專(zhuān)利名稱(chēng)：白花丹醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白花丹醌的新用途，具體涉及白花丹醌在制備抑制血 管新生藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生是微血管從已存在的血管形成新的血管分支及毛細(xì)血管 叢的過(guò)程，是血管內(nèi)成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和重塑的結(jié)果。血管生 成包括五個(gè)階段①血管細(xì)胞分泌蛋白水解酶降解血管基底膜；② 內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)基底膜遷移到血管周?chē)|(zhì)；(D內(nèi)皮細(xì)胞增殖、相互黏 附并連接；④形成管腔樣結(jié)構(gòu)；⑤基質(zhì)重塑和平滑肌細(xì)胞的包繞及 血管的相互吻合形成血管網(wǎng)。血管新生在生理和病理?xiàng)l件下都有發(fā)生。生理性血管新生主要發(fā) 生在胚胎發(fā)生過(guò)程和女性生理周期，對(duì)于正常的發(fā)育非常關(guān)鍵；病理 性血管新生是許多疾病發(fā)生的重要原因，包括腫瘤、心血管疾病、糖 尿病等，其中腫瘤的生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移都有賴(lài)于血管新生。腫瘤從無(wú)血管 新生期或血管新生前期到血管新生期這個(gè)過(guò)程中存在一個(gè)血管新生 開(kāi)關(guān)，它是腫瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移時(shí)血管新生形成必不可少的。腫瘤 一旦產(chǎn)生，腫瘤細(xì)胞、其周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間發(fā)生相互用， 它們首先分泌和激活多種基質(zhì)金屬蛋白酶，降解基質(zhì)，為腫瘤的生長(zhǎng) 和轉(zhuǎn)移提供空間，然后腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌VEGF和bFGF來(lái)刺激內(nèi)皮 細(xì)胞的增殖，從而形成新的血管，為腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了 物質(zhì)條件。目前已經(jīng)了解到，血管新生的異常表現(xiàn)為血管新生過(guò)度和不足， 將導(dǎo)致相關(guān)的疾病，即血管新生性疾病。這類(lèi)疾病包括腫瘤、糖尿病 視網(wǎng)膜病變、銀屑病、血管新生性眼病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、卡波氏肉瘤、 非白血性白血病、十二指腸潰瘍、淋巴瘤、骨髓瘤、月經(jīng)不調(diào)、不孕 癥等，因此有效控制血管新生已成為人們對(duì)相關(guān)疾病治療的新策略。白花丹醌(Plumbagin， CuH803)，又稱(chēng)白花丹醌，白花丹精，磯 松素。存在于白花丹科植物紫雪花(P/"mMgo f"^ca丄.)的全草，白花 丹的根。以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白花丹醌具有抗腫瘤的作用，可以治療 急性早幼粒細(xì)胞白血病，但是目前沒(méi)有白花丹醌抑制血管新生以及作 為抑制血管新生藥物的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供白花丹醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供白花丹醌在制備抑制血 管新生藥物中的應(yīng)用。尤其是白花丹醌在制備抑制腫瘤血管新生、銀 屑病、卡波氏肉瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、非白血性白血病、類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、十二指腸潰瘍、骨髓瘤、淋巴瘤等疾病的血管新生藥物中的 應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供白花丹醌在制備抑制腫瘤血管新生的藥物 中的應(yīng)用。以及制備抑制關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生的藥物，其中關(guān) 節(jié)炎是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或者炎性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還提供白花丹醌在制備抑制血管新生性眼病血管新生的藥 物中的應(yīng)用，包括血管新生性角膜疾??；血管新生性視網(wǎng)膜疾病，其 中管新生性視網(wǎng)膜疾病為糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞或者早 熟性視網(wǎng)膜?。灰种蒲苄律院缒ぜ膊?；抑制新生血管性青光眼； 新生血管性脈絡(luò)膜疾病，其中脈絡(luò)膜病為抑制濕性老年黃斑病變；新 生血管性結(jié)膜眼?。恍律苄圆Ａw眼??；新生血管性視神經(jīng)疾病。本發(fā)明還提供白花丹醌在制備抑制血管瘤病變組織血管新生的藥 物中的應(yīng)用，以及制備抑制銀屑病病變組織血管新生的藥物中的應(yīng) 用；以及抑制實(shí)體瘤病變組織血管新生的藥物，其中實(shí)體瘤包括原發(fā) 性和繼發(fā)性的實(shí)體瘤；以及制備抑制血管瘤的藥物中的應(yīng)用，其中血 管瘤包括多發(fā)性血管瘤、血管母細(xì)胞瘤和其他一些良性血管增生疾 病。本發(fā)明還提供白花丹醌在制備抑制Kaposi' S肉瘤病變組織血管 新生的藥物中的應(yīng)用，包括抑制白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌癥的 藥物，以及抑制Paget' s疾病的藥物；25.根據(jù)權(quán)力要求l所述的 應(yīng)用，其特征在于抑制十二指腸潰瘍疾病的藥物；以及制備治療血管 新生相關(guān)的月經(jīng)不調(diào)的疾病和治療不孕癥的疾病的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的白花丹醌和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成 藥物組合物，也可以添加其他與白花丹醌沒(méi)有拮抗作用的其他抗血管新生藥物。 其制劑可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于散劑、片劑、濃縮丸、分散 片、顆粒劑、大輸液、糖漿、滴丸、膠囊劑、半膠囊劑、丸劑、茶劑、酒劑、噴 霧劑、搽劑、貼膏劑、軟膏劑、口服液、注射劑、栓劑、脂質(zhì)體、舌下含片、懸 浮劑、溶液劑等制劑。施用該藥物載體可采用一種以上固體、半固體或液體狀的稀釋 劑、填充劑及其他處方用的輔助劑。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可經(jīng)口服藥、 組織內(nèi)給藥、局部給藥(經(jīng)皮給藥等)或直腸內(nèi)給藥。以適合于這些給藥方法的劑型投藥,例如特別好的是口服給藥。 本發(fā)明的有益效果-本發(fā)明公開(kāi)了白花丹醌在抑制血管新生中的新用途。實(shí)驗(yàn)表明， 白花丹醌能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管，并能抑制雞胚尿囊膜 的血管新生，可以用于制備抑制血管新生的藥物。


圖1:白花丹醌抑制HMEC-1 (圖A)及HUVEC細(xì)胞(圖B)的增殖。圖2:白花丹醌抑制HUVEC細(xì)胞的遷移照片。其中A，對(duì)照；B， 100nM白花丹醌。圖3:白花丹醌抑制HUVEC細(xì)胞在修飾的Boyden小室中的遷移 實(shí)驗(yàn)。其中A，對(duì)照；B， 100nM白花丹醌。圖4:白花丹醌抑制HMEC—1細(xì)胞的成管照片。其中A，對(duì)照；B， 10pM白花丹醌。圖5:白花丹醌抑制雞胚尿囊膜新生血管形成的照片。其中A， 對(duì)照；B，15^g/濾紙片白花丹醌。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:白花丹醌抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。目的和原理內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTS assay。 MTS assay是一 種運(yùn)用比色法確定細(xì)胞增殖數(shù)量的測(cè)定方法在活細(xì)胞中，NADPH脫 氫酶將MTS四唑鹽化合物轉(zhuǎn)變成一種溶于組織培養(yǎng)液的一種有色物 質(zhì),其顏色深淺與某些細(xì)胞株的活細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)。 通過(guò)該模型可評(píng)價(jià)藥物對(duì)每批細(xì)胞增殖能力的影響。方法將lxl()5個(gè)/mlHMEC-l (人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)或HUVEC(人 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔50^1，給予含有 不同濃度白花丹醌的培養(yǎng)基50^1，在5%<:02培養(yǎng)箱37'C作用48 72 小時(shí)，然后每孔加入20nl檢測(cè)液，孵育1 4小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在 490nm處讀出每個(gè)孔中的光吸收值。結(jié)果與評(píng)價(jià)與對(duì)照組相比，給予白花丹醌后，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 受到抑制，說(shuō)明白花丹醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴(lài)性。實(shí)施例2:白花丹醌抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移目的和原理該細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)又叫體外劃痕實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在 單層內(nèi)皮細(xì)胞上制造劃痕，并在顯微鏡下觀察并記錄下劃痕邊緣細(xì)胞 往空隙部分遷移的情況來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。方法將4"04個(gè)/1111 HUVEC細(xì)胞接種于6孔板中，2ml/孔。待 細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上以后在每孔中制造一條劃痕。將此時(shí)浮于上層的死 細(xì)胞洗凈，再將藥物濃度不同的含4ng/ml VEGF的培養(yǎng)基加入到六孔 板中，于5%(302培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)。結(jié)果與評(píng)價(jià)在顯微鏡下觀察，待VEGF對(duì)照組的劃痕空隙部分 已被細(xì)胞完全覆蓋后通過(guò)顯微鏡拍照，結(jié)果為其中A為VEGF對(duì) 照組；B為100nM白花丹醌。與對(duì)照組A相比，給予白花丹醌后， 內(nèi)皮細(xì)胞的遷移受到抑制，說(shuō)明白花丹醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。實(shí)施例3: 白花丹醌抑制內(nèi)皮細(xì)胞Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮肀緦?shí)驗(yàn)采用Boyden小室細(xì)胞培養(yǎng)小室。細(xì)胞在生長(zhǎng) 因子的誘導(dǎo)下可以透過(guò)孔徑為8pm的多聚碳酸鹽濾膜，此實(shí)驗(yàn)可以 檢測(cè)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞在有阻力條件下的遷移能力的影響。方法用0.1%的明膠將6孔板包被，小室外六孔板中加入600^1 含有10ng/ml VEGF165的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。小室中接入的濃度為 4xl()Scells/mlHUVEC細(xì)胞懸液與含不同濃度白花丹醌的培養(yǎng)基, 37'C5XC02培養(yǎng)箱中孵育四小時(shí)。結(jié)果與評(píng)價(jià)四小時(shí)后，將小室內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，下層細(xì) 胞遷移的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20分鐘，用PBS漂洗干凈，蘇木 精伊紅染色各20分鐘，用PBS將背景多余染料洗去，室溫晾干。 OLYMPUS顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)穿過(guò)膜的細(xì)胞的個(gè)數(shù)。結(jié)果為其 中A為對(duì)照組；B為100nM白花丹醌；與對(duì)照組A比，給予白花丹 醌后，內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力受到影響，說(shuō)明白花丹醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞 的穿過(guò)微孔的遷移能力。實(shí)施例4:白花丹醌抑制內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮鞰atrigel是從ESH小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基 底膜提取物，富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在室溫下，此Matrigel基質(zhì)可 聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，作用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜類(lèi) 似。其對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附有效應(yīng)作用。MatHgel可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì) 胞形成管腔結(jié)構(gòu),建立血管形成的體外培養(yǎng)體系,然后施加實(shí)驗(yàn)樣品。 利用這種特性，可以來(lái)研究藥物對(duì)血管形成的影響。方法用預(yù)冷的移液器將Matrigel鋪到48孔板上，100pl/孔，37°C 孵育3 0min 。待其凝固后，每孔加入5 00pl濃度為12x104/ml的HMEC-1 細(xì)胞懸液，再加入500pl含有不同濃度白花丹醌的培養(yǎng)基，混勻。于 37°C 5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h在顯微鏡下觀察微管形成情況。結(jié)果與評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中生長(zhǎng)16-18h后，細(xì)胞不發(fā)生 融合，由原來(lái)的多角形變成長(zhǎng)梭形，并形成相互連接的毛細(xì)血管樣的血管網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果為其中A為對(duì)照組；B為lO^lM白花丹醌；與對(duì)照 組相比，給予白花丹醌之后，內(nèi)皮細(xì)胞的成管過(guò)程受到顯著抑制，血 管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，說(shuō)明白花丹醌可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管形成。 實(shí)施例5:白花丹醌抑制雞胚尿囊膜血管新生。目的和原理雞胚尿囊膜的血管新生早期，其機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未 完全建立，對(duì)異物幾乎不發(fā)生排斥，將含樣品的載體(濾紙片)置于 其表面，可觀察到藥物對(duì)血管新生的影響，也是目前研究血管生成最 常用、簡(jiǎn)捷的體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?方法將受精卵置于孵化箱中孵化5天，在超凈工作臺(tái)中，用酒精擦拭卵殼表面，在卵殼鈍端用鑷子小心地敲開(kāi)一個(gè)直徑約lcm圓形小口，通過(guò)小孔觀察胚胎所在的位置，在血管稀疏的地方用鑷子撕開(kāi)氣 室膜。將事先準(zhǔn)備好的加了不同濃度白花丹醌的載體濾紙片加在尿囊 膜無(wú)血管區(qū)域。用透明膠帶封口。 A為對(duì)照組，不加白花丹醌；15Pg/ 雞胚)結(jié)果與評(píng)價(jià)放入載體濾紙片的雞胚放入孵育箱中繼續(xù)孵育兩天，揭去透明膠帶，在OLYMPUS體視顯微鏡下拍照。結(jié)果為與對(duì)照組 A比較，給予白花丹醌之后，新的微血管生成受到抑制，說(shuō)明白花丹醌可以抑制雞胚尿囊膜的血管新成。
權(quán)利要求
1. 白花丹醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為 抑制腫瘤血管新生的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為 抑制關(guān)節(jié)炎病變組織的血管新生的藥物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于關(guān)節(jié)炎是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎或者炎性關(guān)節(jié)炎。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為 抑制血管新生性眼病血管新生的藥物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為血 管新生性角膜疾病。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為血 管新生性視網(wǎng)膜疾病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性視網(wǎng)膜疾 病為糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞或者早熟性視網(wǎng)膜病。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為抑 制血管新生性虹膜疾病。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為 抑制新生血管性青光眼。
11. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為 新生血管性脈絡(luò)膜疾病。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于脈絡(luò)膜病為抑制濕 性老年黃斑病變。
13. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為新 生血管性結(jié)膜眼病。
14. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于眼病為新生血管性 玻璃體眼病。
15. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于血管新生性眼病為 新生血管性視神經(jīng)疾病。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物 為抑制血管瘤病變組織血管新生的藥物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物 為抑制銀屑病病變組織血管新生的藥物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物 為抑制實(shí)體瘤病變組織血管新生的藥物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于實(shí)體瘤包括原發(fā)性和繼發(fā)性的實(shí)體瘤。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生的藥 物為抑制血管瘤的藥物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的應(yīng)用，其特征在于血管瘤包括多發(fā)性 血管瘤或者血管母細(xì)胞瘤。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物為 抑制Kaposi' s肉瘤病變組織血管新生的藥物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物 為抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌癥的藥物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管新生藥物 為抑制Paget' s疾病的藥物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制十二指腸潰瘍 疾病的藥物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于治療血管新生相關(guān) 的月經(jīng)不調(diào)疾病的藥物中的應(yīng)用。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于制備治療不孕癥的 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及白花丹醌的新用途，具體涉及白花丹醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供白花丹醌在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。尤其是白花丹醌在制備抑制腫瘤血管新生、銀屑病、卡波氏肉瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、非白血性白血病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、十二指腸潰瘍、骨髓瘤、淋巴瘤等疾病的血管新生藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，白花丹醌能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管，并能抑制雞胚尿囊膜的血管新生，可以用于制備抑制血管新生的藥物。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101283994SQ20081003810
公開(kāi)日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者劉明耀, 盧彬彬, 京 張, 張曉麗, 易庭芳, 易正芳, 力 賴(lài) 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)