來源的細(xì)月包系可以在用SPHK小分子抑制劑進(jìn)行治療時(shí)被推動(dòng)進(jìn)入凋亡，并且它們的效力可以歸于它們降低S1P水平的能力?？偲饋碚f，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)一個(gè)重要的概念，即SIP是一種可能由腫瘤細(xì)胞本身產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，并且降低S1P的濃度可以引起在生長(zhǎng)因子撤退后看到的細(xì)胞凋亡。SIP和力中瘤血管發(fā)生血管發(fā)生是新血管通過其乂人現(xiàn)有脈管系統(tǒng)形成的過程。血管發(fā)生在多個(gè)生理過程中起著關(guān)鍵作用并且涉及各種各樣的紊亂，包括肺瘤生長(zhǎng)、4曼入和轉(zhuǎn)移的發(fā)病4幾制。i人為與實(shí)體瘤和循環(huán)瘤相關(guān)的血管發(fā)生過程(腫瘤血管發(fā)生)是腫瘤生成和疾病進(jìn)展的關(guān)4建要素，其中相比于非癌性細(xì)胞，新血管給腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。因此，血管發(fā)生的臨床控制對(duì)于癌癥和其他血管發(fā)生依賴性疾病的治療是一個(gè)關(guān)鍵成分?？寡苌芍委焺┨貏e引人注意，因?yàn)檠軆?nèi)皮47細(xì)胞(EC)沒有癌細(xì)胞那么容易發(fā)生突變；因此，EC比癌細(xì)胞更不可能獲得對(duì)延長(zhǎng)治療的抗性，使得它們成為治療劑的良好潛在耙標(biāo)。多個(gè)生長(zhǎng)因子涉及癌性血管發(fā)生。發(fā)現(xiàn)生物脂鞘氨醇-l-磷酸(SIP)是許多對(duì)于癌癥重要的細(xì)胞過程的遞質(zhì)。S1P作為G-蛋白-偶聯(lián)受體家族(稱為SIPw)的特異性配體而發(fā)揮其大部分的作用。這些受體調(diào)節(jié)血管發(fā)生和血管成熟作用、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及、淋巴細(xì)胞運(yùn)豐lr。相比于sip，sip的前體鞘氨醇和^申經(jīng)酰胺與生長(zhǎng)4亭止和凋亡相關(guān)。最后，在S1P和其他促血管形成生長(zhǎng)因子如VEGF、EGF、PDGF、bFGF和IL-8之間存在復(fù)雜的串?dāng)_。通過結(jié)合至受體SlPpS1P反式激活生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶，如在VEGFR、EGFR和PDGFR上發(fā)現(xiàn)的。S1P在血管發(fā)生依賴性肺瘤中的重要性使得S1P對(duì)于癌癥治療是一個(gè)例外的靶標(biāo)。基于這些觀察結(jié)果，用于中和胞外S1P的抗體方法可以導(dǎo)致人類癌癥進(jìn)展的顯著下降，這是由于利用對(duì)于支持腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)和氧的相伴隨的損失對(duì)血管形成的抑制的結(jié)果。此外，最近的研究表明，許多血管發(fā)生抑制劑也可以用作抗-侵入性和抗-轉(zhuǎn)移性化合物，其也可以有助于癌擴(kuò)散至遠(yuǎn)離#刀始月中瘤部4立的遷移。表明S1P作為最具潛力的促血管形成試劑的最新i正據(jù)的生長(zhǎng)體來自直4妻比較S1P與注入VEGF和bFGF的試劑的研究。S1P刺激人類靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的DNA合成和趨化運(yùn)動(dòng)性，同時(shí)誘導(dǎo)多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分化，所有這些是S1P在早期血管形成中的作用的表示(Argraves,etal"2004;Leeetal"1999;Liu，etal.,2000)。而且，S1P促進(jìn)骨髓來源的EC前體遷移至新血管形成部J立(Annabi，etal.，2003)。過表達(dá)SIP!的細(xì)胞對(duì)抗-形成血管劑沙立度胺(thalidomide)禾口殺斤4戈司4也(Neovastat)具有^L'f生(Annabietal"2003)。另外，已經(jīng)證實(shí)，在S1P和其他促血管形成生長(zhǎng)因子如VEGF、EGF、PDGF、bFGF和IL-8之間存在實(shí)質(zhì)性串#尤。例如，SIP反式激活EGF(Shida，etal.,2004)和VEGF2受體(Spiegd&Milstien，2003)，并且VEGF上調(diào)SIP!受體表達(dá)(Igarashi，etal.，2003)。而且，SIP,經(jīng)過SlPi和"VEGF軸，，起作用，對(duì)于下月支血管發(fā)生和新血管形成是需要的(Chae，etal.,2004)。用于癌癥的抗-形成血管的方法已經(jīng)被極大地促進(jìn)，通過最近的由FDA糸匕準(zhǔn)才元-形成血管藥物貝4戈單抗(bevacizumab)(Avastin,Genentech)作為細(xì)胞毒性化學(xué)治療的佐劑治療結(jié)腸癌。新近開發(fā)了一種抗-SlP鼠類mAbLT1002,其對(duì)SIP具有高結(jié)合親和力和特異性。LT1002在人類癌癥的多個(gè)動(dòng)物才莫型中表現(xiàn)出顯著更慢的肺瘤進(jìn)展和相關(guān)的血管發(fā)生。另夕卜，LT1002減弱了在建立膜新血管生成(CNV)病變形成。CNV在疾病中出現(xiàn)，其中存在Bruch膜和視網(wǎng)膜色素上皮的異常。最常見的這種類型疾病是AMD,其是老年患者嚴(yán)重喪失3見力的主要病因。這些結(jié)果表明，LT1002具有多種作用機(jī)制，包括(1)對(duì)胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的直接作用；(2)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的間接抗-血管形成作用；以及(3)防止其他促血管形成生長(zhǎng)因子的釋力文和作用的間接抗-血管形成作用。SIP促進(jìn)肺瘤血管發(fā)生的最直4妄體內(nèi)i正據(jù)來自于我們最新的文獻(xiàn)，其重點(diǎn)在于i殳計(jì)用來通過分子吸附中和胞外SIP的鼠類單克隆抗體(Visentin,etal.,2006)。在利用HUVEC的各種體外測(cè)定中，抗-SIPmAb中和血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成、遷移以及防止細(xì)l包死亡，其中的每一個(gè)都是SIP誘導(dǎo)的。SIP增加生長(zhǎng)到植入小鼠的基底膜才全子中的新毛細(xì)血管，一種通過系統(tǒng)給予抗-SlPmAb中和的作用。該mAb在鼠類基底膜栓子測(cè)定中基本上中和了bFGF-和VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生，并且抗體中和的SIP刺激體內(nèi)外促血管形成細(xì)胞因子(VEGF、IL-8、IL-6)從腫瘤細(xì)胞釋放。重要地，在同位放入的人類癌細(xì)月包異種移才直的小鼠利用抗-SlPmAb治療表現(xiàn)出腫瘤進(jìn)展49的實(shí)質(zhì)性延遲。這在人乳房、卵巢和肺癌的鼠類模型以及在鼠類黑素瘤的一個(gè)同種異體移植才莫型中得到證實(shí)(Visentin，etal.，2006)。單克隆抗體(mAb)作為各種各樣的疾病和紊亂的治療性應(yīng)用迅速增大，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)表明是安全和有效的治療劑。批準(zhǔn)的治療用mAb包4舌Avastin⑧、Erbitux⑧和Rituxan⑧。其^也的用于各種疾病的mAb處于各個(gè)臨床開發(fā)階段，其中主要靶向各種形式的癌癥。一4殳地，單克隆抗體在非人哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生。然而，鼠類單克隆抗體的治療性利用是優(yōu)選的，主要是由于人患者對(duì)鼠類抗體產(chǎn)生它們自己的抗體反應(yīng)的事實(shí)。這種相同，所謂的HAMA(人抗-鼠抗體)反應(yīng)，導(dǎo)致鼠類mAb最終的中和并快速消除。這種局限在形成稱為鼠類抗體的"人源化"方法之后纟皮克服。人源化4及大地減輕了針對(duì)所給予的治療用mAb的免疫反應(yīng)的形成，并由此避免了對(duì)HAMA的半衰期和治療效力降低的結(jié)果。對(duì)于大部分來"i兌，人源化過程由將鼠類互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移才直到人免疫^求蛋白的才醫(yī)架區(qū)(FR)中構(gòu)成。這種策略稱為"CDR移植"。經(jīng)常需要對(duì)人類FR中所選殘基的鼠類氨基酸殘基進(jìn)行"回復(fù)突變，，以恢復(fù)在初始移植構(gòu)建體中喪失的親和力。mAb的生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜過程，源于蛋白質(zhì)本身的可變性。mAb的可變性可以定位到蛋白質(zhì)骨架和/或定位到#唐部分。異質(zhì)性可以歸屬于交^齊二石克化物配對(duì)的形成、脫酰胺化和異天冬氨?；鶜埢男纬?、曱石危氨酸和半胱氨酸氧化、N-末端谷酰胺殘基環(huán)化成焦谷氨酸以及C-末端賴氨酸通過哺乳動(dòng)物羧肽酶的部分酶促切割。改造工程適用于抗體分子以改進(jìn)它們的性能，如增強(qiáng)穩(wěn)定性、蛋白酶抗性、聚集行為以及增強(qiáng)異源性系統(tǒng)中的表達(dá)水平。這里，描述了針對(duì)S1P的鼠類MAb的人源化。整個(gè)方法由將來自LT1002的六個(gè)CDR移植到人類框架中構(gòu)成。進(jìn)一步的修飾設(shè)50計(jì)成進(jìn)一步精制和優(yōu)化抗體性能。人源化mAb呈現(xiàn)與LT1002相同的特性，因而適合于臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。S1P和纖維4匕成纖維細(xì)胞，特別是肌成纖維細(xì)胞是在對(duì)細(xì)胞損傷和發(fā)炎的疤形成中的反應(yīng)的關(guān)4建細(xì)月包元^牛[Tomasek,"(2002),NatRevMolCellBiol,vol3:349-63，andViragandMurry(2003),AmJPathol，vol163:2433-40]。通過肌成纖維細(xì)胞的膠原基因表達(dá)是重建的標(biāo)志并且只于于痕形成是必需的[SunandWeber(2000),CardiovascRes,vol46:250-6，andSunandWeber(1996)，JMolCellCardiol,vol28:851-8]。SIP通過纟敫活成纖維細(xì)力包遷移和增生同時(shí)增加力交原生產(chǎn)而促進(jìn)傷口愈合[Sun,d(1994),JBiolChem,vol269:16512-7]。通過受損細(xì)l包局部產(chǎn)生的SIP可以負(fù)責(zé)與重建和疤形成相關(guān)的不合適傷口愈合。因此，i人為S1P抑制劑在至少部分地特^正在于異常纖維形成或纖維化的疾病或病癥中是有用的。本文中，"纖維形成"定義為成纖維細(xì)胞的過度活性或數(shù)量，而"纖維化"定義為導(dǎo)致過度或不恰當(dāng)"交原產(chǎn)生和結(jié)疤、生物組織結(jié)構(gòu)》皮壞和/或?qū)е逻@樣的病理的基質(zhì)的不恰當(dāng)收縮(導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫落或?qū)е缕鞴俟δ苁軗p的其他過程)的成纖維細(xì)胞的過度活性或^t量。SIP和成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)SIP促進(jìn)靜止成纖維細(xì)胞分化成活性肌成纖維細(xì)胞，其在疤形成期間表現(xiàn)出增強(qiáng)的膠原表達(dá)[Urata，aa/.(2005),KobeJMedSci,vol51:17-27]。在成纖維細(xì)月包增生和遷移到結(jié)疤區(qū)域中的同時(shí)，肌成纖維細(xì)胞沉積到主要由骨橋蛋白和纖連蛋白構(gòu)成的臨時(shí)粒狀網(wǎng)絡(luò)[SunandWeber(2000),CardiovascRes,vol46:250-6]。隨著重建繼續(xù)進(jìn)行，該臨時(shí)基質(zhì)被吸附并建立膠原網(wǎng)絡(luò)[SunandWeber(2000),CardiovascRes,vol46:250-6]。我們已經(jīng)證實(shí)，SIP通過肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原產(chǎn)生。TGF|3,—種熟知的纖維化遞質(zhì)，已經(jīng)證實(shí)上調(diào)多種促纖維化蛋白，將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成51肌成纖維細(xì)胞并刺激炎性蛋白表達(dá)，可能通過SIP的作用[Squires,"(2005)，JMolCellCardiol，vol39:699-707andButt，LaurentandBishop(1995)，EurJCellBiol,vol68:330-5〗。TIMPl(—種涉及TGF卩刺激的成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子)的上調(diào)被4十對(duì)SPHKl的siRNA阻斷[Yamanaka,etal.，JBiolChem.2004Dec24;279(52):53994-4001],表明抗-SlP抗體的人源化形式可以減弱TGF(3的促纖維化作用以及轉(zhuǎn)移SIP本身的纖維形成作用。認(rèn)為在纖維化疾病和病癥中最小化不合適結(jié)疤是有用的，包括Y旦不限于眼病或心血管病、傷口愈合以及石更皮病。用于治療-更皮病的纟元-SlPj元體本發(fā)明的組合物和方法在治療至少部分4寺4正在于異常心血管形成、血管發(fā)生、纖維形成、纖維化、結(jié)疤、炎癥和免疫反應(yīng)的紊亂和疾病中^艮有用。一種這樣的疾病是硬皮病，其也稱為系統(tǒng)性硬化病。硬皮病是一種自身免疫疾病，其引起皮膚結(jié)疤或增厚，并且有時(shí)涉及身體的其他區(qū)域，包括肺、心臟、和/或腎。硬皮病特征在于皮膚和身體器官中形成疤組織(纖維化)，這可導(dǎo)致使涉及的區(qū)域變厚和變石更，伴隨功能降寸氐。如今，依據(jù)SclerodermaFoundation,大約300,000美國人患有石更皮病。受影響的這些之中的三分之一或更低具有多種的疾病，而剩余三分之二主要具有皮膚癥狀。當(dāng)該疾病影響肺并引起結(jié)疤時(shí)，呼吸可能變得緊促，因?yàn)榉尾辉偃缢鼈儜?yīng)該那樣地進(jìn)行擴(kuò)張。為了檢測(cè)呼吸能力，醫(yī)生使用評(píng)估用力肺活量能力(FVC)的裝置。在具有低于50%預(yù)期讀#1的FVC的人中，由石更皮病相關(guān)的月申病的10年死亡率為約42%。死亡率這么高的一個(gè)原因在于目前沒有可利用的有歲文治療。如在本申請(qǐng)的實(shí)施例中描述的，現(xiàn)有證據(jù)表明，S1P是可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增生、以及導(dǎo)致與不合適結(jié)疤和重建相關(guān)的成纖維細(xì)月包活性增強(qiáng)的促纖維4匕生長(zhǎng)因子。此外，已經(jīng)i正實(shí)了SlP在皮月夫和其他類型成纖維細(xì)月包的活性中的潛在作用。例如，已經(jīng)表明，生物活性脂類刺激鼠類皮膚成纖維細(xì)胞的遷移(Hama，etal.，JBiolChem.2004Apr23;279(17):17634-9),并且人皮月夫成纖維細(xì)月包表達(dá)多種S1P受體亞型(Zhang,etal.,Blood.1999Mayl;93(9):2984-90)。除了S1P成纖維細(xì)月包活性的多種直4妄作用，S1P還可以只于成纖維細(xì)胞活性具有許多潛在的間接作用。例如，S1P可以有利于其他熟知的促纖維化因子，如TGF-(3和血小板來源的生長(zhǎng)因子(PDGF)的作用。TGF-(3是最廣泛研究和識(shí)別的纖維化貢獻(xiàn)因子之一(Desmouiere，etal.,/Ce〃122:103-111，1993)。TGF-(3上調(diào)SphKl的表達(dá)和活性，導(dǎo)致金屬蛋白酶1的組織抑制劑(TIMP-1)(一種抑制ECMP爭(zhēng)解的蛋白)的表達(dá)增加(Yamanaka,etal.，JAo/C/2ew279:53994-54001，2004)。TIMP-1表達(dá)增加關(guān)聯(lián)到心力衰竭患者的間質(zhì)纖維化和舒張期功能障礙(Heymans,etal.,JPaAo/166:15-25，2005)。相反地，S1P刺激TGF-|3的表達(dá)和釋》丈(Norata，etal.,C/腳/加o"111:2805-2811，2005)。還存在S1P和PDGF之間的串?dāng)_的明顯證據(jù)。S1P直接地刺激PDGF的表達(dá)(Usui,etal.,C7^w279:12300-12311,2004)。另外，SlPi受體和PDGF受體4皮此結(jié)合并且它們的結(jié)合對(duì)于有助于各種細(xì)胞類型的增生和遷移的下;摔4言號(hào)4爭(zhēng)導(dǎo)的PDGF5舌4匕是'必需的(Long,etal.,尸raWag/a"^raC^er丄一Me叔80:74-80,2006;Baudhuinetal"/18:341-343,2004)。同樣，TGF-卩和PDGF對(duì)纖維化的作用可能部分是由于與S1P信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的串?dāng)_。同樣，本發(fā)明的組合物和方法可以用來治療石更皮病，尤其是通過降^氐特定^J旨質(zhì)例如SIP的體內(nèi)有效濃度。53認(rèn)為系統(tǒng)性硬皮病是通過針對(duì)PDGF受體的刺激性自身抗體加重的(Baroni,etal"NEnglJMed.2006v354(25):2667-76)，并且PDGF受體在硬皮病成纖維細(xì)胞中對(duì)TGF-J3發(fā)生反應(yīng)而被上調(diào)(Yamakage，etal.,JExpMed.1992Mayl;175(5):1227-34)。由于SIP、PDGF和TGF-P信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之間的實(shí)質(zhì)性串?dāng)_，所以利用抗-SlP劑(例如抗-SlPmAb)阻斷SIP生物活性可以間^接地減輕PDGF和TGF-|3的促硬化作用。此外，利用這樣的抗SIP劑的治療可以通過減輕SIP促進(jìn)皮膚和疾病進(jìn)展的其他形式的成纖維細(xì)胞的直接作用而使石更皮病患者受益。SIP與眼疾和眼病病態(tài)或異常血管發(fā)生/心血管形成、異常重建、纖維化和結(jié)疤以及發(fā)炎與3見網(wǎng)膜和眼部疾病如老年性黃斑退化癥(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)以及其他發(fā)育障礙一起出現(xiàn)[Eichler，etal.(2006),CurrPharmDes,vol12:2645-60],并且可以作為眼睛感染和機(jī)械性損傷的結(jié)果而出現(xiàn)[Ciulla，etal.(2001),CurrOpinOphthalmol,vol12:442-9andDartetal(2003),Eye:vol17:886-92]。認(rèn)為針對(duì)SIP的抗體在治療眼病中4艮有用，對(duì)于所述眼病，病態(tài)或異常血管發(fā)生/心血管形成、異常重建、纖維化、以及結(jié)疤或發(fā)炎是一個(gè)部分。眼部的血管發(fā)生/新血管形成病態(tài)眼部血管發(fā)生是各種臨床病癥中失明的一個(gè)主要原因。脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)在許多眼病中出現(xiàn)，其中最常見的是滲出性或"濕性"形式的AMD。作為逐漸增多的老齡化人群的結(jié)果，AMD如今是一種流行病并且是西方國家60歲以上患者失明的主導(dǎo)病因。盡管視力喪失的流行病由AMD引起，但是僅一些治療，大多數(shù)是以抗-VEGF為基礎(chǔ)的可以減緩AMD的進(jìn)展，甚至更少可以54反轉(zhuǎn)視力喪失[BylsmaandGuymer(2005)，ClinExpOptom，.vol88:322-34,Gryziewicz(2005),AdvDrugDelivRev,vol57:2092-8,andLiuandRegillo(2004),CurrOpinOphthalmol,vol15:221-6.]。因jt匕，發(fā)現(xiàn)新的用于病態(tài)新血管形成的治療是纟及其重要的。這里使用AMD僅為了在描述與異常血管發(fā)生/新血管形成、異常重建、纖維化和結(jié)疤、以及炎癥相關(guān)的眼病中舉例i兌明的目的，這些病癥在如本文所披露和要求保護(hù)的其他眼病和眼疾中發(fā)現(xiàn)。AMD涉及年齡相關(guān)的病理變化[Tezel，Bora，andKaplan(20(H)，TrendsMolMed,vol10:417-20andZarbin(2004),ArchOphthalmol,122:598-614]。存在多種理論，^旦準(zhǔn)確的AMD的病因?qū)W和發(fā)病枳』制仍然沒有被4艮好地理解。老化與累積氧化性損傷、Bruch膜增厚以及J皮璃疣形成相關(guān)。氧化性應(yīng)激導(dǎo)致對(duì)-見網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞以及在某些情況下脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層的損傷[Zarbin(2004)，ArchOphthalmol,vol122:598-614,andGorin,etal.(1999),MolVis,,vol5:29]。對(duì)RPE的損傷可能在Bruch膜和脈絡(luò)膜內(nèi)引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)[Johnsonetal.(2000)，ExpEyeRes,,vol70:441-9]。這種損傷和炎癥培養(yǎng)通過刺激CNV和萎縮而控制S見網(wǎng)膜損傷[Zarbin(2004)，ArchOphthalmol,vol122:598-614,andWitmer,etal.(2003),ProgRetinEyeRes,vol22:1-29]。CNV導(dǎo)致可能械^人為是傷口的擊夾損且有漏隙的血管(BV)[KentandSheridan(2003),MolVis,vol9:747-55]。傷口愈合源于脈絡(luò)膜并通過Bruch膜和RPE侵入一見網(wǎng)膜下間隙(subretinalspace)。傷口愈合反應(yīng)的特4正在于典型的早期炎性反應(yīng)、顯著的血管形成反應(yīng)和組織形成，之后是所有涉及因素的末期成熟化。傷口重建可能不可逆地?fù)p害光感受器和RPE,由此判斷不能^又-f又利用^元-血管形成療法來治療CNV[LaCour,Kiilgaard,andNissen(2002),DrugsAging，vol19:101-33.12]。正?！娋W(wǎng)月莫和^L網(wǎng)月莫下結(jié)構(gòu)由于CNV相關(guān)纖維化、水腫和炎癥單獨(dú)或累積地引起的改變，導(dǎo)致AMD相關(guān)一見力損失[Tezeland55Kaplan(2004)，TrendsMolMed,vol10:417-20,andAmbati，etal.(2003),SurvOphthalmol,vol48:257-93]。與滲出性AMD相關(guān)的多種細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用在很大程度上使有效治療的研究變得復(fù)雜。盡管CNV和水胂通過抗-VEGF治療部分地可控，但是對(duì)于減輕疤形成和炎癥的潛在治療還沒有充分解決[BylsmaandGuymer(2005),ClinExpOptom，vol88:322-34,andPauleikhoff(2005)，Retina，vol25:1065-84]。只要新血管復(fù)合體保持完整，如看起來是利用抗-VEGF劑治療的患者的情形，對(duì)于視網(wǎng)膜下纖維化以及將來視力喪失的可能就持續(xù)存在?？?VEGF-A治療代表滲出性AMD治療中的最新的顯著進(jìn)步。然而，利用PEGAPTANIB(—種選擇性抑制VEGF-A的165中亞型的高親和力適配子)的III期VISION試-驗(yàn)表明，平均的患者繼續(xù)喪失一見力，而^U艮小百分比恢復(fù)3見力[Gragoudas，etal,(2004),NEnglJMed,vol351:2805-16]。利用抗體片段RANIBIZUMAB對(duì)所有VEGF-A的亞型的抑制(pan-VEGF抑制)產(chǎn)生更加印象深刻的結(jié)果[B畫n,etal"NEngMed(2006)，vol.355:1432-44,Rosenfeld,etal.NEngJMed(2006),vol.355:1419-31]。2年MARINA試驗(yàn)和1年ANCHOR試3全表明，大約40%的患者實(shí)現(xiàn)一些視力恢復(fù)。盡管這些結(jié)果代表我們治療滲出性AMD的能力的一個(gè)顯著進(jìn)步，但是它們也證實(shí)，60%的患者沒有得到視力改善。此外，這些患者必需嚴(yán)格滿足限定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。更大患者群中的結(jié)果可能說服力更小。仍然存在明確的對(duì)于開發(fā)進(jìn)一步的治療劑的需要，這些治療劑革巴向CNV和最終導(dǎo)致光感受器石皮壞形成的過禾呈中的其他步驟。首先，脈絡(luò)膜BV的生長(zhǎng)涉及許多遞質(zhì)而不僅僅是VEGF的交互作用，才是供調(diào)節(jié)或抑制整個(gè)過程的才幾會(huì)[Gragoudas，"a/.(2004),NEnglJMed,vol351:2805-16]。其次，滲出性AMD由血管和血管外成分構(gòu)成。血管成分涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、EC前體和周細(xì)胞。血管外成分，其體積上看起來是最大的成分，由炎癥細(xì)爿包、神經(jīng)"交質(zhì)細(xì)月包、和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞構(gòu)成。組織損傷可以由任一成分導(dǎo)致。該病理過程的這些其他方面沒有通過目前的抗-VEGF治療得到解決。靶向與AMD相關(guān)的形成血管級(jí)聯(lián)的其他因素可以提供對(duì)于治療更有效和增效的途徑[Spaide，RF(2006)，AmJOphthalmol,vol141:149-156]。目艮病中的炎癥越來越多的證據(jù)表明，炎癥、特別是巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)[Klein,"a/.(2005)，Science,vol308:385-9;andHageman,&a/.(2005)，ProcNatlAcadSciUSA,vol102:7227-32]在滲出性AMD發(fā)病才幾制中起著重要作用。手術(shù)性切除脈絡(luò)膜新血管膜的組織病理學(xué)表明，巨噬纟田月包幾乎普遍存在[Grossniklaus，a/.(1994),Ophthalmology,vol101:1099-111，andGrossniklaus,(2002),MolVis,vol8:119-26]。越來越多的證據(jù)表明，巨p盆細(xì)胞可以在介導(dǎo)CNV形成和增殖中通過多種歲文應(yīng)起作用[Grossniklaus,&(2003),MolVis，vol8:119-26;Espinosa-Heidmann,or/.(2003)，InvestOphthalmolVisSci，vol44:3586-92;Oh,"a/.(1999)，InvestOphthalmolVisSci,vol40:1891-8;Cousins,W(2004)，ArchOphthalmol,vol122:1013-8;Forrester(2003),NatMed,vol9:1350-1，andTsutsumi，"a/.(2003)，JLeukocBiol，vol74:25-32],包4舌可以損害細(xì)月包和降解Bruch膜以及釋放促血管形成細(xì)胞因子的酶的分泌[Otani,Wa/.(1999),OphthalmolVisSci，vol40:1912-20，andAmin,Puklin，andFrank(1994)，InvestOphthalmolVisSci，vol35:3178-88]。在4員傷部4立，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出激活的微小形態(tài)表征，如去?；痆Oh,Wa/.(1999),InvestOphthalmolVisSci，vol40:1891-8,andTrautmarm/(2000)，JPathol,vol190:100-6]。因此，認(rèn)為限制巨噬細(xì)胞滲入到脈絡(luò)膜新血管復(fù)合體中的分子可以有助于限制CNV形成。目艮病中的月永全各月莫新血管形成和血管成熟4匕57血管發(fā)生是正常傷口愈合的一個(gè)基本成分，因其將氧和營(yíng)養(yǎng)遞送至炎癥細(xì)月包并有助于碎片清除[Lingen(2001)，ArchPatholLabMed,vol125:67-71]。進(jìn)展性血管發(fā)生由兩個(gè)不同過程構(gòu)成I期對(duì)附近刺激物反應(yīng)，血管EC遷移至毛細(xì)血管尖端，在這里它們?cè)錾⑿纬蓛?nèi)月空結(jié)構(gòu)；以及II期血管網(wǎng)全各的i奮剪(pruning)以及月永管系纟充的優(yōu)4b[Guo，(2003),AmJPathol，vol162:1083-93]。I期新血管形成。血管發(fā)生經(jīng)常有助于傷口愈合。然而，當(dāng)不受控制時(shí)，新血管通常是不健全的并且促4吏漏出、出血和發(fā)炎。通過輩巴向促血管形成的GF，消除功能障礙且漏出的BV已經(jīng)顯示出一些減'l"曼的AMD進(jìn)展的能力[Pauleikhoff(2005),Retina，vol25:1065-84.14,andvanWijngaarden，Coster,andWilliams(2005),JAMA,vol293:1509-13]。II期血管成熟4b和藥物脫每文作用。Pan-VEGF4中制看起來大多數(shù)經(jīng)由導(dǎo)致#見網(wǎng)膜內(nèi)和#見網(wǎng)膜下水胂消退的抗-通透作用而發(fā)揮其有益作用，因?yàn)閷?shí)際CNV病變沒有顯著退化。缺乏顯著CNV退化可能部分是新形成的血管由于周細(xì)胞覆蓋而成熟化的結(jié)果。周細(xì)胞在血管組織形成和保持中起著關(guān)4建作用。周細(xì)胞的存在似乎賦予了抗-VEGF劑抗性并損害它們抑制血管發(fā)生的能力[BergersandSong(2005)，Neuro-oncol,vol7:452-64;YamagishiandImaizumi(2005),IntJTissueReact,vol27:125-35;Armulik,AbramssonandBetsholtz(2005),CircRes，vol97:512-23;Ishibashietal.(1995)，ArchOphthalmol,vol113:227-31]。對(duì)周細(xì)月包聚集具有4中制作用的試劑可能會(huì)破壞血管通道組裝體以及脈絡(luò)膜心血管通道的成熟化，從而保持它們對(duì)抗血管形成劑的敏感性。血管網(wǎng)絡(luò)的重建涉及血管(BV)密度的調(diào)節(jié)以滿足營(yíng)養(yǎng)需要[GarianoandGardner(2005),Nature,438:960-6]。BV不成熟時(shí)間4殳對(duì)應(yīng)于其中新血管發(fā)揮功能但還沒有獲得周細(xì)胞覆層的時(shí)間段58[Benjamin,Hemo，andKeshet(1998)，Development,125:1591-8，andGerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes,2003.314:15-23]。這個(gè)延遲實(shí)質(zhì)上是提供一個(gè)可塑性窗口，用于根據(jù)視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜的營(yíng)養(yǎng)需要形成血管的精細(xì)調(diào)節(jié)。生物活性脂質(zhì)鞘氨醇-l"疇酸(S1P)、VEGF、PDGF、血管生成素(Ang)和其他生長(zhǎng)因子(GF)增加血管生長(zhǎng)并將平滑肌細(xì)胞(SMC)和周細(xì)胞聚集至天然血管，其促進(jìn)新出現(xiàn)的血管的重建[AllendeandProia(2002),BiochimBiophysActa,vol582:222-7;GarianoandGardner(2005),Nature,vol438:960-6;Grosskreutz，etal.(1999),Mic雨ascRes,vol58:128-36;Nishishita,andLin(2004),JCellBiochem,vol91:584-93，andErber，"a/.(2004),FASEBJ，vol18:338-40.32]。周細(xì)胞，最可能是通過在EC出芽時(shí)間之前由間葉細(xì)i包原位分化產(chǎn)生，或者來自動(dòng)力永平滑力幾細(xì)胞的遷移和去分化，緊密地與導(dǎo)致整個(gè)血管成熟和存活的EC相關(guān)并包裹合適的部位[Benjamin,Hemo,andKeshet(1998),Development,vol125:1591-8]。最新研究已表明，SIP和S1P1受體涉及細(xì)胞表面運(yùn)輸以及細(xì)胞之間粘附分子N-鈣連蛋白的活化[Paik，W"/.(2004),GenesDev,vol18:2392-403]。N-鈣連蛋白對(duì)于EC、周細(xì)胞和促進(jìn)穩(wěn)定血管床層形成的周細(xì)胞之間的相互作用是必需的[GerhardtandBetsholtz(2003),CellTissueRes，vol314:15-23]。S1P1基因的總體缺失導(dǎo)致對(duì)于胚胎發(fā)育期間的BV穩(wěn)、定化所需的初生BV的異常周細(xì)月包包圍(ensheathment)[AllendeandProia(2002)，BiochimBiophysActa,vol1582:222-7]。針對(duì)S1P1的siRNA局部注入抑制異源移才直才莫型中的血管^惑定4匕[Chae，Wa/.(2004),JClinInvest,vol114:1082-9]。壽爭(zhēng)基因小鼠研究已經(jīng)證實(shí)，VEGF和PDGF-B促進(jìn)新BV的成熟和穩(wěn)定[Guo,"a/.(2003),AmJPathol,162:1083-93,andGarianoandGardner(2005)，Nature,vol438:960-6.50]。VEGF上調(diào)Ang-l(mRNA和蛋白質(zhì))[Asahara,a/.(1998),CircRes,vol83:233-40]。Ang-1在通過周細(xì)胞聚集和維持外周內(nèi)皮支撐中起到主要作用[Asahara，&59a/.(1998),CircRes,vol83:233-40]。目艮內(nèi)注射VEGF加速EC叢的周纟田月包覆蓋[Benjamin,Hemo，andKeshet(1998)，Development,vol125:1591-8]。PDGF-B缺陷型小鼠胚胎缺乏微小血管周細(xì)胞，這導(dǎo)致水肺、樣i型動(dòng)脈瘤和致死性出血[Lindahl，"a/.(1997),Science,vol277:242-5]。鼠類分娩前研究已證實(shí)，另外的對(duì)于血管床成熟的信號(hào)的完整VEGF-和PDGF-刺激是需要的。基于上文所述的SIP的反式激活，該因子可以是SlP[ErberWo/.(2004)，F(xiàn)ASEBJ,vol18:338-40]。血管穩(wěn)定化和成熟化與可塑性喪失以及對(duì)VEGF和其他GF撤退的消退以及對(duì)抗-血管形成治療的抗性的缺乏相關(guān)[Erber,"(2004),FASEBJ,vol18:338-40,andHughesandChan-Ling(2004),InvestOphthalmolVisSci,vol45:2795-806]。BV只于形成血管抑制劑的抗性是由最初使血管穩(wěn)定以及通過治療一皮募集到未成熟血管的那些周細(xì)月包所f武予[Erber，W(2004),FASEBJ，vol18:338-40]。在包圍未成熟EC之后，周細(xì)胞表達(dá)補(bǔ)充存活因子(Ang-1和PDGF-B)以保護(hù)EC受促凋亡試劑的作用。目艮病中的水胂和血管通透性CNV膜由易于將其血管內(nèi)容物遺漏到周圍孔隙而導(dǎo)致視網(wǎng)膜下出血、滲出物和流體積聚的有孔血管EC構(gòu)成[GerhardtandBetsholtz(2003)，CellTissueRes，vol14:15-23]。4艮多年CNV組織本身，以及最近視網(wǎng)膜內(nèi)新血管形成，已經(jīng)暗示是負(fù)責(zé)與AMD相關(guān)的視敏度的降低。然而，現(xiàn)在認(rèn)為，由血管通透性(VP)增大以及隨后的血管一見網(wǎng)膜屏障(BRB)石皮裂引起的黃J汪7JC月中在與AMD相關(guān)#見力喪失和其4也眼病，包4舌與凈唐尿病相關(guān)的失明中起主要作用[HughesandChan-Ling(2004),InvestOphthalmolVisSci,vol45:2795-806;FelinskiandAntonetti(2005),CurrEyeRes,vol30:949-57;Joussen,"a/.(2003)，F(xiàn)ASEBJ，vol17:76-8,andStrom,"a/.(2005),InvestOphthalmolVisSci,vol46:3855-8;j。尤其是，糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)和糖尿病性黃斑水腫(DME)在患有糖尿病的患者中是60常見的樣t血管并發(fā)癥，并且是糖尿病相關(guān)失明的最常見病因。DME由增大的"f殷血管通透性導(dǎo)致。Joussen,W"/.(2003),FASEBJ，vol17:76-8?？偟膇兌來，這些是工作年齡的人群中新的失明的最常見病因。認(rèn)為諸如耙向SIP的抗體的化合物對(duì)于這些病癥來i兌是治療上有用的。可以依據(jù)本發(fā)明治療的多種眼病的實(shí)例在下文描述。應(yīng)當(dāng)理解，許多疾病和病癥至少部分特4i在于多種病理學(xué)過程，例如，病態(tài)新血管形成和結(jié)疤，并且本文中提供的分類是為了描述方便而不是限制本發(fā)明。a.與病態(tài)新血管形成相關(guān)的缺血性一見網(wǎng)力莫病變和特4正在于一見網(wǎng)膜外層和/或3見網(wǎng)膜下膜形成的疾病缺血性視網(wǎng)膜病變(IR)是特征在于受損視網(wǎng)膜的血流紊亂的多種病變。IR的實(shí)例包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、鐮狀紅細(xì)胞性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜靜脈閉塞性疾病。所有這些紊亂可能與病態(tài)#見網(wǎng)膜新血管形成的VEGF導(dǎo)致的增生相關(guān)，其可以最終導(dǎo)致眼內(nèi)出血、4見網(wǎng)膜外膜形成和牽4立#見網(wǎng)月莫脫落。特發(fā)性一見網(wǎng)膜外膜(ERM)，也稱為黃斑皺褶或玻璃紙3見網(wǎng)膜病變，可以引起次于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變形的視力降低。盡管手術(shù)移除這些膜有時(shí)會(huì)再出現(xiàn)，并且有時(shí)與^L網(wǎng)膜缺血相關(guān)。VEGF及其受體定位至ERM。與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變和黃斑皺褶相關(guān)的膜中存在VEGF,進(jìn)一步表明這種細(xì)胞因子在缺血性視網(wǎng)膜疾病以及增生性玻璃體視網(wǎng)膜紊亂的膜生長(zhǎng)中起作用。另外，在ERM細(xì)胞上也鑒定出了VEGF受體VEGFR1和VEGFR2。這些數(shù)據(jù)表明，VEGF可以是可能促進(jìn)血管和無血管ERM進(jìn)展的自分泌和/或旁分泌刺激因子。PDGF及其受體[Robbins,etal.(1994),InvestOphthalmolVisSci;vol35:3649-3663]在患有增生性#見網(wǎng)膜疾病的眼中進(jìn)4亍過描述[Cassidy，etal.(1998)，BrJOphthamol;vol82:61181-85,andFreyberger，etal.(2000),ExpClinEndocrinolDiabetes,vol108:106-109]。這些發(fā)現(xiàn)表明，PDGF配體和受體在不同起源的增生性視網(wǎng)膜中是廣泛存在的，并且表明利用PDGF的自分泌和旁分泌刺激可能涉及ERM的發(fā)病機(jī)制。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(3(TGF-P)涉及ERM的形成[Pournaras，etal.(1998),KlinMonatsblAugenheilkd,vol212:356-358]，如通過TGF染色和免疫反應(yīng)證實(shí)的。另外，TGF-f3受體II在糖尿病和PVR膜的ERM的肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果表明，TGF-(3(在視網(wǎng)膜和ERM的多個(gè)細(xì)胞型中產(chǎn)生的)是引人注意的用于治療PVR、糖尿病和繼發(fā)ERM的耙標(biāo)。已凈艮道白介素-6(IL-6)在增生性糖尿病一見網(wǎng)膜病變(PDR)中的人3皮璃體中是增多的[LaHeij,etal.(2002)，AmJOphthal，134:367-375]并且在一個(gè)研究中，研究的100%的糖尿病ERM表達(dá)IL-6蛋白[Yamamoto，etal.(2001)AmJOphthal,vol132:369-377]。已證實(shí)外源性給予堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，誘導(dǎo)內(nèi)皮增生和VEGF表達(dá)[Stavri，etal.(1995)，Circulation,vol92:11-14]。與這些觀察結(jié)果一致，bFGF濃度在來自患有PDR患者的JE皮璃體中增大[Sivalingam，etal.(1990),ArchOphthalmol,vol108:869-872，andBoulton,etal.(1997),BrJOphthalmol,vol81:228-233]。bFGF還涉及E腹的形成[Hueber,etal.(1996),Int.Ophthalmol,vol20:345-350],i正實(shí)了所研究的10個(gè)PDR月莫中的8個(gè)中有bFGF。此夕卜，這些研究者發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于相應(yīng)受體FGFR1的陽性染色。對(duì)bFGF的免疫反應(yīng)性也已在非血管特發(fā)性ERM中證實(shí)。這些結(jié)果表明在形成血管和無血管ERM中的bFGF。Harada，etal.(2006)，ProginRetinalandEyeRes，vol25;149-164。增高的bFGF還在患有ROP的患者血清中檢測(cè)到[Becerril，etal.(2005)，Ophthalmology,vol112,2238]。假定SIP的已知多效作用及其與VEGF、bFGF、PDGF、TGF-J3和IL-6的相互作用，i人為結(jié)合、拮抗、抑制SIP的作用或生產(chǎn)的試62劑有效抑制缺血性一見網(wǎng)膜病變以及特征在于血管或無血管ERM形成的后,爻疾病中的病態(tài)4見網(wǎng)月莫新血管形成。至少部分特4正在于異常新血管形成或血管發(fā)生的其他眼疾包括老年性黃斑退化癥，角膜移植排斥，新生血管性青光眼，隱形眼4竟超時(shí)戴4竟癥，角膜感染，包括單純皰滲感染、帶狀皰療感染、原蟲感染，翼狀胬肉，感染性葡萄膜炎，慢性視網(wǎng)膜脫落，激光損傷，鐮狀紅細(xì)胞性視網(wǎng)膜病變，靜脈閉塞性疾病，脈絡(luò)膜新血管生成，-現(xiàn)網(wǎng)膜血管瘤增生，以及特發(fā)性息肉狀脈絡(luò)膜血管病變。b.增生性視網(wǎng)膜玻璃體病變(PVR)在自發(fā)寸生裂孑L源'I"生(spontaneousrhegmatogenous)一見網(wǎng)月莫脫落之后以及在創(chuàng)傷性視網(wǎng)膜脫落之后觀察到PVR。其是失敗的視網(wǎng)膜脫落手術(shù)的主要原因。其特征在于細(xì)胞膜在視網(wǎng)膜兩側(cè)上、在后玻璃體表面和玻璃體基質(zhì)上的生長(zhǎng)和收縮。這種眼中的過度疤組織形成可以導(dǎo)致形成牽^立性4見網(wǎng)月荑脫落(tractionalretinaldetachment)，因此針對(duì)預(yù)防或抑制增生性玻璃體^L網(wǎng)膜病變(PVR)的治療是3見網(wǎng)膜脫落處理的邏輯原理。組織病理學(xué)上，PVR特征在于過度膠原產(chǎn)生、4欠纟宿和細(xì)月包i曾生[Michels，RetinalDetachment2ndEdition.WilkinsinCP,RiceTAEds,Complicatedtypesofretinaldetachment,pp641-771，MosbyStLouis1997]。在PVR膜中鑒定的細(xì)月包類型主要包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨遵細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[Jerdan，"a/.(1989),Ophthalmology,vol96:801-10，andVidi麗a，"a/.(2005),KlinMonatsblAugenheilkd;vol222:568-571]。這種過度結(jié)疤反應(yīng)的病理生理學(xué)看起來是通過多個(gè)細(xì)胞因子介導(dǎo)的，包括血小4反源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)p、石威性成纖維細(xì)月包生長(zhǎng)因子(bFGF)、白介素-6(IL-6)、以及白介素-8(IL-8)[Nagineni,"a/.(2005),JCellPhysiol,vol203:35-43;LaHeij,etal(2002),AmJOphthalmol,134:367-75;Planck，"《/.(1992),CurrEyeRes;vol11:1031-9;Canataroglu(2005)OculImmunolInflamm;vol13:375-81,andAndrews,W(1999)，OphthalmolVisSci;vol40:2683-9]。這些細(xì)胞因子的抑制如果以及時(shí)方式給予可以有助于防止PVR形成，或限制其嚴(yán)重度[Akiyama,etal(2006)，JCellPhysiol,vol207:407-12，andZheng，etal(2003)，JpnJOphthalmolm，vol47:158-65]。鞘氨醇-l-磷酸(SIP)是具有多效作用的生物活性溶血脂質(zhì)。其是促血管形成、促發(fā)炎(刺激巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞的聚集)和促纖維化(刺激疤形成)。S1P通常刺激細(xì)胞發(fā)生增生和遷移，并且是抗細(xì)月包凋亡的。SIP通過其與多個(gè)細(xì)^^因子和生長(zhǎng)因子的沖目互作用而實(shí)現(xiàn)這些生物學(xué)不同的功能。已經(jīng)i正實(shí)SIP經(jīng)過單克隆抗體(SPHINGOMAB)的抑制阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、bFGF、IL-6,口IL一8的功肯fe[Visentin,B"(2006),CancerCell,vol9:1-14]。SIP與SlPt受體的結(jié)合也可增加PDGF的產(chǎn)生；因此，結(jié)合SIP的試劑也預(yù)期可以消除PDGF產(chǎn)生[MilstienandSpiegel(2006),CancerCell,vol9:148-150]。如在以下實(shí)施方式中所表明的，現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，體外SIP將人RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)化成類似于在PVR中》見察到的肌j成纖維細(xì)胞樣表型。假定最終導(dǎo)致在PVR中觀察到的過度結(jié)疤和S1P對(duì)這些相同關(guān)4建遞質(zhì)的已知作用的病理生理學(xué)，認(rèn)為結(jié)合、4吉抗或抑制SIP的作用或產(chǎn)生的試劑在消除或最小化PVR形成或其對(duì)眼睛的嚴(yán)重?fù)p害效果中是有效的。c.葡萄膜炎葡萄膜炎是眼葡萄膜的炎性紊亂。其可以影響眼的前部或后部或者這二者。其在病因?qū)W上可以是特發(fā)性的或感染性的，并且可以威脅到;現(xiàn)力。特發(fā)性葡萄膜炎與前室中增高的CD4+表達(dá)相關(guān)[Calder,etal.(1999)，InvestOphthalmolVisSci，vol40:2019-24]。數(shù)據(jù)還表明，T淋巴細(xì)胞及其趨化物IP-10在葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制中的病理學(xué)作用[AbuEl-Asrar(2004),AmJOphthalmol,vol138:64401-11]。急性促葡萄膜炎中的其他趨化因子包括巨噬細(xì)胞炎癥蛋白、單細(xì)胞趨化物蛋白-1和IL-8。這些細(xì)胞因子可能在急性促葡萄膜炎的白細(xì)胞聚集中起關(guān)鍵作用。Verma,etal.(1997)，CurrEyeRes;vol16;1202-8。假定SIP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)意義深遠(yuǎn)且具有多效作用，認(rèn)為SPHINGOMAB和減少生物活性脂質(zhì)有效濃度的其他免疫部分將用作減少或調(diào)節(jié)與葡萄膜炎相關(guān)的眼內(nèi)炎癥的有效方法。d.屈光手術(shù)角膜傷口愈合反應(yīng)與屈光手術(shù)方式是特別相關(guān)的，因?yàn)槠涫前踩院托ЯΦ闹饕獩Q定因素。這些程序?qū)嵤┯糜谥委熃灰娧?、遠(yuǎn)牙見眼和散光。激光原位角膜磨鑲術(shù)(LASIK)和屈光性角膜切除術(shù)(PRK)是最常見的屈光手術(shù)方式，然而，也已經(jīng)開發(fā)了其他手術(shù)方式試圖克服并發(fā)癥。這些并發(fā)癥其中包括過度矯正、矯正不足、退化(regression)和間質(zhì)渾濁。大量常見的并發(fā)癥涉及愈合反應(yīng)并且具有對(duì)手術(shù)的生物反應(yīng)的^^艮源。角膜生物學(xué)中的最大困難之一是經(jīng)過再生而不是纖維化促進(jìn)組織修復(fù)。認(rèn)為再生和纖維化之間的選4奪在于4空制成纖維細(xì)i包活4b[Stramer，etal(2003),InvestOphthalmolVisSci;vol44:4237-4246,andFini(1999)ProgRetinEyeRes,vol18:529-551]。稱為"幾成纖維細(xì)力包的細(xì)l包可以在手術(shù)或損傷之后1-2周在上皮下間質(zhì)中出現(xiàn)。月幾成纖維細(xì)胞布支定在TGF-p影響下來源于角膜細(xì)月包[Jester，etal.(2003)，ExpEyeRes，vol77:581-592]。角膜混濁和間質(zhì)結(jié)痣的特征在于降低的角膜透明度，并且可以與成纖維細(xì)胞和月幾成纖維細(xì)月包產(chǎn)生相關(guān)。原4立和體外研究已經(jīng)表明，TGF-(3和PDGF在刺激肌成纖維細(xì)胞分化中4艮重要[Folger,etal.(2001),InvestOphthalmolVisSci;42:2534-2541]。'混濁可以在某些'清況下在LASIK之后的中心界面中注意到。這些包括彌散性層狀角膜炎、圏形皮瓣(donut-shapedflap)和界面處上皮碎片的保持。有可能的是，這些中的每一個(gè)與TGF-j3對(duì)從上皮細(xì)胞至活化的角膜細(xì)月包的增加4妄觸相關(guān)[Netto,etal.(2005)，Cornea,vol24:509-522]。退4b最可能是65由于增高的上皮-間質(zhì)傷口愈合相互作用，如通過角膜成纖維細(xì)胞和/或肌成纖維細(xì)胞增高的上皮調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生[Netto，etal.(2005)，如上]。利用局部抗-TGF-(3抗體對(duì)TGF-J3與受體的結(jié)合的抑制已經(jīng)i正實(shí)卩爭(zhēng)4氐由PRK"i秀導(dǎo)的〉'昆濁[Jester,etal.(1997),Cornea,vol16:177-187]。-假定抗生物活性脂質(zhì)抗體對(duì)纖維4匕過程和TGF-p的已知作用，我們認(rèn)為其可以有助于治療一些屈光手術(shù)的并發(fā)癥如混濁、間質(zhì)結(jié)疰和復(fù)原。e.音光眼過濾手術(shù)的調(diào)節(jié)青光眼典型;也i人為是這樣的一種疾病，其中升高的目艮內(nèi)壓引起對(duì)感光神經(jīng)細(xì)胞的損害并且最終損害纟見野和/或視4文度。其4也形式的青光眼存在，其中光學(xué)神經(jīng)損害可以出現(xiàn)在正常壓力情況中或所謂的"正常眼壓性青光眼"。對(duì)于許多患者，藥物治療能夠控制它們的疾病，但是對(duì)于其他青光眼，需要過濾手術(shù)，由此手術(shù)地在眼中形成瘺以允許流體吸出。這可以通過小梁切除術(shù)、醫(yī)療裝置植入或其他手術(shù)干預(yù)方法完成。青光眼過濾手術(shù)由于特征在于成纖維細(xì)月包增生和最終結(jié)疤的傷口愈合過程而失敗?？?代謝物如5-氟尿嘧。定和絲裂霉素C可以減少隨后的結(jié)疤；然而，即〗吏利用這些藥物，長(zhǎng)期的跟蹤表明手術(shù)失敗仍然是一個(gè)嚴(yán)重的臨床問題[MutschandGrehn(2000),GraefesArchClinExpOphthalmol;vol238:884-91，andFontana,etal.(2006)，Ophthalmology,vol113:930-936]。人類Tenon嚢成纖維細(xì)月包(humanTenon'sfibroblasts)的研究表明，它們具有合成bFGF和PDGF以及TGF-(3的能力，并且這些生長(zhǎng)因子涉及促進(jìn)該手術(shù)方式失敗的青光眼過濾手術(shù)之后的組織{務(wù)復(fù)過程。Trpathi,etal.(1996),ExpEyeRes,vol63:339-46。另外的研究也在過濾后傷口反應(yīng)中暗示了這些生長(zhǎng)因子[Denk,etal.(2003)，CurrEyeRes;vol27:35-44],推斷不同的PDGF同種型是青光眼過濾手術(shù)之后的眼球筋膜成纖維細(xì)胞增生的主要刺激物，同時(shí)TGF-P對(duì)于眼球筋膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞是必需的。我們已經(jīng)i正實(shí)，SIP66存在于人眼球筋膜/結(jié)膜成纖維細(xì)胞中，并且SIP在傷口愈合響應(yīng)中強(qiáng)烈表達(dá)。SIP還刺激多個(gè)成纖維細(xì)胞類型的促纖維化功能以及4爭(zhēng)化肌成纖維細(xì)胞表型和膠原產(chǎn)生。假定SIP的特異性多效作用以及其與bFGF、PDGF和TGF-P的已知相互作用，i人為結(jié)合、拮抗、抑制S1P的作用或產(chǎn)生的試劑在調(diào)節(jié)導(dǎo)致青光眼手術(shù)失敗的傷口愈合和/或纖維化反應(yīng)中是有效的，并且將是增強(qiáng)手術(shù)成功結(jié)果的有效治療方法。預(yù)想該試劑可以例如經(jīng)過玻璃體內(nèi)或結(jié)膜下注射或局部進(jìn)行給藥。f.角膜移植角膜移植(滲透性角膜移植術(shù)(PK))是人類最成功的組織移植程序。在美國每年實(shí)施的47,000個(gè)角膜移植中，角膜異體移植排斥仍然是角膜移植失敗的主導(dǎo)原因[Ing,etal.(1998)，Ophthalmology:vol105:1855-1865]。當(dāng)前，沒有足夠避開異體移才直排斥的能力，盡管免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)可能是有希望的方法。近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD4(+)T細(xì)胞如效應(yīng)細(xì)胞一樣直接起作用并且在角膜異體移植的4非斥中不是輔助細(xì)月包。Hegde，etal.(2005)，Transplantation,vol79:23-31。鼠類研究已經(jīng)表現(xiàn)出，經(jīng)歷排斥的角膜間質(zhì)中數(shù)量增加的嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是主要的過濾細(xì)胞型，之后是T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。高危險(xiǎn)角膜移才直中的早期趨化因子表達(dá)是IL-8的小鼠類似物(巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2)和單核細(xì)月包趨化蛋白-l(MCP隱1)[Yamagami,etal.(2005)，MolVis，vol11,632-40]。FTY720(FTY)是一種新型免疫4卬制性藥物，通過文變淋巴細(xì)胞運(yùn)輸起作用；導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)力包減少和淋巴節(jié)中增高的淋巴細(xì)胞數(shù)。FTY通過結(jié)合至一些在淋巴細(xì)胞上表達(dá)的S1P受體而介導(dǎo)其免疫調(diào)節(jié)作用[Bohler，etal.(2005)，Transplantation,vol79:492-5]。藥物口服給藥，并且單個(gè)口服劑量減少30-70%的外周淋巴細(xì)胞數(shù)。FTY減少T細(xì)月包亞組CD4(+)比CD8(+)細(xì)月包更多。Bohler,etal.(2004)NephrolDialTransplant,vol19:702-13。當(dāng)口服纟會(huì)藥時(shí)，F(xiàn)TY治療的小鼠表現(xiàn)出同位角膜移植存活的顯著延長(zhǎng)。Zhang，etal.(2003),Transplantation,vol76:1511-3。FTY口月良治療還顯著延遲在大鼠至小鼠模型中的角膜異種移植排斥并降低其嚴(yán)重度[Sedlakova,etal.(2005),Transplantation,vol79,297-303]?！㊣定異體移植朝,斥的已知發(fā)病^L制結(jié)合該數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)SIP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用可以改善角月莫移植物存活，認(rèn)為降低生物活性脂類有效濃度的免疫部分例如SPHINGOMAB在治療免疫病癥如異體移植物排斥中也將是有用的，例如通過減弱免疫反應(yīng)，因而可能改善PK之后的角月莫移^L物存活。該藥物還可能具有其它的優(yōu)點(diǎn)，除了系統(tǒng)性給藥外，也可能是局部癥合藥，例如經(jīng)由局部眼周圍或眼內(nèi)遞送。具有炎性或免疫成分的其他眼病包括慢性玻璃體炎、感染，包括單純皰滲感染、帶狀皰滲感染、原蟲感染，以及眼組織月包漿菌病。g.凈爭(zhēng);f正為纟吉泡的前,殳(anteriorsegment)疾病利用靶向生物活性脂質(zhì)的抗體的治療還i人為對(duì)于特4正在于眼前卓殳部分結(jié)癥的多種病癥是有益的。這些包括以下i.創(chuàng)傷作為眼的最前方結(jié)構(gòu)，角膜暴露于各種危害，包括可導(dǎo)致機(jī)如戈創(chuàng)傷的氣載碎片至鈍傷。眼睛的角膜和前表面也可能暴露于其他形式的來自手術(shù)、以及化學(xué)物質(zhì)如酸堿的創(chuàng)傷、損傷。這些類型的損傷的結(jié)果可以是災(zāi)難性的，經(jīng)常導(dǎo)致角膜和結(jié)膜結(jié)疤瞼球粘連(symblephera)形成。另外，角膜新血管形成可能跟著發(fā)生。嗜中性粒細(xì)胞積累，它們釋放白細(xì)胞三烯、以及白介素-1和白介素-6，用于聚集炎癥細(xì)胞的連續(xù)變化[Sotozono，etal.(1997)，CurrEyeRes,68vol19:670-676]，其滲入角膜并釋放蛋白水解酶，這導(dǎo)致角膜組織的進(jìn)一步損害和破壞以及角膜熔化。另外，角膜和結(jié)膜成纖維細(xì)胞萍皮激活并侵入，導(dǎo)致力交原沉積和纖維化。過度炎癥和結(jié)皰的不期望作用由TGF-P促進(jìn)。Saika,etal.(2006),AmJPatholvol168，1848-60。這個(gè)過程導(dǎo)致角膜透明度喪失以及視覺損傷。減少的炎癥，包括導(dǎo)致堿燒傷角膜的鼠類模型中更快和更完全愈合的降低的嗜中性4立細(xì)胞'滲入和減少的纖維4b[Ueno，etal.(2005),OphthalmolVisSci,vol46:4097-106]。ii.眼瘢痕性類天皰瘡(OCP)OCP是一種主要影響結(jié)膜的慢性瘢痕性(疤形成)自身免疫疾病。該疾病是持續(xù)進(jìn)展性的并且預(yù)后十分差。在其最終階革殳，結(jié)月莫結(jié)疤以及相關(guān)角膜病變導(dǎo)致雙目失明。組織學(xué)上，結(jié)膜表現(xiàn)出粘膜下結(jié)癡和慢性炎癥，其中肥大細(xì)胞參與令人驚奇地多[Yao，etal.(2003),OculImmunolInflamm，vol11:211-222]。自身抗原導(dǎo)致形成自身抗體。自身抗體與自身抗原的結(jié)合在運(yùn)動(dòng)中具有復(fù)雜的一系列的具有T淋巴細(xì)胞滲入的事件，其中CD4(輔助)細(xì)月包遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過CD8(抑制)細(xì)胞數(shù)。巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞滲入以及促炎癥和促纖維化細(xì)胞因子的釋放也可隨即發(fā)生。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的結(jié)月菱成纖維細(xì)月包增生和活化結(jié)果，具有所得到的上皮下纖維化(參見下文的實(shí)施例)。研究已經(jīng)i正實(shí)了TGF-J3和IL-1在患有OCP患者的結(jié)膜纖維4匕中的4乍用[Razzaque,etal.(2004),InvestOphthalmolVisSci,vol45:1174-81]。iii.斯-約二氏綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)SJS和TEN是對(duì)藥物治療的威脅生命的有害反應(yīng)。這兩種相關(guān)病癥的眼部后遺癥可能是嚴(yán)重的并且涉及球結(jié)膜和瞼結(jié)膜、眼皮和角膜的病態(tài)變化。藥物和感染是最常見的誘因。慢性眼部結(jié)果包括_69結(jié)疤、瞼^求粘連形成以及作為初始炎癥過程結(jié)果的結(jié)膜瘢痕形成。這導(dǎo)致瞼內(nèi)翻形成、倒睫、淚膜的不穩(wěn)定性。眼表面破壞導(dǎo)致角膜結(jié)疤、新血管形成以及嚴(yán)重情況下的角化。如在OCP中，結(jié)膜的上皮下纖維化發(fā)生。對(duì)藥物或感染的嚴(yán)重自身免疫淋巴細(xì)月包反應(yīng)認(rèn)為在形成SJS/TEN中起作用。Harilaos,etal.(2005),ErythemaMultiforme,StevensJohnsonSyndrome,andToxicEpidermalNecrolysis,inCornea2ndedition.Krachmer，Mannis，Hollandeds.ElesevierMosbyPhiladelphia。SJS中的、滲入性細(xì)月包種類包括巨p藍(lán)細(xì)月包、CD4陽性T細(xì)月包和CD8陽性T纟田月包。該細(xì)月包種群類似于在化學(xué)損傷中觀察到的那些。Kawasaki,etal.(2000),JOphthalmol,vol84:1191-3。iv.翼狀胬肉臨床上，翼狀胬肉看起來是肉質(zhì)的、血管實(shí)體，其出現(xiàn)在瞼間裂隙中。翼狀胬肉受試者是一個(gè)肉質(zhì)纖維血管體?；钚砸頎铈廊馓卣髟谟陲@著的血管充血和進(jìn)展性生長(zhǎng)。它們緊緊地粘附于眼球。在嚴(yán)重的病例中，翼狀胬肉侵入到角膜上并且可能51起視軸線內(nèi)僅次于角膜透明度喪失的視力損失或不規(guī)則散光。在癥狀上，患者可能經(jīng)歷外來體覺、撕裂和視力模糊。組織病理學(xué)表明，(鞏膜)固有質(zhì)(substantiapropria)的上皮下結(jié)締組織的玻璃變性、增多數(shù)量的成纖維細(xì)月包和增力。的月巴大細(xì)i包。Butrus，etal.(1995)，AmJOphthalmol,vol119:236-237。翼狀箭肉的控制處理仍然是個(gè)難題。經(jīng)常實(shí)施手術(shù)切除，然而，復(fù)發(fā)率高[Krag,etal.(1992)，ActaOphthalmol,vol70:530]。為了幫助降低翼狀胬肉的復(fù)發(fā)率，已經(jīng)采用了各種藥學(xué)佐劑，如絲裂霉素C和柔紅霉素。盡管這些可以是有幫助的，但是長(zhǎng)期數(shù)據(jù)有限并且它們可能與鞏膜變薄和角膜熔化有關(guān)。Dougherty等[(1996)，Cornea,vol15:537-540,andLee,etal.(2001),Cornea,vol20:238-42]首先證實(shí)了，VEGF可能在翼狀胬肉形成中起重要作用并且在翼狀胬肉的上皮中鑒定了VEGF和氧化一70氮。這些研究人員假設(shè)了這些以及其他細(xì)胞因子負(fù)責(zé)翼狀箭肉的纖維血管向內(nèi)生長(zhǎng)特性。已經(jīng)證實(shí)在原發(fā)性和復(fù)發(fā)翼狀胬肉中存在堿性FGF和TGF-(31[Kim，etal.(1998),GraefesArchClinExpOphthalmol,vol236:702-8],并且/>布的形態(tài)測(cè)定和免疫《且織4匕學(xué)證據(jù)進(jìn)一步支持血管發(fā)生可能在翼狀胬肉形成中起作用的觀點(diǎn)[Marcovich，etal(2002)，CurrEyeRes,vol25:17-22]。其4也研究表明，作為遞質(zhì)的IL-6和IL-8以及VEGF可能與翼狀胬肉形成相關(guān)[DiGirolamo,etal.(2006),InvestOphthalmolVisSci,vol47:2430-7]。針對(duì)翼狀胬肉形成和生長(zhǎng)的一種有效試劑可以消除對(duì)于手術(shù)干預(yù)的需要或者降低復(fù)發(fā)率。具有纖維生成、纖維化或結(jié)疤成分的其《也眼病和眼疾包括rAMD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、鐮狀紅細(xì)J包性視網(wǎng)膜病變、缺血性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞性疾病、以及隱形眼鏡超時(shí)佩戴癥。積jU舌i也，過度結(jié)癡是許多眼病以及非眼病和病癥的病理生理學(xué)的一個(gè)潛在成分。生物活性脂類如S1P在這個(gè)過程中起作用，并且用來減少這些試劑的濃度的抗體相關(guān)治療可能導(dǎo)致對(duì)4妄受該治療的患者的治療益處。在一個(gè)實(shí)施方式中，認(rèn)為生物活性脂類的抑制劑，特別是針對(duì)SIP的單克隆抗體和/或其變體在調(diào)節(jié)手術(shù)和創(chuàng)傷性傷口愈合反應(yīng)中是有用的。纖維〗t、纖維形成和疰形成視網(wǎng)膜下纖維化的形成導(dǎo)致對(duì)光感受器不可逆的損害以及永久性視力喪失。只要新血管復(fù)合體保持完整，如看起來是用抗-VEGF劑治療患者的情況一樣，對(duì)于一見網(wǎng)膜下纖維化和將來視力喪失的可能持續(xù)存在。在RANIBIZUMAB(Lucentis)的最新PRONTO研究中，發(fā)現(xiàn)那些喪失視力的患者缺失由于視網(wǎng)膜下纖維71化或RPE撕裂的結(jié)果導(dǎo)致?？梢越档统衫w維細(xì)胞滲入和膠原沉積的程度的試劑將是有價(jià)值的。成纖維細(xì)胞，尤其是肌成纖維細(xì)胞是對(duì)細(xì)胞損傷和發(fā)炎的疤形成反應(yīng)的關(guān)4建細(xì)月包元件[Tomasek，"a/.(2002)，NatRevMolCellBiol,vol3:349-63，andViragandMurry(2003)，AmJPathol,vol163:2433-40]。通過肌成纖維細(xì)胞的膠原基因表達(dá)是重建的標(biāo)識(shí)并且對(duì)于癥形成是必需的[SunandWeber(2000),CardiovascRes,vol46:250-6，andSimandWeber(1996),JMolCellCardiol,vol28:851-8]。SIP通過激活成纖維細(xì)胞遷移和增生同時(shí)增加月交原產(chǎn)生而促進(jìn)傷口愈合[Sun，"a/.(1994)，JBiolChem，vol269:16512-7]。由受損細(xì)月包局部產(chǎn)生的SIP可能負(fù)責(zé)與重建和疤形成相關(guān)的不合適的傷口愈合。因此，認(rèn)為SIP抑制劑在至少部分特征在于異常血管發(fā)生或纖維4匕的疾病或病癥中是有用的。一見網(wǎng)膜下纖維化的形成導(dǎo)致對(duì)光感受器不可逆的損害以及永久性視力喪失。只要新血管復(fù)合體保持完整，如看起來是用抗-VEGF劑治療患者的情況一樣，對(duì)于一見網(wǎng)膜下纖維化和將來一見力喪失的可能持續(xù)存在。通過中和SIP而最小化不合適疤形成可能是有益的，并且通過限制視網(wǎng)膜下纖維化和隨后光感受器損害的程度而防止視敏度的不可逆喪失。增多的i正據(jù)表明，SIP可以促進(jìn)早期和晚期與滲出性AMD相關(guān)的不合適視網(wǎng)膜重建。SIP具有顯著的非VEGF依賴性促血管形成作用。S1P還刺激多個(gè)細(xì)胞類型，包括成纖維細(xì)胞、EC、周細(xì)胞和炎癥細(xì)胞一殘余滲出性AMD和其他眼紊亂的多個(gè)不合適的過程中的相同細(xì)胞的遷移、增生和存活。SIP關(guān)聯(lián)于涉及滲出性AMD的發(fā)病才幾制的VEGF、bFGF、PDGF和其4也生長(zhǎng)因子(GF)的產(chǎn)生和激活。最后，SIP可以調(diào)節(jié)天然脈管系統(tǒng)的成熟，一種導(dǎo)致對(duì)抗-血管形成劑4丈感性喪失的過程。抑制SIP的作用對(duì)于滲出性AMD可以是一種有效的治療，可以提供相對(duì)于排他地抗-VEGF方法的顯著優(yōu)點(diǎn)或者可以與它們協(xié)同作用而最終導(dǎo)致與#見力喪失相關(guān)的AMD的復(fù)雜過程和多個(gè)步驟。目前只于于AMD的有利治療才莫式包4舌Lucentis和Avastin(Genentech,Inc.)的標(biāo)示以外的4吏用，這二者革巴向單個(gè)生長(zhǎng)因子(VEGF-A)并且看起來經(jīng)過抗-滲透作用而發(fā)揮它們的大多數(shù)有益作用，導(dǎo)致視網(wǎng)膜下和視網(wǎng)膜內(nèi)水腫消退，同時(shí)急性脈絡(luò)膜新血管(CNV)病變還沒有顯著消退。然而，滲出性AMD相關(guān)的S見力喪失不僅僅是由于CNV誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜下和視網(wǎng)膜內(nèi)水腫。由CNV、視網(wǎng)膜下纖維化、水胂和炎癥一起引起^L網(wǎng)膜和碎見網(wǎng)膜下結(jié)構(gòu)的病態(tài)石皮壞和重建，導(dǎo)致與AMD相關(guān)的視敏度喪失。這些多個(gè)病因沒有可利用的治療，包括LucentisTM。因此，可治療引起一見力喪失的多個(gè)機(jī)制的治療劑將是有價(jià)值的，作為單一治療或組合另一試劑，3口4元-VeGF齊'J(4列i口Lucentis⑧或Avastin)。因此，不希望受限于任何特定理i侖，i人為不期望的鞘脂如SIP的水平、和/或一種或多種它們的^"i射物31起或促進(jìn)各種眼病和眼疾的形成，其中不恰當(dāng)炎癥、纖維化和/或血管發(fā)生涉及疾病的發(fā)病機(jī)制。其中抗-SlP抗體可能在臨床上有用的眼病和眼疾包括^唐尿病一見網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、糖尿病性黃斑水肺、PVR、前段疾病和年齡相關(guān)的黃斑水腫，濕性和干性的，以及諸如青光眼中的小梁切除術(shù)或瓣膜移4直手術(shù)之后。用于治療》更皮病的抗-S1P抗體本發(fā)明的組合物和方法在治療至少部分特4正在于異常新血管形成、血管發(fā)生、纖維形成、纖維化、結(jié)疤、炎癥和免疫反應(yīng)的紊亂和疾病中很有用。一種這樣的疾病是硬皮病，其也稱為系統(tǒng)性硬化病。73硬皮病是引起皮膚結(jié)疤或增厚的自身免疫疾病，并且有時(shí)涉及身體的其他區(qū)域，包括肺、心臟和/或腎。石更皮病的特征在于在皮膚和身體的器官中形成疤痕組織(纖維化)，這可導(dǎo)致所涉及區(qū)域的增厚和硬度，其功能隨后減弱。如今，根據(jù)硬皮病基金會(huì)，大約300,000美國人患有硬皮病。受影響的這些之中的三分之一或更低具有多種疾病，而剩余三分之二主要具有皮月夫癥d犬。當(dāng)該疾病影響肺并引起結(jié)疤時(shí)，呼吸可能變得緊促，因?yàn)榉尾辉偃缢鼈儜?yīng)該的那樣進(jìn)行擴(kuò)張。為了4企測(cè)呼吸能力，醫(yī)生^f吏用評(píng)估用力肺活量能力(FVC)的裝置。在具有低于50%預(yù)期讀數(shù)的FVC的人中，來自石更皮病相關(guān)的月申病的10年死亡率為約42%。死亡率這么高的一個(gè)原因在于目前沒有可利用的有^:治療。不希望受任何特定理i侖的限制，i人為脂類如S1P和/或其代謝物的不恰當(dāng)濃度引起或促進(jìn)石更皮病形成。因而，本發(fā)明的組合物和方法可以用來治療硬皮病，特別是通過降低特定靶脂質(zhì)例如S1P的有效體內(nèi)濃度。如本申請(qǐng)其他地方描述的，現(xiàn)有證據(jù)表明，S1P是一種促纖維化生長(zhǎng)因子，其可以促進(jìn)成纖維細(xì)力包活化、增生，并導(dǎo)致與不合適結(jié)宛和重建相關(guān)的成纖維細(xì)力包活性增大。纟人為利用抗S1P劑(例如4元-S1PmAb)的S1P生物活寸生可以間4妄i也減豐至PDGF和TGF畫的促硬化作用。此外，利用這樣的抗-SlP劑的治療通過減輕SlP對(duì)皮膚或促進(jìn)疾病進(jìn)展的其他形式的成纖維細(xì)胞的直接作用而有益于硬皮病患者。心血管和腦血管障；孚不希望受限于〗壬^T特定理i侖，不期望的鞘脂類如CER、SPH或S1P,和/或一種或多種它們的代j射物的x)c平可以直4妾導(dǎo)f丈心功能障74礙，在心臟缺血期間或之后如在再灌注損傷以及所產(chǎn)生的心臟重建,口心力衰竭期間。因?yàn)榍手惾鏢IP涉及肝組織的纖維形成和傷口愈合(Davaille，etal.，J.Biol.Chem.275:34268-34633,2000;Ikeda,etal.,AmJ.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol279:G304-G310,2000),受傷脈管系統(tǒng)的愈合(Lee，etal"Am.J.Physiol.CellPhysiol.278:C612陽C618,2000)，以及其^f也疾病狀態(tài)，或與這才羊的疾病如癌癥、血管發(fā)生和炎癥相關(guān)的事件(Pyne,etal"Biochem.J.349:385-402，2000)，本發(fā)明的心臟病。這表明，來源于心臟或其他非大腦來源的鞘脂可以促使中風(fēng)發(fā)生。因此，干擾鞘脂產(chǎn)生和/或作用可以在減少中風(fēng)、特別是由外周血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟紊亂引起的中風(fēng)中是有益的。最新證據(jù)表明，外源性給予的SIP越過血腦屏障并促進(jìn)大腦血管收縮(Tosaka,etal"Stroke32:2913-2919.2001)。已經(jīng)表明，心臟擊夬血(即，缺少向心臟的血液供應(yīng))的過禾呈中的早期事件是通過心肌的過量產(chǎn)生天然化合物鞘氨醇，以及其他代謝物，特別是S1P也通過心臟組織本身或血液成分產(chǎn)生，作為心臟鞘脂產(chǎn)生和隨后血液中轉(zhuǎn)化的結(jié)果。本發(fā)明提供了用于利用特定人源化單克隆抗體中和SIP的方法。由此，本發(fā)明提供了人源化抗-鞘脂抗體以及相關(guān)組合物和方法以降低關(guān)鍵鞘脂SIP的血液和組織水平。這樣的抗體是有用的，例如對(duì)于全血中不期望鞘脂的結(jié)合以及由此降低其有效濃度。本發(fā)明的治療用方法和組合物被說成是"基于鞘脂的"以表明這些治療可以改變某些而不期望的、有毒的或心臟毒性的鞘脂的相對(duì)、絕對(duì)或可利用濃度。"毒性鞘脂"是指可引起或增強(qiáng)細(xì)胞壞死和/或凋亡或者損傷器官或組織功能(例如通過過度纖維化)、在某75些情況下包括在特定組織或器官中發(fā)現(xiàn)的特定細(xì)胞型的任何鞘脂。"心臟毒性鞘脂"是毒性鞘脂，其通過不合適結(jié)疤(纖維形成)直4妄或間4妄促進(jìn)心力衰竭并引起負(fù)面變力4生(negativeinotropicstate)，或者引起或增強(qiáng)在心臟中發(fā)現(xiàn)或與心臟相關(guān)的細(xì)月包壞死和/或凋亡，包括但不限于心肌細(xì)胞、心臟神經(jīng)元等，和/或由于該鞘脂和/或它們的代謝物的負(fù)面變力性、心律失常冠脈收縮/痙攣?zhàn)饔枚梢砸鹦呐K功能喪失。"不期望的鞘脂，，包括有毒或心臟毒性鞘脂，以及有毒或心臟毒性鞘脂的代謝物，特別是代謝前體。特別感興趣的不期望的、心臟毒性、和/或毒性鞘脂包括但不限于神經(jīng)酰胺(CER)、神經(jīng)酰胺-l-磷酸(C1P)、鞘氨醇-l-磷酸(S-l-P)、二氫-SlP(DHS1P)、鞘氨醇基磷酰膽堿(SPC)、鞘氨醇(SPH;D(+)-赤式-2-氨基-4-反式-十八烯-l，3-二醇，或二氫(神經(jīng))鞘氨醇以及各種代i射物。已知，心肌細(xì)胞對(duì)缺氧或再氧合的最早反應(yīng)之一是中性鞘磷脂酶;敫活以及神經(jīng)酰胺積累。Hernandez,etal.(2000),Circ.Res.86:198-204，2000。SPH已一皮々i定涉及介導(dǎo)各種細(xì)月包型的凋亡細(xì)月包死亡中的早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(Ohta，etal.，F(xiàn)EBSLetters355:267-270，1994;Ohta，etal.,CancerRes.55:691-697，1995;Cuvlilier,etal"Nature381:800-803,1996)?！﹊定缺氧的心臟毒性作用可以部分由鞘脂產(chǎn)生和/或其他代謝物(例如質(zhì)子、4丐、和某些自由基)不恰當(dāng)產(chǎn)生或有害地影響心臟功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(例如MAP激酶，半胱天冬酶)不恰當(dāng)產(chǎn)生所引起。SIP儲(chǔ)存在血小板中并且是人血漿和血清的常^見組分((Yatomi,etal.,J.Biochem.121:969-973,1997)。SIP是對(duì)犬心臟具有其他生物學(xué)作用的冠狀血管^)文縮劑。Sugiyama，etal.(2000),CardiovascularRes.46:119-125。假設(shè)了SIP在動(dòng)脈粥樣石更化中的作用(Siess,etal.,IUBMBLife49:161-171,2000)。這已由其他數(shù)據(jù)支持，包括HDL4呆護(hù)性作用是由于阻斷SIP產(chǎn)生的i正才居(Xia,etal.,PNAS7695:14196-14201，1988;Xia,etal"JBiolChem274:33143-33147,1999)。已經(jīng)報(bào)道鞘磷脂(神經(jīng)酰胺的代謝前體)在經(jīng)受缺氧的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中是增力口的(Sergeev,etal.,Kosm.Biol.Aviakosm.Med.(Russian)15:71-74,1981)。其他研究沖艮道了肌肉細(xì)胞的內(nèi)膜包含很高的SPH和鞘石岸脂量(Sumnicht，etal.，Arch.Biochem.Biophys.215:628-637,1982;Sabbadini,etal"Biochem.Biophys.Res.Comm.193752-758,1993)。利用串珠鐮孢菌素B真菌毒素治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物導(dǎo)致SPH和DHSPH血清水平增高(S1P沒有檢測(cè))，其中同時(shí)發(fā)生對(duì)心臟的負(fù)面變力寸生4乍用(Smithe,etal"ToxicologicalSciences56:240-249，2000)。其他疾病或病癥由于生物活性脂質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及許多過程，包括新血管形成、血管發(fā)生、異常纖維形成、纖維化和結(jié)疤，以及炎癥和免疫反應(yīng)，所以i人為這些生物活性脂類的抑制劑將促進(jìn)與這些過程中的一種或多種相關(guān)的各種疾病和病癥。這才羊的疾病和病癥可以是系統(tǒng)性的(例如系統(tǒng)性硬皮病)或位于一個(gè)或多個(gè)特定身體系統(tǒng)、部分或器官(例如，皮月夫，肺，心血管系統(tǒng)或眼睛)?？刂苹颊叩牟黄谕手囊环N方法是通過提供包含一種或多種人源化抗-鞘脂抗體以結(jié)合一種或多種鞘脂的組合物，從而充當(dāng)降低游離的不期望的鞘脂水平的治療用"海綿"。當(dāng)一個(gè)化合物稱為"游離，，時(shí)，該化合物不以任何方式被限制到達(dá)其發(fā)揮不期望作用的位點(diǎn)或部位。通常，游離化合物存在于血液和組織，其是或包含該游離化合物作用的部位，或者化合物/人其可以自由地遷移至其作用部位。游離化合物也可以用來^皮任何將該化合物轉(zhuǎn)化成不期望化合物的酶所作用。不希望受限于4壬<可特定理"i侖，i人為不期望的鞘脂如SPH或S1P，和/或一種或多種它們的代/謝物的水平引起或促進(jìn)心臟和心月幾疾病和紊《L的形成。因?yàn)榍手采婕案谓M織的纖維形成和傷口愈合(Davaille，etal.J.Biol.Chem.275:34268-34633，2000;Ikeda，etal.，AmJ.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol279:G304-G310，2000)，受傷月永管系統(tǒng)的愈合(Lee,etal.,Am.J.Physiol.CellPhysiol.278:C612-C618，2000)，以及其他疾病狀態(tài)，或與這樣的疾病如癌癥、血管發(fā)生和炎癥相關(guān)的事件(Pyne，etal.，Biochem.J.349:385-402，2000)，本發(fā)明的組合物和方法可以用來治療不〗義這些疾病而且心臟病?；谇手闹委煹囊环N形式涉及操控鞘脂的代謝路徑以便降低不期望的毒性鞘脂的實(shí)際、相對(duì)和/或可利用的體內(nèi)濃度。本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防疾病、紊亂或身體創(chuàng)傷的組合物和方法，其中給予患者人源化抗-鞘脂抗體以結(jié)合不期望的、毒性鞘脂，或其代謝物。這樣的人源化抗-鞘脂抗體可以配制到用于各種目的，包括治療疾病、紊亂或紊亂創(chuàng)傷的藥物組合物中。包含本發(fā)明的一種或多種人源化抗-鞘脂抗體的藥物組合物可以整合到用于這樣的治療的試劑盒和醫(yī)療裝置中。醫(yī)療裝置可以用來將本發(fā)明的藥物組合物給予到需要其的患者，并且根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供的試劑盒包括這樣的裝置。這樣的裝置和試劑盒可以i殳計(jì)用于本發(fā)明的藥物組合物的常^L給藥，包括自身給藥。這樣的裝置和試劑盒還可以設(shè)計(jì)用于緊急用途，例如在救護(hù)車中或急診室，或者手術(shù)期間，或者在可能發(fā)生損傷但完備的醫(yī)療緊急情況可能不會(huì)立即到來的活動(dòng)中(例如，徒步旅行和野營(yíng)，或者戰(zhàn)爭(zhēng)情形)。給藥方法78用于本文中"i寸"i侖的疾病和病癥的治療可以通過采用不同制劑和裝置的各種方式給予本發(fā)明的試劑和組合物而實(shí)現(xiàn)。合適的藥用稀釋劑、載體和賦形劑在本領(lǐng)域是熟知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)于任何具體治療方案要給予的量易于確定。合適的量可以預(yù)期落入10ng/劑量10g/劑量，優(yōu)選地10mg/劑量~1g/劑量的范圍。藥物可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)給予，包括但不限于全身、皮下、皮內(nèi)、粘液給藥，包括通過吸入，以及局部給藥。粘膜是指位于身體內(nèi)腔的上皮組織。例如，粘膜消化道，包括嘴、食道、胃、腸和取門；呼吸道，包4舌鼻通道、氣管、支氣管和肺；以及外生殖器。對(duì)于本說明書的目的，粘膜還包括眼的外表面，即角膜和結(jié)膜。局部給藥(相對(duì)于全身給藥)可以是有利的，因?yàn)檫@種方法可以限制潛在的系統(tǒng)副作用，〗旦仍然允許治療作用。在本發(fā)明中使用的藥物組合物包括但不限于溶液、乳液和含脂質(zhì)體制劑。這些組合物可以^人各種成分形成，包括f旦不限于預(yù)成形液體、自乳化固體和自乳化半固體。在本發(fā)明中使用的藥物制劑可以根據(jù)制藥工業(yè)中熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。這樣的技術(shù)包括使活性成分與藥學(xué)載體或賦形劑混合的步驟。優(yōu)選的載體包括藥學(xué)上可接受的那些，特別是當(dāng)所述組合物用于人類的治療用途時(shí)。^j"于非人治療應(yīng)用(例如，在治療4半侶動(dòng)物、家畜、魚、或家禽)，可以采用獸醫(yī)學(xué)可4妄受的載體。一般地，制劑通過均勻且緊密地使活性成分與液體載體或細(xì)分的固體載體或這二者混合，然后如果需要，可使該產(chǎn)品成形。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能的劑型的任何形式，例如但不限于片劑、膠嚢、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以配制成在含水、非水或混合介質(zhì)中的懸浮液。含水79懸液可以進(jìn)一步包含增大懸液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨凈唐醇和/或葡聚并唐。懸、液還可以包含穩(wěn)、定劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物纟且合物可以配制和用4乍泡沫。藥物泡沫包括這樣的制劑，例如但不限于乳液、微乳液、霜?jiǎng)?、膠凍劑和脂質(zhì)體。盡管性質(zhì)基本類似，但是這些制劑在成分和最終產(chǎn)品的稠度上不同。這樣的組合物和制劑的如何制備對(duì)于藥學(xué)和配制領(lǐng)域的技術(shù)人員來"i兌通常是已知的，并且可以用來配制本發(fā)明的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫源性部分可以遞送至眼，例如，經(jīng)由局部滴藥或抹膏劑、目艮周注射、從前房進(jìn)入前室或玻璃體，通過植入儲(chǔ)藥，或者系統(tǒng)地通過注射或口服給藥。使用的抗體的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。將治療劑遞送至眼的傳統(tǒng)途徑包括局部涂覆、在全身性給藥之后再分配到眼或者直接眼內(nèi)/目艮周注射[Sultana,etal.(2006),CurrentDrugDelivery,vol3:207-217;GhateandEdelhauser(2006)，ExpertOpinion,vol3:275-287;andKaurandKanwar(2002),DrugDevelopIndustrialPharmacy,vol28:473-493]?？?SlP或其他抗-生物活性脂質(zhì)抗體治療劑有可能利用這些方法中的任一種，盡管所有方法都具有某些已知的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。局部滴入方便，但主要被洗掉，因?yàn)楸菧I排出經(jīng)常將少于5%所涂覆的藥物遞送入眼的前部，并且甚至該劑量的更小部分遞送至眼球的后段。除了滴入，噴霧提供局部給藥的另一種模式。第三種模式是眼膏，或者乳劑可以用來延長(zhǎng)制劑與眼表面的接觸時(shí)間，盡管視力模糊和眼皮無光潔很煩。這樣的局部給藥方法仍然是優(yōu)選的，因?yàn)橛糜谥委熝鄄课蓙y的治療劑的全身性給藥將整個(gè)身體暴露于該藥物是潛在有毒。80眼后段的治療在醫(yī)療上^艮重要，因?yàn)槔夏晷渣S斑退化癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、后葡萄膜炎、以及青光眼是美國和其他發(fā)達(dá)國家中視力喪失的主導(dǎo)病因。Myles,etal.(2005)，AdvDrugDelivRev;57:2063-79。藥物遞送至后^殳的最有效才莫式是通過睫狀環(huán)的玻璃體內(nèi)注射。然而，直接注射要求熟練的醫(yī)療人員實(shí)現(xiàn)該遞送，并且可能在許多患者中引起限制治療性焦慮。眼周注射，一種包括結(jié)膜下、目艮3求后、眼3求周和眼后節(jié)注射的方法，比玻璃體內(nèi)注射4曼入性更小。重復(fù)和長(zhǎng)期的玻璃體內(nèi)注射可能引起并發(fā)癥，如玻璃體出血、#見網(wǎng)膜脫落、或眼內(nèi)炎。抗-生物活性脂質(zhì)抗體治療還可以4吏用更新的眼遞送系統(tǒng)之一進(jìn)行給藥[Sultana，etal.(2006),CurrentDrugDelivery,vol3:207-217;andGhateandEdelhauser(2006)，ExpertOpinion,vol3:275-287〗，包括持續(xù)或受控釋放系統(tǒng)，如(a)眼置入物(可溶，易蝕，非易蝕或水凝膠基)，角膜防護(hù)物，例如膠原基繃帶以及提供藥物受控釋放到眼的隱形眼鏡；(b)原位凝膠化系統(tǒng)，其如滴劑一樣給藥便利，提供在眼中轉(zhuǎn)成凝膠形式，由此提供一些藥物在眼中的持續(xù)作用；(c)嚢泡狀系統(tǒng)，如脂質(zhì)體，類脂質(zhì)體/discomes等，其提供耙向遞送、生物相容和沒有^L力^t糊的優(yōu)點(diǎn)；(d)粘膜附著劑系統(tǒng)，其在眼中提供更好的滯留；(e)前藥；(f)滲入增強(qiáng)劑；(g)凍干載體系統(tǒng)；(h)顆粒；(i)亞孩i米乳液；(j)電離子透入；(k)樹狀高分子；(l)微球體，包括生物粘附性微球體；(m)納米球體和其他納米顆粒；(n)collasomes;以及(o)藥物遞送系統(tǒng)，其組合上述系統(tǒng)中的一個(gè)或多個(gè)來提供添加劑，或者甚至協(xié)同有益作用。這些途徑的大多數(shù)靶向眼的前段，并且可以有益于治療前段疾病。然而，這些途徑中的一種或多種仍然可以有用i也影響眼后區(qū)中的生物活性脂質(zhì)濃度，因?yàn)橹|(zhì)相對(duì)的相對(duì)低分子量將可能允許脂質(zhì)在眼內(nèi)的大量運(yùn)動(dòng)。另外，引入到眼前區(qū)中的抗體可以能夠在整個(gè)眼睛遷移，特別是如果其是以較低分子量抗體變體如Fab片段生產(chǎn)。用于后,殳的持續(xù)藥物遞送系統(tǒng)如批準(zhǔn)的或處于開發(fā)的那些(參見參考文獻(xiàn)，supra)也可以采用。如之前提到的，后視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和黃斑的疾病治療在醫(yī)學(xué)上非常重要。在這方面，經(jīng)鞏月莫的電離子透入法[Eljarrat-BinstockandDomb(2006)，ControlRelease,110:479-89]是一個(gè)重要的進(jìn)步，并且可以提供一種有效方式以將抗體遞送至眼后段。各種賦形劑也可以加入到配制的抗體，以改善治療的性能，使得該治療更方<更或者明確地確^f呆配制的抗體<又用于其預(yù)計(jì)的批準(zhǔn)的目的。賦形劑的實(shí)例包括控制pH的化學(xué)物質(zhì)、抗菌劑、防腐劑以防止4元體歲文力損失、染并牛以識(shí)別4又用于眼用途的制劑、增:容劑以增大抗體在制劑中的濃度、滲透增強(qiáng)劑和調(diào)節(jié)等滲性和/或粘度的試劑的使用。例如可以加入蛋白酶的抑制劑以延長(zhǎng)抗體半衰期。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體在包含適合眼睛pH的磷酸緩沖鹽水的溶液中通過^皮璃體內(nèi)注射而遞送至眼?？?SlP劑(例如人源化抗體)也可進(jìn)行化學(xué)修飾以產(chǎn)生在前述制劑或裝置之一中給予的前藥?？贵w的活性形式然后通過內(nèi)源性酶的作用釋放。在本申請(qǐng)中可以考慮的可能的眼用酶是各種細(xì)胞色素p450、醛還原酶、酮還原酶、酯酶或N-乙?；?p-葡萄糖酰胺酶。對(duì)抗體的其他化學(xué)〗奮飾可以增加其分子量，并作為結(jié)果，增加抗體在眼中的停留時(shí)間。這才羊的化學(xué)<奮飾的一個(gè)實(shí)例是聚乙二醇化[HarrisandChess(2003)，NatRevDrugDiscov;2:214-21],—種只于于官能團(tuán)如二碌"匕物通?；蛱囟ǖ倪^程[Shaunak，etal.(2006)，NatChemBiol;2:312-3]orathiol[Doherty，etal.(2005)，BioconjugChem;16:1291-8]。本文下面的實(shí)施例描述了人源化和變異的抗-鞘脂抗體的生產(chǎn)，具有有治療前景的期望性能，包括對(duì)于鞘脂的強(qiáng)結(jié)合親和力。更具82體地，本發(fā)明注意到S1P及其變體，其可以包括S1P本身，定義為鞘氨醇-l-石岸酸[sphingene-l-phosphate;D-赤式-鞘氨醇-l-石粦酸；sphing-4-enine畫l-phosphate;(E,2S,3R)-2畫氨基陽3-,5基-十/v-4畫婦氧]膦酸(AS26993-30-6),DHS1P定義為二氪鞘氨醇-l-磷酸[二氫神經(jīng)鞘氨醇-l-磷酸；[(2S，3R)-2-氨基-3-羥基-十八氧]膦酸；D-赤式-二氫-D-鞘氨醇-l-磷酸(CAS19794-97-9)];SPC是鞘氨醇基磷酰膽堿，溶血鞘磷脂，鞘氨醇基磷酸膽堿，鞘氨醇磷酰膽堿，乙醇銨；1(((0氨基-3-羥基-4-十八烯基)氧)羥基氧膦基)氧)-N,N，N-三甲基-，氯化物，(R-(R*,S*-(E)))，2-[[(E,2R，3S)-2-氨基-3-羥基-十八-4-烯氧基]-羥基-磷?；鵠氧乙基-三曱基-氯化銨(CAS10216-23-6)。4亢體產(chǎn)生禾。表征抗體親和力可以如本文中以下實(shí)施例中描述的進(jìn)4亍確定。優(yōu)選的人源化或變異抗體是以不大于約1x1(T7M，優(yōu)選地不大于約1xl(T8M,并且最優(yōu)選地不大于約5x10-9M的Kd值結(jié)合鞘脂的那些抗體。除了對(duì)鞘脂具有強(qiáng)結(jié)合親和力的抗體之外，還期望選擇具有來自治療前景的其他有益性能的人源化或變異抗體。例如，抗體可以是減少血管發(fā)生和改變腫瘤進(jìn)展的抗體。優(yōu)選地，抗體具有不大于約10pg/ml，優(yōu)選地不大于約1ng/ml，并且最優(yōu)選不大于約0.1嗎/ml的有效濃度50(EC50)值，如在直接結(jié)合ELISA測(cè)定中測(cè)定的。優(yōu)選地，當(dāng)存在1jaM的S1P的細(xì)胞測(cè)定中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抗體具有不大于約10pg/ml，優(yōu)選不大于約1pg/ml，并且最優(yōu)選不大于約0.1jig/ml的有效濃度值，例如，在這些濃度下，抗體能夠抑制至少10%的體外鞘脂誘導(dǎo)的IL-8釋放。優(yōu)選地，當(dāng)在激光燒傷之后的CNV動(dòng)物模型中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抗體具有不大于約10嗎/ml，優(yōu)選不大于約1^g/ml，并且最優(yōu)選不大于約0.1]Lig/ml的有效濃度^f直，83例如，在這些濃度下，抗體能夠抑制至少50%的體內(nèi)鞘脂誘導(dǎo)的新血管形成。用于確定本發(fā)明的抗-鞘脂抗體活性的測(cè)定包括ELISA測(cè)定，如在下文實(shí)施例中所示的。優(yōu)選地，人源化或變異抗體在將治療有效量的該抗體給予人類患者之后不能引發(fā)免疫源性反應(yīng)。如果免疫源性反應(yīng)^皮引發(fā)，則優(yōu)選地，該反應(yīng)使得抗體仍然對(duì)所治療的患者提供治療性益處。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，人源化抗-鞘脂抗體結(jié)合如本文定義的"表位"。為了篩選結(jié)合至鞘脂上的表位的抗體，該鞘脂結(jié)合至感興趣的抗體(例如，阻斷抗體與鞘脂結(jié)合的那些抗體)，可以實(shí)施常頭見交叉阻斷實(shí)-驗(yàn)，如在Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中描述的?？商娌艎Ji也，表4立定4立例^口在Champe，etal.[J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)]中描述的，可以實(shí)施以確定抗體是否結(jié)合感興趣的表位。本發(fā)明的抗體具有包含由下式表示的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域FR1畫CDRH1誦FR2-CDRH2-FR3國CDRH3陽FR4，其中"FR1-4"表示4個(gè)框架區(qū)而"CDRHl-3"表示抗-鞘脂抗體可變重鏈結(jié)構(gòu)域的3個(gè)高變區(qū)。FR1-4可以來源于如在以下實(shí)施例中的"共有序列，，(例如，人類免疫J求蛋白重鏈或輕鏈種類、亞類或亞群的最常見氨基酸)，或者可以來源于單個(gè)人類抗體框架區(qū)或來源于不同框架區(qū)序列的組合。許多人類抗體框架區(qū)序列例如由以上的Kabat等編序。在一個(gè)實(shí)施方式中，可變重鏈FR是由上述Kabat等編序的人類免疫球蛋白亞群的共有序列。優(yōu)選地，人類免疫球蛋白亞群是人重鏈亞群III(例如，如SEQIDNO:16中的)。84人類可變重鏈FR序列優(yōu)選地其中具有一個(gè)或多個(gè)替換，例如，其中人類FR殘基被相應(yīng)的非人殘基取代(通過"相應(yīng)的非人殘基"是指當(dāng)人類和非人序列對(duì)齊時(shí)，具有與感興趣的人類殘基相同的Kabat位置編號(hào)的非人殘基)，但利用非人殘基的取代不是必需的。例如，不同于相應(yīng)的非人殘基取代FR殘基可以通過噬菌體展示加以選擇。示例性的可以替換的可變重鏈FR殘基包括FR殘基號(hào)37H,49H,67H，69H，71H，73H,75H,76H,78H，以及94H(這里采用Kabat殘基編號(hào))中的一個(gè)或多個(gè)。優(yōu)選地，這些殘基中的至少兩個(gè)、或至少三個(gè)、或至少四個(gè)^皮替換。FR替換的一個(gè)特別優(yōu)選的組合是49H,69H,71H,73H，76H，78H,以及94H。對(duì)于重鏈高變區(qū)，這些優(yōu)選地具有在以下表2中列出的氨基酸序列。列的45鏈可變結(jié)構(gòu)i或FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4，其中"FRl-4"表示4個(gè)框架區(qū)而"CDRLl-3"表示抗-鞘脂抗體可變重《連結(jié)構(gòu)域的3個(gè)高變區(qū)。FR1-4可以來源于如在以下實(shí)施例中的"共有序列"(例如，人類免疫J求蛋白重鏈或輕鏈種類、亞類或亞組的最常見氨基酸)，或者可以來源于單個(gè)人類抗體沖醫(yī)架區(qū)或來源于不同框架區(qū)序列的組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可變輕FR由人類免疫球蛋白亞組的共有序列提供，如由以上的Kabat等編序的。優(yōu)選地，人類免疫球蛋白亞群是人K輕鏈亞群I(例如，如SEQIDNO:17中的)。人類可變輕FR序列優(yōu)選地其中具有^^^,例如，其中人類FR殘基被相應(yīng)的小鼠殘基取代，但利用非人殘基的取代不是必需的。例如，不同于相應(yīng)的非人殘基的取代殘基可以通過噬菌體展示加以選才奪。示例性的可以取代的可變輕FR殘基包括FR殘基編號(hào)，包括但不限于F4、Y36、Y49、G64、S67中的任意一個(gè)或多個(gè)。對(duì)于CDR,這些優(yōu)選地具有在下表2中列出的氨基^歹'J。85用于產(chǎn)生本文中感興趣的人源化抗-鞘脂抗體的方法在下文更i羊纟田；也4苗述。A.抗體制備用于人源化非人抗-鞘脂抗體以及產(chǎn)生抗-鞘脂抗體的變體的方法在以下實(shí)施例中描述。為了使抗-鞘脂抗體人源化，制備非人抗體起始材料。在要產(chǎn)生變體的情況下，制備親代抗體。用于產(chǎn)生這樣的非人抗體起始材料和親代抗體的示例性技術(shù)將在以下部分進(jìn)行描述。(i)抗原制備用于生產(chǎn)抗體的鞘脂抗原可以是例如完整鞘脂或鞘脂的一部分(例如，包含"表位"的鞘脂片段)。對(duì)于產(chǎn)生抗體有用的其他形式的抗原對(duì)于本領(lǐng)域4支術(shù)人員是顯而易見的。用于產(chǎn)生抗體的鞘脂抗原在以下實(shí)施例中描述。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是鞘脂的一種4汙生形式，并且可以與載體蛋白相連。(ii)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而在動(dòng)物中產(chǎn)生。有用的是，將相關(guān)抗原結(jié)合到在待免疫化的物種中是免疫原性的蛋白，例如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，利用雙功能基團(tuán)或衍生試劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰基磺?；牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R/N-C-NR,其中R和R^是不同的烷基基團(tuán)。通過將例:^100(xg或5(ig的蛋白或結(jié)合物(分別用于兔或小鼠)與三體積的弗氏佐劑混合并在多個(gè)部^f立皮內(nèi)注射該溶液，將動(dòng)物針對(duì)所述抗原、免疫原性結(jié)合物、或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月之后，動(dòng)物用0.10.2倍原始量的在弗氏佐劑中的蛋白或結(jié)合物通過在多個(gè)部位皮下注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7至14天之后，動(dòng)物i文血并測(cè)定血清的抗體效價(jià)。動(dòng)物加強(qiáng)免疫直至效價(jià)穩(wěn)定。優(yōu)選地，動(dòng)物利用相同抗原的結(jié)合物(conjugate),^f旦結(jié)合于不同蛋白和/或通過不同交聯(lián)劑的結(jié)合物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。結(jié)合物也可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制成蛋白融合體。而且，諸如白礬的聚集劑可以合適地用來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。(iii)單克隆抗體單克隆4元體可以利用首次由Kohler,etal.，Nature,256:495(1975)描述的雜交瘤方法，或者通過其他合適方法包括通過重組DNA方法(參見例如美國專利No.4,816,567)制得。在雜交瘤方法中，小鼠或其他恰當(dāng)宿主動(dòng)物，如倉鼠或獼浙吳如上文所述進(jìn)4亍免疫，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合用于免疫的蛋白的抗體的淋巴細(xì)胞?？商鎿Q地，淋巴細(xì)胞可以體外進(jìn)行免疫。然后利用合適融合劑如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。由此制得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行接種并在合適培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基優(yōu)選地包含抑制未融合的親^骨髓瘤細(xì)力包的生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶-次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨基喋呤、和胸苷(HAT介質(zhì))，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是指那些有效融合、支持^皮選的抗體生成細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定地高水平生產(chǎn)抗體，并且對(duì)培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基每丈87感的細(xì)胞。這之中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠類骨髓瘤系，如來源于MOP-21和M.C,ll小鼠月中瘤(可,人SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，Calif.USA獲得)、以及SP-2或X63-Ag8-653細(xì)月包(可乂人AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Md.USA獲4f)的那些細(xì)胞。人類骨髓瘤和d、鼠-人異種骨髓瘤細(xì)胞系也已描述用于生產(chǎn)人類單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur，etal"MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987》。其中雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基對(duì)于針對(duì)抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選地，通過雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或酮體外結(jié)合測(cè)定，如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)4于確定。單克隆4元體的結(jié)合親和力可以例如通過Munson,etal.,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析力。以確定。在鑒定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生具有期望特異性、親和力、和/或活性的抗體之后，該克隆體可以通過有限稀釋方法進(jìn)行亞克隆分類并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長(zhǎng)(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103(AcademicPress,1986))。用于這個(gè)目的的合適i咅養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物體內(nèi)作為腹水腫瘤生長(zhǎng)。通過亞克隆體分泌的單克隆抗體^皮合適地/人i咅養(yǎng)基、腹水流體、或血清中通過傳統(tǒng)免疫球蛋白純化程序，例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石色譜法、凝膠電泳、滲析、或親和色鐠法分離。編碼單克隆抗體的DNA利用傳統(tǒng)程序(例如通過使用能夠特異性地結(jié)合編碼該單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探884十)易于分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)l包是這才羊的DNA^尤選來源。一旦分離，該DNA可以置入表達(dá)載體，其然后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞中，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。抗體的重組生產(chǎn)在以下更詳細(xì)地進(jìn)4于描述。(iv)人源化和氨基酸序列變體以下的實(shí)施例12描述了用于抗-鞘脂抗體的人源化的方法。用于人源化的一般方法例如描述在US5861155、US19960652558、US6479284、US20000660169、US6407213、US19930146206、US6639055、US20000705686、US6500931、US19950435516、US5530101、US5585089、US19950477728、US5693761、US19950474040、US5693762、US19950487200、US6180370、US19950484537、US2003229208、US20030389155、US5714350、US19950372262、US6350861、US19970862871、US5777085、US19950458516、US5834597、US19960656586、US5882644、US19960621751、US5932448、US19910801798、US6013256、US19970934841、US6129914、US19950397411、US6210671、US6329511、US19990450520、US2003166871、US20020078757、US5225539、US19910782717、US6548640、US19950452462、US5624821、以及US19950479752中。在某些實(shí)施方式中，可能期望產(chǎn)生這些人源化抗體的氨基酸序列變體，特別是在這些變體改進(jìn)該人源化抗體的結(jié)合親和力或其他生物學(xué)性能的情況下。實(shí)施例12描述了用于產(chǎn)生相對(duì)于親代抗體具有增強(qiáng)親和力的抗-鞘脂抗體的氨基酸序列變體的方法。抗-鞘脂抗體的氨基酸序列變體通過將恰當(dāng)核苦酸變化引入到抗-鞘脂抗體DNA中、或者通過肽合成而進(jìn)行制備。這樣的變體包括例如本文實(shí)施例的抗-鞘脂抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基的在夬失、和89/或插入和/或替代。缺失、插入和替代的任意組合可以達(dá)到最終的構(gòu)建體，-假定最終構(gòu)建體具有期望的特性。氨基酸變化還可以改變?nèi)嗽椿蜃儺惪?鞘脂抗體的翻譯后過程，如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量或位置。用于鑒定抗-鞘脂抗體的某些殘基或區(qū)域(其是伊乙選的用于誘發(fā)突變的位置)的有用方法稱為"丙氨酸掃描誘變"，如由CunninghamandWellsScience,244:1081-1085(1989)所描述的。這里，輩巴殘基的一個(gè)殘基或基團(tuán)一皮鑒定(例如，帶電殘基如arg，asp，his,lys禾口glu)并被中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與鞘脂抗原的相互作用。然后，那些表明對(duì)取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過對(duì)取代位點(diǎn)f1入進(jìn)一步的或其他變體進(jìn)行細(xì)化確認(rèn)(refined)。因此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)定的，但是突變本身的特性不需要預(yù)定。例如，為了分析給定位點(diǎn)的突變性能，丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變?cè)诎忻艽a子處或區(qū)域進(jìn)行，并篩選表達(dá)具有期望活性的抗-鞘脂抗體變體。氨基酸序列插入包括長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基至包含一百個(gè)或更多殘基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合體，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括具有N-末端曱碌u氨?；鶜埢目?鞘脂抗體或融合至表位標(biāo)簽的抗體?？?鞘脂抗體分子的其他插入變體包括融合到抗-鞘脂抗體的N-或C-末端的增大抗體血清半衰期的酶或多肽。變體的另一種類型是氨基酸取代變體。在這些變體中抗體-鞘脂抗體分子中的至少一個(gè)氨基酸殘基被去除并在其4立置中插入不同的殘基。對(duì)于取代誘變最感興趣的部位包括高變區(qū)，但也考慮了FR改變。保守取代是優(yōu)選的取代。如果這樣的取代導(dǎo)致生物學(xué)活性改變，則可以引入更多實(shí)質(zhì)性改變并篩選產(chǎn)品，以下列出了占伊乙勢(shì)的"示例性，，取代，或者如參照氨基酸種類在以下進(jìn)一步描述的。90表l:示例性氨基酸殘基耳又代<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>抗體生物學(xué)性能的實(shí)質(zhì)性^修飾通過選擇取代完成，其中該取代在保持(a)替代區(qū)域中的多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如作為層狀或螺旋構(gòu)象；(b)耙部位的分子的電荷或疏水性；或(c)側(cè)鏈的體積上的作用顯著不同?；诠餐膫?cè)鏈特性天然殘基^皮分成組(1)疏水性的正亮氨酸，met,ala，val,leu,ile;(2)中'I"生親7jc'l"生的cys，ser,thr;(3)酸'l"生的asp，glu;(4)石咸'l"生的asn,gin,his,lys，arg;(5)影響鏈定位的殘基gly,pro;以及(6)芳香'l"生的trp,tyr，phe。非保守性取代(subsititution,替代)需要將一個(gè)單元從一個(gè)種類換成這些種類中的另一類。不涉及保持人源化或變體抗-鞘脂抗體的正確構(gòu)象的任〗可半胱氨酸殘基也可以替^<，以改進(jìn)該分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反地，半胱氨酸鍵可以加入到抗體以改善其穩(wěn)定性(特別是抗體是抗體片段如Fv片段的情況)。一種類型的替代變體包括替代親代抗體(例如，人源化或人類抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。一般地，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)所生這樣的替代變體的方《更方法是<吏用噬菌體展示的親和性突變。簡(jiǎn)而言之，多個(gè)高變區(qū)省fH立(例4。6-7個(gè)部4立)發(fā)生突變以在每一個(gè)部位產(chǎn)生所有可能的氨基替代。由此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式從絲狀噬菌體顆粒作為與包裝在每一個(gè)顆粒內(nèi)的M13的基因IIII產(chǎn)物的融合體展示。噬菌體展示的變體然后如本文披露的對(duì)其生物活性(例如，結(jié)合親和力)進(jìn)行篩選。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)，實(shí)施丙氨酸掃描誘變以鑒定顯著貢獻(xiàn)于抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基?？?,換地，或另外地，有利地分析抗原-抗體復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和鞘脂之間的接觸點(diǎn)。這樣的接觸殘基和相鄰殘基是用于根據(jù)本文描述的4支術(shù)進(jìn)行替代的候選。一旦產(chǎn)生這樣的變體，一組變體如本文所述進(jìn)4亍篩選，并且在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)測(cè)定中具有^尤異特性的抗體可以選4奪用于進(jìn)一步開發(fā)?？贵w氨基酸變體的另一種類型改變?cè)摽贵w的原始糖基化形式。通過改變是指缺失抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖基部分，和/或插入在該抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)?？贵w的糖基化通常是N-連接的和/或O-連接的。N-連接的是指糖基部分連接至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸92和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除了脯氨酸的任意氨基酸)是用于糖基部分部分酶促連接至天冬酰胺側(cè)鏈的最常見識(shí)別序列。因此，多肽中存在這些三肽序列任一個(gè)創(chuàng)造了潛在的糖基化位點(diǎn)。o-連接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一連接至羥氨酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸也可以一使用。糖基化位點(diǎn)插入到抗體中通過改變氨基酸序列以使其包含上述三肽序列的一個(gè)或多個(gè)(用于N-連4妄的沖唐基化部4立)可以方侵j也完成。改變也可以通過向原始抗體序列插入或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于O-連接的羰基化位點(diǎn))而制成。編碼抗-鞘脂抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)ff制備。這些方法包括i"旦不限于/人天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)或通過寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn)的)誘變的制備、PCR誘變、以及早期制得的變體或抗-鞘脂抗體的非變異形式的盒式誘變。(v)人類抗體作為人源化的一種替代方案，可以產(chǎn)生人類抗體。例如，在缺少內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生下，在免疫后可以產(chǎn)生能夠產(chǎn)生人類抗體全組成的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈接合區(qū)(Jh)基因的純合子缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。在這樣的種系突變小鼠中的人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人類抗體。參見例如Jakobovits，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551(1993);Jakobovits,etal"Nature,362:255-258(1993);Bruggermann，etal"YearinImm腸.，7:33(1993);以及美國專利No.5，591，669、5,589,369和5，545,807。人類抗體也可以來源于噬菌體展示文庫(Hoogenboom，93etal"J.Mol.Biol"227:381(1991);Marks,etal"J.Mol.Biol"222:581-597(1991);以及美國專利No.5,565,332和5,573,905)。如上所述的，人類抗體還可以通過體外活化的B細(xì)胞(參見，例如美國專利No.5,567,610和5,229,275)或者通過其他合適方法產(chǎn)生。(vi)抗體片段在某些實(shí)施方式中，人源化或變異抗-鞘脂抗體是抗體片段。已經(jīng)開發(fā)了各種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)地，這些片段經(jīng)過完整#元體的蛋白7JC解消4b而4f到(參見，例3。Morimoto,etal.,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992》andBrennan，etal"Science229:81(1985))。然而，這些片賴:5見在可以直4妄通過重纟且宿主細(xì)月包產(chǎn)生。例3口，F(xiàn)ab'-SH片4殳可以直4妄/人大腸才干菌回收并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter,etal.，Bio/Technology10:163-167(1992))。在另一實(shí)施方式中，F(xiàn)(ab')2是利用亮氨酸拉鏈GCN4形成的以促進(jìn)F(ab')2分子的組裝。才艮據(jù)另一種方法，F(xiàn)v、Fab或F(ab')2片段可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)分離。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對(duì)于熟練工作者來說是明顯的。(vii)多特異性抗體在一些實(shí)施方式中，可以期望產(chǎn)生多特異性(例如，雙特異性)人源化或變異抗-鞘脂抗體，其對(duì)至少兩個(gè)不同的表位具有結(jié)合特異性。示例性雙特異性抗體可以結(jié)合至鞘脂的兩個(gè)不同表位?？商鎿Q地，抗-鞘脂臂可以與結(jié)合不同分子的臂組合。雙特異性抗體可以制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片革殳(例如F(ab')2雙特異性抗體)。#4居用于制備雙特異性抗體的另一種方法，一對(duì)抗體分子之間的界面可以進(jìn)行改造以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包含至少抗體恒定結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域的一94部分。在這種方法中，來自第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈^皮更大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替代。與該大側(cè)鏈相同或類似大小的互補(bǔ)"空穴"通過用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替代大氨基酸側(cè)鏈而在第二抗體分子的界面上形成。這提供了一種用于增大異二聚體而不是其他不希望終產(chǎn)物如同二聚體的產(chǎn)率的才幾制。參見例如美國專利No.5,731,168。雙特異性抗體包括交耳關(guān)或"異質(zhì)輒合(heteroconjugate)"抗體。例如，異源結(jié)合物中的抗體之一可以偶耳關(guān)于抗生物素蛋白，其<也偶聯(lián)于生物素。異源結(jié)合抗體可以利用任何便利的交聯(lián)方法制得。合適的交耳關(guān)劑在本領(lǐng)i或是熟知的，并在例如美國專利No.4,676,980中披露，其中還有大量的交聯(lián)技術(shù)。用于/人抗體片萃殳產(chǎn)生雙特異性抗體的l支術(shù)在文獻(xiàn)中已描述。例如，雙特異性抗體可以利用化學(xué)4定接進(jìn)行制備。Brennan,etal.,Science229:81(1985)描述了一種方法，其中完整抗體^皮蛋白水解地切割以產(chǎn)生F(ab')2片段。這些片段在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉存在下,皮還原，以4吏鄰近的二石克醇穩(wěn)、定并防止分子內(nèi)二錄b化物形成。產(chǎn)生的Fab'片萃殳然后轉(zhuǎn)成碌u代硝基苯甲酸(TNB)4汙生物。Fab，-TNB衍生物之一接著通過利用巰基乙胺還原而再轉(zhuǎn)化成Fab，-石克醇，并與等摩爾量的其他Fab，-TNB彩f生物混合以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可以用作用于酶選擇性固定化的試劑。在又一個(gè)實(shí)施方式中，直接從大腸桿菌回收的Fab，-SH片段可以在體外化學(xué)偶耳關(guān)乂人而形成雙特異性抗體。Shalaby,etal.,J.Exp.Med.175:217-225(1992)。也已經(jīng)描述了用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。例如，雙特異性抗體利用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生。Kostelny,etal.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合而連接至兩個(gè)不同抗體的Fab'95部分?？贵w同二聚體在4交鏈區(qū)^皮還原以形成單體，然后再氧化以形成抗體異二聚體。這種方法可以用于抗體同二聚體的產(chǎn)生。由Hollinger,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的"雙特異抗體"技術(shù)提供了用于制備雙特異性抗體片段的一種可選捧機(jī)制。這些片段包含通過連接區(qū)連接于輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH),其中該連接區(qū)太短而不允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)。因此，一個(gè)片,殳的Vh和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片萃殳的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合部位。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一方法。參見例3口Gruber,etal.，J.Immunol.152:5368(1994)?？商鎿Q地，雙特異性抗體可以是"線性抗體，，，如在例如Zapata，etal.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中所述產(chǎn)生的。還考慮了具有多于兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tuttetal.，J.Immunol.147:60(1991)。每一個(gè)臂或其片段包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部位的本發(fā)明抗體(或聚合物或多肽)在本文中將稱為"多價(jià)"抗體。例如，本發(fā)明的"二價(jià)"抗體每個(gè)Fab或其片段包含兩個(gè)結(jié)合部位，而本發(fā)明的"三價(jià)"多肽每個(gè)Fab或其片段包含三個(gè)結(jié)合部位。在本發(fā)明的一種多價(jià)聚合物中，每個(gè)Fab的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合部4立可以結(jié)合至相同或不同抗原。例如，本發(fā)明多價(jià)多肽中的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合部位可以針對(duì)相同抗原，例如針對(duì)所述抗原的相同部分或表位，或者針對(duì)所述抗原的兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同部分或表4立；和/或可以4十只寸不同抗^原；或它們的組合。因此，本發(fā)明的二^f介多肽例如可以包含兩個(gè)相同的結(jié)合部位，可以包含針對(duì)抗原第一部分或表位的第一結(jié)合部位以及針對(duì)所述抗原相同部分或表位或者針對(duì)所述抗原另一部分或表位的第二結(jié)合部位；或者可以包含針對(duì)抗原第一部分或表位的第一結(jié)合部位以及針對(duì)不同抗原的第二結(jié)合部位。然而，如根據(jù)上文96描述將清楚的，，本發(fā)明并不局限于此，意思就是本發(fā)明的多價(jià)多肽可以包含任何數(shù)量的針對(duì)相同或不同抗原的結(jié)合部位。每個(gè)Fab或其片段包含至少兩個(gè)結(jié)合部位的本發(fā)明抗體(或聚合物或多肽)，其中至少一個(gè)結(jié)合部位針對(duì)第一抗原并且第二結(jié)合部位針對(duì)不同于該第一抗原的第二抗原，也將稱為"多特異性的"。因此，"雙特異性"聚合物包含至少一個(gè)4f對(duì)第一抗原的部^f立以及至少一個(gè)針對(duì)第二抗原的第二部位，而"三特異性，，聚合物包含至少一個(gè)針對(duì)第一抗原的結(jié)合部位、至少一個(gè)針對(duì)第二抗原的另一結(jié)合部位、以及至少一個(gè)針對(duì)第三抗原的另一結(jié)合部位等。因此，以它們最簡(jiǎn)單的形式，本發(fā)明的雙特異性多肽是本發(fā)明的二價(jià)多肽(每個(gè)Fab)。然而，如才艮據(jù)上文描述將清楚的，本發(fā)明并不局限于此，意思就是本發(fā)明的多特異性多肽可以包含任何數(shù)量的針對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)不同抗原的結(jié)合部位。(viii)其他^f奮飾考慮了人源化或變異抗-鞘脂抗體的其他修飾。例如，本發(fā)明還涉及免疫結(jié)合物，其包含結(jié)合至細(xì)胞毒性劑如毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶促活性毒素或其片段)、或放射性同位素(例如放射結(jié)合物)的本文所述的抗體。結(jié)合物利用各種雙官能蛋白偶聯(lián)劑制得，如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡咬基二硫醇)丙酸酯(鹽)(SPDP)、亞氨基石克烷(IT)、亞酰胺酯的雙官能4汙生物(如己二亞胺二甲酯(HCL)、活性酯(如辛二酸琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙疊氮基化合物(如雙(對(duì)疊氮基苯甲?；?己二胺)、雙-二重氮鹽衍生物(如雙-(對(duì)二重氮基苯曱?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如亞千基2,6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。97本文中4皮露的抗-鞘脂抗體還可以配制成免疫脂質(zhì)體。包含該抗體的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)i或已知的方法進(jìn)4亍制備，如在Epsteinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang,etal"Pro"NatlAcad.Sci.USA77:4030(1980);以及美國專利No.4,485,045和4，544，545中描述的那些方法。具有增強(qiáng)循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體4皮露于美國專利No.5,013,556。例如，月旨質(zhì)體可以通過反相蒸發(fā)方法利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過限定孔尺寸的過濾器擠出以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab，片^爻可以經(jīng)過二石克化物互換反應(yīng)而結(jié)合至如在Martin，etal.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中描述的脂質(zhì)體。另一活性組分可選地包含在該脂質(zhì)體中。酶或其他多肽可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)如利用上述的異源雙官能交聯(lián)劑而共價(jià)地4建接至抗-鞘脂抗體?？商鎿Q地，至少包含本發(fā)明抗體(連^f妄于本發(fā)明酶的至少一個(gè)功能活性部分)的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白可以利用本領(lǐng)域熟知的重組DNA4支術(shù)進(jìn)4亍構(gòu)建(參見，例如Neuberger,etal"Nature312:604-608(1984))。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可以期望使用抗體片段而不是完整抗體，以增大例如耙組織和細(xì)月包的;參透性。在這種情況下，可以期望修飾該抗體片段以便增大其血清半衰期。這可以通過例如將補(bǔ);故受體(salvagereceptor)結(jié)合表^f立整合到抗體片革殳(例如通過抗體片段中的恰當(dāng)區(qū)域的突變或者通過將表位整合到肽標(biāo)簽中，肽標(biāo)簽隨后在抗體片段的任一端或中間融合至抗體片段，例如通過DNA或肽合成)而實(shí)現(xiàn)。參見，例如美國專利No.6,096,871。人源化或變異抗-鞘脂抗體的共價(jià)々務(wù)飾也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。它們可以通過化學(xué)合成或通過抗體的酶促或化學(xué)切割(如果可采用)而制成。抗體其他類型的共價(jià)修飾通過使抗體的靶向氨基酸殘基與能夠和所選側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化試劑98反應(yīng)而引入該分子。多肽的示例性共^H務(wù)飾描述于美國專利No.5,534,615中，特別將其通過引用結(jié)合于本文?？贵w的一種優(yōu)選共價(jià)修飾包括將抗體連接至各種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧^f匕烯，并以在美國專利No.4，640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4，791，192或4,179,337中才是出的方式進(jìn)行。B.載體、宿主細(xì)力包和重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了分離的編碼人源化或變異抗-鞘脂抗體的核酸、包含該核酸的載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生抗體的重組技術(shù)。對(duì)于抗體的重組生產(chǎn)，編碼其的核酸可以分離并插入到用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或用于表達(dá)的可復(fù)制載體中。在另一實(shí)施方式中，抗體可以通過同源性重組例如在美國專利No.5,204,244中描述的進(jìn)4亍生產(chǎn)。編石馬單克隆4元體的DNA利用傳統(tǒng)禾呈序(例如通過使用能夠特異性地結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)而易于分離和測(cè)序?？梢垣@得許多載體。載體成分一般包括寸旦不限于以下中的一個(gè)或多個(gè)^言號(hào)肽序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄終止序列，例如在美國專利No.5,534,615中4苗述的。用于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的合適宿主細(xì)胞是如上所述的原核生物、酵母或更高級(jí)真核生物細(xì)l包。用于該目的的合適原核生物包4舌真細(xì)菌(eubacteria)，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科，如埃希氏菌，例如大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，克雷伯菌屬，變形桿菌屬、沙門氏菌屬，例如鼠傷寒沙門氏菌，沙、雷菌屬，1"列^口津占質(zhì)沙、雷菌(Serratiamarcescans)，和志、賀菌屬，以及桿菌，如枯草桿菌和蘚樣芽胞桿菌(例如蘚樣芽胞桿菌41P),假單胞菌屬如銅綠假單胞菌，和鏈霉菌屬。一種優(yōu)選的大腸桿菌克99隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446),盡管其他菌林如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些實(shí)例是舉例說明性的而不是限制性的。除了原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母是用于抗-鞘脂抗體編石馬載體的合適克隆或表達(dá)宿主。在^[氐級(jí)真核宿主樣i生物中，最常使用的是釀酒酵母菌或普通面包酵母。然而，大量其他屬、種和^^常?？色@得并且在本文中有用，如裂殖酵母菌絲；克魯維酵母屬宿主例如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(ATCC16,045)，K.wickeramii(ATCC24，178)、克魯雄酵母(ATCC56,500)、嗜露酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、以及馬克思克魯維酵母(K.marxianus);子嚢菌酵母屬(EP402,226);畢赤氏酵母(EP183,070);念i朱菌屬；里氏木菌(Trichodermareesia)(EP244,234);粗壽造鏈孢霉；許旺酵母屬如西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis);以及絲a犬真菌例如鏈3包霉屬，青霉屬，彎頸霉(Tolypocladium)、以及曲霉菌屬宿主如構(gòu)巢曲霉菌和黑曲霉。用于糖基化抗-鞘脂抗體的表達(dá)的合適宿主細(xì)胞來源于多細(xì)胞生物體。無脊推動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。大量桿狀病毒(baculoviral)林和變體以及來自宿主如草地貪夜蛾(毛毛蟲)、埃及^f尹蚊(蚊子)、白紋〗尹蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)、以及家蠶的相應(yīng)允許的昆蟲宿主細(xì)胞已被鑒定。各種用于轉(zhuǎn)染的病毒抹可7>開獲得，例如苜蓿4艮紋夜蛾核型多角體病毒NPV的L-l變體和家蠶NPV的Bm-54朱，并且這樣的病毒在本文中可以用作才艮據(jù)本發(fā)明的病毒，特別是用于草地貪夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽?；ā⒎押蜔煵菀部捎米魉拗?。然而，最大的興趣在于脊推動(dòng)物細(xì)胞，并且培養(yǎng)物(組織培養(yǎng)物)中的脊#*動(dòng)物細(xì)月包的增殖已經(jīng)成為常規(guī)4呈序。有用的哺乳動(dòng)物100宿主細(xì)胞系的實(shí)例是通過SV40(COS-7,ATCCCRL1651)轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系；人類胚胎腎系(293或293細(xì)胞，亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，Graham，etal.，J.GenVirol.36:59(1977));嬰倉鼠腎細(xì)胞(BHK,ATCCCCL10);中華倉鼠卵細(xì)胞/-0亞11(CHO,Urlaub,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠睪丸支持細(xì)月包(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CVlATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)月包(HELA,ATCCCCL2);犬腎細(xì)月包(MDCK,ATCCCCL34);布法羅大鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(H印G2,HB8065);小鼠乳房瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細(xì)l包(Mather，etal.,AnnalsN.^^.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5纟田月包；FS4纟田月包；以及人肝細(xì)胞瘤細(xì)月包系(HepG2)。宿主細(xì)胞用上述用于抗-鞘脂抗體產(chǎn)生的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化并在作為對(duì)于誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼期望序列的基因合適的修飾的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。用來生產(chǎn)本發(fā)明的抗-鞘脂抗體的宿主細(xì)胞可以在各種介質(zhì)中培養(yǎng)。商業(yè)可獲得的介質(zhì)如Ham'sF10(Sigma)、最小必需培養(yǎng)基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、以及達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基((DMEM),Sigma)適合用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另夕卜，在Ham,etal"Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes,etal.，Anal.Biochem.102:255(1980)、美國專利No.4，767，704;4，657，866;4，927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;美國專利Re.30,985中描述的任何介質(zhì)可以用作用于宿主細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)。這些介質(zhì)中的任一種可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其他生長(zhǎng)因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、或上皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、^:和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如&袈苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以毫摩爾范圍的終濃度存在的無才幾化101合物)、以及葡萄糖或等價(jià)能量源。也可以包括恰當(dāng)濃度的任何其他必需的補(bǔ)充物，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是之前所選的用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，抗體可以在細(xì)胞內(nèi)、壁膜間隙中生產(chǎn)，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果是細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)抗體，作為第一步，分離特定的；爭(zhēng)片，宿主細(xì)"包或溶解的片^a，例如通過離心或超濾。Carter,etal.,Bio/Technology10:163-167(1992)描述了一種用于分離分泌到大腸4干菌壁力莫間隙中的抗體的禾呈序。簡(jiǎn)而言之，細(xì)月包漿體在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA、和苯基甲基石黃?；?PMSF)存在下解凍約30min。細(xì)胞碎片可以通過離心分離出來。在抗體分泌到培養(yǎng)基中的情況下，來自這樣的表達(dá)系統(tǒng)的上清液一般首先利用商業(yè)上可獲得的蛋白濃度過濾器例如Amicon或MilliporePellicon超濾裝置進(jìn)4亍濃縮。蛋白酶才中制劑如PMSF可以包4舌在前述步艱i的4壬一個(gè)中以抑制蛋白水解，并且也可以包括r抗生素以防止偶然性污染物的生長(zhǎng)。從所述細(xì)胞制得的抗體組合物可以利用例如羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、滲析、以及親和性色譜進(jìn)行純化，其中親和性色譜是優(yōu)選的提純技術(shù)。作為親和配體的蛋白A的合適性依賴于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可以用來純^f匕基于人類重鏈的l元體(Lindmark，etal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和用于人類(Guss，etal.，EMBOJ.5:15671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)最經(jīng)常是瓊脂糖，但其他基質(zhì)也可利用。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)如受控有孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯比利用瓊脂糖能夠?qū)崿F(xiàn)更快的流動(dòng)速度和更短的力口工時(shí)間。在包含Cm3結(jié)構(gòu)域的抗體的情況下，BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg,N丄)可以用于純化。用于蛋白純化的其他4支術(shù)，如在離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅102膠上的層析、肝素SEPHAROSETM上層析、陽離子或陰離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上層析、色譜聚焦、SDS-PAGE、以及也可以才艮據(jù)要回收的抗體利用石克酸銨沉淀。任何初步純化步驟之后，包含感興趣抗體和污染物的混合物可以經(jīng)受低pH疏水性相互作用色譜，使用pH在約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下實(shí)施。C.藥物制劑本發(fā)明的抗體或免疫源性部分的治療用制劑通過混合具有期望純度的抗體與可選的生理上可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(參見，侈寸^口Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol，A.Ed.(1980))制備并儲(chǔ)存，以凍干制劑或含水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑型和濃度下對(duì)受體沒有毒性，并且包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二曱基千基氯化銨；六曱銨；殺藻胺；千索氯銨；苯酚；丁醇或千醇；烷基苯曱酸酯類如苯曱酉臾甲酯或苯曱酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯基吡p各烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸；單糖，二糖，或其他糖類包括葡萄糖，山梨糖醇，或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗4軒離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN11^,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文中的制劑還可以包含如只t于治療的4爭(zhēng)定病4正所需的多于一種的活性化合物，優(yōu)選地具有不會(huì);f皮此不利地互相影響的具有互103補(bǔ)活性的活性化合物。這樣的分子合適地以對(duì)于預(yù)計(jì)目的有效的量組合存在。活性成分還可以包括在例如通過凝聚4支術(shù)或通過表面聚合制備的樣i月交嚢中，例如分別在月交態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白孩"求體，《效乳液，納米粒子和納米月交嚢)中或在粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠-微膠嚢以及聚-(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢中。這樣的技術(shù)披露于Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed.(1980)。要用于體內(nèi)給藥的制劑必需是消毒的。這易于實(shí)現(xiàn)例如通過無菌過濾月莫過濾?？梢灾苽渚忈屩苿＞忈屩苿┑暮线m實(shí)例包括包含抗體的固體疏水聚合物的半滲透性基質(zhì)，該基質(zhì)為成型制品例如膜、或微膠嚢形式。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利No.3，773，919)、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷酰胺的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LupronDepot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)、以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物如乙烯-醋酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠使分子釋放超過100天，但是某些水凝膠在更短時(shí)間期內(nèi)釋放蛋白。當(dāng)包封的抗體在體內(nèi)保持長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，由于暴露于37。C下的濕度，它們可能變性或聚集，導(dǎo)致失去生物活性或免疫原性的可能變化。合理的方法是可以根據(jù)涉及的機(jī)制設(shè)計(jì)穩(wěn)定的方法。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制為通過硫-二硫化物交換的分子間S-S鍵形成，則穩(wěn)定化可以通過修飾巰基殘基而實(shí)現(xiàn)，從酸性溶液凍干，控制濕度，使用恰當(dāng)添加劑，以及開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物。D.抗體的非治療性應(yīng)用104本發(fā)明的抗體可以用作親和性純化試劑。在這個(gè)過程中，抗體使用本領(lǐng)域熟知的方法被固定至固體相如Sephadex樹脂或?yàn)V紙上。固定的抗體與包含待純化的鞘脂進(jìn)行接觸，之后用合適溶劑洗脫支持物，這將基本上除去樣品中的所有材料，除了鞘脂，其結(jié)合于固定的抗體。最后，支持物用另一種合適溶劑如甘氨酸緩沖液，例如在pH3pH5.0之間進(jìn)行清洗，這將從抗體釋》文鞘脂。抗-鞘脂抗體在對(duì)于鞘脂的診斷測(cè)定中也是有用的，例如檢測(cè)其在特定細(xì)月包、組織(如活組織樣品)、或體液中的表達(dá)。這樣的it斷方法在心血管或月畝血管疾病或紊舌L中可以是有用的。對(duì)于i貪斷應(yīng)用，抗體通常用可才全測(cè)部分加以標(biāo)i己。多種標(biāo)記可以利用，其可以總體分成以下種類(a)放射同位素，如"S,"C,1251,&和1311?？贵w可以使用如在例如CurrentProtocolsinImmunology,Volumes1and2,Coligenetal.，Ed.Wiley-Interscience,NewYork,N.Y"Pubs,(1991)中4葛述l支術(shù)用》文射同位素標(biāo)記，并且》文射活性可以利用閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)4亍^r測(cè)。(b)熒光標(biāo)記如稀土螯合物(銪螯合物)或焚光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰酰(dansyl)、麗絲胺(lissamine)、藻紅蛋白和德克薩斯紅是可利用的。熒光標(biāo)記可以4吏用在例如CurrentProtocolsinImmunology,supra中4皮露的#支術(shù)結(jié)合至4元體。熒光可以利用熒光計(jì)進(jìn)4于定量。(c)可利用各種酶-底物標(biāo)記物。例如，美國專利No.4,275,149提供這些中的一部分綜述。酶通常催化可利用各種技術(shù)檢測(cè)的生色底物的4b學(xué)改變。例如，酶可以4lMt底物的顏色改變，這可用分光光度計(jì)4企測(cè)?？蒦^才灸地，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。用于量化熒光改變的沖支術(shù)如上所述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)激發(fā)電105子，然后可以發(fā)出可以進(jìn)行檢測(cè)(例如利用化學(xué)發(fā)光計(jì))的光或向熒光受體貢獻(xiàn)的能量。酶促標(biāo)記物的實(shí)例包括焚光素酶(例如，熒火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利No.4,737,456)、熒光素、2,3-二氫酞。秦二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-石粦酸脫氬酶)、雜環(huán)氧化酶(heterocyclicoxidases)(如尿酸酶和黃噤p令氧化酶)、乳過氧化物酶(lactoperoxidase)、孩吏過氧化物酶(microperoxidase)等。用于將酶結(jié)合至抗體的#支術(shù)描述于O'Sullivan,etal.,MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,inMethodsinEnzym.(edJ.Langone&H.VanVunakis)，Academicpress,NewYork,73:147-166(1981)。酶-底物組合的實(shí)例包括，例如(i)以過氧化氫酶作為底物的辣才艮過氧化物酶(HRPO),其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3'，5,5'-四曱基耳關(guān)苯胺化鹽酸(TMB));(ii)以對(duì)硝基苯基磷酸作為生色底物的堿性磷酸酶(AP);以及(iii)(3-D-半乳糖苷酶(p-D-Gal)與生色底物(例如對(duì)硝基苯基|3-D-半乳糖苷酶)或熒光底物4-曱基傘形酮P-D-半乳糖苷酶。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，大量其他酶-底物組合可以利用。對(duì)于這些一般性綜述，參見美國專利No.4,275,149和4,318,980。有時(shí)，標(biāo)記物間沖妄地與抗體結(jié)合。技術(shù)人員就會(huì)注意到用于實(shí)現(xiàn)此目的的各種技術(shù)。例如，抗體可以與生物素結(jié)合，并且上述三種寬類別的標(biāo)記物中的4壬一種可以與抗生物素蛋白結(jié)合，或反之亦然。生物素選4奪性地結(jié)合于抗生物素蛋白，因而，標(biāo)記物可以以這106種間接方式與抗體結(jié)合?？商鎿Q地，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接結(jié)合，將抗體與小半抗原(例如地高辛)結(jié)合并且上述不同標(biāo)記物之一與抗-半抗原抗體(例如抗-地高辛抗體)結(jié)合。由此，可實(shí)J見標(biāo)記物與抗體的間接結(jié)合。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，抗-鞘脂抗體不需要進(jìn)4亍標(biāo)記，并且其存在可以利用標(biāo)記的抗體(其結(jié)合抗-鞘脂抗體)進(jìn)行沖全測(cè)。本發(fā)明的抗體可以在任何已知方法中采用，如竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定、直4妻和間4妄夾心測(cè)定、以及免疫;兄淀測(cè)定。參見例如Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158(CRCPress,Inc.1987)。竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與試驗(yàn)樣品分析物對(duì)有限量抗體的結(jié)合的能力。試-驗(yàn)樣品中鞘脂的量與已結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了有利于確定已結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，抗體通常在竟?fàn)幹盎蛑笫遣豢扇艿?，以使結(jié)合于抗體的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物可以方侵j也乂人仍然未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分一斤物分離。夾心測(cè)定涉及使用兩種抗體，每一種能夠結(jié)合至待纟企測(cè)蛋白的不同免疫原性部分、或表位。在夾心測(cè)定中，試驗(yàn)樣品分析物由固定在固定支持物上的第一載體結(jié)合，之后第二抗體結(jié)合至分析物，由此形成不溶的三部分復(fù)合體。參見例如美國專利No.4,376,110。第二抗體本身可以用可^r測(cè)部分標(biāo)記(直接夾心測(cè)定)或者可以利用可4全測(cè)部分標(biāo)記的抗-免疫球蛋白抗體進(jìn)行才企測(cè)(間接夾心測(cè)定)。例如，一種類型的夾心測(cè)定是ELISA測(cè)定，在這種情況下可檢測(cè)部分是酶。對(duì)于免疫組織化學(xué)，血液或組織才羊品可以是新鮮或冷凍的，或者可以i里入石蠟并用防腐劑例如福爾馬4木固定。107抗體還可以用于體內(nèi)診斷測(cè)定。一般地，抗體用放射性核素(如mIn，"Tc，14C,131I,125I，3H,32p，或35S)標(biāo)記以使結(jié)合的靶分子可以利用免疫閃爍顯^f象加以定位。E.it斷纟式劑盒為了方便，本發(fā)明的抗體可以提供在試劑盒中，例如一個(gè)包括預(yù)定量的試劑和用于實(shí)施診斷測(cè)定的說明書的包裝組合。在抗體用酶標(biāo)記的情況下，試劑盒將包括該酶所需的底物和輔助因子(例3口才是供可才企測(cè)發(fā)色團(tuán)或焚光團(tuán)的底物前體)。例》口，可以包4舌其^f也添加劑，如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封閉緩沖劑或溶解/裂解緩沖劑)等。各種試劑的相對(duì)量可以廣泛地變化以提供試劑在溶液中的各種濃度，其實(shí)質(zhì)上優(yōu)化測(cè)定的靈敏度。特別地，試劑可以作為干燥粉末提供，通常凍干的，包括溶解后提供具有恰當(dāng)濃度的試劑溶液的賦形劑。R4元體的治療性用途對(duì)于治療應(yīng)用，本發(fā)明的抗-鞘脂抗體以上述的藥用劑量形式給予哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類，包括可以靜脈內(nèi)作為4,注劑或通過在一定時(shí)期內(nèi)的連續(xù)灌注、通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、動(dòng)脈內(nèi)、滑月莫內(nèi)、鞘內(nèi)、口月良、局部或吸入途徑給予人類。對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，抗體的恰當(dāng)劑量如上所述，取決于待治療的疾病類型、疾病嚴(yán)重度和病考呈、抗體給藥是用于予貞防或治療目的、之前的治療、患者臨床病史和對(duì)抗體的反應(yīng)，以及參與醫(yī)師的判斷?？贵w合適地在一個(gè)時(shí)間或一系列治療內(nèi)給予患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重度，大約1昭/kg至約50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的才元體是用于鄉(xiāng)合藥至患者的初始^f吳選劑量，例如無i侖108是通過一次或多次分開的給藥，或者是通過連續(xù)灌注。才艮據(jù)上述因素，典型的每天或每周劑量可以在約1lag/kg至約20mg/kg或更高的范圍。對(duì)于在數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的重復(fù)給藥，沖艮據(jù)病癥，重復(fù)治療直至發(fā)生疾病癥狀按期望地被抑制。然而，其他劑量方案可以是有用的。這種治療的進(jìn)展易于通過傳統(tǒng)技術(shù)和試驗(yàn)，包括例如放射顯像進(jìn)行監(jiān)控。才艮據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，抗體在預(yù)防或治療疾病中的效力可以通過只于于這些目的有歲丈的另一{式劑-例*^匕療用#元癌藥物-連續(xù)地或組合地給予抗體而得到改進(jìn)。這樣的其他試劑可以存在于給藥的組合物中或者可以單獨(dú)給藥?？贵w合適地與其他試劑連續(xù)給藥或組合給藥。G.制品在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了包含用于治療上述紊亂的材料的制品。該制品包括容器和標(biāo)記物。合適的容器包括例如玻璃瓶、藥瓶、注射器和試管。容器可以由各種材料如玻璃或塑料制成。容器容納對(duì)治療病癥有效的組合物，并且可以具有無菌入口(例如，容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可由皮下注射針頭刺穿的塞子的藥瓶)。組合物中的活性劑是抗-鞘脂抗體。容器上或與其相關(guān)的標(biāo)^己-表明《且合物用于治療選擇的病癥。制品可以進(jìn)一步包4舌包含藥用緩沖液如磷酸鹽緩沖鹽水、林格溶液或葡聚糖溶液的第二容器?？梢赃M(jìn)一步包括從商業(yè)或使用者角度認(rèn)為期望的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器以及放入了使用說明書的包裝。本發(fā)明通過參考以下實(shí)施例將被更好地理解，這些實(shí)施例用于舉例說明，僅限制對(duì)于實(shí)施本發(fā)明已知的最佳模式。本發(fā)明的范圍不i人為局限于此。109實(shí)施例實(shí)施例1:4十對(duì)SIP的鼠類單克隆抗體(Sphingomab;LT1002)一種類型的治療用抗體特異性地結(jié)合不期望的鞘脂以實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的效果，例如(1)降低不期望的有毒鞘脂的有效濃度(和/或它們的代謝物前體的濃度)，該鞘脂促進(jìn)不期望的作用如心臟毒性、致瘤性、或生成血管的作用；(2)抑制不期望的、有毒的、致瘤的或生成血管的鞘脂與細(xì)胞受體的結(jié)合，因此，和/或降低可用于結(jié)合這樣的受體的鞘脂的濃度。這樣的治療作用的實(shí)例包括但不限于，使用抗-SlP抗體降低可利用S1P的有效體內(nèi)血清濃度，從而阻斷或至少限制S1P致瘤和血管生成作用，以及它在MI后心力衰竭、癌癥、或纖維形成疾病中的作用。合成好u醇化S1P以含有能夠?qū)1P的基本結(jié)構(gòu)特4i與載體分子如KLH交聯(lián)的反應(yīng)性基團(tuán)。在免疫之前，硫代-SlP類似物利用標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)過IOA或SMCC交聯(lián)至蛋白載體(例如KLH)而結(jié)合。SMCC是一種雜二官能團(tuán)交聯(lián)劑，其與伯胺和巰基基團(tuán)反應(yīng)，并且代表優(yōu)選的交聯(lián)劑。SwissWebster或BALB-C小鼠利用每次注射50|iig的免疫原(SMCC有利于石克醇化SIP和KLH的結(jié)合)在兩個(gè)月期間免疫4匕4次。血清才羊品在第二次、第三次和第四次免疫^R:之后兩周收集并通過直接ELISA篩選抗-SlP抗體的存在。來自顯示高效價(jià)的抗體的動(dòng)物的脾隨后用標(biāo)準(zhǔn)融合方法產(chǎn)生雜交瘤。所4尋雜交瘤生長(zhǎng)至融合，之后收集細(xì)胞上清液用于ELISA分析。在免疫的55只小鼠中，8只是良好的反應(yīng)者，表現(xiàn)出對(duì)SIP具有反應(yīng)活性的抗體的顯著血清效價(jià)。接著利用這些小鼠的脾和骨髓瘤根據(jù)已有方法實(shí)施融合。所得1500個(gè)雜交瘤然后通過直4妾ELISA篩選，產(chǎn)生287個(gè)陽性雜交瘤。在這287個(gè)雜交瘤之中，通過直接ELISA篩選，159個(gè)顯示顯著效z階。這159個(gè)雜交瘤中的每一個(gè)然后擴(kuò)展到24-孔^反中。擴(kuò)展雜交瘤的細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)然后進(jìn)行再篩選以鑒定能夠分泌感興趣的抗體的穩(wěn)定雜交瘤。在60個(gè)最高效價(jià)穩(wěn)定的雜交瘤上實(shí)施竟?fàn)幮訣LISA。在篩選的55只小鼠和幾乎1500個(gè)雜交瘤中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)雜交瘤顯示被認(rèn)為是有限稀釋克隆的性能特征，如對(duì)于最終產(chǎn)生真正單克隆抗體所需的。這個(gè)過程產(chǎn)生47個(gè)克隆體，其中大部分^皮認(rèn)為產(chǎn)生S1P抗體是陽性的。在這47個(gè)克隆體中，6個(gè)擴(kuò)展到24-孔板中并接著通過竟?fàn)幮訣LISA進(jìn)4亍篩選。從保持陽性的4個(gè)克隆體中，選才奪一個(gè)來啟動(dòng)S1P單克隆抗體的大規(guī)^莫生產(chǎn)。將這些細(xì)胞注射纟合SCID小鼠并且所得腹水經(jīng)過蛋白A純化(50%收率)并分析內(nèi)毒素水平(<3EU/mg)。對(duì)于一輪腹水生產(chǎn)，注射50只小鼠，產(chǎn)生總共125ml腹水。抗體同種型為IgGlK，并且認(rèn)為通過HPLC達(dá)到>95%純度?？贵w在具有150mM氯化鈉(pH7.2)的20mM石粦酸鈉中制備并在-70°C下儲(chǔ)存。這種抗體指定為L(zhǎng)T1002或SphingomabTM。陽性雜交瘤克隆體(稱為克隆體306D326.26)保藏在ATCC(安全保藏號(hào)SD-5362),并且代表針對(duì)SIP的第一鼠mAb。該克隆還包含可以用于產(chǎn)生"人源化"抗體變體的抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)，以及構(gòu)建嵌合抗體所需的序列信息。篩選血清和細(xì)月包上清液中的S1P特異性抗體是利用碌u醇化S1P類似物作為抗原的直4妾ELISA。如以下所述實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)ELISA,只是將50)al的沖羊品(血清或細(xì)胞上清液)用等體積的PBS/0.1°/。Tween-20(PBST)在初始孵育期間加以稀釋。ELISA在96-孔高結(jié)合ELISA板(Costar)中實(shí)施，該板用0.1pg的化學(xué)合成的好iJf化-SlP(在結(jié)合緩沖液(33.6mMNa2C03,lOOmMNaHC03;pH9.5)中結(jié)合至BSA)涂覆。硫醇化-SlP-BSA在ELISA板孔中在37°C孵育1小時(shí)，在4。C過夜。然后該4反用PBS(137mMNaCl,2.68mMKCl,10.14mMmNa2HP04,1.76mMKH2P04;pH7.4)清洗4次并在室溫下用PBST封閉lh。對(duì)于初始孵育步驟，將75iil樣品(包含4寺才企測(cè)SIP)用25pl的在PBST中稀釋的0.1|ag/mL抗-SlPmAb孵育并力o入到ELISA4反孔中。每一個(gè)樣品在三個(gè)孔實(shí)施。在室溫孵育lh之后，ELISA板用PBS清洗4次并用100pl/孔的0.1嗎/mLHRP羊抗-小鼠二級(jí)抗體在室溫下孵育lh(JacksonImmunoresearch)。然后才反用PBS清洗4次并暴露于四甲基耳關(guān)苯胺(Sigma)1-10分鐘。才企測(cè)反應(yīng)通過力口入等體積的1MH2S04而終止。沖羊品的光學(xué)密度通過在450nm處利用EL-X-800ELISA板讀數(shù)器(Bio-Tech)才企測(cè)而確定。對(duì)于交叉反應(yīng)性，如上所述實(shí)施竟?fàn)幮訣LISA，只是有以下改變。初始孵育由竟?fàn)巹?S1P，SPH、LPA等)和生物素-結(jié)合的抗-SIPmAb組成。純化的單克隆抗體的生物素化利用EZ-LinkSulfo-NHS-生物素化試劑盒(Pierce)實(shí)施。生物素整合4艮據(jù)試劑盒方法確定并且范圍在每個(gè)抗體對(duì)應(yīng)7-11個(gè)生物素分子。竟?fàn)巹┲苽淙缦轮|(zhì)原液進(jìn)4于聲處理并在氬氣下干燥，然后在DPBS/BSA[DPBS(Invitrogen14040-133)中的lmg/ml無月旨肪酸的BSA(Calbiochem)]中進(jìn)行重建。純化的抗-SlPmAb才艮據(jù)需要在PBS/0.5%TritonX-100中稀釋。竟?fàn)巹┖涂贵w溶液混合在一起4吏3份竟?fàn)巹?duì)應(yīng)1f分抗體。HRH結(jié)合的鏈霉抗生物素二級(jí)抗體(JacksonImmunoresearch)用來產(chǎn)生信號(hào)。竟?fàn)幮訣LISA數(shù)據(jù)(圖1A所示)的另一方面在于，其表明了抗-SlPmAb不能區(qū)分在竟?fàn)帉?shí)-驗(yàn)中添加的石危醇化SIP與天然SIP。還證實(shí)了該抗體不識(shí)別任何氧化產(chǎn)物，因?yàn)轭愃莆镌撛跊]有任何雙鍵的情況下構(gòu)建的。抗-SlPmAb還針對(duì)包含允許在室溫下保持48小時(shí)的雙4建的天然產(chǎn)物進(jìn)4亍測(cè)試。天然SIP的反相HPLC才艮據(jù)之前才艮道的方法實(shí)施(Deutschman,etal.(July2003),AmHeartJ.，vol.146(l):62-8),并且結(jié)果表明保留/滯留時(shí)間上沒有差別。而且，單克隆抗體與各種脂質(zhì)的結(jié)合特性的比較在圖1A中示出，表明有抗體112識(shí)別的表位不涉及天然S1P雙鍵的區(qū)域中的烴鏈。另一方面，由單克隆抗體識(shí)別的表位是包含在鞘氨醇基本骨架加上游離磷酸上的氨基醇的區(qū)域。如果游離磷酸與膽堿連接(如在SPC情況下)，然后結(jié)合會(huì)減少。如果氨基集團(tuán)被酯化成脂肪酸(如在C1P的情況下)，沒有觀察到抗體結(jié)合。如果鞘氨醇氨基醇骨架被甘油骨架取代(如在LPA的情況下)，S1P特異性單克隆沒有表現(xiàn)出結(jié)合。這些表位定位數(shù)據(jù)表明，在S1P上僅有一個(gè)表位被該單克隆抗體識(shí)別，并且該表位通過S1P的獨(dú)特才及性頭部基團(tuán)^皮限定。在利用ELISA檢測(cè)的類似實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)合適的對(duì)照材料以確保這種抗-SlP單克隆4元體不識(shí)別蛋白載體或交耳關(guān)劑。例如，正常交聯(lián):劑SMCC在將硫醇化S1P結(jié)合至作為ELISA中的涂敷材料的BSA中交換IOA。當(dāng)使用IOA時(shí)，抗體的結(jié)合特性幾乎與當(dāng)4吏用BSA-SMCC-硫醇化-SlP時(shí)相同。類似地，KLH交換作為與涂敷材料硫醇化-SlP復(fù)合的蛋白的BSA。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在抗體的結(jié)合特性上也沒有顯著差異。結(jié)合動(dòng)力學(xué)S1P與其受體或其他部分的結(jié)合動(dòng)力學(xué)傳統(tǒng)地由于脂質(zhì)的特性而一直是個(gè)問題。許多問題與脂類的不溶性相關(guān)。對(duì)于BIAcore才全測(cè)，這些問題通過直4^將S1P固定至BIAcore芯片而克服?？贵w然后在芯片表面上流過，并且檢測(cè)光學(xué)密度的改變以確定抗體與S1P的結(jié)合特性。為了避免抗體的二價(jià)結(jié)合特性，S1P以低密度涂覆到芯片上。另外地，芯片用各種密度的S1P(7、20和1000RU)涂覆，并且抗體結(jié)合數(shù)據(jù)全部擬合至1:1相互作用模型。圖2中所示的結(jié)果i正實(shí)，由于單克隆抗體與S1P在三個(gè)不同密度的S1P下的結(jié)合導(dǎo)致的光學(xué)密度改變。總的i兌來，確定單克隆抗體與S1P的親和力是非常高的，在大約88皮摩爾(pM)至99nM的范圍內(nèi)，取決于單價(jià)或二價(jià)結(jié)合模型是否用來分析結(jié)合數(shù)據(jù)。實(shí)施例2:ELISA測(cè)定1131.定量ELISA樣史滴定ELISA板(Costar，CatNo.3361)用兔抗-小鼠IgG涂覆，在37。C在1M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中稀釋F(ab，)2片段特異性抗體(Jackson,315-005-047)1h。板用PBS清洗并在37°C用PBS/BSA/Tween-20封閉lh。對(duì)于初始孵育，將非特異性小鼠IgG或人類IgG、完全分子(用于4交準(zhǔn)曲線)和待4企側(cè)樣品的稀釋液加入到孑L中。清洗板并用每孔100pi的HRP結(jié)合的羊抗-小鼠(H+L)(1:40000牙希釋)在37°C(Jackson，catNo115-035-146)孵育lh。在清洗之后，酶促反應(yīng)利用四曱基聯(lián)苯胺(Sigma,catNoT0440)4企測(cè)并通過加入1MH2S04終止。光學(xué)密度(OD)在450nm利用ThermoMultiskanEX4企測(cè)。原始^:據(jù)轉(zhuǎn)換成GraphPad專欠件用于分對(duì)斤。2.直接ELISA孩吏滴定ELISA才反(Costar，CatNo.3361)在37°C下用在1M碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中稀釋的LPA-BSA涂覆lh。板用PBS(137mMNaCl，2.68mMKC1,10.1mMNa2HP04，1.76mMKH2P04;pH7.4)清洗并在室溫下用PBS/BSA/Tween-20封閉lh或在4°C過夜。待測(cè)試的才羊品以0.4pg/mL、0.2jag/mL、0.1(ig/mL、0.05jag/mL、0.0125pg/mL和0pg/mL稀釋并向每一個(gè)孔加入100pl。清洗4反并用每孔100pi的HRP結(jié)合羊抗-小鼠(1:20,000稀釋液)(Jackson,cat.no.115-035-003)在室溫下孵育lh。在清洗之后，酶促反應(yīng)用四曱基聯(lián)苯胺(Sigma，cat.no.T0440)才企測(cè)并通過加入1MH2S04終止。光學(xué)密度(OD)在450nm利用ThermoMultiskanEX才全測(cè)。原始凄史據(jù)轉(zhuǎn)換成GraphPad軟件用于分析。3.竟?fàn)帨y(cè)定114mAb的特異性在ELISA測(cè)定中測(cè)試。樣t滴定板ELISA板(Costar,CatNo.3361)在37°C下用稀釋在1M-灰酸鹽纟爰沖液(pH9.5)的18:0LPA-BSA涂覆lh。板用PBS(137mMNaCl，2.68mMKCl，10.1mMNa2HP04,1.76mMKH2P04;pH7.4)清洗并用PBS/BSA/Tween-20在37°C下封閉lh或室溫下過夜。對(duì)于初始孵育，將0.4昭/mL抗-LPAmAb和指定量的(14:0，16:0，18:0，18:1，18:2和20:4)LPA、DSPA、18:1LPC(溶血石粦脂酰月旦石咸)、S1P、神經(jīng)酰胺和神經(jīng)酰胺-l-石壽酸加入ELISA板的孑L中并在37°C下孵育lh。清洗板并在37。C下用每孔100nl的HRP結(jié)合羊抗-小鼠(1:20,000#希釋液)(Jackson，catNo115-035-003)或HRP結(jié)合羊抗-人類(H+L)(1:50,000稀釋)(Jackson,catNol09誦035-003)孵育lh。在清;先之后，酶促反應(yīng)利用四曱基聯(lián)苯胺檢測(cè)并通過加入1MH2S04終止。光學(xué)密度(OD)在450nm利用ThermoMultiskanEX才企測(cè)。原始凄t據(jù)轉(zhuǎn)換成GraphPad軟件用于分析。實(shí)施例3:SPHINGOMAB鼠mAb對(duì)SIP是高度特異'性的竟?fàn)幮訣LISAi正實(shí)，相比于其他生物活性脂類，SPHINGOMAB對(duì)SIP的特異性。SPHINGOMABi正實(shí)對(duì)鞘氨醇(SPH)沒有交叉反應(yīng)性，鞘氨醇是S1P或溶血磷脂酸(LPA)的直接代謝前體，一種結(jié)構(gòu)和功能類似于SIP的重要胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。SPHINGOMAB不識(shí)別其他結(jié)構(gòu)上類似的脂類和代謝物，包括神經(jīng)酰艇-l-磷酸(C1P)、二氫鞘氨醇(DH-SPH)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)或鞘磷脂(SM)。SPHINGOMAB確實(shí)與二氫鞘氨醇-l-磷酸(DH-S1P)具有交叉反應(yīng)，并且在更小程度上與鞘氨醇基磷酸膽堿(SPC)交叉反應(yīng)(圖3)。實(shí)施例4:SPHINGOMAB在CNV鼠類模型中顯著減少CNV和疤痕形成雌性C57BL6/J小鼠經(jīng)歷Bruch膜的激光誘導(dǎo)石皮裂并給予在2fxl生理鹽7jc中稀釋的0.5pgSphingomab或同種型匹配的非4寺異'1"生(NS)抗體。小鼠在激光石皮裂之后14和28天殺死。為了誘導(dǎo)CNV病變，瞳孔用眼用托品酰胺(0.5%)和苯腎上腺素(2.5%)擴(kuò)散。將遮蓋片置于眼上。偶聯(lián)至狹縫燈裝置以遞送具有50nm斑點(diǎn)大小在150mW的100msec脈沖的OculightGL532nm(IridexCorporation,MountainView,CA)用來石皮裂右眼三個(gè)象P艮中的Bruch膜，在相當(dāng)于9、12和3點(diǎn)位置距離^L神經(jīng)盤大約50pm。左眼用作所有情況下的未受損對(duì)照。與蒸氣泡不相關(guān)的任何病變或融合的病變?cè)诜治鲋信懦榱藴y(cè)量CNV病變尺寸，制備鞏膜-脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體的脈絡(luò)膜平鋪片并對(duì)脈管系統(tǒng)染色(蓖麻凝集素I;紅色)和周細(xì)胞(CD140b;綠色)。數(shù)字照片利用具有RGB斑點(diǎn)高分辨率tt字照相才幾和5敫光掃描共焦顯孩"竟的表面熒光ZeissAxioplan2(BioRadMRC1024,BioRadCorporation,Temecula,CA)4乾獲。只于于體積分沖斤，使用z-系列捕獲并將整個(gè)z-系列上的病變區(qū)域的總和乘以z厚度(4|Lim)以獲4f病變體詳只。為了評(píng)價(jià)膠原沉積，鞏膜-脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體用馬森三色進(jìn)行染色。鞏膜-脈絡(luò)膜-RPE復(fù)合體埋入石蠟中，然后連續(xù)切成厚度為6毫米的切片。評(píng)價(jià)每個(gè)病變的大約30個(gè)切片。膠原沉積體積的定量以如3十于CNV病變體積描述的相同方式進(jìn)4亍計(jì)算。4甫獲的凄史字照片利用ImageJ壽欠4牛(ResearchServicesBranch,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD)形態(tài)度量i也進(jìn)4亍評(píng)1"介。圖4A示出了SPHINGOMAB顯著減弱在Bruch膜激光誘導(dǎo)破裂之后14和28天的脈絡(luò)膜新血管形成。圖4B示出了SPHINGOMAB116顯著減少與在Bruch膜激光誘導(dǎo)-皮裂之后28天CNV病變形成相關(guān)的纖維化。實(shí)施例5:SPHINGOMAB通過包括抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管形成的多種機(jī)制而4卬制新血管形成S1P促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以及基底膜和其他試驗(yàn)中的遷移，促進(jìn)乂人頭開始的體夕卜BV形成；SPHINGOMAB可以中和SIP的這些4乍用。戈口4姿照Visentinda/.(CancerCell2006Mar;9(3):225-38)所述實(shí)施實(shí)驗(yàn)。圖5A中的數(shù)據(jù)表明，接種到GF-還原的基底膜上的HUVEC在S1P存在下形成多個(gè)毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)，并且在沒有S1P或當(dāng)用SPHINGOMAB和SIP共同孵育時(shí)不能形成毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)。圖5B中的數(shù)據(jù)證實(shí)，在基底膜趨化侵襲試驗(yàn)中，O.l-lnMSlP刺激HUVEC遷移的能力高出未處理的HUVEC，或與SPHINGOMAB共孵育的HUVEC2-2.5倍?？偲饋?，這些研究"i正實(shí)，SPHINGOMAB可以有效地減輕SIP對(duì)EC的促血管形成作用。實(shí)施例6:SPHINGOMAB通過包括減輕S1P、VEGF和bFGF的體內(nèi)作用的多種才幾制而抑制新血管形成基于體內(nèi)研究表明，S1P增加內(nèi)皮毛細(xì)血管生長(zhǎng)到皮下植入的基底膜栓子中，我們推觀'JSPHINGOMAB可以減少從頭開始的體內(nèi)BV形成。為了考察這個(gè)推測(cè)，我們對(duì)新血管形成采用了體內(nèi)基底膜栓子測(cè)定。在一組實(shí)驗(yàn)中，基底膜補(bǔ)充了1jliMS1P、0.5pg/mLbFGF或l|iig/mLVEGF,然后在腹膜內(nèi)注入到小鼠(n=4)。10天之后，小鼠肝素化并用熒光凝集素、異凝集素B4-FITC(其結(jié)合至有形成生長(zhǎng)BV的血管EC表達(dá)的粘附分子)注射。然后栓子切除，在OCT中冷凍，切片并觀察FITC染色的BV。圖6A中的凝:據(jù)表明，S1P是比bFGF或VEGF更有效的體內(nèi)新血管形成的刺激劑[Lee,etal.，(1999)，BiochemBiophysResCommun，.vol264:743-50]，如通117過與包含bFGF或VEGF的栓子相比，在大量包含S1P的栓子中的FITC染色的BVi正實(shí)的。栓子的切片然后用蘇木素&署紅染色用于評(píng)價(jià)EC滲入(圖6B)。EC的滲入是新血管形成中的關(guān)鍵步驟。包含S1P的栓子相比于僅基底膜栓子具有增加3倍的EC滲入。細(xì)胞滲入假設(shè)是EC,盡管我們i人為其他細(xì)月包型如免疫細(xì)月包也可以染色。小鼠系統(tǒng)性地每48h給予SPHINGOMAB(在對(duì)全子植入先1天開始)，i正實(shí)即4吏當(dāng)SIP加入到基底膜栓子時(shí)EC滲入量也減少。這些結(jié)果證實(shí)，SPHINGOMAB抑制體內(nèi)EC滲入的能力。來自血液和周圍組織的內(nèi)源性SIP可以給傷口供應(yīng)促形成血管刺激?？疾炝薙PHINGOMAB減少傷口中的內(nèi)源性SIP的能力。最佳刺激的—全子(補(bǔ)充了0.5|ttg/mLbFGF或10mg/mLVEGF的基底膜)植入到小鼠中。小鼠接受從基底膜植入之前1天開始每48h腹膜內(nèi)注射25mg/kgSPHINGOMAB或鹽水。每個(gè)治療組(基底膜，基底膜力口GF或基底膜力oGF并給予SPHINGOMAB)由最少6只小鼠組成。在10天之后，小鼠用肝素處理，注射異凝集素B4-FITC，才全子切除，埋入OCT冷凍介質(zhì)中并切片。孩i血管密度通過凝集素-FITC染色血管定性地評(píng)價(jià)，如圖6C所示。BV染色零星地出現(xiàn)在對(duì)照(未處理)栓子中，而包含bFGF或VEGF的栓子顯示了血管形成的顯著證據(jù)。來自用SPHINGOMAB處理的小鼠的栓子相比于來自鹽水處理小鼠的bFGF或VEGF栓子，顯示顯著減少BV形成。染色血管的量化表明，用SPHINGOMAB處理的動(dòng)物的含VEGF或bFGF的栓子，相比于鹽水處理的動(dòng)物，在新血管形成上減少5至8.5倍(圖6C)。這個(gè)評(píng)價(jià)進(jìn)一步表明，內(nèi)源性血清和組織SIP增強(qiáng)樣么血管形成的能力以及SPHINGOMAB中和內(nèi)源性SIP促血管形成作用的能力。實(shí)施例7:SPHINGOMAB4中制體內(nèi)癥形成118SIP通過激活成纖維細(xì)胞遷移、增生和力交原產(chǎn)生而對(duì)傷口愈合具有深遠(yuǎn)的貢獻(xiàn)；SPHINGOMAB中和這些作用。利用多種類型的成纖維細(xì)胞的多個(gè)研究確認(rèn)了SIP促進(jìn)傷口愈合的能力I)SIP增大Swiss-3T3成纖維細(xì)胞增生，如利用標(biāo)準(zhǔn)方法通過311-胸苷整合測(cè)得的(圖7A);2)S1P在標(biāo)準(zhǔn)刮傷口愈合試驗(yàn)中促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的遷移(圖7B);3)S1P促進(jìn)通過從具有月交原laGFP報(bào)告子的轉(zhuǎn)基因小鼠分離的心臟成纖維細(xì)胞的膠原表達(dá)，如通過免疫熒光顯樣丈鏡指示的(圖7C);以及4)S1P誘導(dǎo)WI-38肺成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞，其在疤重建中是活性細(xì)胞，如利用免疫印跡分析，通過月幾成纖維細(xì)月包標(biāo)記物蛋白-平滑肌』幾動(dòng)蛋白的表達(dá)增多所暗示的(圖7D)。在這些測(cè)定的每一個(gè)中，SPHINGOMAB中和SIP的作用。預(yù)期眼成纖維細(xì)胞將類似地對(duì)SIP和SPHINGOMAB發(fā)生反應(yīng)。已經(jīng)注意到在心血管疾病和AMD的tf血管病變，包4舌痣重建和隨后的不合適纖維組織形成之間的類似性(Vine,etal.(2005)，Ophthalmology"vol112:2076-80andSeddonandChen(2004)，IntOphthalmolClin,.vol44:17-39);因此，認(rèn)為SPHINGOMAB對(duì)眼新血管形成和結(jié)疤具有類似于在心血管系統(tǒng)中i正實(shí)的作用。研究評(píng)4介了SPHINGOMAB在永久性心肌梗死(MI)之后經(jīng)過小鼠左降冠狀動(dòng)脈連4妄而減少心臟疤形成的效率。系統(tǒng)性給予25mg/kgSPHINGOMAB或鹽水在手術(shù)后48h啟動(dòng)。選擇在48h的抗體給藥以允許在早期重建階,殳期間出現(xiàn)正常的^f奮補(bǔ)性疤形成，并允許在MI后立即的有益的S1P刺激的血管發(fā)生。在梗死之后兩周，小鼠殺死并通過心臟組織的馬森三色染色進(jìn)4于評(píng)<介。接受SPHINGOMAB治療的動(dòng)物表i見出血管周圍纖維j匕的幾乎完全消失(圖7，照片)。作為用于任何特定傷口愈合反應(yīng)的對(duì)照，假手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行開胸手術(shù)但沒有進(jìn)行冠狀動(dòng)脈連4妄(圖7E)。實(shí)施例8:SIP促進(jìn)眼上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成收縮性的產(chǎn)生皰組織的肌成纖維細(xì)胞病理性組織纖維化(疤形成)是許多眼紊亂中的一種原發(fā)性促進(jìn)因素，包括年齡相關(guān)性黃斑退化癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變以及青光眼手術(shù)后遺癥。在這些紊亂的i午多中，血液循環(huán)生長(zhǎng)因子和趨化因子促進(jìn)正常眼細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維收縮性、產(chǎn)生疤組織的細(xì)胞(稱為"肌成纖維細(xì)胞")。通常，肌成纖維細(xì)胞作為損傷后傷口愈合反應(yīng)的一部分而負(fù)責(zé)組織^修復(fù)。然而，"幾成纖維細(xì)胞Jt量和功能的變化涉及特4正在于肝、皮膚、肺、腎、心臟和眼中的病態(tài)疰組織形成。在眼中，^L網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞表型與纖維收縮性膜的形成有關(guān)，其引起一見網(wǎng)膜脫落和隨后的#見力受損。另夕卜，眼成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以在目艮損傷后導(dǎo)致異常疤組織產(chǎn)生，導(dǎo)致隨后的視力喪失。盡管已經(jīng)鑒定了眼中促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞形成的許多血液循環(huán)蛋白因子，但是關(guān)于溶血脂類如S1P在該過程中的作用還一無所知。因此，我們考察了S1P對(duì)多種人類眼細(xì)月包系的月幾成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。如在圖8中所示的，S1P刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(圖8A)和人類結(jié)膜成纖維細(xì)胞(圖8B)中的a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA;—種肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物)的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)第一次表明，S1P是周圍環(huán)境中促進(jìn)眼上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成收縮性產(chǎn)生疤組織的肌成纖維細(xì)胞的化學(xué)因子，其可以促進(jìn)視網(wǎng)膜脫落、眼部纖維化以及隨后的3見力受損。在這些實(shí)驗(yàn)中，S1P促進(jìn)a-SMA表達(dá)的能力在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和結(jié)膜成纖維細(xì)胞之間以濃度依賴性方式不同。如所示的，在上皮細(xì)i包中在0.001nM濃度下只見察到a-SMA表達(dá)顯著增力口，其然后在10pM濃度下降至基本水平。相反，在結(jié)膜成纖維細(xì)胞中僅在10|aM濃度下觀察到a-SMA表達(dá)顯著增加。這種差異認(rèn)為是由上皮細(xì)月包中相比于成纖維細(xì)力包增加的S1P受體表達(dá)導(dǎo)致的。由于增高的S1P受體表達(dá)水平，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可能在低濃度下就對(duì)S1P120更敏感。相反，在高S1P水平下，受體變得敏感化或者可能地甚至內(nèi)化，導(dǎo)致降^[氐的S1P的刺激。膠原是原始結(jié)構(gòu)蛋白之一，其支持體內(nèi)所有的組織，并且是疤組織主要成分之一。在非病態(tài)環(huán)境下，組織內(nèi)的總膠原總量通過在成纖維細(xì)胞的膠原產(chǎn)生和被某些酶的降解之間的平衡得以保持。涉及增高的疤組織水平的許多紊亂部分地由抑制對(duì)于疤形成所需的膠原的降解的生理學(xué)和分子過程所導(dǎo)致。假設(shè)S1P促進(jìn)癥組織形成的能力由其抑制膠原降解，乂人而導(dǎo)致器官內(nèi)疤組織凈增加的能力所導(dǎo)致的。因此，考察了S1P對(duì)人結(jié)膜成纖維細(xì)胞中的纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)的表達(dá)的作用。增加的PAI-1表達(dá)與結(jié)締組織的蛋白水解降解減少相關(guān)并且與涉及疤痕增加的多種纖維化疾病相關(guān)地被上調(diào)。如圖8C所示，S1P以劑量依賴性方式刺激PAI-1表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，還可以通過刺激抑制其降解的蛋白表達(dá)來促進(jìn)皰痕組織形成，表明S1P通過多種才幾理途徑起作用以促進(jìn)和4呆持與眼病才目關(guān)的病態(tài)^^。實(shí)施例9:SPHINGOMAB4中制發(fā)炎和免疫細(xì)胞:^入發(fā)炎是重建過程中的第一反應(yīng)。其由缺血和細(xì)胞受損觸發(fā)，并導(dǎo)致刺激巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞遷移至吞謹(jǐn)死亡細(xì)胞的受損區(qū)域的細(xì)胞因子的上調(diào)并進(jìn)一步上調(diào)炎性反應(yīng)[Jordan，eta1.(1999),CardiovascRes，.vol43:860-78]。月巴大細(xì)月包也是炎性反應(yīng)的重要細(xì)月包遞質(zhì)。從肥大細(xì)胞釋放的SIP與在炎癥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中的許多有害反應(yīng)有關(guān)[Jolly，etal(2004),JExpMed,.vol199:959-70andJollyetal(2005)，Blood,.vol105:4736-42]?；贑NV和CVD中的免疫和炎性反應(yīng)的類似性，在鼠類梗死才莫型中評(píng)價(jià)了SPHINGOMAB減輕免疫細(xì)胞滲入到傷口中的作用，作為SPHINGOMAB在AMD期間減輕這些損傷中潛在作用的指示121[Vine,etal.(2005)，Ophthalmology,,vol112:2076-80;andSeddonandChen(2004)，IntOphthalmolClin，.vol44:17-39]。MI后4天，利用MAC-1和MCG35抗體分別評(píng)《介了危險(xiǎn)區(qū)域中的巨噬細(xì)月包和肥大細(xì)月包滲入。SPHINGOMAB顯著減弱炎癥巨噬細(xì)月包(圖9A)和肥大細(xì)月包(圖9B)的密度，表明SPHINGOMAB可以在AMD期間中和免疫和炎性損傷。實(shí)施例10:SIP鼠類單克隆抗體(LT1002;SPHINGOMAB)的可變結(jié)構(gòu)域的克隆和^^征這個(gè)實(shí)施例才艮道了針對(duì)SIP的鼠類mAb的克隆。整個(gè)方法由克隆的輕鏈(VL)和重鏈(VH)的鼠類可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。306DVH的共有序列表明，恒定區(qū)片4殳與y2b同種型一致。鼠類可變結(jié)構(gòu)i或與輕《連的恒定結(jié)構(gòu)i或(CL)和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)i或(CH1、CH2和CH3)克隆在一起，得到嵌合抗體構(gòu)建體。1.鼠類mAb克隆來自抗-SlP雜交瘤細(xì)月包系306D326.1(ATCC弁SD-5362)的克隆在DMEM(Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基，具有GlutaMAXI、4500mg/LD-葡萄4唐、丙酮酸鈉；Gibco/Invitrogen,Carlsbad，CA，111-035-003)、10%FBS(無菌胎兒克隆體I，PerbioScience)、以及l(fā)X谷酰胺/青霉素/鏈霉菌素(Gibco/Invitrogen)中生長(zhǎng)?？俁NA利用基于RNA酶樣i型試劑盒(Qiagen,HildenGermany)的方法/人107雜交瘤細(xì)胞分離。該RNA用于才艮據(jù)制造商的試驗(yàn)方法產(chǎn)生第一鏈cDNA(第一鏈合成試劑盒，AmershamBiosciences)。免疫^求蛋白重鏈可變區(qū)(VH)cDNA利用MHV7引物(MHV7:5，-ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT-3，[SEQIDNO:l])結(jié)合IgG2b恒定區(qū)引物MHCGl/2a/2b/3混合物(MHCG1:1225'-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3'[SEQIDNO:2]、MHCG2a:5，-CAGTGGATAGACCGATGGGGC-3[SEQIDNO:3]、MHCG2b:5，-CAGTGGATAGACTGATGGGGG-3'[SEQIDNO:4]、MHCG3:5，-CAAGGGATAGACAGATGGGGC畫3，[SEQIDNO:5])通過PCR擴(kuò)增。反應(yīng)的產(chǎn)物利用TOPO-TA克隆@試劑盒和順序連接到pCR2.1⑧-TOPO⑧載體(Invitrogen)中。重鏈可變結(jié)構(gòu)域然后乂人該載體通過PCR擴(kuò)增并作為HindIII和ApaI片l殳插入，并連4妄到包含HCMVi啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和Y-l恒定區(qū)的表達(dá)載體pGlD200(參見美國專利No.7，060，808)或pG4D200(同前)中，以產(chǎn)生質(zhì)4立pGlD200306DVH(圖10)。306DVH的共有序列(如下所示)表明，該恒定區(qū)片4殳與y2b同種型一致。類合乂i也，免疫^求蛋白k鏈可變區(qū)(VK)利用MKV20引4勿(5，-GTCTCTGATTCTAGGGCA-3，[SEQIDNO:6])結(jié)合k恒定區(qū)引物MKC(5，-ACTGGATGGTGGGAAGATGG國3，[SEQIDNO:7])擴(kuò)增。該反應(yīng)的產(chǎn)物利用TOPO-TA克隆試劑盒和順序連接到pCR2.1⑧-TOPO⑧載體中。輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域然后通過PCR擴(kuò)增，然后作為BamHI和HindIII片,史插入到包含HCMV啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列以及人類k恒定結(jié)構(gòu)i或的表達(dá)載體pKN100(參見美國專利no.7,060,808)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pKN100306DVK。將重鏈和輕鏈質(zhì)粒pGlD200306DVH+pKN100306DVK轉(zhuǎn)化到DH4a細(xì)菌中并儲(chǔ)存在甘油中。大失見才莫質(zhì)粒DNA如由制造商(Qiagen,無內(nèi)毒素MAXIPREPTM試劑盒)所述進(jìn)行制備。DNA樣品，利用Qiagen，sQIAprepSpinMiniprep^式劑盒或EndoFreePlasmidMega/Maxi試劑盒純化，利用ABI3730x1自動(dòng)4b測(cè)序4義進(jìn)行測(cè)序，其還將焚光信號(hào)翻譯成它們對(duì)應(yīng)的核酸堿基序列。引物在5'端和3，端進(jìn)行設(shè)計(jì)以使獲得序列重疊。引物的長(zhǎng)度為18-24個(gè)堿基，并且優(yōu)選地，它們包含50%GC含量并且沒有預(yù)測(cè)到二聚體或二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)于來自SphingomabTM的小鼠Vh和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分別123是SEQIDNO:8和9(表2)。CDR殘基(參見Kabat,EA(1982),PharmacolRev,vol.34:23-38)在表2中力口了下劃線，并在以下表3中分別示出。表2:來自鼠mAb,SphingomabTM的VH和VL結(jié)構(gòu)域小鼠VH,纖S鵬LVK織SVKISCKVSGFIFIMTIH柳曙卿GSEQID么士化ALE跳CISP睡ITKY腿MFRG匿:Lm脇STTMIQV脇TF薦.g幫我E眼VYFCARG諮GST歴,鄰GT窗VS小鼠VLETrVTQS戰(zhàn)SLSMRIGEKVTIlFCITTm3[aP[MWFQQK鄉(xiāng)PP亂LISS《士化^GWLggGVPSRFSSSGYCTt3milEHMLSED卿YYCl/QSDHLPFTFGiSEQID-口，"風(fēng)^JfKx表3:小鼠Vh和Vl結(jié)構(gòu)域的小鼠SphingomabCDR序列<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table>多個(gè)嵌合抗體可變(Vh和VL)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在表4中進(jìn)行比較。這些變體克隆入Lonza表達(dá)載體中。鼠Vn和VL結(jié)構(gòu)域的序列用來構(gòu)建分子才莫型以確定哪個(gè)框架殘基應(yīng)整合到人源化抗體中。<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>入50|ul的REDSTOP溶液(SkyBioLtd.)而終止，并利用MicroplaterReader3550(Bio-RadLaboratoriesLtd.)在655nm確定吸4史率。4元體結(jié)合測(cè)定的結(jié)果在圖11中示出。3.293F表達(dá)重鏈和輕鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Top10大腸桿菌(一種ShotTop10化學(xué)竟?fàn)幮源竽c桿菌細(xì)胞(Invitrogen,C4040-10))中并儲(chǔ)存在甘油中。大頭見才莫質(zhì)粒DNA如制造商(Qiagen,無內(nèi)毒素MAXIPREPTM試劑盒批號(hào)12362)所述進(jìn)行制備。對(duì)于在人類系統(tǒng)中的抗體表達(dá)，利用293fectin(Invitrogen)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人類胚胎腎細(xì)胞系293F(Invitrogen)并利用293F-FreeStyleMedia(Invitrogen)培養(yǎng)。輕《連和重《連質(zhì)斗立均以0.5g/mL進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染以1()S個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度進(jìn)行。上清液在轉(zhuǎn)染后3天，通過以llOOrpm在25°C離心5分鐘加以收集。表達(dá)水平通過定量ELISA(參見前面的實(shí)施例)進(jìn)4亍定量并且對(duì)于嵌合抗體在~0.25-0.5g/mL變化。4,抗體純化單克隆抗體通過4吏培養(yǎng)物上清液以0.5mL/min流過蛋白A/G柱(Pierce,Cat.No53133)而乂人培養(yǎng)物上清液純化。流動(dòng)相由IXPierceIgG結(jié)合緩沖液(批號(hào)21001)和0.1M甘氨酸pH2.7(Pierce,洗脫緩沖液，批號(hào)21004)構(gòu)成。在O.lM甘氨酸中的抗體收集物利用1M磷酸緩沖液pH8.0稀釋，以中和pH。集中IgGi收集物并僅針對(duì)IXPBS(PierceSlide-A-LyzerCassette,3,500MWCO,Cat.No66382)進(jìn)4亍滲4斤。5先脫液利用CentriconYM-3(10,000MWCOAmiconCat.No4203)通過以2，500rcf離心lh濃縮。利用商業(yè)骨髓瘤IgGi原溶液作為標(biāo)準(zhǔn)，抗體濃度通過如上所述的定量ELISA確1296.通過表面等離子體共振(SPR)確定結(jié)合動(dòng)力學(xué)所有結(jié)合凄t椐用Biacore2000光學(xué)生物傳感器(BiacoreAB，UppsalaSweden)收集。SIP偶聯(lián)至馬來酰亞胺CM5傳感器芯片。首先，CM5芯片用NHS/EDC均等混合物活化7分鐘，然后是利用乙二胺封閉7分鐘的步驟。接著使石黃基-MBS(PierceCo.)以在HBS運(yùn)行緩沖液(10mMHEPES,150mMNaCl,0.005%p20，pH7.4)中的0.5mM濃度流過這些表面。SIP稀釋到HBS運(yùn)行緩沖液中至O.lmM濃度并注射不同時(shí)間長(zhǎng)度，產(chǎn)生2個(gè)不同密度的SIP表面(305和470RU)。接著，利用3倍稀釋系列，從16.7nM、50.0nM、50.0nM、16.7nM和16.7nM開i臺(tái)，分另'J只十'J、t氛201308、201309和207308抗體收集mAb的結(jié)合數(shù)據(jù)。定。mAb的重鏈類型利用單克隆抗體同種型化試劑盒通過ELISA確定(Sigma,ISO-2)。5.4元體變體與SIP的7十比結(jié)合下表6示出了突變體與嵌合抗體的對(duì)比分析。為了產(chǎn)生這些結(jié)果，結(jié)合的抗體通過第二抗體(對(duì)于小鼠或人類IgG，結(jié)合有HRP)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)顯色反應(yīng)并作為光學(xué)密度(OD)報(bào)告。一組抗體的濃度為0.1jag/ml。沒有4企測(cè)到該第二抗體與單獨(dú)S1P涂覆的基質(zhì)的相互作用。表6:在嵌合抗-SlP抗體的變體上與S1P的對(duì)比結(jié)合可變結(jié)構(gòu)域^S^~"pATH50+pATH101.5pATH50+pATHll2pATH50+pATH120.6pATH50+pATH140.4pATH50+pATH162pATH53+pATH101.6ar,gwSde"h丄、，AsApL力口ssss,g嵌ccccMcHc130每一個(gè)濃度一式二份地測(cè)試。表面利用50mMNaOH再生。所有凄t據(jù)在25°C收集。反應(yīng)凄t據(jù)利用參照表面以及空白注射進(jìn)4亍處理。來自兩個(gè)表面的反應(yīng)并且每一個(gè)變體測(cè)試兩次的數(shù)據(jù)組擬合到相互作用模型以獲得結(jié)合參數(shù)。來自不同mAb濃度的數(shù)據(jù)利用1:1(小鼠)或1:2(變體)相互作用模型全部擬合至確定的明顯的結(jié)合速率常數(shù)。括號(hào)中的數(shù)字表示尾數(shù)的誤差。實(shí)施例11:針對(duì)S1P的嵌合mAb如本文使用的，術(shù)語"嵌合"抗體(或"免疫球蛋白")是指包含與來源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源的重鏈和/或輕鏈，而剩余的鏈與來源于另一物種子，以及這樣的抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(Cabilly，etal"supra;Morrisonetal"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1984))。針對(duì)SIP的嵌合抗體利用包含來自特定雜交瘤(ATCC安全保藏號(hào)SD-5362)的鼠類抗體的活性S1P結(jié)合區(qū)的可變區(qū)(Fv)與人類IgG!免疫^求蛋白的Fc區(qū)產(chǎn)生。該Fc區(qū)包含人類抗體的CL、ChL和Ch3結(jié)構(gòu)域。不希望受限于特定方法，嵌合抗體還可以乂人人類IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA或IgM的Fc區(qū)產(chǎn)生。如本4頁i或4支術(shù)人員理解的，"人源化，，抗體可以通過將人類抗體框架區(qū)(例如Frl、Fr4等)如IgGl的框架區(qū)4家接到鼠類抗-SlPmAb的補(bǔ)體決定區(qū)(CDR，例如CDRl-4)而產(chǎn)生。圖11示出了利用石克醇4匕S1P作為涂覆材料嵌合mAb和全長(zhǎng)鼠類mAb在直接ELISA檢測(cè)中的結(jié)合。對(duì)于圖11所示的直接ELISA實(shí)^r，針對(duì)S1P的嵌合抗體具有與全長(zhǎng)鼠類單克隆抗體類似的結(jié)合特性。在用O.lng化學(xué)合成的硫醇化S1P(結(jié)合至結(jié)合緩沖液(33.6mMNa2C03、100mMNaHCO3;pH9.5)中的BSA)涂覆的96-孔高度結(jié)合ELISA板(Costar)中實(shí)施ELISA。硫醇化S1P-BSA在ELISA板中在37。C孵育lh或4°C過夜。然后這些才反用PBS(137mMNaCl、2'68mMKC1、10.14mMNa2HP04、1.76mMKH2P04;pH7.4)清洗4次并用PBST在室溫下封閉lh。對(duì)于初始孵育步驟，75^1的樣品(包含待;險(xiǎn)測(cè)的SIP)用25的在PBST中牙希釋的0.1|ag/mL抗-SlP單克隆抗體孵育，并加入到ELISA板的孔中。每個(gè)樣品一式三份地實(shí)施。在室溫下孵育lh后，ELISA板用PBS清洗4次并每孔用lOOpl的0.1嗎/mLHRP羊4元-小鼠二級(jí)4元體(JacksonImmunoresearch)在室;顯下卵孚育lh。然后板用PBS清洗4次并暴露于四曱基聯(lián)苯胺(Sigma)1-10分鐘。檢測(cè)反應(yīng)通過加入等體積的1MH2S04而終止。樣品的光學(xué)密度通過利用EL-X-800ELISA4反讀凄t器(Bio-Tech)在450nm才僉測(cè)確定。同才羊，才企測(cè)免疫動(dòng)物血清中或產(chǎn)生抗體的細(xì)月包如雜交瘤細(xì)月包的細(xì)胞條件培養(yǎng)基(例如上清液)中的抗體效價(jià)的優(yōu)選方法涉及用已共價(jià)連接至蛋白載體如BSA的耙配體(例如S1P、LPA等的硫醇化類似物)涂覆ELISA板。不希望受限于具體方法或?qū)嵤├?，嵌合抗體可以針對(duì)其他脂質(zhì)靶如LPA、PAF、神經(jīng)酰胺、錄u苷脂、腦苷脂、心^疇脂、>瞵脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、類花生酸和其他白三烯等。而且，如果期望，這些脂類中的許多也可以被糖基化和/或乙?；?。實(shí)施例12:人源4匕抗-SlP單克隆抗體LT1009(Sonepcizumab)的產(chǎn)生和表征132鼠類抗-SlP單克隆抗體306D(LT1002;SphingomabTM),其特異性地結(jié)合S1P，已經(jīng)證實(shí)在各種動(dòng)物才莫型中有效地抑制血管發(fā)生和肺瘤生長(zhǎng)。如以下討i侖的，LT1002利用研究在鼠類CDR和計(jì)算機(jī)產(chǎn)生模型中尋找人類框架的序列同一性和同源性來指導(dǎo)一些框架回復(fù)突變而進(jìn)行人源化。兩個(gè)變體HuMAbHCLC3(LT1004)(在輕鏈中具有3個(gè)回復(fù)突變)和HuMAbHCLC5(LT1006)(在輕鏈中具有5個(gè)回復(fù)突變)表現(xiàn)出在納摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力。實(shí)施進(jìn)一步變體HuMAbHCCysAlaLC3(LT1007)和HuMAbHCCysAlaLC5(LT1009)(其中HCDR2中的游離半胱氨酸殘基被丙氨酸替代)表現(xiàn)出在皮摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力。所有人源化變體在老年性黃斑退化癥(AMD)的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)模型中抑制血管發(fā)生，其中相比于親代鼠類抗體，HuMAbHCCysAlaLC5(LT1009)表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性和體內(nèi)效力。變體huMAbHCcysalaLC5(LT1009)稱為SonepcizumabTM。a.抗-SlP抗體的人源化zi殳計(jì)鼠類mAbLT1002(SphingomabTM)的可變結(jié)構(gòu)域經(jīng)過CDR嫁接進(jìn)行人源化(Winter美國專利No.5,225,539)。CDR殘基基于如Kabatetal.1991所述的序列高變性加以鑒定。在這個(gè)研究中，合適的受體結(jié)構(gòu)利用結(jié)構(gòu)比對(duì)禾呈序(SRv7.6)，初始步驟是查詢這些分別具有LT1002VH和VL蛋白序列的人類重鏈可變(VH)和輕鏈可變(VL)序列數(shù)據(jù)庫，以鑒定在FR中具有高序列同一性的人類才匡架(FR),在Vernier(Foote,J.&Winter,G.Antibodyframeworkresiduesaffectingtheconformationofthehypervariableloops./Mo/.5/o/.224,487-499(1992))、Canonical133(Morea,etal"Antibodymodeling:implicationsforengineeringanddesign,Methods20,267-279(2000)(Chothia，C.,Novotny，J.，Bruccoleri，R.，&Karplus，M.Domainassociationinimmunoglobulinmolecules.Thepackingofvariabledomains.JMol.Biol.186,651-663(1985))VH-VL界面殘基，具有相同的canonical種類和/或長(zhǎng)度。這個(gè)文庫每一個(gè)成員與小鼠抗體的單個(gè)對(duì)齊殘基的同一性利用該程序計(jì)算。鑒定了具有與小鼠FR最相同的FR序列的那些人類序列，產(chǎn)生人類"受體，，序列的最初的候選名單。也計(jì)算了與小鼠抗體在Vernier、Canonical和VH畫VL界面(VCI)殘基處具有最大同一'I"生的那些序列。在人類和d、鼠之間的這些位置處的差別分成保守性和非保守性取代，以使最佳框架選擇與LT1002具有最小數(shù)量的非保守性VCI差別。LT1002的CDR環(huán)L3和HI可以歸為canonical結(jié)構(gòu)。這些L3和HI結(jié)構(gòu)用來選擇具有相同canonical結(jié)構(gòu)的人類抗體FR。對(duì)于未分類的CDR,試圖選擇具有與小鼠抗體相同的CDR身，而且依賴于潛在的框架殘基(canonical殘基)。因此具有匹配的canonicalCDR結(jié)構(gòu)和/或CDR長(zhǎng)度的人類框架可能保持^家接的小鼠CDR具有最恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)以保持抗原結(jié)合親和力。這對(duì)于所有CDR(除了CDRH13)通過選擇人類框架序列而實(shí)現(xiàn)。另夕卜，具有不常用半胱氨酸或脯氨酸殘基的框架盡可能排除。這些計(jì)算對(duì)于重鏈和輕鏈序列單獨(dú)實(shí)施。最后，在整個(gè)框架區(qū)域中，最佳匹配序列中的單個(gè)序列差別進(jìn)行比對(duì)。在上述最匹配比對(duì)計(jì)算的人類抗體中，選擇抗體AY050707和AJ002773分別作為對(duì)輕鏈和重鏈的最恰當(dāng)人類框架提供者。第二步驟是產(chǎn)生LT1002可變區(qū)的分子模型，以及鑒定可能影響抗原結(jié)合^f旦不包4舌在Vernier、Canonical和界面殘基組中的FR殘基?？疾炝思藿庸w和接受體可變結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu)特征以便更好理解各個(gè)FR殘基如何影響CDR環(huán)的構(gòu)象，反之亦然。LT1002中134可能影響CDR的非保守FR殘基才艮據(jù)Vernier和Canonical定義(參見上文)進(jìn)行鑒定，因而人類FR的多個(gè)殘基恢復(fù)至原始的鼠類氨基酸(回復(fù)突變)。b.誘變可變區(qū)序列中的突變利用QuikChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene,Catalog弁200524)產(chǎn)生。單個(gè)反應(yīng)利用50ng的雙鏈DNA模板、2.5U的PfuUltreHFDNA聚合酶及其對(duì)應(yīng)的緩沖劑(Stratagene，Catalog#200524)、10mMdNTP混合物以及125ng的再懸浮在5mMTris-HCl(pH8.0)和0.1mMEDTA中的每一個(gè)突變寡核苷酸實(shí)施。初始變性在95。C實(shí)施30s,4妄著16個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增95。C30s,55。C60s以及68。C8min。在溫度循環(huán)之后，最終反應(yīng)接著用Dpnl消化劑在37°C消化lh以除去曱基化親代DNA。最終的突變體壽爭(zhēng)4b入竟?fàn)幮訶L1-Blue大腸4干菌中并4妄種到在含50jLig/ml青霉素的LB-瓊脂上。然后通過測(cè)序檢測(cè)克隆。每一個(gè)突變體然后在1升搖瓶中培養(yǎng)并利用EndoFree質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen,catalog#12362)進(jìn)行純化。c.人源化抗體變體的產(chǎn)生小鼠-人類嵌合抗體(chMAbSIP)通過將LT1002的可變結(jié)構(gòu)域克隆入包含k和重鏈的人類恒定區(qū)的栽體中，以允許全長(zhǎng)抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。人源化重鏈的產(chǎn)生是將來自LT1002VH的KabatCDR1、2和3嫁接到AJ002773的受體框架中的結(jié)果。與AJ002773最接近的種系基因是VH5-51,其前導(dǎo)序列作為前導(dǎo)序列整合到人源化重鏈變體中。pATH200的蛋白序列在表4中示出，pATH200是LT1002Vh的第一個(gè)人源化形式，具有VH5-51前導(dǎo)序列。在LT1002的VH結(jié)構(gòu)域的情況下，在位置2、27、37、48、67和69處的殘基是Verier殘基或者在Vh和Vt結(jié)構(gòu)i或的界面處，并且可能影響CDR的結(jié)構(gòu)方向。位置37看起來對(duì)Vh和V^結(jié)構(gòu)域之間的界面很關(guān)鍵。在人類框架中的這些位置處的殘基利用在相應(yīng)位置處發(fā)現(xiàn)的鼠類殘基進(jìn)行回復(fù)突變。突變V37M、M48I和Y27F單個(gè)地進(jìn)行測(cè)試。一種形式(pATH205)包含所有3個(gè)突變以及V67A和169L，而另一形式(pATH206)包含所有5個(gè)突變和V2A。人源化輕鏈的產(chǎn)生是將LT1002VL的KabatCDR1、2和34家接到AY050707的受體框架中的結(jié)果。與AY050707最接近的種系基因是Lll,其前導(dǎo)序列被整合到人源化輕鏈構(gòu)建體中。pATH300(LT1002輕鏈)的蛋白和DNA序列分別是SEQIDNO:17和28(對(duì)于氨基酸序列參見表4)。在Vl的情況下，4個(gè)非保守Vernier位置4、36、49、64選擇對(duì)鼠類殘基的回復(fù)突變，因?yàn)樗鼈兩婕爸С諧DR環(huán)的結(jié)構(gòu)。LT1002的分子才莫型的考察表明，Tyr67靠近CDR表面并定向朝向抗原結(jié)合平面，并且可以與S1P相互作用。因此，S67Y回復(fù)突變也加入到后一個(gè)人源化形式。兩個(gè)突變分別引入以產(chǎn)生包含Y49S或Y36F的兩種形式。多種形式利用以下突變癥且合產(chǎn)生(Y49S,F4V)、(Y49S,Y36F)、(Y49S,Y36F,F4V)、(Y49S,G64S)、(Y49S,Y36F，F(xiàn)4V，G64S)、(Y49S，Y36F，F(xiàn)4V，G64S，S67Y)、(Y49S，G64S，S67Y)。d.人源化前導(dǎo)候選的選擇基本:S家4妾形式(pATH200和pATH300)和所有包含回復(fù)突變的變體的可變區(qū)克隆入包含人類Vh或Vt恒定區(qū)的表達(dá)載體中。所抗體產(chǎn)生，并通過ELISA測(cè)試與S1P結(jié)合。產(chǎn)率對(duì)于人源化變體為約10-20mg/1而對(duì)chMAbS1P為0.3-0.5mg/1。在還原條件下的SDS-PAGE顯示在25kDa和50kDa處具有高純度(>98%)的兩個(gè)136帶，與輕鏈和重鏈預(yù)期質(zhì)量一致。單個(gè)帶在非還原條件下觀察，具有預(yù)期質(zhì)量為150k。chMAb在人源化抗體結(jié)合測(cè)定中用作標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)槠浒鳛橛H代小鼠抗體的相同可變區(qū)，并且?guī)в凶鳛槿嗽椿?元體的相同恒定區(qū)，因此可以利用相同ELISA方案進(jìn)行才全測(cè)。初始人源化抗體，其中六個(gè)鼠類CDR嫁接到未突變的人類框架中，沒有顯示可才企測(cè)的與S1P的結(jié)合(圖11)。包含4個(gè)回復(fù)突變(Y49S,Y36F,F4V和G64S)的K輕鏈，與嵌合重鏈相關(guān)，表現(xiàn)出如在ELISA中檢測(cè)的低于最佳的與S1P的結(jié)合。在位置Y67處的另外突變的整合顯著改善該結(jié)合。包含回復(fù)突變Y49S、Y36F、F4V、G64S和S67Y的形式pATH308以及包含回復(fù)突變Y49S、G64S和S67Y的形式pATH309,與嵌合重鏈相關(guān)，都產(chǎn)生與嵌合抗體類々乂i也如通過ELISA確定的結(jié)合S1P的抗體。2個(gè)突變Y36F和F4V從S1P結(jié)合的角度看不認(rèn)為是必需的回復(fù)突變。需要在VL框架中的35個(gè)回復(fù)突變的改造以恢復(fù)活性。Vernier回復(fù)突變V37M整合到重鏈的人類框架中，與嵌合輕鏈相關(guān)，足以恢復(fù)與嵌合抗體類似的結(jié)合行為(圖11)。概括地，LT1002VH結(jié)構(gòu)域的人源化僅需要一個(gè)來自鼠類框架序列的氨基酸，而鼠類VL框架結(jié)構(gòu)域，必需保留3至5個(gè)鼠類殘基以實(shí)現(xiàn)等同于鼠類親代LT1002的結(jié)合。e.人源化前導(dǎo)候選物的優(yōu)化鼠類抗-SlP抗體包含在可以潛在地引起抗體分子某些不穩(wěn)定性的重鏈的CDR2(Cys50)中的游離半胱氨酸殘基。利用定點(diǎn)誘變，pATH201的變體是利用丙氨酸(huMAbHCcysalaLC3)(pATH207)、甘氨酸(huMAbHCcysalaLC3)、絲氨酸(huMAbHCcysserLC3)、以及苯丙氨酸(huMAbHCcyspheLC3)代替半胱氨酸殘基產(chǎn)生的。半胱氨137酸突變重鏈也利用包含5個(gè)回復(fù)突變的人源化輕4連(pATH308)進(jìn)行才企測(cè)(huMAbHCcysalaLC5=LT1009)。變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，然后在一組體外測(cè)定中進(jìn)行表征。重要地，人源化變體的表達(dá)速率顯著高于chMAbS1P。f.人源化前導(dǎo)候選的深入表征i.特異性。人源化變體在竟?fàn)幮訣LISA測(cè)定中4十對(duì)S1P和多種其他生物脂類測(cè)試特異性。該測(cè)定增加了允許表位定位的功能。人源化抗體LT1009沒有顯示對(duì)鞘氨醇(SPH)的交叉反應(yīng)性，鞘氨醇是S1P或LPA(溶血石粦脂酸，lysophosphatidicacid)的中間謝前體，LPA是一種結(jié)構(gòu)上和功能上類似于SIP的重要胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。此外，rhuMAbSIP不識(shí)別其他結(jié)構(gòu)類似脂類和代謝物，包括神經(jīng)酰胺(CER)、神經(jīng)酰胺-l-磷酸(C1P)。然而，如預(yù)期的，LT1009不與鞘氨醇基磷酸膽堿(SPC)交叉反應(yīng)，SPC是一種其中SIP的游離磷酸基與膽堿殘基連接的脂質(zhì)。重要地，所有人源化變體表現(xiàn)出與小鼠抗體相當(dāng)?shù)奶禺愋员憩F(xiàn)。ii.結(jié)合親和力。結(jié)合于S1P涂覆芯片的IgG的Biacore才企測(cè)表明，變體LT1004或LT1006表現(xiàn)出類似于chMAbS1P的在低納摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力，如圖11所示。其中半月光氨酸殘基^皮丙氨酸替代的人源化變體LT1007和LT1009表現(xiàn)出類似于鼠類親代LT1002(SphingomabTM)的在皮摩爾范圍的結(jié)合親和力。穩(wěn)定性。人源化變體在高溫刺激后測(cè)試穩(wěn)定性。通過從60至74。C變化上清液的溫度范圍確定每一個(gè)人源化變體的熱變構(gòu)溫度的恰當(dāng)中點(diǎn)(TM)對(duì)?；谠趯挏囟确秶?080。C之間的熱攻擊之后對(duì)鼠類抗體分子進(jìn)行變性特性研究。每一個(gè)變體的結(jié)合性能在熱刺激之前和之后確定。鼠類抗體表現(xiàn)出的TM為65。C。變體138huMAbHCcysalaLC5(LT1009)相比于所有其他變體表現(xiàn)出優(yōu)異的TM。表7示出了前導(dǎo)人源化候選以及它們的特性。表7:前導(dǎo)人源化SIPmAb的候選物和特性(指出了重鏈和輕鏈中的突變數(shù)量。說明一欄中給出重鏈和輕鏈的同一性。)<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>如利用天然抗體，LT1009在組成每一個(gè)抗體分子的兩個(gè)輕鏈多肽的每一個(gè)中和兩個(gè)重鏈多肽的每一個(gè)中包4"舌三個(gè)互4卜決定區(qū)(每一個(gè)為"CDR")。^f于這六個(gè)CDR每一個(gè)的氨基酸序列在下面提供("VL"表示免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，而"VH"表示免疫球蛋白重鏈的可變區(qū))CDR1VL:ITTTDIDDDMN[SEQIDNO:10]CDR2VL:EGNILRP[SEQIDNO:11]CDR3VL:LQSDNLPFT[SEQIDNO:12]CDR1VH:DHTIH[SEQIDNO:13CDR3VH:GGFYGSTIWFDF[SEQIDNO:15]CDR2VH:AISPRHDITKYNEMFRG[SEQIDNO:31]對(duì)于LT1009的重鏈和輕4連多肽的核苷酸和氨基酸序列在以下列出LT1009HC可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列[SEQIDNO:32]:1raewswvfifflsvttgvhsevqlvqsgaevklqpge:slJciscqsfgyifid51htihwmrqffl.pgqglewmgaisprhditkynem.frgqvtisadkssstayi101gwsslkasc!tamyfear'ggfygstiwfdfwgqgt,tvssLT1009LC可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列[SEQIDNO:33]:■1rasvptqvlgllllwitdarcettvt，psflsasvgdrvt.itcitttdicl51dd酣wfqqepgkapJcliisegnilrpgvpssssgygtdtftltiskl鄰1.01eclfatyyciqsdnlpftfgqgtkle丄kLT1009HC核苷酸序列[SEQIDNO:34]:14051cgtgacc為cs101這ggt;gaa8B8151tscatctttai201經(jīng)ggcct柄3g301agcaccgcct351gtatttctgt40;Ltttggggcca451ccateggt:ct501agcggccctgS51tgtcgtggaa601gtcctacagt651etcc這gcage701ceagcaacac:751卿a卿tgi:801ecggctatgc851ttxaccegga901ctggc"i:tt951esggccctgci001catatccg:gg1101Gtcceasfcct1151tgcccaccgt1201gc;ggg為cagg1251ggtgctgaea1.301gggaccgtca1351tctcccggac1401gaccc仁gagg1451tgccaaLgaca1501tc的cgtcct1551asgtgcaagg1601etccaaagce1651ggccggctxg1701tgtccctacai1751cccgggagga1801ggcttetate1851gg逸g效恩esi盈:c1901tcttcctcta1951透acgtcttct2001gc在gaagagecc為cc為tggaggcgtgcattgttcaggggcacttgcagtggcgag逸ggggagggacaatgggctgcctggcct仁aggactcaaggtggacctgctggaagagt'ccc祖gtcacccaggctcagg逸cc:ctgctctetctgcagcccaggtaacgtocacctcccctgaggtccaccgtcctgcatget:ccgttattcactggot為tt:t:ctccgtcaccgtct遂c;cC2tcctc:ctcaaggactactac:tccctcaagagagttgccaggctcagg,gtgctgccctgacetagccagcccagcatctettecacatgcgtggagga.geagtacaccaggactccegtggggtcgcctcccgtaccgtggacaitctcctgxcatsgtactstcGttcagcetccttccccgsagcgtgcacscagcagcgtggcgctcctgccgcctcgcccttggtggacgtgscggcgtggggctgaatgggcccce改tcggtgaccgctggcctgacctgtggg教g逸gcagctctgcacatctttctgtctctggagcaggagttttggatgcccgggcaaeaccgccatctg柳gcaeccggtgacggcttcccggct為這tc遂c扇3gctggacgcstccgtctgcctctgccssg3gcaaagg.cc西aaattccagtaaccagctc^gtaccgtgtgg'atgggcagccLT1009HC氨基酸序列[SEQIDNO:SSL-mi1鵬w，vflff1svttgvhsevcjlvqsgaevkkpg經(jīng)sikiscqsfgyifid51htihwmrqrapgqglewmgais:prhditkyn色mfrggvtisadks.sstaylLqwsslkasdt細(xì)yfcarggfygstiwfdfwgqgtmvtvssastkgpsvfjpLlapsskstsggtaalgeivkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssLglyslssvvtvpssslgtqtyiciwnhkpsntkvdkrvap燈llggpsvfiLfppkpicdftirnisrtp錄vtcv，dvshecfpevk.f.nwyvclgvvhnaktkprLg輕qynstyrvvsvltvlhqdwlngk培ykckv:snJcadpapiektisfcakgqLpi:錢pqvytippsr經(jīng)em.tknqvsltcl.vkgfypsdiavewesngq.pennyklttppvlds勿sffiys;kltvdksi:wqcjgiwfscsvmhealhnhytqkslsLT1009LC核苷酸序列[SEQIDNO:36]:1aagcttgccg1gctgtggctg1ecttcctgt:c1ageecctaag1cateaagatt1agesMttgc■1t效3cttacca.1cggtggetgc1aaatctggas1aigaggecsaa1cg'cctgcgaaccaccstgtctg:catctgtactcctgatctttcactt.tcg'accatctgtectgcctctgttgtgcctacccegaaggcsaggatatggcattttgcwcttgtgtgcctgtsttcttcgtc3g3tttc3ctattactgttcgccctcc這agactgctgctC3gtc:tcesttgcagagtgatctatccc:agLT1009LC氨基酸序列[SEQIDNO:37]:1msvptqvlgiiliwitdatx經(jīng)ttvtgspsflsasvgdrvtitcitttdid51cktotwfqqepgkapkllisegnilrpgvpsrfsssgygtdftitisklqp10i餘dfat，ycJl<jsdnlpftfgqgtki8ikrtva邀psvfifpps<i€qiksgta151swcHnnfyprakv:qwkvdrvaiqsgnsq[esvteqdskdstyslsstit201isksdyekhkvy^cevthqglsspvtksfnrg@c實(shí)施例13:人源J匕SIPmAb的生產(chǎn)和純4乜該實(shí)施例描述了以高親和力結(jié)合至生物活性脂質(zhì)鞘氨醇-l-石粦酸(SIP)的重組人源化單克隆抗體(LT1009;Sonepcizumab)。LT1009是由兩個(gè)相同輕鏈和兩個(gè)相同重鏈(總分子量為150kDa)構(gòu)成的全長(zhǎng)IgGlk同種型抗體。重鏈包含N-連接的糖基化部位。寡<D5o5o5o1i1-CNI2334505050505050142糖結(jié)構(gòu)的性質(zhì)還沒有確定，4旦預(yù)期是具有核心海藻并唐的雙觸角(biantennary)結(jié)構(gòu)。起重要作用的糖形式的性質(zhì)在這個(gè)階段還不知道。預(yù)測(cè)了一些C-末端異質(zhì)性，因?yàn)樵谥劓湹暮愣ńY(jié)構(gòu)域中存在賴氨酸殘基。兩個(gè)重鏈彼此通過兩鏈間二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)，其與人類IgGl的結(jié)構(gòu)一至丈。LT1009最初來源于利用乂人用S1P免疫小鼠產(chǎn)生的雜交瘤產(chǎn)生的鼠類單克隆抗體(LT1002;Sphingomab)。鼠類抗體的人源4匕涉及六個(gè)鼠類CDR插入到由于與鼠類親代抗體的結(jié)構(gòu)類似而選擇的人類抗體框架的那些位置中。在框架中形成一系列替代以改造該人源化抗體。這些替代稱為回復(fù)突變，并用在抗體與抗原的相互作用中起重要作用的鼠類殘基替代人類。最終的人源化形式包含在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的人類框架中的一個(gè)鼠類回復(fù)突變和在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的人類框架中的5個(gè)鼠類回復(fù)突變。另外，在重鏈CDR#2中存在的一個(gè)殘基被替代成一個(gè)丙氨酸殘基。這種替代證實(shí)增加抗體分子的穩(wěn)定性和效力。將人源化可變結(jié)構(gòu)域克隆入LonzaGS基因表達(dá)系統(tǒng)中以產(chǎn)生質(zhì)粒pATH1009。這種表達(dá)系統(tǒng)由帶有抗體基因的恒定結(jié)構(gòu)域以及可選擇的標(biāo)記物谷酰胺合成酶(GS)的表達(dá)載體。GS是負(fù)責(zé)從谷氨酸和氨合成谷酰胺的酶。帶有抗體基因和可選才奪標(biāo)i己物的載體壽爭(zhēng)染到適于在無血清介質(zhì)中生長(zhǎng)的專有(proprietary)中華倉鼠卵巢(CHOKISV)宿主細(xì)胞系中，并為細(xì)胞提供足夠的谷酰胺以在沒有外源性谷酰胺的情況下下存活。另外，將特定GS抑制劑-甲硫氨酸砜亞胺(MSX)填加到血清中以抑制內(nèi)源性GS活性，以使僅由載體提供具有GS活性的細(xì)胞系可以存活。在MSX存在下，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞針對(duì)它們?cè)贛SX存在下在無谷酰胺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力進(jìn)4亍選4奪，并且在分離物中選4奪活性LT1009的高水平分泌。然后生產(chǎn)用于毒性研究和臨床開發(fā)的材料以用于毒性和臨床開發(fā)。143ATCC保藏包含aATH1009質(zhì)粒的大腸桿菌StB12在美國典型培養(yǎng)物收藏中心保藏(ATCC)(保藏號(hào)PTA-8421)。用DNA質(zhì)粒pATH1009轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)月包系LH1275已在美國典型培養(yǎng)物^1欠藏中心保藏(保藏號(hào)PTA-8422)。實(shí)施例14:人源4tmAb的生產(chǎn)通常，生產(chǎn)過程涉及三個(gè)階段種繁殖(seedtrain)、接種繁殖(inoculumtrain)和生產(chǎn);咅養(yǎng)。所有階賴使用無血清i式劑和4氐蛋白細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。為了開始種繁殖，使用來自工作細(xì)胞庫的細(xì)胞；細(xì)胞每3至4天進(jìn)行再次培養(yǎng)，在規(guī)定的種繁殖培養(yǎng)時(shí)間之后，開始接種繁殖。優(yōu)選使用非選擇性培養(yǎng)基(無MTX培養(yǎng)基)來擴(kuò)增細(xì)胞以51入到生產(chǎn)階段。細(xì)胞通過連續(xù)亞培養(yǎng)到增大體積的容器中進(jìn)行擴(kuò)增。在接種繁殖的某些天，開始生產(chǎn)階段。生產(chǎn)培養(yǎng)在體積為200L、400L、2000L、或20000L的生物反應(yīng)器中進(jìn)行。生物反應(yīng)器的實(shí)例在以下進(jìn)4于描述。生物反應(yīng)器的實(shí)例從2L生物反應(yīng)器的失見模首先在Applikon15L攪拌罐中繼續(xù)，然后依次至50L生物反應(yīng)器、200L生物反應(yīng)器以及最后的2000L生物反應(yīng)器(所有都設(shè)到相同規(guī)才莫)。這些罐的特性如下生產(chǎn)商ABEC,Inc.根據(jù)ASME第VIII部分壓力容器頭見范制造。4妄觸表面為316LSS。底部偏置馬區(qū)動(dòng)，ABECH殳i十低剪切渦輪316LSS，拋光至15-20微英寸并鈍化。直徑~1/2的容器直徑?？刂艫llenBradleyControlLogicPLC,具有Versa4喿作界面。144攪拌AllenBradley傳感器，用于RPM控制的VFI的輸出A-BPLC控制溫度雙重控制100歐姆鉑RTD傳感器，A-BPLC控制熱、冷和蒸汽閥w/再循環(huán)泵。在生物反應(yīng)器是空時(shí)的自動(dòng)消毒循環(huán)。pH:Ingold傳感器，凝膠填充，C02的可加壓A-BPLC控制以噴射?！等萁獾难鮅ngold才及i普電才及傳感器(polarographicelectrodesensor),02噴射的A-BPLC控制?？諝夂蜌怏w流傳感器是用于空氣、02、N2和C02噴射的4種Brooks熱質(zhì)量流量計(jì)(thermalmassflowmeter),還供應(yīng)Brooks熱質(zhì)用于空氣覆蓋，對(duì)于所有氣流的pH自動(dòng)、DO自動(dòng)或手動(dòng)氣流控制通過A-BPLC的A-BPLC控制。容器壓力傳感器是Rosemount清潔隔膜式轉(zhuǎn)換器，控制是具有背壓式控制閥的轉(zhuǎn)換器的A-BPLC控制。可編程邏輯控制器(PLC):用于所指定的過程的連續(xù)環(huán)控制的AllenBradleyControlLogix系統(tǒng)。豐欠件PLC編程利用Rockwell軟件(AllenBradley)RSLogix5000。人才幾界面(HMI):局部才喿作界面在具有集成FPD/具有以太網(wǎng)觸屏進(jìn)入訪問PLC的AllenBradleyHMIVersoView工業(yè)i十算才幾上。軟件是RockwellSoftwareRSView32。生產(chǎn)過程的實(shí)例。在溫度、溶解氧和pH控制下攪拌不銹鋼生物反應(yīng)器。為了最佳產(chǎn)率而確定接種密度。通常利用無血清的培養(yǎng)基。145典型地一個(gè)分批進(jìn)料過程。典型地具有溫度變化。生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間預(yù)期為8至14天。收獲時(shí)的存活性待定。收獲物通過過濾凈化。收獲物在凈化后且純化前4諸存在2-8。C。實(shí)施例15:人源化mAb的;^g^漠純化藥物純化過禾呈通常由4個(gè)步艱《構(gòu)成蛋白A層析、陰離子交才奐層析(Q瓊脂糖)、陽離子交換層析(CM瓊脂#唐)以及超濾/、滲濾(UF/DF)。親和性柱通常是在收獲和凈化之后的第一步。該柱通常利用固定化蛋白A樹脂。這個(gè)親和性步驟針對(duì)宿主細(xì)胞蛋白和DNA才是純抗體。為了滅活潛在的病毒，洗脫液通常經(jīng)歷一個(gè)病毒滅活過程，接著是陰離子交換層析步驟以減少宿主細(xì)胞蛋白、DNA、蛋白A和潛在的病毒。*接著，通常4吏用陽離子交換層析步艱《以進(jìn)一步減少宿主細(xì)月包蛋白和抗體聚集物的殘留量。最后，池液(pool)然后滲碎斤并進(jìn)一步濃縮。代表性純化過程4欠獲物可以在蛋白A4主之前進(jìn)^f亍;農(nóng)縮和鄉(xiāng)爰沖液交4奐。該過禾呈的下一步是蛋白A柱親和性層析。結(jié)合的抗體利用低pH纟差沖液洗脫。蛋白A洗脫液保持一定時(shí)間以便滅活病毒。該過程的下一步可以是在Q(+)柱上的離子交換層析，其中抗體產(chǎn)物流過并且污染物如DNA和宿主細(xì)"包蛋白結(jié)合至4主樹脂。146該過程的下一步可以是在s(-)柱上的第二次離子交換層析，其中污染物流過該柱。可以使用疏水性相互作用柱步驟代替s(-)柱步驟。該過程的下一步可能是納米過濾病毒移除步驟，使用DV20或Planva過濾器。產(chǎn)物流過該過濾器。該過程的最后步驟是滲析到最終藥物制劑緩沖液中以及超濾以實(shí)現(xiàn)耙蛋白濃縮。實(shí)施例16:鼠類抗-SlP抗體的人源化變體的生物學(xué)活性體外細(xì)"包測(cè)定測(cè)試人源化抗體在如圖12所示的化療劑存在下改變腫瘤細(xì)月包存活的能力。SKOV3肺瘤細(xì)胞暴露于紫杉醇(泰素)，其為一種通過活化細(xì)胞凋亡執(zhí)行者-半胱天冬酶(caspase)-3而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的化療劑。相比于對(duì)照未處理細(xì)力包，S1P能夠降4氐紫杉醇i秀導(dǎo)的半胱天冬酶-3的活化和/或細(xì)胞死亡。細(xì)月包凋亡測(cè)定如生產(chǎn)商(Promega,Cat.NoG7792)所推薦的實(shí)施。簡(jiǎn)而言之，將A549細(xì)胞(每孔2500個(gè)細(xì)月包)4妄種到96-孔才反中并在處理之前允許生長(zhǎng)至80%鋪滿。細(xì)胞然后在有和沒有0.1-l|uM紫杉醇(Sigma,Cat.NoT7409)、O.l-l(iMS1P和ljag/mL的抗-SlPmAb下，在McCOy;咅養(yǎng)基中處理48h。在48h之后，將半胱天冬酶-3測(cè)定緩沖液加入到該細(xì)月包。上清液中的半胱天冬酶-3活性根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案通過Apo-OneHomogeneousCaspase-3/7Assaykit(Promega，Cat.NoG7792)進(jìn)4于測(cè)量。半胱天冬酶-3/7活性按照相對(duì)于載體處理細(xì)月包的熒光信號(hào)增加的倍數(shù)表示。半胱天冬酶-3(caspase-3)活化通過在S1P存在下加入抗-SlPmAb而增力。，表明S1P的保護(hù)性抗-細(xì)胞凋亡作用通過抗體對(duì)S1P的選擇性吸附而消除。相比于LT1002，人源化抗體變體huMAbHCLC3(LT1004)和huMAbHCLC5(LT1006)表現(xiàn)出優(yōu)異的活147性。平行地，測(cè)試所有變體對(duì)SIP誘導(dǎo)的細(xì)胞因子從癌細(xì)胞釋放的作用。已經(jīng)知道SIP引發(fā)IL-8從癌細(xì)胞顯著釋放到細(xì)胞條件培養(yǎng)基中。小鼠只于照4元-SlPmAb的力口入以濃度依賴')"生方式減少了IL-8乂人卵巢癌細(xì)胞的釋放。相比于HuMAbHCLC3(LT1004)和huMAbHCLC5(LT1006)，兩種人源化變體huMAbHCcysalaLC3(LT1007)和huMAbHCcysalaLC5(LT1009)表現(xiàn)出IL-8釋放的更大程度的減少。實(shí)施例17:鼠類mAb(Sphingomab)坤目對(duì)人源4匕mAb(Sonepcizumab)在新血管形成動(dòng)物模型中的體內(nèi)效力脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)是指起源于脈絡(luò)膜通過Bruch膜破裂進(jìn)入眼中的視網(wǎng)膜下色素上皮(sub-RPE)或一見網(wǎng)膜下間隙中的新血管生長(zhǎng)。CNV是黃斑退化癥和其他眼病癥中#見力喪失的一個(gè)主要病因。CNV的小鼠模型在這個(gè)實(shí)施例中用來評(píng)價(jià)針對(duì)S1P的mAb。比較人源化抗體變體和鼠類抗體抑制AMD的CNV動(dòng)物模型中的新血管形成的能力，如圖13所示。通過3皮璃體內(nèi)癥合藥，向小鼠兩次(第0天和第6天)纟合予0.5嗎的鼠類mAb(Mu:LT1002)、人源化變體[LC3(LT1004)，LC5(LT1006),HCcysLC3(LT1007)和HCcysLC5(LT1009)]或非特異性mAb(NS),然后經(jīng)歷Bruch膜的激光石皮裂。小鼠在激光手術(shù)后14天殺死。對(duì)照小鼠用含水緩沖液(PBS)或同種型匹配的非特異性抗體處理。人源化變體中的三個(gè)基本上等同于鼠類抗體在抑制血管發(fā)生上的作用，如通過CNV面積測(cè)量所評(píng)估的。CNV病變體積表示為平均值土SEM。包含在輕鏈中的5個(gè)回復(fù)突變并具有在重鏈CDR2中的半胱氨酸突變的人源化變體(huMAbHCcysLC5;LT1009)顯著地抑制新血管形成。這種差別是高度統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。148對(duì)于CNV的誘導(dǎo)，小鼠以5^L/20g體重的劑量腹膜內(nèi)給予在無菌鹽水中的氯胺酮(14mg/kg)和賽拉嗪(30mg/kg)的混合物進(jìn)行麻醉。它們的曈孔然后每個(gè)用一滴眼用托吡卡胺(0.5%)和去氧腎上腺素(2.5%)進(jìn)行擴(kuò)散。然后，連接到狹縫燈(slitlamp)以遞送在150mW具有50斑尺寸的100msec月永沖的氬氣綠色眼用激光器(OculightGL532nm，IridexCorporation,MountainView,CA)用來石皮壞位于在相對(duì)9、12和3點(diǎn)處距碎見盤大約50的右眼的三個(gè)象限中的Bruch力莫。左眼在所有情況下用作未受損對(duì)照。CNV病變的形態(tài)測(cè)定和體積測(cè)定一企測(cè)如下。在激光i秀導(dǎo)CNV之后兩周，動(dòng)物通過過劑量的氯胺酮-賽拉嗪混合物麻醉，然后用在PBSpH7.5中的6ml4。/。多聚甲醛經(jīng)過心臟刺穿進(jìn)行全身灌注，如之前描述(Senguptaeta1.，2003)。然后剜出眼，用27g4十頭lmm纟彖后部刺穿，并在室溫下在固定劑中浸泡lh，然后通過在PBS中浸泡30min進(jìn)行清洗2X。然后解剖眼睛以分離有4見網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜內(nèi)層和鞏膜構(gòu)成的后段。該組織然后羅丹明結(jié)合的蓖麻凝集素I(VectorLaboratories,Burlingame,CA);參透并反應(yīng)，長(zhǎng)口前戶斤述檢觀'JCNV病變(Senguptaetal"2003;Senguptaetal.,2005)。后部杯然后-陂切成4-7力文射狀切片，并平鋪到具有一滴Vectashield抗-褪色介質(zhì)(VectorLaboratories,Burlingame，VT)的顯孩吏4竟載iE皮片上，用于通過具有RGB斑點(diǎn)高分辨率凄t字照相4幾的ZeissAxioplan2和激光掃描共焦顯孩M竟(BioRadMRC1024，BioRadCorporation,Temecula,CA)拍才聶數(shù)字照片。捕獲的凄史字照片利用ImageJ壽欠件(ResearchServicesBranch,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)通過形態(tài)測(cè)定進(jìn)4亍^H介。照片分成用于如下紅和綠通道分析的單個(gè)RGB通道1)通過對(duì)特定物體和顯孩"竟的才交準(zhǔn)以i殳置像素-長(zhǎng)度比；2)利用Otsu算法4吏用閾值；3)照片制成二元的；4)概括感興趣的區(qū)域(ROI)以包括149整個(gè)病變區(qū)；5)實(shí)施顆粒分析以定量ROI內(nèi)在閾值水平上方的傳_素區(qū)。對(duì)于體積測(cè)定分析，過程類似于上述的，只是l吏用z-軸捕獲。整個(gè)z-系列的病變區(qū)總和然后乘以z厚度(通常4)nm)以獲得病變體積。在該才莫型中測(cè)試的藥物產(chǎn)品是LT1002(S1P的鼠類mAb;SphingomabTM)、LT1004(人源化mAb)、LT1006(人源化mAb)，LT1007(人源化mAb)和LT1009(人源4bmAb;Sor^pcizumabTM)。還包括鹽水介質(zhì)和非特異性抗體(NSA)對(duì)照。如圖13所示的，鼠類mAbLT1002(SphingomabTM)和人源化mAbLT1009(SonepcizumabTM)在這個(gè)CNV小鼠才莫型中顯著減少病變。所有測(cè)試的mAb表^L出病變尺寸大約80-98%減少，其在所有情況下者卩是顯著性的(相對(duì)鹽水，pO.OOl)。另外，相比于非特異性抗體對(duì)照，LT1007和LT1009還表現(xiàn)出顯著抑制(p<0.05)。病變尺寸的抑制百分比在LT1002(鼠類)為約80%，在LT1004(人源化)為約82%，在LT1006為約81%以及在LT1009為約99%。因此，LT1009是這個(gè)新血管形成的體內(nèi)模型中最具活性的人源化mAb變體。實(shí)施命J18:Sonepcizumab劑量v^應(yīng)的確定在激光誘導(dǎo)石皮裂Bmch膜的前一天，小鼠(n=10)4姿受單個(gè)、雙側(cè)JE皮璃體內(nèi)注射逐漸增高劑量的sonepcizumab(0.05,0.5,1.0或3.0pg/目艮)或高劑量非特異性(NS)抗體(3.0iLig/眼)。在激光破裂后14天，小鼠麻醉并用熒光素標(biāo)記的葡聚糖灌注，并制備脈絡(luò)月莫展開固定片以用于CNV病變尺寸分析。在該研究中，sonepcizumab*會(huì)藥量和鄉(xiāng)會(huì)藥時(shí)間間隔對(duì)CNV氺卩制的作用利用另一種量化CNV區(qū)的有效方法進(jìn)行考察，其中動(dòng)物在殺死之前用熒光素標(biāo)"i己的葡聚津唐剛剛灌注。Sonepcizumab在CNV150區(qū)誘導(dǎo)了劑量依賴性減少，導(dǎo)致在3.0ng/眼劑量下大約50%的最大抑制。這種減少是顯著性的(使用未配對(duì)t檢驗(yàn)，相比于非特異性抗體對(duì)照，pO.OOOl)。在給藥頻率研究中，在超過14-天的研究中，在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第0天)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第0天和第7天)用Sonepcizumab處理的組之間7見察到類似歲丈力。將利用Sonepcizumab處理(3.0pg/眼)觀察到的大約50%的最大抑制有利地與之前在相同模型中并由相同研究者實(shí)施的試驗(yàn)中公開的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，證實(shí)通過VEGF-Trap)(4.92jiig/眼減小CNV區(qū)。Saishin，etal.CW/尸—》/，2003.195(2):p.241-8。"Trap"(RegeneronPharmaceuticals,Inc)是兩個(gè)不同受體成分和稱為Fc區(qū)的抗體分子的Fc區(qū)之間的融合體，并且VEGF-Trap是通過Regeneron3艮蹤眼病和癌癥。這些兩個(gè)獨(dú)立研究之間的比4交表明，通過Sonepcizumab減小CNV病變尺寸比利用VEGF-Trap觀察到的20個(gè)更大的百分點(diǎn)。因此，這些數(shù)據(jù)不僅證實(shí)我們關(guān)于抗-SlP治療減少CNV鼠類4莫型中病變形成的能力的初步發(fā)現(xiàn)，而且它們還i正實(shí)該人源化抗體Sonepcizumab在抑制CNV病變形成以及抑制4十對(duì)抗?jié)B入性4是供滲入的的能力方面增加的效果。實(shí)施例19:Sonepcizumab在早產(chǎn)A^L網(wǎng)膜病變的鼠類模型中減少視網(wǎng)膜新血管形成中的作用C57BL/6小鼠(n=7)在生命的第7天置于75°/。氧中并在生命的第12天回到環(huán)境空氣中，并在一只眼中鄉(xiāng)合予3pgSonepcizumab的目艮內(nèi)注射，而在對(duì)側(cè)眼中給予介質(zhì)(vehicle)。在第17天，小鼠接受用FITC標(biāo)記的抗-PECAM抗體的眼內(nèi)注射并在8小時(shí)后，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉并取出眼睛，并在PBS緩沖的福爾馬林室溫下固定5小時(shí)。視網(wǎng)膜切除并用包含0.25%TritonX-100的磷酸緩沖鹽水清151洗，整體固定。載玻片用Nikon熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并且每個(gè)視網(wǎng)膜的^L網(wǎng)膜NV的面積通過照片分析進(jìn)行檢測(cè)。與在鼠類激光破裂模型中觀察到的CNV減少一致，我們也觀察到早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)的鼠類模型中CNV的顯著減少。相比于鹽水對(duì)照，Sonepcizumab(3.0(ig/目艮)的玻璃體內(nèi)給藥導(dǎo)致視網(wǎng)膜新血管形成的幾乎4倍的減少。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了Sonepcizumab在一見網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管床中抑制病態(tài)眼部血管發(fā)生，無i侖是局部擊夾血導(dǎo)致的或Bruch力莫-皮裂導(dǎo)致的。實(shí)施例20:Sonepcizumab在基-底膜栓子測(cè)定中對(duì)VEGFi秀導(dǎo)的血管發(fā)生的作用體內(nèi)新血管形成利用GFR基底膜栓子測(cè)定實(shí)施，如在Staton，etal"IntJExpPathol,2004.M(5):p.233-48中4笛述的。S奪4-6周齡nu/nu小鼠在左側(cè)面注射500^1的冰冷GFR基底膜。GFR基底膜單獨(dú)注射(對(duì)照)或在加入補(bǔ)充了100昭/ml肝素的10(ag/mLVEGF之后注射。由3只用于對(duì)照和sonepcizumab處理的動(dòng)物組成組。在GFR基底月莫才直入之前1天，動(dòng)物用鹽水和sonepcizumab(lOmg/kg)處理，并且在實(shí)驗(yàn)持續(xù)期間每72h腹膜內(nèi)給予各個(gè)劑量。在12天后，殺死動(dòng)物；切除栓子并立即在鋅和無福爾馬林固定劑中固定過夜，埋入石蠟中并切片(5um)。石蠟埋入切片然后對(duì)CD31(Pharmingen)染色。通過數(shù)字照相機(jī)以20x放大獲取照片(每個(gè)切片9張照片，每個(gè)栓子3個(gè)切片)，并且CD31陽性染色然后通過PhotoShop6.0程序量化并通過ImageJ表示為血管發(fā)生計(jì)射像素2).Sonepcizumab的抗形成血管作用在該基底膜栓子測(cè)定中明顯。如預(yù)期的，在填加了10昭/mlVEGF的基底膜栓子中誘導(dǎo)了廣泛新血管形成(在缺少VEGF或sonepcizumab的未處理只于照中的大約1525.75x)。重要的是，在基底膜注射之前，利用sonepcizumab的系統(tǒng)管密度增加。這種減少是顯著性的(p<0.05，相比于單獨(dú)的VEGF)，并且i正實(shí)了當(dāng)系纟克i也纟會(huì)予動(dòng)物時(shí)sonepcizumab的;昝在4元國形成血管活性，并且有力地表明了sonepcizumab能夠顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與來自Lpath的腫瘤學(xué)規(guī)劃的數(shù)據(jù)一致，因而SIP抗體在鼠類原位乳腺癌模型中減少多種血管形成因子包括VEGF的血清7K平。與AMD相關(guān)的血管生長(zhǎng)的主要組成是周細(xì)胞的聚集，其包圍并支持生長(zhǎng)的內(nèi)皮血管。Jo,etal.,AmJPathol,2006.168(6):p.2036-53。轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明，VEGF和PDGF-B是刺激周細(xì)胞滲入和分4匕的主要因子，導(dǎo)致血管成熟和穩(wěn)-定4匕。Guo,etal.，AmJPathol,2003.162(4):p.1083-93;Benjamin,L.E.，I.Hemo,andE.Keshet，Development,1998.125(9):p.1591-8。重要地，SIP促進(jìn)VEGF和PDGF的反式激活。因此，son印cizumab間"接中和這些生長(zhǎng)因子的能力表明，sonepcizumab可以防止AMD期間的異常血管生長(zhǎng)。實(shí)施例21:Sonepcizumab顯著減少在Bruch膜激光破^>^>^的血在Bruch膜激光破裂的鼠類才莫型中，給予Sonepcizumab評(píng)價(jià)抑制血管滲漏(除了抑制如上所示的新血管形成外)的效力。C57BL/6小鼠(n=10)在每一只眼的3個(gè)位置經(jīng)歷Bruch膜的激光石皮裂并在一只眼中眼內(nèi)注射3)Lig的Sonepcizumab,對(duì)側(cè)目艮中注射介質(zhì)。在激光破裂后一周，小鼠腹膜內(nèi)注射給予12nl/g體重的1%熒光素鈉，之后麻醉5分鐘。取出眼睛并在室溫下在PBS緩沖153的福爾馬才木中固定5小時(shí)。然后切除4見網(wǎng)月莫，清洗，并用一級(jí)(primary)抗-PECAM-l孵育。然后清洗一見網(wǎng)月莫，用二級(jí)(secondary)抗體(結(jié)合有羅丹明的羊抗-大鼠IgG)孵育，然后展開固定。CNV病變面積的定量通過PECAM-1染色進(jìn)4亍4企測(cè)。血管、滲漏的定量通過熒光素鈉染色進(jìn)4亍才全測(cè)?？?、滲漏面積來自CNV=CNV+滲漏(綠色)-CNV面積(紅色)。數(shù)值表示對(duì)于n=10只小鼠/組的平均值士SEM。脈絡(luò)膜新血管形成面積(通過PECAM-1染色)用LT1009處理的動(dòng)物為約0.015mm2,而鹽7K處理的只于照動(dòng)物為約0.03mm2。這是新血管形成的50%減少(p-0.018)。來自月永絡(luò)膜新血管形成的滲漏面積(通過熒光素染色)對(duì)于用LT1009處理的動(dòng)物為約0.125mm2，而鹽水處理的對(duì)照動(dòng)物為約0.2mm2。這是血管滲漏中大約38%的減少(p-0.017)。在用3.0ng/眼的Sonepcizumab或PBS對(duì)照處理的小鼠中脈絡(luò)膜新血管形成和血管滲漏減少的代表性免疫組織化學(xué)照片與這些結(jié)果一致。因此，除了減少CNV外，Sonepcizumab在〖敫光石皮裂Bruch膜的視網(wǎng)膜水腫之后顯著減少血管滲漏，其在視敏度喪失中起主要作用，血管滲漏與以下有關(guān)(i)AMD中的脈絡(luò)膜新血管滲漏；和(ii)糖尿病中血4見網(wǎng)膜屏障的石皮壞。Gerhardt,H.andC.Betsholtz，CellTissueRes，2003.314(1):p.15-23。Sonepcizumab減少目艮中的病態(tài)血管形成以及導(dǎo)致一見網(wǎng)膜水腫的血管滲漏。這些發(fā)現(xiàn)與小鼠用熒光素標(biāo)記的葡聚糖灌注的CNV面積定量實(shí)-驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)一致。經(jīng)由這種方法的CNV定量確定地受血管滲透影響。高度有利的結(jié)果說明了在脈絡(luò)膜血管床中的抗-滲透作用。給定這些數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為Sonepcizumab具有成為單一療法的潛力。與目前pan-VEGF-A封閉劑的協(xié)同效應(yīng)的可能性也存在。154實(shí)施例22:在用針對(duì)SIP的抗體處理之，后視網(wǎng)膜中巨喧細(xì)胞:^入減少老年性黃斑退4b癥(AMD)是一種與逐漸石皮壞4兌利中心—見覺的與老4b相關(guān)的疾病。有兩種主要的黃斑退4b癥類型。占到85-90%AMD病例的干性或萎縮形式AMD病例以及濕性形式的AMD的特征在于異常血管生長(zhǎng)。當(dāng)稱為玻璃疣的黃色斑點(diǎn)開始從主要在黃斑區(qū)i或中石皮壞組織的沉淀或石爭(zhēng)片聚集時(shí)，i貪斷為干性黃斑退化癥?？赡馨l(fā)生逐漸的中心視覺喪失。對(duì)于最流行的AMD萎縮(干性)形式?jīng)]有有效的治療。萎縮性AMD由位于光感受器細(xì)胞下方并通常對(duì)這些感光細(xì)胞提供關(guān)4建代謝支持的一見網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中的異常所引起。次于RPE功能障礙，黃斑棒和推體變性，導(dǎo)致視力不可逆喪失。氧化作用應(yīng)激、缺血、J皮璃疣形成、脂褐素聚集、局部炎癥和反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生代表萎縮性AMD發(fā)病機(jī)制表現(xiàn)的病理過程。在這些過程之中，炎癥作為對(duì)組織損害的關(guān)鍵促進(jìn)因素出現(xiàn)。巨噬細(xì)胞滲入到患有干性AMD的患者的黃斑中已凈皮證實(shí)是損害性的炎性反應(yīng)的一個(gè)重要部分。因此，可以減輕巨噬細(xì)胞滲入的試劑將是有價(jià)值的治療劑，因?yàn)榫奘杉?xì)胞滲入的抑制將可能消除黃斑組織損害。這樣的試劑也可以降低干性AMD轉(zhuǎn)化成濕性AMD的速率。在缺血和炎性視網(wǎng)膜病變的模型中，現(xiàn)在已被證實(shí)在用抗SIP抗體的治療之后巨噬細(xì)胞滲入抑制55%。這些數(shù)據(jù)利用良好建立的鼠類氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型(也稱為早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)模型)產(chǎn)生。特別地，將C57BL/6小鼠在生命的第7天放入75%氧中并在生命的第12天回到環(huán)境空氣，并在一只眼中菱會(huì)予眼內(nèi)注射的3pg人源化抗S1P抗體(LT1009,SonepcizumabTM)，而在另一只眼中注射介質(zhì)。在生命的第17天，小鼠接受眼內(nèi)注射的針對(duì)F4/80(—種pan-巨噬細(xì)月包標(biāo)記物)的FITC標(biāo)記抗體，并且在8小時(shí)后，小155鼠麻醉。取出眼球并在室溫下在PBS緩沖的福爾馬林中固定5小時(shí)。切除3見網(wǎng)膜并用包含0.25%TritonX-100的石岸酸》爰沖鹽7JC清洗，并整體固定。載玻片利用Nikon熒光顯微鏡觀察并將視網(wǎng)膜巨噬細(xì)胞定量。結(jié)果示于下表8中。表8:通過用針對(duì)S1P的人源化單克隆抗體處理，碎見網(wǎng)膜中巨喧細(xì)/胞;參入的減少<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>基于這些數(shù)據(jù)和已知的巨噬細(xì)胞在干性AMD發(fā)病機(jī)制中的作用，i人為4元-SlP4元體^^表一種有歲文的治療干性AMD的治療劑。實(shí)施例23:棵NCr小鼠中SCCOLO205結(jié)腸直腸腫瘤異種移;fafc^單獨(dú)4吏用25-75mg/kgLT1009和聯(lián):合阿瓦斯丁(Avastin)或紫杉醇4吏用25-75mg/kgLT1009治療的^jl這個(gè)研究的目的是確定單獨(dú)LT1009和LT1009聯(lián)合另一抗癌劑在延遲站,性Ncr(nu/nu)小鼠中皮下移才直和建立的人類結(jié)腸直腸(COLO205)癌腫瘤的進(jìn)展的效力。棵小鼠在右側(cè)面附近皮下植入來自體內(nèi)途徑的COLO205腫瘤的一個(gè)片,殳/小鼠。在每個(gè)實(shí)-驗(yàn)中的60只小鼠建立范圍在大約100至200mm3大小的肺瘤時(shí)，所有治療開始。然后小鼠(11=10/組)用25mg/kg的LT1009、50mg/kgLT1009、40mg/kgP可瓦其斤丁、50mg/kgLT1009+40mg/kg阿瓦斯丁、15mg/kg紫杉醇或介質(zhì)(鹽水)進(jìn)行處理。25或50mg/kgLT1009和鹽7jc然后在實(shí)-驗(yàn)期間以0.1mL/20g156體重的體積腹膜內(nèi)給予一次q3d。阿瓦斯丁在q7d時(shí)間表上以40mg/kg/每次的劑量靜脈內(nèi)給藥，以0.1mL/20g體重的體積注射。紫杉醇(陽性對(duì)照)在qldx5時(shí)間表上以15mg/kg/每次的劑量靜脈內(nèi)給藥，以0.1mLAOg體重的體積注射。在第21天，將25mg/kgLT1009的劑量在研究持續(xù)時(shí)間內(nèi)增加至75mg/kgLT1009。每天，見察動(dòng)物的死亡率。腫瘤尺寸和體重每周收集兩次，乂人治療的第一天開始并且包括研究終止的那天。當(dāng)每個(gè)研究中的介質(zhì)(vehicle)處理的對(duì)照組中的中間肺瘤達(dá)到約4,000mg時(shí)，終止該研究。收獲來自每個(gè)動(dòng)物的月中瘤，i己錄濕重，處理月中瘤以通過CD-31染色確定微血管密度(MVD)。腫瘤重量(mg)利用用于橢球體(/x^2)/2=1111113的方程技術(shù)，其中l(wèi)和w是指在每次測(cè)量收集的較大和較小尺寸，并假定單位密度(1mm3=1mg)。表9:發(fā)現(xiàn)物-Cok)205的數(shù)值概括相比于^h質(zhì)處理小鼠處理最終腫瘤重量(mg)的減少％介質(zhì)3047.25-50mg/kgLT腦92071.1732%25/75mg/kgLT10092465.6020%阿瓦斯丁1967.9035%阿瓦^j"丁十50mg/kgLT10091614.4048%紫杉醇0100%50mg/kgLT1009實(shí)質(zhì)性地抑制腫瘤進(jìn)展(p<0.018)，如通過最鄉(xiāng)冬肺瘤重量測(cè)4尋的，當(dāng)相比于鹽7K處理動(dòng)物時(shí)減少32%。25/75mg/kgLT1009在減少20%最終肺瘤重量中也是有效的；然而，這種減少不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。50mg/kgLT1009與阿瓦斯丁在減少最終胂瘤重量中一樣有效(分別為32%和35%減少)。LT1009與阿瓦斯丁的組合比每個(gè)單獨(dú)試劑都更有效，當(dāng)相比于鹽水處理動(dòng)物時(shí)，顯157示出腫瘤重量48%的減少。因此，LT1009和阿瓦斯丁的作用看起來是可累加的。陽性對(duì)照紫杉醇完全消除預(yù)先建立的腫瘤。實(shí)施例24:棵NCr小鼠中SCHT29結(jié)腸直腸腫瘤異種移植對(duì)單獨(dú)用50mg/kgLT1009和用50mg/kgLT1009與阿瓦斯丁和5國FU纟且合的治療的M這個(gè)研究的目的是評(píng)價(jià)LT1009單獨(dú)和組合另一抗癌劑在針對(duì)雌性無胸腺NCr-nu/nu小鼠中皮下植入人類HT29結(jié)腸腫瘤異種移才直的抗胂瘤效力?？眯∈笤谟覀?cè)面附近皮下植入來自體內(nèi)途徑的HT29腫瘤的一個(gè)片段/小鼠。當(dāng)每個(gè)實(shí)驗(yàn)中60只小鼠建立范圍在約100至200mm3的尺寸范圍的腫瘤時(shí)，所有治療開始。每個(gè)治療組有IO只小鼠。在實(shí)-瞼期間以0.1mL/20g體重的體積腹月莫內(nèi)q2d給予50mg/kgLT1009和鹽水。75mg/kg5-FU和20mg/kg阿瓦斯丁分別以75mg/kg/每次和20mg/kg/每次的劑量腹膜內(nèi)和靜月永內(nèi)給藥，q4d,以0.1mL/10g體重的體積注射。第一次主會(huì)予LT1009由請(qǐng)爭(zhēng)月永內(nèi)鄉(xiāng)會(huì)予100mg/kg構(gòu)成。每天7見察動(dòng)物的死亡率。肺瘤尺寸和體重每周收集兩次，,人治療的第一天開始并且包括研究終止的那天。當(dāng)每個(gè)研究中介質(zhì)處理的對(duì)照組中的中間腫瘤達(dá)到大約4，000mg時(shí)，終止研究。收獲來自每個(gè)動(dòng)物的腫瘤，記錄濕重，并且處理腫瘤以通過CD-31染色確定MVD。月中瘤重量(mg)利用用于橢5求體(/xw2)/2=mm3的方程才支算，其中l(wèi)和w是指在每次測(cè)量收集的較大和較小尺寸，并假定單位密度(1mm3=1mg)。表10最終肺瘤重量-HT29治療介質(zhì)LT1009阿瓦斯丁LT1009+阿瓦斯丁5-FULT1009+5-FU最終腫瘤重量(mg)顯著性(p.值)相比于^h質(zhì)處理小鼠的減少％2723.672390.631927.441624.901963.711948.001.000.390.0010.0990.04913%30%41%28%29%50mg/kgLT1009減少腫瘤進(jìn)展，如通過腫瘤重量測(cè)得的，當(dāng)相比于來自鹽7K處理動(dòng)物的力中瘤時(shí)，減少13%,而阿瓦斯丁減少30%的腫瘤重量。LT1009與阿瓦斯丁的組合比任何單獨(dú)試劑更有效，當(dāng)相比于鹽水處理動(dòng)物時(shí)顯示出腫瘤重量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性地41%的減少。用5-Fu處理減少28%的腫瘤重量。5-FU表現(xiàn)出與LT1009最小的累加效應(yīng)，顯示出最終腫瘤重量的29%抑制。實(shí)施例25:棵NCr小鼠中SCDU145前列腺腫瘤異種移植對(duì)單獨(dú)4吏用50mg/kgLT1009或用50mg/kgLT1009《且合阿瓦斯丁或紫杉醇的治療^^應(yīng)這個(gè)研究的目的是確定LT1009單獨(dú)和組合其他抗癌劑在延遲雌性Ncr(nu/nu)小鼠中皮下抑制(sc)和建立的人類前列腺(DU1145)癌性肺瘤進(jìn)展的效力。-陳小鼠在右側(cè)齒面附近皮下植入來自體內(nèi)途徑的DU145腫瘤的一個(gè)片革殳/小鼠。當(dāng)每個(gè)實(shí)-瞼中60只小鼠建立范圍在約100至200mm3的尺寸范圍的肺瘤時(shí)，所有治療開始。小鼠(n-10/組)然后用50mg/kg的LT1009、20mg/kg阿瓦其斤丁、7.5mg/kg紫杉醇、50mg/kgLT1009+20mg/kg阿瓦斯丁、50mg/kgLT1009+7.5mg/kg紫杉醇或介質(zhì)(鹽水)進(jìn)4亍處理。50mg/kgLT1009和鹽水在實(shí)-瞼期間以0.1mL/20g體重的體積腹膜內(nèi)q2cU會(huì)予。紫杉醇和阿瓦斯丁159分別以75mg/kg/每次和20mg/kg/每次的劑量腹膜內(nèi)和靜月永內(nèi)qldx5和q4d纟會(huì)藥，以0.1mL/10g體重的體積注射。第一個(gè)LT1009劑量由靜脈內(nèi)給予100mg/kg構(gòu)成。在研究的過程中，腫瘤生長(zhǎng)通過4全測(cè)皮下肺瘤在三個(gè)軸上的<直并計(jì)算體積而進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在研究結(jié)束時(shí)，確定最終肺瘤重量和體積，然后殺死小鼠，收獲肺瘤。胂瘤的微血管密度(MVD)然后通過CD-31染色確定。表ll:對(duì)發(fā)現(xiàn)物-DU145的數(shù)值概括<table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table>50mg/kgLT1009顯著地(pO.OO)減少胂瘤進(jìn)展，如通過最終月中瘤重量測(cè)定的，減少28%。當(dāng)與鹽7jc處J里的動(dòng)物的"中瘤時(shí)相比時(shí)，阿瓦斯丁和紫杉醇也顯著(PO.OO)減少胂瘤重量的80%。LT1009沒有顯著增大阿瓦斯丁或紫杉醇的抗腫瘤活性，如通過最終腫瘤重量測(cè)定的。實(shí)施例26:CB17SCID小鼠中RPMI8226人類骨髓_瘤異種移#^~單獨(dú)4吏用25mg/kg或50mg/kgLT1009和用25mg/kg或50mg/kgLT1009纟且合硼#^米(Bortezomib)的治療^^這個(gè)研究的目的是評(píng)價(jià)LT1009單獨(dú)和組合抗癌劑硼替佐米(Bortezomib)在乂于扭侏性CB17SCID小鼠皮下植入的人類RPMI人骨髓瘤異種移植的抗腫瘤效力。凈果小鼠(CB17SCID，4-5周齡，重18-22mg,獲自Harlan的雌性小鼠)皮下注射從組織培養(yǎng)物收獲的RPMI8226纟田胞(1x107個(gè)細(xì)力包/小鼠)。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至大約100mm3大小時(shí)，動(dòng)物通過腫瘤尺寸配對(duì)到治療和對(duì)照組(10只小鼠/組)中。初始纟會(huì)藥在S己對(duì)后第1天開始。所有《且中的動(dòng)物4姿重量鄉(xiāng)合藥(0.01ml/g;10ml/kg)。介質(zhì)中的LT1009通過每3天腹膜內(nèi)(IP)注射一次進(jìn)行給藥，直到研究完成(Q3D至結(jié)束)。硼替佐米經(jīng)由尾靜脈每3天一次通過靜月永內(nèi)注射給藥，達(dá)到6個(gè)治療(Q3Dx6)。為了用作陰性只于照，LT1009介質(zhì)(0.9。/。鹽7K)在Q3D直至結(jié)束時(shí)間表上給藥。每周記錄兩次單個(gè)和組平均肺瘤體積土SEM，直至研究完成，從第1天開始。對(duì)于每一個(gè)組，最終平均胂瘤體積士SEM在研究完成時(shí)才艮告；經(jīng)歷部分或完全腫瘤消退的動(dòng)物或經(jīng)歷4支術(shù)或藥物相關(guān)死亡的動(dòng)物/人這些計(jì)算中4非除。表12:最終肺瘤體積-RPMI最終腫瘤重量相比于介質(zhì)處理小治療(mg)鼠的減少％介質(zhì)20830硼替佐米166420%25mg/kgLT1009186011%50mg/kgLT100919785%50mg/kgLT1009+硼替佐米183212%本文中描述的和要求-床護(hù)的所有組合物和方法才艮據(jù)本4皮露內(nèi)容可以在無需過度實(shí)驗(yàn)的情況下制得和實(shí)施。雖然本發(fā)明的組合物和方法依據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以對(duì)所述組合物和方法施加變化。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯的所有這樣的類似替換和更改認(rèn)為在如由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。161在本說明書中提及的所有專利、專利申請(qǐng)、以及出版物是本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員的水平的指示。所有專利、專利申請(qǐng)和出版物，包括要求的優(yōu)先^又或其他權(quán)益的那些文獻(xiàn)，通過引用并入本文中，如同每一個(gè)單個(gè)出版物具體和單獨(dú)地指明通過引用并入的程度一樣。本文舉例說明性地描述的發(fā)明可以在缺少本文沒有特定披露的任何元件或要素的情況下實(shí)施。因此，例如，在本文中的每一種情況下，術(shù)語"包含"、"基本上由…構(gòu)成"、以及"由…構(gòu)成，，中的任一個(gè)可以用另外兩個(gè)中的任一個(gè)替代。所采用的術(shù)語和表達(dá)用于描述而不是限定，并且在使用這樣的術(shù)語和表達(dá)中不排除所示出和所描述的特征、或其部分的任何等同替換，但是應(yīng)當(dāng)理解，各種修飾在要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選實(shí)施方式和最佳特4正具體地進(jìn)4亍了4皮露，4旦是本文披露的概念的更改和變化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員做到，并且這樣的更改和變化認(rèn)為屬于由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種用于治療或預(yù)防與鞘氨醇-1-磷酸(S1P)水平升高相關(guān)的眼疾或眼病的方法，包括給予需要這種治療的受試者的目標(biāo)眼組織有效量的組合物，以治療或預(yù)防所述眼疾或眼病，因而治療或預(yù)防所述目標(biāo)眼的所述眼疾或眼病，其中，所述組合物包含抗-S1P劑，所述抗-S1P劑是在生理?xiàng)l件下與S1P具有反應(yīng)活性的免疫衍生部分。2.根據(jù)權(quán)利要求i所述的方法，其中，與sip水平升高相關(guān)的所述眼疾或眼病選自由年齡相關(guān)性黃斑變性、力永絡(luò)力莫新生血管、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、角膜移植排斥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、鐮狀紅細(xì)胞性視網(wǎng)膜病變、自發(fā)性息肉狀脈絡(luò)膜血管病變、缺血性視網(wǎng)膜病變、激光損傷、視網(wǎng)膜靜脈閉塞性疾病、新生血管性青光眼、黃斑皺褶、玻璃紙才羊一見網(wǎng)月莫病變、erm形成、隱形眼鏡超時(shí)戴4竟癥、牽4i性^L網(wǎng)膜脫離、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、創(chuàng)傷性眼損傷、眼瘢痕性類天皰癡、眼組織胞漿菌病、—見網(wǎng)月莫血管瘤增殖、史-約綜合征、中毒性表皮壞死松解癥型藥疹、翼狀胬肉、角膜感染、以及眼手術(shù)后果組成的組。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述角膜感染選自由單純皰滲感染、帶4犬皰滲感染和原蟲感染《且成的纟且。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述眼手術(shù)選自由屈光手術(shù)、玻璃體切割術(shù)和青光眼手術(shù)組成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，與S1P水平升高相關(guān)的眼疾或眼病的特征在于至少部分的異常新血管形成、異常纖維生成、纖維4b、疤痕化、和/或發(fā)炎。6.才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,或局部給藥的。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,是干性年齡相關(guān)性黃斑變性。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,是濕性年齡相關(guān)性黃斑變性。其中，所述組合物是系統(tǒng)、目艮內(nèi)其中，所述年齡相關(guān)性黃斑變性其中，所述年齡相關(guān)性黃斑變性9.一種用于眼部主會(huì)藥的組合物，包含載體和分離的抗-SlP劑，所述抗S1P劑在生理?xiàng)l件下與鞘氨醇-l-磷酸(S1P)具有特異的反應(yīng)活性并且包含至少一個(gè)具有氨基目臾序列的CDR肽，所述氨基酉臾序列與選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)、ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:ll)和LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組中的肽氨基酸序列具有至少50%,可選地至少65%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列同一性。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述至少一個(gè)CDR肽的序列同一性選自由一個(gè)肽氨基酸序列的至少80%、至少90%和至少95%組成的組，所述肽氨基酸序列選自由DHTIH(SEQIDNO:13)、AISPRHDITKYNEMFRG(SEQIDNO:31)、GGFYGSTIWFDF(SEQIDNO:15)、ITTTDIDDDMN(SEQIDNO:10)、EGNILRP(SEQIDNO:ll)和LQSDNLPFT(SEQIDNO:12)組成的組。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述抗-SlP劑選自由抗體、抗體片革殳、抗體衍生物和非抗體源性分子組成的組。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述抗-SlP劑是全長(zhǎng)抗體，所述抗體可選地是親和力成熟的抗體。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述抗-SlP劑選自由嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體組成的組。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述抗體由兩個(gè)免疫球蛋白重鏈和兩個(gè)免疫球蛋白輕鏈構(gòu)成，其中每一個(gè)免疫球蛋白重鏈包含才艮據(jù)SEQIDNO:32的氨基酸序列并且每一個(gè)免疫球蛋白輕鏈包含根據(jù)SEQIDNO:33的氨基酸序列。15.才艮據(jù)一又利要求11所述的組合物，其中，所述抗體由兩個(gè)免疫球蛋白重鏈和兩個(gè)免疫球蛋白輕鏈構(gòu)成，其中每一個(gè)免疫球蛋白重鏈包含根據(jù)SEQIDNO:35的氨基酸序列并且每一個(gè)免疫球蛋白輕鏈包含根據(jù)SEQIDNO:37的氨基酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述載體是適于眼部給藥的藥用載體。17.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中，所述組合物包含磷酸鹽緩沖鹽水。18.—種用于眼部給藥的組合物，包含載體和抗SIP劑，所述抗SIP劑包含純化的抗-SlP抗體或其片革殳，其中，所述抗體或其抗體片段的每一個(gè)免疫球蛋白重鏈包含具有SEQIDNO:32的氨基酸序列的可變結(jié)構(gòu)i或，并且所述抗體或其抗體片賴:的每一個(gè)免疫5求蛋白輕鏈包唾、具有SEQIDNO:33的氨基酉臾序列的可變結(jié)構(gòu)域。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中，所述載體是適于眼部給藥的藥用載體。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中，所述組合物包含磷酸鹽緩沖鹽水。全文摘要本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療疾病和病癥，尤其是眼疾或眼病，的組合物和方法，所述疾病和病癥的特征在于異常纖維化或結(jié)疤、發(fā)炎和/或異常新血管形成或血管形成。本發(fā)明的組合物和方法利用與生物活性脂質(zhì)鞘氨醇-1-磷酸及其變體具有特異反應(yīng)活性的免疫源性部分，該部分能夠降低所靶向的生物活性脂質(zhì)的有效濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中，該免疫源性部分是與鞘氨醇-1-磷酸具有反應(yīng)活性的人源化單克隆抗體。文檔編號(hào)A61K39/395GK101687031SQ200780048648公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日發(fā)明者威廉·A·加蘭,格倫·L·斯托勒,羅格·A·薩巴迪尼申請(qǐng)人:勒帕斯公司