專利名稱：：具有雙陽(yáng)離子側(cè)臂的二(2,2’-聯(lián)吡啶)合銅配合物在消除超氧離子自由基中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有雙陽(yáng)離子側(cè)臂的二(2，2'-聯(lián)吡啶)合銅配合物在消除超氧離子自由基中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，自由基致病和致哀學(xué)說(shuō)在醫(yī)學(xué)界受到普遍支持。當(dāng)氧分子失去一個(gè)電子后就形成的超氧離子自由基(02，—)是人體內(nèi)氧代謝首先形成的自由基，它們?cè)诜肿娱g和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化以及宿主免疫防御機(jī)制等方面有重要作用。但是，Or非?；顫姡軈⑴c一系列的連鎖反應(yīng)，而且能進(jìn)一步產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)的羥基自由基。因此它也能攻擊復(fù)制中的基因，引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，造成基因突變，激活人體免疫系統(tǒng)，使體內(nèi)的許多酶及激素失去生物活性，機(jī)體的免疫能力、神經(jīng)反射能力、運(yùn)動(dòng)能力等系統(tǒng)活力降低，同時(shí)還能破壞核酸結(jié)構(gòu)和導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體代謝失常等，最終使機(jī)體發(fā)生病變。已經(jīng)證實(shí)它的過(guò)量能導(dǎo)致衰老及許多疾病，包括癌癥、糖尿病、中風(fēng)、腦血栓、關(guān)節(jié)炎、肌萎縮側(cè)索硬化癥等。通常，細(xì)胞通過(guò)超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，簡(jiǎn)稱SOD)催化體內(nèi)O,的歧化反應(yīng)，能夠壓制它們中的大部分，把它們的數(shù)量控制在一定范圍內(nèi)。而SOD是體內(nèi)清除(V的專一性酶，它在生物界的分布極廣，幾乎從人到動(dòng)物、植物，都有它的存在。SOD被醫(yī)學(xué)界稱之為"人體清道夫"，在醫(yī)學(xué)臨床上可以治療多種疾病，在防輻射，抗腫瘤等方面也有積極的作用，而且廣泛用于化妝品保護(hù)皮膚。但是天然SOD具有提取困難、價(jià)格高、穩(wěn)定性差、難于透過(guò)細(xì)胞膜以及異體抗原性等缺點(diǎn)，在臨床治療應(yīng)用上受到了限制。因此，近年來(lái)許多小分子模擬物引起了人們的重視并取得了重要進(jìn)展。因此，模擬生命體系的SOD，進(jìn)一歩發(fā)展限制氧化應(yīng)激和清除Or—的SOD替代品，將是預(yù)防和治療SOD失活導(dǎo)致的疾病的一種有效途徑。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究顯示動(dòng)物紅細(xì)胞的SOD的活性中心含有一個(gè)獨(dú)特的咪唑橋聯(lián)的Q^-Z^+異雙核結(jié)構(gòu)，因此，通常用Cu，Zn-SOD表示。在該活性中心，屬于五配位畸變四方錐構(gòu)型的Cu2+，處于一個(gè)約4A寬的圓錐形溶劑通道的底部。人們做了大量的努力試圖通過(guò)模擬Cu，Zn-SOD的結(jié)構(gòu)特征來(lái)獲得具有醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值的超氧離子自由基清除劑。但是，迄今為止，所報(bào)道的模擬物的SOD活性都比較低，最高的活性也只能達(dá)到天然Cu，Zn-SOD活性的20%。最新研究顯示Cu,Zn-SOD的活性受到活性中心周圍氨基酸殘基的影響。在其活性腔口靠近配位水分子處有一帶正電荷的精氨酸Argl41(在植物或人Cu，Zn-SOD中為Arg143)，它與活性中心012+之間的距離為5.88A，有吸引02—入腔的作用，誘導(dǎo)CV靠近活性中心，如果這個(gè)Argl41被電中性或負(fù)電性的氨基酸殘基取代，會(huì)使酶的活性降低一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這說(shuō)明正電荷的氨基酸殘基在SOD的催化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。還有研究表明，在Cu,Zn-SOD活性中心附近有幾個(gè)疏水性氨基酸側(cè)鏈，如纈氨酸Valll6和丙氨酸Ala138，它們與活性中心Cu"之間的距離為46人，它們的突變也可以改變SOD的生物活性。另外，蘇氨酸Thrl35因含有羥基，從而對(duì)腔的親水性起重要作用，近年來(lái)，利用電化學(xué)和Fourier變換紅外光譜技術(shù)對(duì)SOD的研究揭示，氨基酸主鏈提供的電荷補(bǔ)償作用以及溶劑通道儲(chǔ)存電子的性質(zhì)，是Cu，Zn-SOD具有高催化活性的兩個(gè)關(guān)鍵因素。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的困難，改變技術(shù)偏見(jiàn)，提供一種具有雙陽(yáng)離子側(cè)臂的二(2，2'-聯(lián)吡啶)合銅配合物的應(yīng)用于模擬SOD消除超氧離子自由基的技術(shù)方案，本技術(shù)方案是通過(guò)對(duì)二(2，2'-聯(lián)吡啶)合銅配合物連接帶正電荷的季銨離子側(cè)臂來(lái)模擬Cu,Zn-SOD的活性區(qū)的疏水環(huán)境和有識(shí)別功能的精氨酸殘基，從而實(shí)現(xiàn)高效清除超氧離子自由基的目的。本發(fā)明所述的具有季銨離子側(cè)臂的2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物結(jié)構(gòu)如下R3N++NR3CI)上述結(jié)構(gòu)式可以用化學(xué)式[Cu(L)2Br](C104)5來(lái)表示，L是金屬離子與陰離子以外的有機(jī)基團(tuán)，其屮N上連有三個(gè)相同的垸基R，R是乙基、正丁基或正辛基，對(duì)應(yīng)的配合物為L(zhǎng)產(chǎn)5，5'-二(三乙銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶、L^5,5'-二(三正丁銨基甲基)-2,2'-聯(lián)吡啶或Lf5，5'-二(三正辛銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶，平衡的陰離子是高氯酸根。上述配合物帶有正電性和疏水性的季銨離子側(cè)臂，晶體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示，側(cè)臂上正電荷的氮原子與012+之間的距離約為6.06.4A，這與Cu，Zn-SOD中正電荷Argl41與Cu"之間的距離比較相近；另外配合物側(cè)鏈上的疏水性烷基鏈環(huán)繞在012+周圍，其位置也與Cu，Zn-SOD中的疏水性氨基酸側(cè)鏈非常相似，而且直接在配體的合成屮引入的正電荷和疏水性取代基團(tuán)比包合物中結(jié)合得更加牢固。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，所述的技術(shù)方案具有如下有益效果本發(fā)明改變了現(xiàn)有技術(shù)單純模擬天然Cu,Zn-SOD活性中心結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)SOD替代品的思路，提供了一種全新的尋找SOD模擬物的途徑；本發(fā)明所述的配合物經(jīng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，配合物的SOD活性明顯提高，甚至能夠達(dá)到牛紅細(xì)胞SOD活性的一半，接近山葵SOD的活性，并且超過(guò)了以往文獻(xiàn)報(bào)道的所有模型物的SOD活性，是目前最活性最高的消除超氧離子自由基的配合物。圖1是實(shí)施例2中所測(cè)得的天然酶和三種不同銅配合物催化02—歧化的抑制率曲線，圖中1是5,5'-二(三乙銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物，2是5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物，3是5，5'-二(三正辛銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶乙基合銅配合物。圖2是實(shí)施例3中pH值變化對(duì)5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的SOD活性影響。圖3是5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的循環(huán)伏安滴定圖，銅離子與5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶的摩爾t匕分另l』是0.0:2.0(a)，0.5:2.0(b),1.0:2.0(c)，1.5:2.0(d)，2.0:2.0(e)禾卩2.5:2.0mM(f)，條件為1:1DMF-H20作為溶劑，0.1MTBAP作為支持電解質(zhì)，鉑絲電極作為輔助電極，玻碳電極作為工作電極，SCE電極作為參比電極，掃描速度為lOOmVs.1，氮?dú)獗Ｗo(hù)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l配合物的活性測(cè)定方法(X-XO-NBT法)X-XO-NBT法是指黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-氯化硝基四氮唑法。用超純水配制pH值為7.8，濃度為50mM的磷酸鹽緩沖溶液，并以緩沖液為溶劑配制濃度分別為1.50x10—3M和1.50x10-3M的黃嘌呤和NBT溶液，再用該緩沖液配制lU/mL的黃嘌呤氧化酶溶液，避光冷藏保存，配合物的溶液用含5免DMSO的磷酸緩沖液配制。做SOD活性測(cè)定時(shí)，首先測(cè)量不加SOD或配合物時(shí)02—產(chǎn)生的吸光度變化，依次加入黃嘌呤溶液1.0mL，NBT溶液1.0mL，磷酸鹽緩沖液0.070-0.100mL，攪拌并在25±0.1。C的水浴中恒溫10min，攪拌下再加入黃嘌呤氧化酶溶液0.100-0.130mL，并同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，1.5min后用Cary300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在5min內(nèi)測(cè)定560nm吸光度的變化，求出吸光度變化AO，要求將吸光度的變化(a4560/Amin)控制在0.025±0.002范圍內(nèi)，取3min內(nèi)所測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。然后用同樣的方法測(cè)定加入SOD或其配合物時(shí)的吸光度變化As，最后由公式/(%)=(Ao-As)x100a4。求出各濃度下配合物對(duì)O2—的抑制率/(%)。最后以配合物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，求出抑制率為50%時(shí)配合物的濃度，即為衡量其SOD活性的參數(shù)/C5()。實(shí)施例2天然酶和配合物的SOD活性測(cè)定結(jié)果配合物以及天然牛紅細(xì)胞超氧化物歧化酶(BeSOD)催化02—歧化的活性使用X-XO-NBT法進(jìn)行了測(cè)定。在不加天然酶或配合物和加入不同濃度天然酶或配合物時(shí)，測(cè)得樣品的吸光度數(shù)據(jù)隨時(shí)間的變化，對(duì)每個(gè)樣品吸光度隨吋間變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸擬合得一條直線，直線的斜率即為單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值(a4"0。不加天然酶或配合物時(shí)，樣品的吸光度變化用A)表示，加入天然酶或配合物時(shí)樣品的吸光度變化用A表示，用公式/(%)=(Aj-As)x100a4。求出每個(gè)天然酶或配合物在各種濃度下對(duì)超氧離子的抑制率/。然后以天然酶或配合物的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，得到清除劑催化02—歧化的抑制率曲線，如圖l所示。從圖1中求出抑制率為50%時(shí)配合物的濃度，即為天然酶或配合物的/Cso值，/C5o值是衡量配合物SOD活性的參數(shù)，通過(guò)比較/C50值可以判斷SOD配合物催化02—歧化的活性大小，/Cso值越小則表示配合物的SOD活性越高。配合物1-3的/Cso值分別為0.18±0.01、0.089±0.01和0.33±0.01jliM。配合物的SOD活性順序?yàn)?，5'-二(三正辛銨基甲基)-2,2'-聯(lián)吡啶合銅配合物<5，5'-二(三乙銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物<5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物。與以往報(bào)道的SOD替代品相比，5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的SOD活性是目前最高的。實(shí)施例3pH值變化對(duì)5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的SOD活性影響5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的/Cso值在pH68.5的范圍內(nèi)幾乎沒(méi)有變化，這與天然酶的特征一致。在pH為7.2時(shí)，5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的SOD活性最高(/C50=0.072±0.01|LiM)。結(jié)果顯示5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物在人生理pH值時(shí)表現(xiàn)出最高的SOD活性，超過(guò)天然牛紅細(xì)胞超氧化物歧化酶(BeSOD)活性(/C5Q=0.04|iM)的一半，并且與報(bào)道的來(lái)自一種天然植物(山葵，Hoseradish)的SOD的活性(/C50=0.07|iM)相當(dāng)。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)施例4配合物的電化學(xué)性質(zhì)測(cè)試配合物的氧化還原電勢(shì)利用循環(huán)伏安法在ZahnerElektrikIM6E型電化學(xué)工作站上進(jìn)行測(cè)定，使用三電極系統(tǒng)，鉑絲電極作為輔助電極，玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞(saturatedcalomelelectrode,SCE)電極作為參比電極。用體積比為1:1的DMF和水作溶劑，濃度為O.lM的四丁基高氯酸銨(tetra-butylammoniumperchlorate，TBAP)溶液作為支持電解質(zhì)，所有測(cè)試均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫進(jìn)行，掃描速度為100mVs'1。配合物的電化學(xué)滴定實(shí)驗(yàn)是在以上條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)固定配體的濃度，向配體中滴加金屬離子溶液，改變配體與金屬離子的物質(zhì)的量比值，觀察其電化學(xué)活性的變化。具體實(shí)驗(yàn)如下(1)以含有O.lM的四丁基高氯酸銨、體積比為l:l的DMF和水作溶劑，配制2mM的替代物2的配體溶液，再用該溶液配制96mM的高氯酸銅溶液。(2)取5ml上述配體的溶液，通氮?dú)?0min，然后在電化學(xué)工作站上用最低電位-600mV，最高電位600mV進(jìn)行測(cè)試。(3)向上述溶液中分次連續(xù)滴加上述高氯酸銅溶液，攪拌IOmin,通氮?dú)?0min然后在電化學(xué)工作站上用最低電位-600mV，最高電位600mV進(jìn)行測(cè)試。該步驟共重復(fù)5次，每次操作滴加氯酸銅溶液的體積分別為26.2pL,26.4^L，26.7pL，27.0jiL，27.3pL。實(shí)施例5配合物的電化學(xué)特性對(duì)5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果如表l所示(1)對(duì)應(yīng)的l:l和l:2的銅配合物具有相同的SOD酶活性，但它們的銅離子氧化還原電位值卻不同，二者在溶液中平衡共存，當(dāng)催化過(guò)程中的氧化還原態(tài)改變時(shí)，銅離子與配體的摩爾比發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致模擬體系的電位變化，即體系具有"電位轉(zhuǎn)換"功能，如圖3所示，而獲取額外的反應(yīng)自由能(AE);(2)具有雙季銨陽(yáng)離子側(cè)臂的配合物具有更高SOD酶活性，證明季銨陽(yáng)離子不僅能夠模擬SOD酶的Arg-143的生物功能，而且其誘導(dǎo)能力強(qiáng)，使得Cu原子周圍的配位N原子帶上較多的正電荷，以銅離子為中心形成了一個(gè)很大的正電荷區(qū)域，從而更容易吸附并清除有害超氧離子自由基；(3)由于三個(gè)銅配合物的電化學(xué)性質(zhì)相似，但SOD活性不同，說(shuō)明5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物雙季銨陽(yáng)離子側(cè)臂上的疏水鏈具有適宜的長(zhǎng)度，有利于配合物的催化超氧離子歧化。表l5，5'-二(三正丁銨基甲基)-2，2'-聯(lián)吡啶合銅配合物的電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注L-5,5'-二(三正丁銨基甲基)-2,2'-聯(lián)吡啶，e為一個(gè)電子，L2表示兩個(gè)L基團(tuán)。權(quán)利要求1.具有雙陽(yáng)離子側(cè)臂的二(2，2’-聯(lián)吡啶)合銅配合物在消除超氧離子自由基中的應(yīng)用。2、如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述二(2，2'-聯(lián)吡啶)合銅配合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R=CH3CH2-、CH3CH2CH2CH2-或CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。3、如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的二(2，2'-聯(lián)吡啶)合銅配合物結(jié)構(gòu)中帶正電荷的銨離子與Ci^+之間的距離為6.0-6.4人。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種具有雙陽(yáng)離子側(cè)臂的二(2，2’-聯(lián)吡啶)合銅配合物消除超氧離子自由基的應(yīng)用的技術(shù)方案，所述的技術(shù)方案是通過(guò)對(duì)二(2，2’-聯(lián)吡啶)合銅配合物連接帶正電荷的季銨離子側(cè)臂來(lái)模擬Cu，Zn-SOD的活性區(qū)的疏水環(huán)境和有識(shí)別功能的精氨酸殘基，從而實(shí)現(xiàn)高效清除超氧離子自由基的目的。本發(fā)明改變了現(xiàn)有技術(shù)單純模擬天然Cu，Zn-SOD活性中心結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)SOD替代品的思路，提供了一種全新的尋找SOD模擬物的途徑，而且所述的二(2，2’-聯(lián)吡啶)合銅配合物SOD活性測(cè)試結(jié)果超過(guò)了現(xiàn)有技術(shù)中所有模型物的SOD活性，達(dá)到天然牛紅細(xì)胞銅鋅超氧化物歧化酶SOD活性的一半，接近天然的山葵超氧化物歧化酶SOD的活性。文檔編號(hào)A61K31/444GK101284010SQ20081002770公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者燕安,李佶輝,毛宗萬(wàn),平胡,黃華珍申請(qǐng)人:中山大學(xué)