專利名稱：APOB的RNAi調(diào)節(jié)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)載脂蛋白B表達(dá)的組合物和方法，尤其是涉及到寡核苷酸例如化學(xué)修飾的寡核苷酸對(duì)載脂蛋白B的負(fù)調(diào)解作用。
背景技術(shù)：
RNA干擾或“RNAi” ー詞最初是由Fire及其合作者在描述雙鏈RNA(dsRNA)在被引入到線蟲里時(shí)發(fā)現(xiàn)其能夠阻遏基因表達(dá)而提出的(Fire et al.，Nature 391 :806-811，1998)。短雙鏈RNA在許多有機(jī)體包括脊椎動(dòng)物體內(nèi)引導(dǎo)基因特異性的轉(zhuǎn)錄后沉默，并為研究基因功能提供了一個(gè)新的工具。脂蛋白由甘油酷和膽固醇酷構(gòu)成，周圍具有蛋白質(zhì)、憐脂和膽固醇的雙未包被。脂蛋白的蛋白質(zhì)成分眾所周知為調(diào)節(jié)載脂蛋白，并且人類至少有九種調(diào)節(jié)載脂蛋白。調(diào)節(jié)載脂蛋白B(ApoB)發(fā)現(xiàn)于各類脂蛋白中乳糜微粒、密度極低的脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)和低密度脂蛋白(LDL)。ApoB的功能為通過ApoB/E受體作為細(xì)胞結(jié)合和LDL顆粒的內(nèi)陷的識(shí)別信號(hào)。含有載脂蛋白B的脂蛋白積聚和過多，會(huì)導(dǎo)致脂相關(guān)疾病的生成，如動(dòng)脈粥樣硬化。研究降低ApoB的療法對(duì)治療脂相關(guān)疾病很有意義。一種以反義治療的形式、以寡核苷酸為基礎(chǔ)的治療，已經(jīng)顯示能夠降低小鼠體內(nèi)ApoB水平，并且該治療還能夠減少血清膽固醇和甘油三酸酯的水平(U.S.公告號(hào)2003/0215943)。這些結(jié)果表明了一個(gè)適度的ApoB的負(fù)調(diào)解作用，以及作為治療脂相關(guān)疾病的一個(gè)靶。本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)表現(xiàn)在提供了能夠減少體內(nèi)血清ApoB水平的IRNA試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了能夠減少受試者如哺乳動(dòng)物(例如人)中載脂蛋白B (APoB)水平的組合物及其方法。所述方法包括對(duì)受試者施用能夠使ApoB基因沉默的ー種iRNA試劑。該iRNA試劑可以是在本文所描述的這樣，或者是ー種基于具有活性的序列之一的dsRNA，并且對(duì)哺乳動(dòng)物ApoB基因如來自人或小鼠ApoB基因的相同區(qū)域定位。iRNA試劑包含每條鏈少于30個(gè)的寡核苷酸,例如21-23個(gè)核苷酸,構(gòu)成、包括在此提供的試劑標(biāo)號(hào)為1-74的試劑之一，或是來自在此提供的標(biāo)號(hào)為1-74的試劑之ー衍生物。這些優(yōu)選的iRNA試劑含有對(duì)受試者所有非ApoB基因序列的四個(gè)或更多個(gè)的核苷酸錯(cuò)配。本發(fā)明尤其是提供ー種iRNA試劑，其包含ー種有義鏈，該有義鏈具有至少15個(gè)有義鏈序列的連續(xù)的核苷酸，以及具有ー種反義鏈，該反義鏈具有至少15個(gè)反義鏈序列的連續(xù)的核苷酸，這些序列為在此提供的試劑標(biāo)號(hào)為1-74的iRNA試劑的序列，例如，I號(hào)試劑，有義鏈序列 5，-cuuuacaagccuugguucagu-3，(SEQ. ID NO. 153),反義鏈序列 5，-acugaaccaaggcuuguaaagug-3，(SEQ. ID NO. 154)。需要理解的是，在此提供的某些iRNA試劑包含特定的修飾核苷酸優(yōu)選類型如54-74號(hào)試劑，同時(shí)試劑號(hào)為1-53的iRNA試劑則作為藍(lán)圖。它們是指包含這樣的修飾，該修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，且與試劑標(biāo)號(hào)為1-53的iRNA試劑相當(dāng)，如下面還要提到的，例如，2’ -O-甲基修飾、堿基替代等，對(duì)于上述修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)認(rèn)為這些試劑的特性會(huì)改變，尤其是不會(huì)改變兩條鏈與它們的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格的條件下雜交的能力。表1:靶向ApoB的示例性iRNA
權(quán)利要求
1.一種由有義鏈和反義鏈組成的iRNA試劑，其中所述的有義鏈的序列選自SEQ IDNo :1、3、5、21、23、25、27、29、33、35、39、41、43、45、49、51、55、57、59、61、63、65、69、71、73、77、79、83、93、95、97、99、105、107、109、117、121、123、125、127、129、131、133、135、137、143、145、147、153、155、157、159和161，與所述有義鏈對(duì)應(yīng)的的反義鏈的序列選自SEQID No:2、4、6、22、24、26、28、30、34、36、40、42、44、46、50、52、56、58、60、62、64、66、70、72、74、78、80、84、94、96、98、100、106、108、I10、I18、122、124、126、128、130、132、134、136、138、144、146、148、154、156、158、160和162，其中每條鏈中不超過3個(gè)核苷酸分別被其它核苷酸所替代，同時(shí)基本保持了抑制培養(yǎng)的人HepG2細(xì)胞中ApoB表達(dá)的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的iRNA試劑，其中每條鏈中不超過2個(gè)核苷酸分別被其它核苷酸所替代。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的iRNA試劑，其中每條鏈中不超過I個(gè)核苷酸分別被其它核苷酸所替代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其中所述替代是腺苷被尿嘧啶所替代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其中，所述iRNA試劑使與這些試劑孵育后培養(yǎng)的人H印G2細(xì)胞中存在的ApoB mRNA的量與沒有與該試劑孵育的細(xì)胞相比降低了50 %以上，和/或使分泌到人IfepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的Apo蛋白的量降低了 50 %以上，和/或使該iRNA試劑以50mg/kg體重或者100mg/kg體重給藥后，將C57B1/6小鼠的鼠肝臟細(xì)胞中所存在的apo-B mRNA的量在體內(nèi)降低至少20%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其包括硫代磷酸酯或者2’-修飾的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其包括 5’_尿苷-腺嘌呤_3’(5’-UA-3’)二核苷酸，其中所述的尿苷是2’-修飾的核苷酸；5’ -尿苷-鳥嘌呤-3’ (5，-UG-3’ ) 二核苷酸，其中所述的5’ -尿苷是2’ -修飾的核苷酸； 5’ -胞苷-腺嘌呤_3’ (5，-CA-3’ ) 二核苷酸，其中所述的5’ -胞苷是2’ -修飾的核苷酸； 或者5’ -尿苷-尿苷-3’ (5，-UU-3’ ) 二核苷酸，其中所述的5’ -尿苷是2’ -修飾的核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的iRNA試劑，其中在所有出現(xiàn)的序列基序5’-UA-3’、5’ -CA-3’、5’ -UU-3’和5’ -UG-3’ 二核苷酸中的最5’端嘧啶都是2’ -修飾的核苷酸， 或者在有義鏈中的所有嘧啶以及在所有出現(xiàn)的5’ -UA-3’和5’ -CA-3’的最5’端嘧啶都是2’ -修飾的核苷酸， 或者其中在有義鏈中的所有嘧啶都是2’ -修飾的核苷酸，以及在反義鏈中所有出現(xiàn)的序列基序5’ -UA-3’、5’ -CA-3’、5’ -UU-3’和5’ -UG-3’中的最5’端嘧啶都是2’ -修飾的核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的iRNA試劑，其中所述的2’-修飾選自2’ -脫氧、2’ -脫氧-2’-氟、2’-0-甲基、2’-0_ 甲氧乙基(2’-0-M0E)、2’-0-氨基丙基(2’-0-AP)、2’-0-二甲基氨基乙基(2’ -0-DMA0E)、2’ _0_ 二甲基氨基丙基(2’ _0_DMAP)、2’ _0_ 二甲基氨基乙氧基乙基(2’ -0-DMAE0E)和2’ -O-N-甲基乙酰氨基(2’ -0-NMA)的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其進(jìn)一步含有膽固醇部分，其中所述的膽固醇部分連接到所述iRNA試劑有義鏈的3’ -末端。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No :153所示的有義鏈和序列如SEQ ID No :154所示的反義鏈組成的試劑I。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No :155所示的有義鏈和序列如SEQ ID No :156所示的反義鏈組成的試劑2。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No :147所示的有義鏈和序列如SEQ ID No :148所示的反義鏈組成的試劑4。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No 49所示的有義鏈和序列如SEQ ID No 50所示的反義鏈組成的試劑7。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No :137所示的有義鏈和序列如SEQ ID No :138所示的反義鏈組成的試劑9。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No 97所示的有義鏈和序列如SEQ ID No 98所示的反義鏈組成的試劑11。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No :71所示的有義鏈和序列如SEQ ID No :72所示的反義鏈組成的試劑29。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，其為由序列如SEQID No 5所示的有義鏈和序列如SEQ ID No :6所示的反義鏈組成的試劑35。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的由有義鏈和反義鏈組成的iRNA試劑，其中所述的有義鏈的序列選自 SEQ ID No :241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、.263、287、289、291、293、299、301、303和305，與所述有義鏈對(duì)應(yīng)的的反義鏈的序列選自SEQIDNo :242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、288、290、292、294、300、302、.304 和 306。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑在制備用于治療具有脂類紊亂或者有產(chǎn)生脂類紊亂的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的藥物中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中所述受試者被診斷為患有脂類紊亂。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中所述的脂類紊亂是高膽固醇血癥、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈病、冠心病、血栓或動(dòng)脈粥樣硬化。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中藥物中iRNA試劑的量足以降低受試者細(xì)胞或者組織中ApoB表達(dá)。
24.—種藥物組合物，其包含 a.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑，和 b.藥物上可以接受的載體。
25.一種制備藥物組合物的方法，其包括使用藥物上可以接受的載體配制權(quán)利要求.1-19中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑。
26.—種降低細(xì)胞中ApoB RNA量的體外方法，其包括 將細(xì)胞與權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的iRNA試劑接觸。
27.一種制備權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的iRNA試劑的方法，其中所述方法包括合成所述iRNA試劑，其中所述iRNA試劑包括 2’ -O-甲基修飾或者硫代磷酸酯鍵修飾。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)載脂蛋白B表達(dá)的組合物和方法，尤其是涉及到利用化學(xué)修飾寡核苷酸而對(duì)載脂蛋白B的負(fù)調(diào)解作用。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102628044SQ20121008079
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日
發(fā)明者于爾根·蘇賽克, 漢斯-彼得·沃爾洛赫爾, 菲利普·哈德維格, 薩伊達(dá)·埃爾巴希 申請(qǐng)人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司