專利名稱：：康普立停的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，尤其涉及康普立停的新用途。
背景技術(shù)：
：一百多年前人們就已發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織較正常組織富含血管，但人們一直在爭論腫瘤是由已經(jīng)存在的血管提供營養(yǎng)，還是由新生血管提供營養(yǎng)，并且普遍認為這種血管反應(yīng)只是一種炎癥反應(yīng)，并非腫瘤生長所必需。1971年Folkman最早提出血管新生理論(AngiogenesisTheory)，大膽作出如下設(shè)想腫瘤的生存需要依靠新生血管的生成，腫瘤能夠主動刺激這種血管的生成，腫瘤能夠分泌某種物質(zhì)誘使血管朝它們生長，并能生長出分枝(FolkmanJ.Tumorangiogenesis[j].^c/kCa/cerA"e5'1985，43:175-203)。但當(dāng)時這種觀點并未為人們所接受。直到1979年毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，1982年第一個血管生成抑制劑的發(fā)現(xiàn)，1984年第一個血管生成活性蛋白的純化等一系列工作的完成(FolkmanJ.Whatistheevidencethattumorsareangiogenesisd印endent[J]./〃at7ca/cer1990，82(1):4-6.)，這一觀點為越來越多的證據(jù)所支持，并使這一領(lǐng)域成為腫瘤研究的熱點及腫瘤治療的新策略。腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，是促成上述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會超過l-2mm3。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因。在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的多步驟過程中，在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始和終末階段，血管生成均發(fā)揮著重要作用。以腫瘤的血管生成為靶點，開發(fā)血管生成抑制劑，可使實體瘤的治療效果得到較大提高?；熕幬飵缀鯇w內(nèi)所有快速分裂增殖的細胞包括癌細胞產(chǎn)生抑制或毒殺作用，即它們?nèi)狈拱┘毎鲋车奶禺愋?。在抗癌細胞增殖的同時，對骨髓細胞、胃腸粘膜上皮細胞及其他組織器官中快速分裂的細胞有很大的毒副作用。另外腫瘤很容易對化療藥物產(chǎn)生抗藥性，原因是由于癌細胞基因的不穩(wěn)定性、癌細胞種類的多樣性和基因的高突變率，使得病灶已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者的生存幾率不大，這些抗癌藥物對正常細胞產(chǎn)生的毒副作用及藥物抗性作用是難以克服的。使君子科(Combretastaceae)植物是一類分布于熱帶和亞熱帶的灌木和樹木，具有十分重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。已知風(fēng)車藤(Combretum)屬的植物中有25種。它們在非洲和印度被用于治療麻風(fēng)和癌癥等。70年代末，美國國家癌癥研究所在廣篩中發(fā)現(xiàn)這種植物對小鼠P388淋巴白血病細胞具有很高的抑制作用。80年代開始，對這種植物的研究引起了廣泛的興趣。這一時期，美國亞利桑納大學(xué)癌癥研究所所長，化學(xué)家皮特.喬治教授(G.RobertPettit)和四位同事從學(xué)名為"Combretumcaffrum，，的南非樹禾中中提取Combretastatins，這禾中樹以前"曾被祖魯人當(dāng)成退敵的咒符"，皮特教授在《加拿大化學(xué)期刊》如此寫道，樹根的外皮確實具有抗癌效果。以后不僅有大量的高活性的化合物被分離、鑒定出來，而且對其藥理作用機制和結(jié)構(gòu)修飾工作也在不斷深入。由皮特小組最先開展這方面的工作。對combretum屬植物進行深入研究，提純出一系列抗癌活性的菲，芪和二芐苯的衍生物。其中CombretastatinA-1和A-4(簡寫為CA-1和CA-4)是目前為止，此類化合物中所知的最強微管蛋白聚集抑制劑(PettitGR，SinghSB，Ca/./C/e瓜(1987)652390-2396)。小劑量的此類化合物還可以用作新生血管抑制劑。所謂的新生血管抑制劑是抑制血管的生成，但對于已經(jīng)長成的腫瘤血管還沒有針對性的藥物可供使用。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種對己經(jīng)生成的腫瘤血管有破壞作用的藥物。本發(fā)明旨在提供如式I或式II的化合物在制備破壞人體腫瘤血管的藥物中的應(yīng)用，特別是依賴血管提供氧氣和養(yǎng)分的腫瘤。本發(fā)明中，提供了一種如式I或式II的化合物的用途，所述的化合物被用作或用于制備破壞腫瘤血管的藥物
發(fā)明內(nèi)容ii在另一優(yōu)選例中，所述的化合物被用作或用于制備破壞腫瘤血管的內(nèi)皮細胞的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤是依賴血管提供氧氣和養(yǎng)分的腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤包括肝癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、小細胞肺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、淋巴瘤、和骨肉瘤；優(yōu)選胃癌、淋巴瘤、或骨肉瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物含有(a)20-250重量份如式I或式II的化合物；和(b)10-1000重量份藥學(xué)上可接受的載體；其中(a)+(b)的重量占藥物總重量的50-100w/w%。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物含有(a)30-200重量份如式I或式II的化合物；和(b)20-900重量份藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物選自以下劑型凍干粉劑、粒劑、粉劑、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射劑、乳劑、酊劑、或懸浮液。據(jù)此，本發(fā)明提供了提供一種對已經(jīng)生成的腫瘤血管有破壞作用的藥物。圖1顯示了不同劑量的康普立停誘導(dǎo)人結(jié)腸癌Lsl74t腫瘤壞死的情況。圖2是服E染色(4倍)圖譜，顯示了康普立停誘導(dǎo)人結(jié)腸癌Lsl74t腫瘤5壞死的情況；其中A是對照組，B是CA4P50mg/kg體重組，C是長春瑞濱10mg/kg體重組。圖3顯示了康普立停抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的情況。圖4是活細胞顯微照片(10倍)，顯示了康普立停抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的情況；其中A是對照，B是0.01pM的康普立停。圖5顯示了康普立停給藥后腫瘤組織冷凍切片Hoechst33342染色(IO倍)的情況；其中A是對照，B是康普立停處理l小時，C是康普立停處理6小時，D是康普立停處理24小時。具體實施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，如式I或式II的化合物具有破壞腫瘤血管的作用，從而使腫瘤凋亡。如本文所用，"康普立停"是指CombretastatinA-4(CA-4或CA4)的磷酸二鈉鹽(簡寫為CA4P)，其結(jié)構(gòu)如式II所示在本發(fā)明中，所述的破壞腫瘤血管是指減少腫瘤組織功能血管床體積，較佳地是抑制腫瘤血管增殖，更佳地是對腫瘤血管的內(nèi)皮細胞具有破壞作用。所述的對于腫瘤血管的內(nèi)皮細胞的破壞作用包括抑制內(nèi)皮細胞增殖、使內(nèi)皮細胞變形、使內(nèi)皮細胞腫脹從而堵塞血管。在本發(fā)明中，所述的可抑制腫瘤血管生成的藥物中含有治療有效量的式I或式II化合物和藥學(xué)上可接受的載體；其中治療有效量的式I或式II化合物如式I所示的化合物(CA4)是康普立停游離酸:占藥物總重量的0.1-99%(w/w)，較佳地是2_80%(w/w)。體外培養(yǎng)的腫瘤細胞經(jīng)式I化合物(CA-4)處理72小時后，應(yīng)用MTT或SRB方法評價CA4對腫瘤增殖的抑制作用。CA4對多種體外培養(yǎng)的腫瘤細胞增殖均有明顯的抑制作用，其ICs。為3.98x10—3—1.89/^，對胃癌、淋巴瘤、骨肉瘤及內(nèi)皮細胞的作用相對較強?？偨Y(jié)見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>B161.48X10—28.57X10—9.12X10—3-2.56X10—21.83X10—23.68X10—2康普立停體內(nèi)抗腫瘤療效顯示康普立停對多種小鼠腫瘤及人腫瘤裸小鼠移植瘤生長均有明顯的抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤組織廣泛的壞死；提示康普立停是一個治療依賴血管提供氧氣和養(yǎng)分腫瘤的、療效確實的、廣譜的抗腫瘤藥物。具體結(jié)果見表2。表2康普立停體內(nèi)抗腫瘤療效總結(jié)每組動物數(shù)給藥方案給藥途徑劑量(mg/kg)結(jié)果(%T/C或XTGI)小鼠腫瘤模型，皮下接種，療效用WTGI(%抑瘤率)表示小鼠肝癌H2210-20d1-5ip100死5/16,TGI=35.9%dl'3,5，7ip100死2/8，TGI=25.8%dl-9ip50死1/8，TGI=42.9%dl-5ip25X2/天死4/8,TGI=28.1%8-16dl-7iv25TGI=38.1%d卜7iv50死1/10，TGI=58.5%d1-3,d5-7iv100死8/10，TGI=61.9%VN緒，4,7iv5TGI=25.2%小鼠S180肉瘤10-20dl-7iv12.5-50TGI=43.4-69.1%VN隨，4iv10TGI=75.7%10-20dl-7iv12.5-50TGI=33.9-53.1%VNRdl,4iv10TGI=68.9%小鼠黑色素瘤B167-14dl,4,7,10iv20-80TGI:ll.6-46.8%VNRdl，4iv10TGI=63.6%小鼠乳腺癌EMT-68<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中y。T/c或WTGI的計算方式見實施例1中的評價標(biāo)準(zhǔn)?？灯樟⑼δ[瘤細胞尤其是血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用常在納摩爾水平；臨床藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CA4P18-60mg/m"給藥時的Cmax為8.4-39.6pM/L，AUC為2.54-10.58(nM.h)(DowlatiA，etalCancerRes2002:62:3408-3416)，說明體內(nèi)能夠建立足夠的血藥濃度發(fā)揮康普立停的抗腫瘤作用。臨床使用劑量為每天40-120mg/ra2，在七天治療中的總劑量不超過360mg/m2。連續(xù)三周為一個療程。本發(fā)明的藥物可以多種劑型存在。所述的劑型可以是凍干粉劑、粒劑、粉劑、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射劑、乳劑、酊劑、懸浮液、溶液的形式靜脈注射或口服給藥劑型。對于靜脈注射給藥，可使用凍干粉劑，用生理鹽水或葡萄糖溶液配成溶液，進行靜脈輸液。對于口服給藥，可使用片劑、錠劑、膠囊、丸劑、粉末、顆粒、糊劑、混懸劑、乳劑或者溶液劑。在優(yōu)選例中，本發(fā)明的化合物可通過口服以及靜脈內(nèi)途徑給藥。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括無菌水、聚乙二醇、甘露醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。如本文所用，靜脈注射包括腹膜內(nèi)注射和滴注輸液，使用凍干粉劑，用生理鹽水或葡萄糖溶液配成的溶液。其中凍干粉劑由本領(lǐng)域常規(guī)方法制得。本發(fā)明式I或式II的化合物配制成口服制劑，包括片劑、膠囊。這種劑型可用有效組分與至少一種添加劑混合而成，這些添加劑包括賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味劑等，并將所形成的混合物制成粉劑、粒劑、片劑、涂層片劑、丸劑、膠囊等劑型。賦形劑包括乳糖、玉米淀粉、糖類，葡萄糖，山梨醇，結(jié)晶纖維素中的一種或多種。粘合劑包括聚乙烯醇、甲基纖維素、乙基纖維素、阿拉伯樹膠、黃耆膠、明膠、紫膠、羥丙基纖維素、羥丙基淀粉，聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種。崩解劑包括淀粉、瓊脂、凝膠粉，結(jié)晶纖維素、碳酸f丐、碳酸氫鈉、擰檬酸鈣、環(huán)糊精，果膠中的一種或多種。潤滑劑包括硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、硅石，硬化植物油中的一種或多種。著色劑包括允許加到藥品中的色素。矯味劑包括可可粉、薄荷醇、薄荷油、精制冰片，以及肉桂。如果需要，這些片劑和粒劑可用蔗糖、明膠等包衣。一般這些劑型可含有另外的添加劑，包括惰性稀釋劑，防腐劑如對羥苯甲酸酯類，山梨酸，抗氧劑如維生素C、a-維生素E和半胱氨酸，分解劑，粘結(jié)劑，增稠劑，緩沖液，甜味劑，調(diào)味劑和香料。片劑和丸劑也可覆以腸衣?？诜囊后w劑型包括可藥用的乳劑、糖漿、酊劑、懸液和溶液，可以含有常用的惰性稀釋劑，如水。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、發(fā)現(xiàn)康普立停有體內(nèi)破壞腫瘤血管的作用，發(fā)現(xiàn)康普立停能明顯抑制人結(jié)腸癌裸小鼠移植瘤的生長，其抗腫瘤作用可能是通過減少腫瘤組織血流量，導(dǎo)致腫瘤組織壞死所致；2、提出了康普立停作為腫瘤血管破壞藥物的臨床劑量；3、發(fā)現(xiàn)康普立停對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖有明顯的抑制和破壞作用；4、發(fā)現(xiàn)康普立停在動物實驗中能迅速、明顯地減少腫瘤組織血流量，引起明顯的腫瘤組織壞死。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1康普立停對人結(jié)腸癌Lsl74t裸小鼠移植瘤的療效細胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞Ls-174t(購自上海藥物所的小鼠實體瘤)，使細胞一直處于對數(shù)生長期。移植取制備好的細胞接種于裸小鼠皮下，等成瘤后傳代2-3次。接種在無菌條件下，將腫瘤塊接種于動物一側(cè)腋下。分組和劑量設(shè)置裸小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測量直徑，待腫瘤生長到100-3001111113后，將動物隨機分組。給藥途徑和時間選用帶有80-200mri^大小腫瘤的裸小鼠隨機分組，測瘤體積后給藥。以靜脈注射給藥，12.5mg/kg;25.Omg/kg;50mg/kg，dl，3，5，7，9，11共6次；長春瑞濱10mg/kg，dl，d6，共2次。每周測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數(shù)據(jù)。第10天，處死小鼠，解剖取瘤組織，福爾馬林固定后，進行病理組織學(xué)檢查。評價標(biāo)準(zhǔn)腫瘤體積(V)計算公式為V=l/2XaXb2其中a、b分別表示長、寬。根據(jù)測量結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relativetumorvolume,RTV)，公式為RTV=Vt/V0。其中V。為分籠給藥時(即d0)所測得的腫瘤體積；Vt為每次測量時的腫瘤體積。抗腫瘤活性指標(biāo)為T/C(X)，公式為T/C(%)=TRTV/CRTVX100其中T,:治療組RTV;CRTV:陰性對照RTV(將不用藥的組作為陰性對照)稱重法計算抑瘤率公式為抑瘤率(％)=(對照組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重xlO(F。組織病理切片應(yīng)用常規(guī)石蠟切片，服E染色，低倍光學(xué)顯微鏡下，計算壞死面積。采用雙盲法。表3靜脈注射康普立停對人結(jié)腸癌Lsl74t書艮小鼠移植瘤的實驗治療fl^用(腫瘤體積法計JfT/C%)組別劑量(mg/kg)動物數(shù)去瘤后體重(克)TVx±SDRTVx土SDT/C(%)d0dnd0dnd0dn對照121221.520.6171±32880±2855.26±1.6康普立停12.56621.319.6142±44687士1414.15±2.6778.9康普立停25.06521.319.9144±28501±1933.7±1.6770.3康普立停50.06621.119.8137±17344土1582.59±1.2849.2*長春瑞賓106621.017.7132±21237±581.82±0.4934.6*d0:分籠給藥時間；dn:第l次給藥后ll天；*P<0.OlvS對照表4靜脈注射康普立停對人結(jié)腸癌Lsl74t裸小鼠移植瘤的實驗治療作用(稱重法計算抑瘤率)組別劑量(mg/kg)動物數(shù)d0dn去瘤后體重(克)d0dn瘤重(克)x±SD抑瘤率(%)對照101021.520.61.02±0.37康普立停12.56621.319.60.55±0.1046.1*康普立停25.06521.319.90.48±0.1760.0*康普立停50.06621.119.80.27±0.1173,5*長春瑞賓10.06621.017.70.17±0.0485.8*d0:分籠給藥時間；dn:第l次給藥后ll天；*P<0.Olvs對照結(jié)果表明，康普立停明顯抑制結(jié)腸癌Lsl74t的生長；給藥劑量50mg/kg時，T/C。/。達到49.2%;抑瘤作用有一定的量效關(guān)系(見圖l);腫瘤組織病理學(xué)檢査發(fā)現(xiàn)康普立停明顯誘導(dǎo)腫瘤組織壞死。對照藥物長春瑞濱的抗腫瘤療效雖然優(yōu)于康普立停，但沒有明顯誘導(dǎo)腫瘤組織壞死(見圖2)，提示二者不同的作用機制。結(jié)論康普立停明顯抑制人結(jié)腸癌裸小鼠移植瘤的生長。其抗腫瘤作用可能是通過減少腫瘤組織血流量，導(dǎo)致腫瘤組織壞死所致。13實施例2康普立停對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響試驗試劑、藥物及儀器HUVEC:人臍靜脈內(nèi)皮細胞。細胞購自美國ATCC。實驗時細胞傳代數(shù)不超過6代。培養(yǎng)條件M199培養(yǎng)基，20%胎牛血清，內(nèi)皮細胞生長刺激影子，VEGF10ng/ml。M199，內(nèi)皮細胞生長刺激因子(ECSF)購自GibcoBRL公司；胰酶購自DIFCO公司；胎牛血清購自Hyclone公司；酶標(biāo)儀POLARstar型號，德國BMG公司產(chǎn)品；蘇丹明B購自Sigma。試驗方法細胞增殖分析用蘇丹明B法，即SRB法。SRB法主要試驗步驟i)細胞以含10%的胎牛血清培養(yǎng)，傳代時以0.2%的胰酶消化液消化，使細胞一直處于對數(shù)生長期；ii)試驗時細胞接種于96孔培養(yǎng)板，初始接種密度為2X104/ml。37°C，5XC02培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時；iii)加藥，藥物設(shè)5個濃度，連續(xù)作用72小時；iv)藥物作用結(jié)束后，用三氯醋酸、SRB處理；v)每孔加入15(^110mM非緩沖Tris堿。溶解與蛋白結(jié)合的SRB;vi)用酶標(biāo)儀在545nm波長處測定每個小孔的0D值。試驗對照空白對照孔加2(^1培養(yǎng)液。濃度設(shè)置康普立停設(shè)5個濃度。療效評價細胞生長抑制率計算對照組OD值一用藥組OD值x1()0%對照組OD值x0生物統(tǒng)計根據(jù)藥物在不同濃度下對細胞生長的抑制率以Logit方法計算IC50值。與空白對照組比較計算P值及95%可信限范圍。生物統(tǒng)計軟件程序來源于《藥理學(xué)計算與程序》一書，人民衛(wèi)生出版社1988年版，張文貴主編。康普立停明顯抑制HUVCE的增殖；當(dāng)藥物濃度較低時(〈0.01pM)，抑制作用具有明顯的劑量依賴性(見圖3);但濃度較高時，抑制作用達到平臺，這可能與部分細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)有關(guān)?？灯樟⑼Ｖ粚μ幱谠鲋碃顟B(tài)的內(nèi)皮細胞有效，而對靜止期的細胞無效(DarkGG，HillSA,PriseVE，TozerGM,PettitGR,ChaplinDJ.CancerRes1997;57:1829-1834)。從流式細胞光度術(shù)可以清楚地看出(見圖4)，培養(yǎng)的HUVCE始終有部分細胞處于G0/G1，這部分細胞應(yīng)該有部分細胞同時也處于靜止期，因此，當(dāng)較高濃度的康普立停應(yīng)用時，不難理解其抑制作用會缺乏明顯的量效關(guān)系。通過計算，康普立停抑制HUVCE增殖的IQ為3.2nM，說明HUVCE對康普立停非常敏感，也提示康普立停能夠體內(nèi)抑制腫瘤新生血管的生成。結(jié)果表明，康普立停對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖有明顯的抑制作用。HUVEC經(jīng)不同濃度的康普立停處理72h,其生長受到明顯抑制。康普立停抑制HUVEC生長的I&。為3.2nM。說明HUVEC對康普立停非常敏感，也提示康普立停能夠?qū)θ缒[瘤血管那樣的快速增殖的血管的內(nèi)皮細胞具有抑制作用。實施例3康普立停對腫瘤組織血流量的影響裸小鼠經(jīng)1周適應(yīng)后，皮下接種人結(jié)腸癌Lsl74t細胞，待腫瘤長到0.5cm3后，隨機分組，每組5只小鼠。小鼠靜脈注射康普立停100mg/kg，注射體積10ml/kg，對照注射相同體積的生理鹽水?？灯樟⑼＝o藥后l,6，24h,小鼠再次靜脈注射Hoechst3334210mg/kg，1分鐘后，斷頸處死小鼠，取出腫瘤，迅速液氮冷凍，并做冷凍切片。每個腫瘤取3個位置的切片，分別在中間、外1/3處，切片厚10pM。熒光顯微鏡下計數(shù)染色陽性(發(fā)藍色熒光)的點數(shù)。激發(fā)波長376nm,發(fā)射波長418nm。每個切片至少計數(shù)20個隨機視野，每個腫瘤至少評價6張切片。Hoechst33342是DNA特異熒光染料，能夠與血管內(nèi)皮細胞或血管周圍的腫瘤細胞DNA結(jié)合，在紫外激發(fā)下，發(fā)藍色熒光，因此，Hoechst33342靜脈注射后，腫瘤組織冷凍切片上可見血管的輪廓(圖5)。組織切片上，熒光染色的多少與腫瘤血管床的開放程度成正比，因此事實上，熒光染色反映了功能血管床的體積，也即血流量。該方法是目前評價組織血流量較常用的方法。從圖5可以看出，對照組腫瘤組織的血流量豐富，康普立停給藥后l小時，即可見熒光染色明顯減少約50%左右，至6小時時，熒光染色減少超過90%，并一直維持到至少24小時。給藥后24小時，可見腫瘤內(nèi)部彌漫性熒光，這是壞死的腫瘤細胞，而在腫瘤邊緣則仍可見清晰染色的血管輪廓。這一現(xiàn)象反映了康普立停主要引起腫瘤組織內(nèi)部缺血壞死，而對腫瘤周圍組織影響較小?？灯樟⑼Ｃ?5顯迅速減少腫瘤組織功能血管床體積，也即減少腫瘤組織血流量，并引起腫瘤組織缺血壞死。結(jié)果說明康普立停是一個有效的腫瘤血管破壞藥物。動物實驗發(fā)現(xiàn)康普立停迅速、明顯地減少腫瘤組織血流量，康普立停給藥后1小時，即可使血流量下降50%;6小時時，下降90%以上；24小時時，引起明顯的腫瘤組織壞死。結(jié)果說明康普立停是一個有效的破壞人體腫瘤血管藥物?？灯樟⑼？鼓[瘤作用機制研究表明康普立停明顯抑制微管蛋白的聚集，抑制作用有明顯的濃度依賴性，IG為3.0±0.6pM。康普立停與微管蛋白結(jié)合的Kd為0.82pM，比秋水仙堿(C0L)、長春瑞賓(VNR)、紫杉醇(PTX)與微管蛋白結(jié)合的Kd小?？灯樟⑼８偁幮缘匾种艭OL與微管蛋白的結(jié)合，IC5。=0.37uM，Ki=0.16uM，說明康普立停和COL在微管蛋白(tubulin)上存在相同的結(jié)合位點。VNR和PTX不能抑制COL與tubulin的結(jié)合，說明康普立停的結(jié)合位點可能與VNR、PTX不同?？灯樟⑼Ｃ黠@引起細胞周期阻滯在G2/M期，并可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。以微管作為靶點的抗腫瘤藥物較多，如臨床常用的藥物長春堿類、紫杉醇類、埃波霉素類等，但以微管為靶點，能迅速關(guān)閉腫瘤功能血管床，誘導(dǎo)腫瘤組織壞死的藥物目前主要是Combretastatin類化合物。長春堿類雖然也能減少腫瘤組織血流量，但所需劑量常常需達到其最大耐受劑量，因此，沒有實際的臨床意義；而康普立停應(yīng)用其1/10最大耐受劑量時，即能迅速減少腫瘤組織血流量，這是其能夠被作為破壞腫瘤血管藥物的關(guān)鍵原因?？灯樟⑼Ｑ杆訇P(guān)閉腫瘤組織功能血管床，藥物應(yīng)用后10-20分鐘即觀察到這一作用，這一現(xiàn)象似乎很難用康普立停抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡來解釋。因此，康普立停誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡在腫瘤組織壞死中的地位還不是很清楚。新生的血管內(nèi)皮細胞由于肌動蛋白(actin)不成熟，使其首先受到康普立停的打擊，這是構(gòu)成新生血管與成熟血管對康普立停差異反應(yīng)性的基礎(chǔ)。另外，新生血管與成熟血管之間的這一差異也可能是構(gòu)成腫瘤組織首先受到康普立停打擊的原因，因為腫瘤組織的新生血管比正常組織明顯豐富。值得注意的是康普立停誘導(dǎo)的腫瘤組織壞死主要發(fā)生在腫瘤的中央，腫瘤組織中央?yún)^(qū)由于缺乏血液供應(yīng)，相對缺氧，這部分細胞對細胞毒性藥物相對不敏感?？灯樟⑼Ｖ饕T導(dǎo)腫瘤中央?yún)^(qū)的組織壞死，使康普立停的藥理作用有別于其他抗微管細胞毒類藥物。因此康普立停作為腫瘤血管破壞藥物較傳統(tǒng)的細胞毒抗腫瘤藥物有明顯的優(yōu)點，那就是沒有明顯的毒副作用?？灯樟⑼⑹且粋€非常有前途的抗腫瘤新藥。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實體或方法，若是與申請的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。權(quán)利要求1.一種如式I或式II的化合物的用途，其特征在于，被用作或用于制備破壞腫瘤血管的藥物2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，被用作或用于制備破壞腫瘤血管的內(nèi)皮細胞的藥物。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤是依賴血管提供氧氣和養(yǎng)分的腫瘤。4.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括肝癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌、小細胞肺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、淋巴瘤、和骨肉瘤；優(yōu)選胃癌、淋巴瘤、或骨肉瘤。5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物含有(a)20-250重量份如式I或式II的化合物；和(b)10-1000重量份藥學(xué)上可接受的載體；其中(a)+(b)的重量占藥物總重量的50-100w/w%。6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物含有(a)30-200重量份如式I或式II的化合物；和(b)20-900重量份藥學(xué)上可接受的載體。7.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的藥物選自以下劑型凍干粉劑、粒劑、粉劑、片劑、膠囊、糖漿、栓劑、注射劑、乳劑、酊劑、或懸全文摘要本發(fā)明公開了一種如式I或式II的化合物的用途，其特征在于，所述的化合物用于制備破壞腫瘤血管的藥物。文檔編號A61K31/661GK101579328SQ20081003724公開日2009年11月18日申請日期2008年5月12日優(yōu)先權(quán)日2008年5月12日發(fā)明者沈衛(wèi)平,王建國申請人:浙江大德藥業(yè)集團有限公司