專利名稱：老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗及其制備方法，特別是一種老年性癡呆重組多價(jià)13-淀 粉樣蛋白1-15 (AU腺病毒疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
老年性癡呆(Alzheimer's disease, AD )是一種神經(jīng)細(xì)胞退行性疾病，臨床 以進(jìn)行性記憶和后天獲得的知識(shí)喪失為特征，直到最后病人喪失生活能力。隨 著發(fā)病人數(shù)的增加，AD給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，是一個(gè)重要的社會(huì)和醫(yī) 療衛(wèi)生問(wèn)題。關(guān)于AD的治療，目前尚無(wú)理想方法，現(xiàn)有的治療策略主要著眼 于緩解癥狀,并沒(méi)有阻止AD的病理進(jìn)程，其臨床療效并不理想。Afi是老年性 癡呆病理變化老年斑的主要成分，其由39-42個(gè)氨基酸組成。近年來(lái)的研究表 明，AB的集聚和沉積及其伴隨的神經(jīng)元損害是老年性癡呆病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)， 因此，針對(duì)AB的治療策略和方法相繼被提出。研究表明，1999年Schenk首次 才艮道{Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse [see comments]. Nature, 1999 Jul 8; 400(6740): 173誦7}采用免 疫學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因AD模型鼠(PDAPP鼠)治療；目前，國(guó)外的老年性癡呆疫 苗Afi42肽疫苗已進(jìn)入IIa臨床試驗(yàn)，由于部分試驗(yàn)病人出現(xiàn)了接種后綜合癥， 包括無(wú)菌性腦膜炎，實(shí)驗(yàn)因此停止。尸檢發(fā)現(xiàn)，在患者的軟腦膜、血管間隙及 腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有T細(xì)胞浸潤(rùn)，由此推測(cè)腦膜腦炎的發(fā)生可能與A1342全肽C末端含有 的毒性T細(xì)胞抗原表位(Afi16-42)激發(fā)了機(jī)體Thl型自身免疫反應(yīng)有關(guān)。因此， 通過(guò)去除Afi T細(xì)胞抗原表位、保留其B細(xì)胞抗原表位的方法來(lái)制備第二代AD疫苗的方法成為了首選。
最近文獻(xiàn)報(bào)道的第二代AD疫苗仍有許多不盡人意的地方1 )研究者們制 備的抗原大多為化學(xué)合成，合成肽的化學(xué)修飾難度大，成本高，而且純度不高。 2)研究者們?cè)谥苽浜蠥B N末端B細(xì)胞抗原表位的多價(jià)疫苗時(shí)，大多是將B 細(xì)胞抗原表位片段直接與一個(gè)新的T細(xì)胞表位連接，或者B細(xì)胞抗原表位直接 串聯(lián)，容易影響抗原的空間結(jié)構(gòu)，不利于AJ3的B細(xì)胞抗原表位的暴露。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服制備老年性癡呆疫苗的上述缺點(diǎn)，提供一種毒 性小、免疫原性好、以柔性肽連接AJ3B細(xì)胞抗原表位的一種老年性癡呆重組多 價(jià)ABw5腺病毒基因疫苗，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例為提供重組四價(jià)Mw5腺病毒基 因疫苗(Ad-4xAi315)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為了提供成本低、化學(xué)純度高的 生產(chǎn)該疫苗的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案合成多條寡核苷酸引物，通 過(guò)基因擴(kuò)增得到的兩個(gè)或以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)Afiw5基因片斷、IRES 基因片斷(internal ribosome entry site,核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn))及優(yōu)選釆用 GM-CSF基因片斷(采取人的GM-CSF即hGM-CSF，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (granulocyte/macrophage-colony stimulating factor)， 也可以采用白細(xì)胞介素-4 ， 依次克隆入pShuttle-CMV (購(gòu)自美國(guó)stratagene公司的商業(yè)質(zhì)粒)中，同時(shí)利用 pAdEasy系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Qbiogene公司)制備出能呈分泌性共表達(dá)柔性可折疊 的多價(jià)Afiw5及基因佐劑GM-CSF的重組腺病毒疫苗。其中，所述Afiws氨基酸 序列為
Asp陽(yáng)Ala誦Glu畫(huà)Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly誦Tyr-Glu-Val-His-His-Gln 柔性連接肽的序列可以為 Gly-Gly或Gly-Ser
其中，基因佐劑為GM-CSF,它能與多價(jià)Mw5基因呈分泌性表達(dá)。柔性連
接肽避免了多拷貝AB B細(xì)胞抗原表位的空間僵化結(jié)構(gòu)，還使AJ^5表位更容易 暴露，增強(qiáng)了免疫原性。同時(shí)也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。 GM-CSF作為基因佐劑有增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。
本發(fā)明的老年性癡呆重組多價(jià)Afiw5腺病毒基因疫苗的生產(chǎn)方法包括以下 步驟
(1) 合成多條寡核苷酸引物，通過(guò)基因擴(kuò)增得到的兩個(gè)或兩個(gè)以上含有柔性 連接肽基因 的二價(jià) 15 基因 片 斷 ； Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G/,G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser畫(huà)Gly-Tyr-Glu-Val誦His-His-Gln ( 2xAI315);
優(yōu)選第 一個(gè)二價(jià)AJ3w5基因之前含有Kozak序列及小鼠IgG k輕鏈信號(hào)肽序列。
(2) 將兩個(gè)或以上含有柔性連接肽基因的二價(jià)AB,-！5基因片斷依次克隆入質(zhì) 粒pcDNA3.1 (購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司的商業(yè)質(zhì)粒)，制備重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-s4xAfi15;酶切pcDNA3.1-s4xAI^質(zhì)粒，回收純化s4xAB15片斷；
(3) 合成多條寡核苷酸引物，PCR擴(kuò)增出GM-CSF基因片斷或白細(xì)胞介素-4 基因片斷、IRES基因片斷；
(4) 將從重組質(zhì)粒pcDNA3.1-s4xAfi!5酶切出的4xAl^基因片斷及(3)中 經(jīng)酶切純化的基因片斷依次克隆入pShuttle-CMV質(zhì)粒中制備 pShuttle-4xAB15-IRES-GMCSF重組穿梭載體；
(5) 利用pAdEasy系統(tǒng)，同源重組后，在人胚胎腎293A細(xì)胞中包裝出重組 腺病毒Ad-4xAfi15;
(6) 通過(guò)氯化銫密度梯度低溫超高速離心純化重組腺病毒Ad-4xA1^5,并進(jìn) 行滴度測(cè)定。
本發(fā)明選擇多價(jià)可折疊的Afiw5為免疫原，避免了多拷貝A6B細(xì)胞抗原表 位的空間僵化結(jié)構(gòu)，還使Al^表位更容易暴露，增強(qiáng)了免疫原性。同時(shí)也增加
了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。選擇以腺病毒為載體的抗原傳遞系 統(tǒng)，避免了化學(xué)合成的高難度及高成本的缺點(diǎn)。
另外，在選擇以GM-CSF細(xì)胞因子為基因佐劑時(shí)，還有增強(qiáng)體液免疫和細(xì) 胞免疫的功能；而采用白細(xì)胞介素-4,則可以促進(jìn)免疫反應(yīng)向Th2方向極化。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一 步說(shuō)明。
實(shí)施例一 以四價(jià)可折疊的A13w5為免疫原、以GM-CSF細(xì)胞因子為基因 佐劑的重組腺病毒基因疫苗的制備，包括以下步驟 1 Ad-4x AB15重組腺病毒疫苗的制備
1.1設(shè)計(jì)插入pShuttle-CMV的四價(jià)B細(xì)胞抗原表位片斷s4xAJ^序列及 IRES-GMCSF序列為Kozak + signal peptide + ABws + GG + Afiw5 + GS(5amHI) + A15w5 + GG + ABw5 + IRES + hGMCSF
pcDNA3.1 -s4x A仏5質(zhì)粒的構(gòu)建
1.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1 -4 x AB, 5構(gòu)建
1.2.1 設(shè)計(jì)插入pcDNA3.1的四價(jià)B細(xì)胞抗原表位片段4xAB^序列 Kozak + signal peptide(IgG k) + AB," + GG(linker) + AB^s + GS(5amHI)
(linker) + Aflws + GG(linker) + AJ3ws
1.2.2 Kozak + IgG k signal p印tide +八15,—15 + GG + ABw5 + GS(BamH I) (2xA1315-l,即第一個(gè)二價(jià)ABws基因)片段的引物設(shè)計(jì)
PI引物5，-GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAT TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA G*GL4 GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAT TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA GGA TCC GGG -3 ，。斜體加粗為甘氨酸連接肽，甘氨 酸連接肽前后分別為八1515堿基序列，加粗為S"mH I酶切位點(diǎn)，下劃線為引物 配只于的4tt。
P2引物5，-CCC GGA TCC TTG ATG ATG AAC-3，:加粗為Sa附HI酶切位
點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的石威基；
P3引物5 ，-TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC GAT GCA GAA TCC CGA CAT -3，；下劃線為引物配對(duì)的堿基；
P_4引物5，_GG GGT JCC GCC爿CC爿rG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG隱3，;加粗為《p"I酶切位點(diǎn)，斜體為Kozak 序列，下劃線為引物配對(duì)的堿基；
1.2.3 GS(5"m7/I) + AI3,.,5 + GG + Afiw5(2xAfi,5-2,即第二個(gè)二價(jià)Afiws基 因)片段的引物設(shè)計(jì)
P5引物5，- GGG GGA TCC GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAT TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA G*GL4 G*GL4 GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAT TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA TGA CTC GAG-3 ，；斜體加粗為甘氨酸 連接肽，甘氨酸連接肽前后分別為A1^44^序列，加粗分別為5awHI和^Tw I 酶切位點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的堿基；
P6引物5 ，- CCG CTC GAG TCA TTG ATG ATG -3 ，；加4丑為J^o I酶切位 點(diǎn)，下劃線為引物配對(duì)的堿基；
1.2.4 2xAfi^片段的擴(kuò)增
P2, P3為引物，以合成的PI引物為沖莫4反，ExTaq酶，94。C預(yù)變性5min， 然后94。C變性45s; 52。C退火30s; 72。C延伸45 s， 30次循環(huán)。最后72。C延伸 7min，擴(kuò)增P2xA仏w片段。然后，P2xAB^片段為模板，P2， P4為引物，相 同PCR條件擴(kuò)增2xA&w片段。1.5%的瓊脂糖電泳觀測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物純 化試劑盒純化。
1.2.5 2xAi^.2片段的擴(kuò)增
P5， P6為引物及模板，ExTaq酶，94。C預(yù)變性5 min,然后94。C變性45s; 52。C退火30s; 72。C延伸45 s, 30次循環(huán)。最后72。C延伸7 min,擴(kuò)增2xAI315-2 片段。
1.2.6 pcDNA3.1-4xAI^5的構(gòu)建
用K/w I和5awH I雙酶切2xAAw片段和pcDNA3.1 ?；厥站€狀pcDNA3.1 載體與2xA仏w片段，T4 DNA連接酶，16。C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a, 挑選轉(zhuǎn)化子，含氨千青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，Omega質(zhì)粒小量制備試劑盒 提取質(zhì)粒，用^p"I/SawHI于37。C雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組子命名為 pcDNA3.1-2xAB,w 。同樣，用5awHI和Wol雙酶切2xAB15.2片段和 pcDNA3.1-2xAJ3!w，以同樣的方法獲得陽(yáng)性重組子pcDNA3.1-4xA1315。
1.3 四價(jià)B細(xì)胞抗原表位片斷s4xAJ315片斷的獲取
以K/7"I和Wol雙酶切pcDNA3.1-s4xAJ^5質(zhì)粒，切膠回收s4xAI315片斷。
1.4 IRES片斷的引物設(shè)計(jì)
Pl引物CCGCTCGAGAATTCCGCCCCTCTCCCT。后18個(gè)堿基為IRES 上的》咸基序列，下劃線為Wol酶切位點(diǎn)。
P-2引物ACGCGTCGACCATATTATCATCGTGTT。后18個(gè)堿基為IRES 上的;成基序列，下劃線為酶切位點(diǎn)。
1.5 hGM-CSF(粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)基因片斷的引物設(shè)計(jì) P3引物
CCGCTCGAGAAGCTTGTCGACCACAACCATGTGGCTGCAGAGCCTG。 后18個(gè)堿基為hGM-CSF上的堿基序列，下劃線分別為和&/I酶切位點(diǎn)。 P4引物
CGGATATCTCACTCCTGGACTGGCTC。后18個(gè)^tt為hGM-CSF上的堿 基序列，下劃線為￡"coRV酶切位點(diǎn)。
1.6 pShuttle-s4xAB15的構(gòu)建
以《p"I和Wol雙酶切本課題組構(gòu)建的pcDNA3.1-s4xA1^5質(zhì)粒并切膠回收 s4xAi^5片斷，同樣雙酶切純化pShuttle-CMV載體。連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿 菌E.coli DH5a，陽(yáng)性重組子命名為pShuttle-s4><AB15。1.7 pShuttle-s4xAfi15-GM-CSF的構(gòu)建
抽取健康人血液，淋巴細(xì)胞分離液提取人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，ConA刺激72h后 提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄并以P3和P4為引物PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因片斷。 Wol和五coRV雙酶切純化的hGM-CSF基因片斷和pShuttle-s4xA1315重組子，連 接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5a。陽(yáng)性重組子命名為pShuttle-s4xAfi15-GMCSF。
1.8 pShuttle-s4xA1315-IRES-GMCSF重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
以pShuttle-IRES-hrGFP-1為模板，以PI和P2引物PCR擴(kuò)增IRES基因片 斷。Wol和Sa/I雙酶切純化的IRES基因片斷和pShuttle-s4xAfi15-GMCSF重組 子，連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli DH5a 。 陽(yáng)性重組子命名為 pShuttle-s4xA/515-IRES-GMCSF。
1.9 AD-4xA仏5重組腺病毒的制備 內(nèi)切酶線性化pShuttle-sAp4x『IRES-GMCSF，轉(zhuǎn)化Adeasier-1感受態(tài)
細(xì)胞，與骨架栽體ADeasy-1同源重組，尸acl鑒定陽(yáng)性重組子命名為 AD-sAp4xl5-IRES-GMCSF，大量提取陽(yáng)性質(zhì)粒，尸acl內(nèi)切酶線性化后用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染10天收集細(xì)胞，并反復(fù)3次凍融裂解 細(xì)胞，以裂解上清反復(fù)感染293A細(xì)胞，直到感染50-60個(gè)100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿， 收集細(xì)胞，凍融，分別進(jìn)行不連續(xù)和連續(xù)氯化銫密度梯度超高速離心，抽取病 毒帶透析后分裝保存于-8(TC。純化的病毒命名為AD-4xM15。
2 AD-4xAI315重組腺病毒在293A細(xì)胞的表達(dá)及鑒定
用AD-4xAJ^5重組腺病毒以感染復(fù)數(shù)(multiple of infection, MOI)為10感 染293A細(xì)胞，37°C, 5% C02培養(yǎng)箱孵育72 h，細(xì)胞出現(xiàn)完全細(xì)胞病變效應(yīng) (cytopathic effect, CPE),同時(shí)以AD-GMCSF (只克隆入IRES-GMCSF,以下 簡(jiǎn)稱AD-GMCSF)為陰性對(duì)照，同樣感染293A細(xì)胞。收集培養(yǎng)上清液，-20°C 保存。
取對(duì)照和表達(dá)分泌型s4xAB15的AD-4xAB15重組腺病毒293A細(xì)胞上清液， 加入等量加樣緩沖液，煮沸10 min后，12000 rpm,離心10 min,取20 fil上清 上樣。5 %濃縮膠，20 %的分離膠的制備的PAGE膠(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,聚丙烯酰胺凝膠電泳)，Tricine(三(羥甲基)曱基甘氨酸)電泳緩
ioresis，
十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳，電泳條件先40v恒壓約40min, 待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至恒壓60v,約3h。再lOOv電轉(zhuǎn)1.5h至聚偏二 氟乙烯(PolyvinylideneFluioride， PVDF)膜上，用5 %脫脂奶粉封閉2 h，加入抗Afi 單抗(1 : 2000, Sigma)孵育1 h, TBST緩沖液洗滌5次后，加入HRP-羊抗鼠 IgG (1:4000)，孵育lh。 TBST緩沖液洗滌5次后,顯影，同時(shí)以本申請(qǐng)人原核表 達(dá)并純化的GST-Afi42肽為免疫印跡Western Blotting實(shí)-瞼的陽(yáng)性對(duì)照。
本實(shí)施例中，A15!5即為ABws。
實(shí)例例二 重組腺病毒Ad-4xAfi15疫苗接種Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠后免疫學(xué)、 病理學(xué)及行為學(xué)觀察試驗(yàn)。 1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只12月齡Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠為美國(guó) Taconic公司產(chǎn)品，并在本室繁育成功)。飼養(yǎng)到12月齡后隨機(jī)分為2組 Ad-4xAfi15組和Ad-GMCSF對(duì)照組(只克隆入IRES-GMCSF)，每組各6只。
1.2免疫接種接種采取鼻黏膜接種的方式，每只小鼠接種病毒量為lxl08 PFU，總體積20jiL,用10pLTips從兩鼻孔滴入鼻腔。
1.3 間才妄酶耳關(guān)免疫吸附觀'J定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法
檢測(cè)血清中抗Afi 42的滴度
鼠尾采血，凝固后，離心分離血清，間接ELISA法檢測(cè)Afi抗體。用以本課 題組原核表達(dá)并純化的GST-AB42肽(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶，glutathione
S-transferase, GST)為抗原包被ELISA板，每孔1 |ig (0.05M碳酸鹽緩沖液,pH 9.0 配制)，4。C包被過(guò)夜。PBST(phosphate buffer saline tween,吐溫磷酸鹽緩沖液) 洗板后，于37°C ， 3 % BSA(Bovine Serum Albumin,牛血清白蛋白)封閉2 h。血清 樣品從1: 20開(kāi)始倍比稀釋，平行兩孔，100 h1/孔，37°C, 2 h;以空病毒Ad-GMCSF 免疫的小鼠血清為陰性對(duì)照，AJ3單抗為陽(yáng)性對(duì)照。PBST洗板四次，拍干后， 加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1:5000)， 37°C, 1 h; PBST洗板四次， 拍干后，加入TMB(3,3',5,5-Tetramethylbenzidine， 3，3,5,5-四曱基聯(lián)苯胺)底物， 室溫顯色10 min， 2 mol/L 112804終止,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的OD值(optical density, 光學(xué)密度)。(測(cè)定值OD-空白OD ) / (陰性對(duì)照OD-空白OD )大于或等于2.1, 且實(shí)驗(yàn)組OD值大于0.4,判斷為陽(yáng)性。
1.4 3H-TdR([3H-methyl]thymidine，(曱基-3印胸腺嘧咬核普)摻入法檢測(cè)抗原 特異性淋巴細(xì)胞增殖作用
96孔聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板加懸浮培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞,每孔100 ，含2x105 個(gè)細(xì)胞。分別加4xAI5!5和AJ340 (先用雙蒸水溶解，再與10% BSA-RPMI1640 混勻),4xABi5和Afi4o終濃度均為10 pg/ml。37。C，5y。C02,培養(yǎng)72h。加3H-TdR， 每孔l^iCi。培養(yǎng)18h后，用多頭細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾紙上。依 次用PBS， 5%三氯醋酸和無(wú)水乙醇洗滌細(xì)胞各3次，每次5 min。將濾紙?jiān)?0°C 烘箱中烘干30 min。將濾紙放入閃爍杯中，每個(gè)閃爍杯內(nèi)加入5 ml閃爍液，在 fi液閃計(jì)數(shù)儀上測(cè)定cpm值。各組樣本分別加4xAJ515和Afi40。每個(gè)樣本做3個(gè) 復(fù)孔。陽(yáng)性對(duì)照用ConA(Concanavalin,刀豆蛋白)，每孔50pl，含5 |ig/ml。陰性 對(duì)照只加培養(yǎng)液。采用刺激指數(shù)(stimulation index, SI)作為結(jié)果分析的指標(biāo)， SI二實(shí)驗(yàn)組cpm值/陰性對(duì)照組cpm值。SI> 3為陽(yáng)性結(jié)果。 1.5 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試
Morris水迷宮主要由三部分組成，即內(nèi)含平臺(tái)的圓形水池、自動(dòng)記錄裝置 和電腦分析系統(tǒng)。水池由不銹鋼板制成，直徑100 cm、水池深40 cm,平臺(tái)由 透明有機(jī)玻璃制成，臺(tái)高29cm,加水至30cm。水中加入奶粉成乳白色，使水 面看不清平臺(tái)，水溫保持20。C左右。按電腦分析系統(tǒng)內(nèi)所標(biāo)象限坐標(biāo)，標(biāo)記東 (E， X軸正極)、南(S，Y軸負(fù)極)、西(W,X軸負(fù)極)、北(N,Y軸正極)4個(gè) 入水點(diǎn)。自動(dòng)記錄裝置包括攝像頭、攝像儀和電腦組成，攝像儀與電腦相連。 電腦Morris水迷宮自動(dòng)分析軟件，對(duì)動(dòng)物游泳軌跡進(jìn)行自動(dòng)分析，分析結(jié)果包 括小鼠游泳軌跡圖，各象限游泳時(shí)間及距離，20%邊緣區(qū)、40%邊緣區(qū)和中心區(qū) 域游泳路徑占全部路徑比，第 一次找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)等。
定位航行測(cè)試測(cè)試前，讓少鼠自由游泳一天，上下午各一次，每次2min。 測(cè)試時(shí)平臺(tái)放在第一象限，小鼠分別從東、南、西、北(E、 S、 W、 N)四個(gè)象 限面對(duì)池壁放入水池，小鼠找到平臺(tái)后在平臺(tái)保持30 s后，在行下一個(gè)入水點(diǎn) 測(cè)試，超過(guò)60 s未找到的按60 s計(jì)算，取逃避潛伏期時(shí)間作統(tǒng)計(jì)。每天上下午 各測(cè)試一單元(block )，連續(xù)4天，共8個(gè)block。
空間探索測(cè)試第8次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，使小鼠在無(wú)平臺(tái)情況 下尋找記憶中的平臺(tái)，游泳60s,取穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)和平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí) 間百分比作統(tǒng)計(jì)，無(wú)記憶障礙的老鼠穿過(guò)平臺(tái)次翁:較多，平臺(tái)象限的游泳時(shí)間 百分比高。整個(gè)測(cè)試過(guò)程中，水池周圍的參照物(包括實(shí)驗(yàn)者所站位置)不變， 實(shí)驗(yàn)在安靜環(huán)境中完成。 1.6老年斑的檢測(cè)和定量分析
腦組織取材，4%多聚曱醛固定的右側(cè)半腦用于老年斑的檢測(cè)和定量分析。 腦組織脫水、包埋，腦組織切片厚8nm，表于經(jīng)翁附劑處理的載玻片上。采用 免疫組織化學(xué)染色方法，曱醇(含3%11202)反應(yīng)20min, 0.01 MPBS (pH7.4) 洗滌5 minx3次，70%曱酸滴注于切片后靜置5 min, 0.01 M PBS洗滌5 minx3 次，1% BSA (0.01 M PBS配制，含0.3% Triton X-100 )， 37。C封閉30 min，加 抗八642單克隆抗體(1 : 2000 ), 37°C 2 h，再轉(zhuǎn)至4。C過(guò)夜，0.01 M PBS洗滌5 minx3次，加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1 : 200)， 37。C孵育2h;
DAB (3, 3，-diaminobenzidine, 二氨基聯(lián)苯 胺)(含0.03% H202)顯色5-10 min,顯微鏡下見(jiàn)老年斑著色后，0.01 M PBS洗
滌終止液終止反應(yīng)。脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。選背側(cè)海馬 部位，每間隔40 取一張腦片，每只小鼠腦取6張腦片用于定量分析。分析 的部位是整個(gè)海馬及其上方頂葉聯(lián)合皮質(zhì)的老年斑。使用Leica顯微鏡及配套的 軟件系統(tǒng)和JVC ky-F30B 3-CCD彩色圖像掇錄系統(tǒng)對(duì)老年斑面積進(jìn)行定量分 析，計(jì)算頂葉聯(lián)合皮質(zhì)和海馬部位淀粉樣斑塊面積占皮質(zhì)和海馬面積的百分比。 每只小鼠腦6張切片的結(jié)果平均后作為一只小鼠頂葉聯(lián)合皮質(zhì)和海馬部位的淀 粉樣斑塊面積百分比計(jì)算。 2結(jié)果 2.1 —般情況
在免疫過(guò)程中，Ad-4xAJ3i5組小鼠血清抗體水平持續(xù)升高。到第9次免疫后， 抗體水平基本達(dá)到平臺(tái)期，在后來(lái)的免疫中抗體滴度變化不大。免疫結(jié)束時(shí)， Ad-4xAJ}15組小鼠血清抗體水平達(dá)到117.9±22.14嗎/mL。而Ad-GMCSF組小鼠 血清抗體水平一致處于背景水平。Ad-4xAi^5組小鼠血清中抗M42抗體的IgG 均以IgGl為主，其次是IgG2b和IgG2a， IgG 1/IgG2a > 1 。實(shí)驗(yàn)期間，各組Tg2576 小鼠外觀正常；飲食無(wú)明顯變化；毛發(fā)無(wú)脫落；精神狀態(tài)好；意識(shí)清醒；四肢 運(yùn)動(dòng)正常；免疫部位未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)。
腦、肝和腎HE染色顯示腦皮質(zhì)細(xì)胞清晰，層次分明細(xì)胞構(gòu)筑無(wú)異常；肝細(xì) 胞形態(tài)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；Perls染色呈陰 性反應(yīng)，表明疫苗接種沒(méi)有引起Tg2576小鼠腦出血。 2.2檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖
體外培養(yǎng)的Ad-4xABu組和Ad-GMCSF組Tg2576小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞都 經(jīng)特異性抗原4xAI5,5和AB4Q刺激后，^-TdR摻入法結(jié)果顯示，Ad-4xAi^組小 鼠的脾臟淋巴細(xì)胞只對(duì)4xAfi15抗原產(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，刺激指數(shù)為12.97±1.76,而對(duì)Afi4?？乖划a(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。Ad-GMCSF組對(duì)兩種抗 原的刺激均不產(chǎn)生淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，剌激指數(shù)(SI)均小于2。(見(jiàn)表l) 表1特異性抗原刺激后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖功能檢測(cè)(SI)
組別 4xAB15 AB40
Ad-4xAJ315 12.97±1.76**# 2.45±U1
Ad-AB42 1.60±1.58 16.09±4.43**
Ad-GMCSF_1.41±1.75_1.89±0.48
與Ad-GMCSF組相比較，**P<0.01;與Ad-AB42組相比較，# P>0.05
2.3 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果
各組小鼠的定位航行實(shí)驗(yàn)用平均逃避潛伏期來(lái)作統(tǒng)計(jì)比較。在8個(gè)單元測(cè) 試中，各組小鼠的平均逃避潛伏期均隨著測(cè)試次數(shù)的增加而縮短。在第3-4天的 測(cè)試中，和Ad-GMCSF組相比，Ad-4xA1^5組平均逃避潛伏期明顯縮短，差異 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO.01)(表2)。平臺(tái)撤離后，以平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間 百分比和穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)判斷動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。Ad-4xM15組小鼠在疫苗接種 后，平臺(tái)象限(Target quadrant, TQ)游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比(Percentage of time in TQ， ％)明顯較Ad-GMCSF組大，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO.01)(表3)。 Ad-4xM15組小鼠在疫苗接種后，平臺(tái)象限(TQ )穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)(Annulus crossing index)明顯較Ad-GMCSF組多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO.05 )。(表3)
表2重組腺病毒疫苗接種后各組小鼠平均逃避潛伏期
組別 12 3 4
Ad-4xAI315 56.1±3.5 52.6±3.0 43.7±2.3** 38.3±2.4** Ad-Afi4256.5±4.1 54.2±3.3 40.5±2.1** 35.4±2.3** Ad-GMCSF 57.2±1.3 53.2±3.0 50.6士2.6 45.9±2.1 與Ad-GMCSF組相比較，**P<0.01
表3重組腺病毒疫苗接種后各組小鼠平臺(tái)象限(TQ )游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比 及各組小鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)
平臺(tái)象限游泳時(shí)間 平臺(tái)象限安全穿過(guò)
組別
_占總時(shí)間百分比_平臺(tái)次數(shù)_
Ad-4xAB15 24.4±3.3** 2.0±1.1*
Ad-AB4226.4±3.7** 2.4士1.1*
Ad-GMCSF 18.6±2.1 0.6±0.5 與Ad-GMCSF組相比較，**P<0.01， *P<0.05
2.4老年斑的檢測(cè)和定量分析
疫苗接種7個(gè)月后，19月齡的對(duì)照組Ad-GMCSF組鼠和實(shí)驗(yàn)組Ad-4xAB15 組相比淀粉樣斑塊的數(shù)量顯著增加，致密斑、彌散斑都存在。淀粉樣斑塊主要 分布在胼胝體壓部后方和枕葉的皮質(zhì)、頂葉和額葉的皮質(zhì)以及海馬，白質(zhì)及其 它區(qū)域無(wú)斑塊沉積發(fā)生。定章結(jié)果顯示，和Ad-GMCSF組相%， Ad4xAI3is組 海馬部位(hippocampus)和頂葉聯(lián)合皮質(zhì)部位(parietal association cortex)的淀 粉樣沉積的面積分別下降了 26.9%和25.6%,下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表 4)。這說(shuō)明Ad-4xAI^疫苗的接種可能有效的阻止了新的老年斑的形成或者消除
了以前已形成的老年斑。
表4重組腺病毒疫苗接種后各組小鼠腦老年斑的定量檢測(cè)
組別 海馬部位 頂葉聯(lián)合皮質(zhì)部位
Ad-4xM15 1.62±0.11** 1.30±0.15**
Ad-M42 1.04±0.12** 1.33±0.16**
Ad-GMCSF_1.59±0.17_1.75±0.17
與Ad-GMCSF組相比較，**P<0.01。
序列表SEQUENCE LISTING
<110> 中山大學(xué)
<120>老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗及其制備方法 <130>
<140> 200810028601.8 <141〉 2008-06-06
〈160〉 12
<170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 15 〈212〉 PRT
<213〉 人(Homo sapiens) <400> 1
A印Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin 15 10 15
<210> 2
<211> 32
<212> PRT 〈213>人工序列
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Gly 15 10 15
Gly Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin 20 25 30
<210> 3 <211> 105 〈212> ■ <213>人工序列 <400> 3
gatgc3g33t tccgac3tg3 ttcsgg3tat g33gttc8tc 3tc犯ggagg 3gatgcagaa 60 ttccgacatg attc鄉(xiāng)ata tgaagttcat catcaaggat ccggg 105
<210> 4
〈211> 21 <212>薩 <213>人工序列
〈400> 4
cccggatcct tgatgatgaa c 21
〈210> 5
<211> 57 .
〈212> ■ 〈213>人工序列
〈柳> 5
tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc actggtgacg atgcBgaatc ccgacat 517
〈210> 6
<211> 56.
〈212> DNA <213>人工序列
〈400> 6
ggggtaccgc caccatggag acagacacac tcctgct3tg ggtactgctg ctctgg 56
〈210> 7
<211> 114
〈212〉 ■ 〈213>人工序列
<400> 7
gggggstccg atgc卿3tt ccg織tgat tcaggatstg卿ttc3tc3 tc卿gagga 60 gatgcagaat tccgacatg3 ttcagg3tat gaagttc3tc atcaatgact cgag 114<210> 8
<211> 21
<212> 靈 <213>人工序列
〈400〉 8
ccgctcgagt cattgatgat g 21
〈210> 9
<211> 27
〈212> DNA <213>人工序列
〈400> 9
ccgctcgaga attccgcccc tctccct 27
〈210> 10
<211> 27
〈212> DNA <213>人工序列
<400> 10
acgcgtcgac catattatca tcgtgtt 27
<210> 11
<211> 46 〈212〉腿 <213>人工序列
<400> 11
ccgctcgaga agcttgtcga ccacaaccat gtggctgcag agcctg 46
〈210> 12
<211> 26
〈212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 12
cggatatctc actcctggac tggctc 2權(quán)利要求
1、一種老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗，為分泌性共表達(dá)柔性可折疊的多價(jià)Aβ1-15及基因佐劑的重組腺病毒疫苗，其中，所述Aβ1-15氨基酸序列為Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln采用柔性連接肽連接多價(jià)Aβ1-15。
全文摘要
一種老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗以及制備方法，為分泌性共表達(dá)柔性可折疊的多價(jià)β-淀粉樣蛋白1-15(Aβ_1-15)及基因佐劑的重組腺病毒疫苗，其中，采用柔性連接肽連接多價(jià)Aβ_1-15。本發(fā)明選擇多價(jià)可折疊的Aβ_1-15為免疫原，避免了多拷貝AβB細(xì)胞抗原表位的空間僵化結(jié)構(gòu)，還使Aβ₁₅表位更容易暴露，增強(qiáng)了免疫原性；同時(shí)也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性；選擇以腺病毒為載體的抗原傳遞系統(tǒng)，避免了化學(xué)合成的高難度及高成本的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P25/28GK101357227SQ20081002860
公開(kāi)日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者姚志彬 申請(qǐng)人:中山大學(xué)