專利名稱：：“海普諾”在制備治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體地說是一種海洋天然活性化合物"海普諾"的制備方法、藥理活性及藥學(xué)用途。該化合物及其衍生物作為胰島素增敏劑，可用于治療胰島素抵抗類2型糖尿病。
背景技術(shù)：
：糖尿病(DiabetesMellitus,DM)是一種慢性的代謝分泌內(nèi)分泌疾病，據(jù)2007年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)資料，全世界成年糖尿病患者人數(shù)約2.46億，其中2型糖尿病(T2DM)患者占總糖尿病患者90。/。以上。到2025年，全世界的糖尿病患者人數(shù)預(yù)計將達(dá)到3.8億。目前用于治療T2DM的藥物主要有雙胍類、磺脲類、(x-糖苷酶抑制劑和噻唑烷二酮類等，由于它們多是針對病癥而不是針對病因分子耙點(diǎn)藥物的設(shè)計，因而存在各種弊端。因此，市場急需安全有效、價格合理且能長期安全服用的降糖藥物。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素，酪氨酸磷酸化是胰島素效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的重要環(huán)節(jié)，受PTK和PTP共同調(diào)節(jié)。PTK在胰島素信號傳遞中的作用很早即被人們關(guān)注，但直到最近，人們才逐漸認(rèn)識到PTP在糖尿病發(fā)病中的重要性。Gold-stein研究表明，胰島素抵抗患者的胰島素耙組織中PTP1B和LARPTP表達(dá)增加，且能阻斷胰島素受體酪氨酸的激活以及胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；Elchebly等發(fā)現(xiàn)，PTP1B基因剔除鼠可提高胰島素的敏感性，且增敏效應(yīng)具有組織特異性。研究表明，胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素，PTP1B在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的負(fù)調(diào)控作用，現(xiàn)已證實(shí)它在T2DM的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，可能成為T2DM的病因新耙點(diǎn)。國際上對PTP1B抑制劑的研究不多，主要有以下幾類(1)、肽類含磷酸化酪氨酸殘基(pTyr)的肽類底物與PTP1B有較高的親和性，但其化學(xué)和生物穩(wěn)定性差；(2)、萘醌類Naphthnoquinone:通過修飾PTPase的活性位點(diǎn)來抑制酶的活性；(3)、噻唑烷二酮類Azolidinediones:通過增加耙器官的胰島素敏感性來改善血糖的控制，主要包括ciglitazone、troglitazone和rosiglitazone，但由于嚴(yán)重的肝臟毒性，ciglitazone已從市場撤出；(4)、Benzo[b]naphthol[2，3-d]furans禾口thiophenes類以benzbromarone為先導(dǎo)化合物進(jìn)行設(shè)計合i^的系列Benzo[b]naphthol[2,3-d]furans和thiophenes類化合物，在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的降血糖活性，但要最終成為治療糖尿病藥物還需要克服很多障礙，如電負(fù)性高、細(xì)胞膜通透性差以及選擇專一性差等，以上因素都使這些抑制劑的成藥性降低；目前尚未見溴酚類化合物作為PTP1B抑制劑抗糖尿病方面的研究報道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種新型的胰島素增敏劑-"海普諾"，該化合物及其衍生物通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶IB的活性，增強(qiáng)胰島素受體敏感性，可用于治療胰島素抵抗類2型糖尿病。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下1、"海普諾"的制備與結(jié)構(gòu)鑒定風(fēng)干的松節(jié)藻i/zo&me/acw7/enwV^樣品粉碎后用95%乙醇提取，提取液減壓濃縮；濃縮物用蒸餾水懸浮后，用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮。乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫，直至二者體積比為1:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脫，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢查，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得14個部分L,Lw。L9部分[氯仿甲醇=4:l]洗脫部分經(jīng)過硅膠色譜，采用氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，重結(jié)晶可得純化合物，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-溴-4-[2'，3'-二溴-4',5'-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1,2—二苯酚(中文)；3-bromo-4-[2',3'-dibromo-4'，5'-dihydroxypheny]methyl-5-(ethoxymethyl)1,2-benzenediol(英文)。2二蛋白酪氨酸磷脂酶1B抑制活性測定采用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建基因重組的hGST-PTPlB-BL21Co//人類PTP1B工程菌，以GST親和層析柱純化hGST-PTPlB蛋白質(zhì)，利用含有磷酸的多肽para-NitrophenylPhosphate(pNPP)被PTP1B酶解掉一個磷酸后的產(chǎn)物pNP在波長405nm處有吸收峰的原理，以PTPlB作用后生成pNP的量表示PTP1B酶活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況，計算化合物PTP1B酶活力抑制率及IC50。3、急性毒性觀察試驗(yàn)采用Hom法對"海普諾"進(jìn)行毒性觀察試驗(yàn)。4、高脂飲食-鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2DM大鼠體內(nèi)降糖試驗(yàn)(1)造模wistar大白鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分組，實(shí)驗(yàn)組飼以高脂飼料，對照組飼以正常飲食，連續(xù)喂養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)組禁食24小時后，按照35mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素，誘導(dǎo)糖尿病模型，以血糖大于16.7mmol/L確定為糖尿病模型組。(2)治療采用隨機(jī)分組法，將成模大鼠分為模型組，高、中、低劑量組及陽性對照組(文迪雅)；分別得到正常組(l組)、模型組(糖尿病不干預(yù)組)(2組)、海普諾低劑量組(3組)、海普諾中劑量組(4組)、海普諾高劑量組(5組)、陽性對照文迪雅組(6組)。1組、2組等體積羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液灌胃，36組分別以海普諾低、中、高劑量和文迪雅灌胃(臨床用量的劑量換算，drat=dhumanxRrat/Rhumanx(Whuman/Wrat)1/3，Rrat=90;Rhuman=100)。(3)指標(biāo)檢測每7天測定各組實(shí)驗(yàn)大鼠血糖，持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來源于紅藻的卣代化合物"海普諾"(HPN)不僅具有新穎的碳骨架結(jié)構(gòu)，而且能夠顯著抑制PTP1B酶活性，阻斷胰島素受體與胰4島素受體底物的去磷酸化，從而增強(qiáng)胰島素敏感性，達(dá)到控制血糖的目的，是一種針對病因靶點(diǎn)并能有效防治胰島素抵抗T2DM的化合物；此外，毒性試驗(yàn)結(jié)果也表明HPN屬于低毒化合物，為HPN的臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。與現(xiàn)有臨床藥物相比，本發(fā)明具有作用靶點(diǎn)新穎，安全性高，可長期服用以及價格便宜等明顯優(yōu)勢；作為一種新型、高效低毒的胰島素增敏劑，"海普諾"能夠針對病因靶點(diǎn)，并對胰島素抵抗類T2DM具有良好的防治功效。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1"海普諾"的制備與結(jié)構(gòu)鑒定松節(jié)藻(干重20kg)粉碎后用95。/。乙醇100L提取，提取液減壓濃縮；濃縮物用10L蒸餾水懸浮后，用等體積乙酸乙酯萃取，減壓濃縮。乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮(100:01:1)梯度洗脫，直至二者體積比為1:1(石油醚于石油醚和丙酮混合洗脫液中的體積濃度沿梯度從100%-50%變化)，改用氯仿-甲醇(100:00100)梯度洗脫(氯仿于氯仿-甲醇混合洗脫液中的體積濃度沿梯度從100%-0%變化)，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢査，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得14個部"Lw。L9部分[氯仿甲醇體積比=4:l]洗脫部分經(jīng)過硅膠色譜，采用氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，重結(jié)晶可得純化合物95mg，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-溴-4-[2'，3'-二溴-4',5'-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1,2—二苯酚(簡稱海普諾),化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下CH2OEt上述化合物具有以下理化特性。淺黃色針晶(DMSO),熔點(diǎn)mp197-199°C;紅外光譜IR(KBr)v應(yīng)3527,3415，2875，1610,1585,1568，1478,1469，1406,1348,1302,1271,1097,1076,1003，955，872，808cm";低分辨質(zhì)譜EIMSw/z(%)530,528,526，524[M]+(4,12，12，4),484(11),482(34)，480(34)，478(12),467(9),465(28)，463(31),461(10),403(30),401(58),399(31),384(18),357(17),355(17)，353(7),322(100),320(97),393(15),391(15)，24256)，213(33),184(24)，161(32),160(35)，139(25),121(51)，58(80);高分辨質(zhì)i普HREIMSw/z523.8466(計算值C16H1579Br305,523.8470);核磁共振NMR(acetowe-^，500MHz)S7.00(1H，s,H-4),4.13(2H,s,H畫7),3.40(2H，q，J=7.0Hz,H畫9),1.06(3H,t，J=7.0Hz，H-IO)，6.08(1H,s,H-6');核磁共振13CNMR(acetowe-《，125MHz)5144.1(s,C曙l)，142.8(s,C-2),114.4(s,C匿3),128.8(s,C-4),130.5(s,C-5)，114.3(d,C-6),38.8(t,C-7)，70.7(t，C-8),65.5(t,C-9)，14.7(q，C-IO)，131.8(s，C-l')，115.6(s,C-2'),112.9(s，C-3')，142.8(s,C-4'),144.7(s，C-5')，114.3(d，C畫6')。本發(fā)明所述化合物不僅包括從自然界中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物，也包括其它來源如化學(xué)合成、生物合成等手段得到的合成產(chǎn)物。實(shí)施例2蛋白酪氨酸磷脂酶1B抑制活性測定將待測化合物(3-溴-4-[2'，3'-二溴陽4',5'-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1,2-二苯徵用0]^80配制成不同濃度的供試品溶液，取2pL供試品溶液分別加入到標(biāo)準(zhǔn)的測活體系(50mMTris-HCl,PH6.5,2mMpNPP,2%DMSO,30nMhGST-PTPlB)，陰性對照DMSO，陽性對照正釩酸鈉(2pM)，反應(yīng)溫度為30°C，動態(tài)測定波長為405nm處的光吸收，時間3min，按如下公式計算化合物PTP1B酶活力抑制率及IC5Q(LOGIT法)。抑制率=(實(shí)驗(yàn)組A值-陰性對照組A值)/(對照組A值-陰性對照組A)xlOOX，結(jié)果見表l。表l蛋白質(zhì)酪氨酸磷脂酶1B抑制率(％)及ICsoTable1Inhibition(%)andIC50ofPTP1B項(xiàng)目抑制率(％)ic50濃度200|aM/mL20|aM/mL2nM/mL0.2pM/mL(xM/mL海普諾109.298.989.364.70.83試驗(yàn)結(jié)果表明化合物對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶IB具有良好的抑制作用。實(shí)施例3急性毒性觀察試驗(yàn)20只昆明小鼠，隨機(jī)分成4組，每組雌性3只，雄性2只，分籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d;第四天給藥前禁食16h，飲水不限，分別以5000mg/kg，500mg/kg及50mg/kg劑量灌胃ig，觀察24h，小鼠死亡數(shù)為0。實(shí)施例4高脂飲食-鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2DM大鼠體內(nèi)降糖試驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)動物雄性Wistar大鼠(250士20g)，青島市實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院SPF級試驗(yàn)動物中心。正常黑夜交替，自由飲食進(jìn)水。所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，待進(jìn)一步研究。將大鼠按體重隨機(jī)分為6組，1'組飼以普通飲食，2'-5'組飼以高脂飲食(碳水化合物20%,蛋白質(zhì)21%,脂肪59%)，時間8周。每次測定血糖和注射鏈脲佐菌素前禁食12小時，但可自由飲水。(2)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型(STZ-DM)2'-5'組禁食24小時后，按照35mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌(streptozotocin，STZ，購自Sigma公司)誘導(dǎo)糖尿病模型。STZ使用前即時配置，溶解于0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，PH4.5。注射STZ后48小時測空腹血糖(FBG)，以FBG血糖高于16.7mmol/L確立為糖尿病造模成功。(3)分組與治療造模成功大鼠按照FBG隨機(jī)分為5組(2-5組)，每組10只。(正常對照組(l組)、陰性對照組(2組)灌服等體積羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液；治療組(3、4禾f!5組)分別按照5、10和20mg/kg劑量灌服海普諾，溶媒為羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液。陽性對照組(6組)按照LOmg/kg劑量灌服馬來酸羅格列酮(文迪雅)。1組正常對照組(非糖尿病，不治療)2組糖尿病大鼠陰性對照組(糖尿病，不治療)3組糖尿病大鼠海普諾5mg/kg劑量組4組糖尿病大鼠海普諾10mg/kg劑量組5組糖尿病大鼠海普諾20mg/kg劑量組6組糖尿病大鼠陽性對照組(羅格列酮1.0mg/kg)藥物溶液或溶媒以注射器灌胃，每天一次，共計56天；期間各組大鼠均飼以普通飼料，自由飲食進(jìn)水。(4)血樣采集與生理指標(biāo)測定在藥物治療的第0、7、14、21、28、35、42、49和56天，于大鼠禁食12小時后，尾靜脈取血，用血糖儀(OnetouchUltra,美國)測定FBG，結(jié)果見表2。表2海普諾對大鼠血糖的影響(n=10)Table2EffectofHPNonserumglucoseindiabeticmice(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2可見，與模型組比較，海普諾低、中、高劑量組對鏈脲佐菌素所致的糖尿病小鼠血糖升高具有明顯的抑制作用，具有較好的降血糖治療作用o該化合物及衍生物通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶IB的活性，增強(qiáng)胰島素受體敏感性，對胰島素抵抗類2型糖尿病具有良好的治療作用。權(quán)利要求1.“海普諾”在制備治療2型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述“海普諾”的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下其中苯環(huán)的6，7和2′位碳所連接的基團(tuán)為氫；8位碳與乙氧基相接；化學(xué)名稱中文為3-溴-4-[2′，3′-二溴-4′，5′-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚；英文為3-bromo-4-[2′，3′-dibromo-4′，5′-dihydroxypheny]methyl-5-(ethoxymethyl)1，2-benzenediol；具有PTP1B酶抑制活性的海洋天然產(chǎn)物“海普諾”，能夠通過負(fù)調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強(qiáng)胰島素受體敏感性，使胰島素生理功能正常發(fā)揮，進(jìn)而調(diào)控血糖，達(dá)到對胰島素抵抗類2型糖尿病的治療功效。2.按照權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述胰島素增敏劑"海普諾"還可為化合物"海普諾"的藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚等化學(xué)等價物的任一單體或混合物用于制備治療和預(yù)防2型糖尿病的醫(yī)學(xué)藥物中。3.按照權(quán)利要求l所述應(yīng)用，其特征在于所述"海普諾"及其的藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚可與醫(yī)藥上可接受的藥物載體混合制成片劑、膠囊劑、口服液、栓劑或注射劑。4.按照權(quán)利要求l所述應(yīng)用，其特征在于所述的胰島素增敏劑"海普諾"，其來源不僅為天然產(chǎn)物，或采用化學(xué)合成或生物合成方法的合成產(chǎn)物。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型的胰島素增敏劑“海普諾”及其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、醚和其它明顯的化學(xué)等價物，所述“海普諾”的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖，其中苯環(huán)的6，7和2′位碳所連接的基團(tuán)為氫；8位碳與乙氧基相接；化學(xué)名稱中文為3-溴-4-[2′，3′-二溴-4′，5′-二羥基苯基]甲基-5-(乙氧基)-1，2-二苯酚；英文為3-bromo-4-[2′，3′-dibromo-4′，5′-dihydroxypheny]methyl-5-(ethoxymethyl)1，2-benzenediol；該化合物及衍生物通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶1B的活性，增強(qiáng)胰島素受體敏感性，對胰島素抵抗類2型糖尿病具有良好的治療作用。文檔編號A61P3/00GK101559048SQ20081001529公開日2009年10月21日申請日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者史大永,敬李,曉范,鳳許,郭書舉,韓麗君申請人:中國科學(xué)院海洋研究所