專利名稱：：麥冬多糖mdg-1在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及麥冬多糖MDG-1新的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：養(yǎng)陰類中藥具有生津潤(rùn)燥、滋陰養(yǎng)液等功效，以治療陰虛證為主，它們的毒性一般較小，作用比較溫和，以滋補(bǔ)作用為主，對(duì)提高人體免疫力，防病治病具有重要的意義。隨著人們對(duì)多糖藥理作用的認(rèn)識(shí)，多糖的研究也愈來(lái)愈受到重視，具有養(yǎng)陰作用的中藥常含有大量的多糖，它們的生理活性作用分別體現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、降血糖、降血脂作用、抗氧化、抗衰老、保肝作用、抗病毒作用、抗疲勞、耐缺氧、抗纖維化、抗?jié)冏饔玫雀鞣矫?。中?guó)專利CN1445244A于2003年10月1日公開(kāi)的麥冬多糖MDG-1是分子量為5000的P-D-果聚糖，以2—1連接的呋喃型果糖為主，平均每2.8個(gè)主鏈基上有一個(gè)/^//(2—6),2T//(2—分支，且該多糖的還原端可能與a-D-Glc相連。麥冬多糖MDG-1抗心肌缺血作用顯著，是一種具有藥用價(jià)值的活性多糖。麥冬多糖MDG-1可以使缺血再灌的心臟收縮幅度和冠脈流量較快地恢復(fù)，并可抑制心率加快，還可降低缺血后血漿中乳酸脫氫酶的釋放。說(shuō)明麥冬多糖MDG-1對(duì)缺血再灌的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。(鄭琴、馮怡、徐德生等麥冬多糖MDG-l對(duì)鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血的保護(hù)作用，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(12):1116)。文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)麥冬多糖MDG-1治療糖尿病及作用機(jī)理的報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于開(kāi)發(fā)麥冬多糖MDG-1的新用途，提供麥冬多糖MDG-1在制備治療糖尿病藥物中應(yīng)用。本發(fā)明中的麥冬多糖MDG-1是從麥冬總多糖中分離獲得的。中國(guó)專利CN1445244A于2003年10月1日公開(kāi)了麥冬多糖MDG-1的制備方法。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥冬多糖MDG-1對(duì)于高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射造成的實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型(DM大鼠)，經(jīng)口服給藥9周后，MDG-l組(37mg/kg)飲食、飲水及尿量與模型組相比明顯減少，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)終末期，MDG-1組血糖與模型組相比明顯降低。綜合說(shuō)明，MDG-1組能夠改善匿大鼠的多食、多飲及多尿癥狀，具有一定的降血糖作用。本發(fā)明通過(guò)血管生成抗體芯片實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥冬多糖MDG-1能使FGF-p，F(xiàn)GF-a上調(diào)，這些結(jié)果說(shuō)明MDG-1可能是通過(guò)S1P/Akt/ERK信號(hào)通路，穩(wěn)定細(xì)胞膜，促進(jìn)新生血管的生成，從而改善缺血心肌的血液和能量供給，達(dá)到治療心肌缺血的作用；在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)麥冬多糖MDG-1能使L印tin，TNFa下調(diào)，而L印tin，TNFot同糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程相關(guān)，提示了麥冬多糖MDG-1可能通過(guò)抑制L印tin和TNFa通路，起到治療糖尿病的作用。本發(fā)明中，麥冬多糖MDG-1最好以片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或其他適合于口服的固體或液體藥物的形式存在于一個(gè)攝入單位中，而每個(gè)攝入單位麥冬多糖MDG-1的含量最好為0.03—0.3g，且每個(gè)攝入單位中麥冬多糖MDG-1的重量百分比最好為6-60%，余量為藥用輔料或附加劑。圖1是麥冬多糖MDG-150mg/ml組血管生成抗體芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2是麥冬多糖MDG-1lmg/ml組血管生成抗體芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施例方式有關(guān)本發(fā)明前述及其它技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效，在以下較佳實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明中，將可清楚的呈現(xiàn)。實(shí)施例l(麥冬多糖MDG-1降血糖實(shí)驗(yàn)研究)1、糖尿病大鼠模型的建立清潔級(jí)$SD大鼠60只，體重(90士10)g，隨機(jī)進(jìn)行分組，其中10只作為正常對(duì)照組，給予普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其余50只予高糖高脂飲食，5周后將高脂高糖詞料喂飼的動(dòng)物，給予腹腔注射P/。STZ(40mg/kg)造模，正常對(duì)照組給予等容量溶媒，72小時(shí)后，空腹血糖>16.7腿01/1，尿糖在+++以上作為糖尿病造模成功大鼠，將DM大鼠根據(jù)血糖及尿糖隨機(jī)分為4組，分別為模型組(N=10)，MDG低劑量(37mg/kg)治療組(N二9)，MDG高劑量(75mg/kg)治療組(N=10)，二甲雙胍組(N二10，20mg/kg)。各組按上述藥物劑量灌胃，正常對(duì)照組給予以等量的生理鹽水，匿大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高脂高糖飼料，空白組飼養(yǎng)個(gè)普通詞料，治療9周。2、觀測(cè)指標(biāo)治療后的第3周、第6周、第9周代謝籠收集24h尿液，同時(shí)檢測(cè)24小時(shí)飲食、飲水、尿量、尿糖。體重每周測(cè)一次。給藥9周后，禁食12h，次日以25y。烏拉坦麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈收集血標(biāo)本，測(cè)空腹血清血糖、糖化血紅蛋白(均為常規(guī)生化方法)。3、指標(biāo)測(cè)定血糖測(cè)定禁食8小時(shí)后，尾靜脈取血，用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，用血糖飲食、飲水、尿量的測(cè)定采用代謝籠，分別于第3周、第6周、第9周測(cè)定大鼠的飲食、飲水和收集24h尿液，觀察其變化。每周稱量大鼠的體重，觀察其變化。用藥9周后，禁食8小時(shí)后麻醉，腹主動(dòng)脈取血，用生化分析儀測(cè)定血糖，用羅氏ModularP800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定糖化血紅蛋白。4、統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)用x士s表示，用SPSS13.O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.l.造模情況50只高脂高糖飼料喂養(yǎng)的大鼠詞養(yǎng)5周后，然后按照40mg/kg的劑量腹腔注射l。/。的STZ后，血糖〉16.7，尿糖+++或以上納入DM造模成功大鼠,共有39只，按照血糖、尿糖及體重隨機(jī)進(jìn)行分組，包括模型組(n=10)、MDG-l低劑量組(37mg/kg，n=9)、MDG-1高劑量組(75mg/kg，n=10)、二甲雙胍組(n=10)。各濕組血糖與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(p〈0.01)。見(jiàn)表l。表1.注射1%STZ后各組血糖的變化正常對(duì)照組模型組MDG低劑量組MDG高劑量組二甲雙胍血糖4.2±0.218.9±2.3"20.0±3.1"19.8±2.9"19.3±3.1"AP<0.05，"P〈0.01vscontrolgroup5.2.各組大鼠治療期間飲食變化在給藥后的第3周、第6周、第9周，與正常對(duì)照組相比，各DM組飲食有顯著增加(P〈0.01);與模型組相比，MDG-1低劑量組飲食在給藥后的6周、9周均有顯著降低(P〈0.05)，而MDG-1高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〉0.05)。_表2,造模后各組飲食的變化(單位g/24小時(shí))_空白組模型組MDG低劑量組MDG高劑量組二甲雙胍組3周30.6±0.539.3±3.7**39.5±2.041.7±5.439.4±6.56周25.5±1.643.7±i.3甜38.1±0.5"42.1±3.141.9±4.9"9周26.8±0.445.6±1.0**37.8±2.9"41.1±6.237.1±4,8"P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;"<0.05，"P<0.01vsmodelgro卯5.3.各組大鼠治療期間飲水變化在治療后的第3周、第6周、第9周，與正常對(duì)照組相比，各DM組飲水顯著增加(P〈0.01);與模型組相比，各治療組組飲水顯著降低(P<0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05,P<0.01vscontrolgroup;AP<0.05,"P〈0.01vsmodelgroup5.4.各組大鼠治療期間尿量的變化在治療后的第3周、第6周、第9周，與正常對(duì)照組相比，各DM組飲食明顯增加，有顯著性差異(P〈0.01)，見(jiàn)表2。與模型組尿量相比，MDG-1低劑量組明顯減少，有顯著差異(P<0.05)，而MDG-l高劑量組6、9周尿量差異無(wú)顯著意義(p〉0.05)。_表4.造模后各組尿量的變化(單位ml)_空白組模型組MG低劑量組MG高劑量組二甲雙胍組3周21.3±7.433.2±14.5#6周14.5±4.640.7±20.489周16.4±5.137.2±6.0##將》P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;*P<0.05,"P<0.01vsmodelgroup15.2±6.4**20.8±9.6*24.7±12.125.8±10.0A38.5±14.49.8±3.6A17.3±6.5A36.2±1.712.4±5.5.5.各組大鼠給體重的變化造模后，DM組開(kāi)始給藥，正常對(duì)照組給予同等量的生理鹽水，在整個(gè)給藥期間與空白對(duì)照組相比，各DM組體重出現(xiàn)明顯的減少見(jiàn)表2。與模型組相比，各治療組體重?zé)o明顯變化(p〉0.05)。表5.造模后各組體重在不同時(shí)間段的情況(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05,P<0.01vscontrolgroup;<0.05，"P<0.01vsmodelgroup5.6.給藥9周大鼠血糖及糖化血紅蛋白影響與正常對(duì)照組比較，模型組血糖、糖化血紅蛋白顯著升高(P〈0.01);與模型組相比，MDG-l低劑量血糖顯著降低(P<0.05)糖化血紅蛋白有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)結(jié)果見(jiàn)表6。表6.實(shí)驗(yàn)終末期各組血糖、糖化血紅蛋白的變化(單位mniol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;*P<0.05，"P<0.01vsmodelgroup6、實(shí)驗(yàn)結(jié)論高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射是實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠常用造模方法。通過(guò)高熱量飼料喂養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上給予一定劑量STZ破壞部分胰島e細(xì)胞，引起大鼠高血糖狀態(tài)。在此次實(shí)驗(yàn)中，先給予SD大鼠5周的高脂高糖飼料喂養(yǎng)，然后腹腔注射40mg/kg的1%STZ,與正常對(duì)照組相比，各DM組大鼠血糖、尿糖明顯升高(P〈0.0D，同時(shí)表現(xiàn)出明顯的"三多一少"癥狀，飲食、飲水、尿量明顯增多，體重減輕。經(jīng)給藥9周后，MDG-1低劑量組(37mg/kg)飲食、飲水及尿量與模型組相比明顯減少，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)終末期，MD-1G低劑量組(37mg/kg)血糖與模型組相比明顯降低。綜合說(shuō)明，MDG-1低劑量組能夠改善DM大鼠的多食、多飲及多尿癥狀，具有一定的降血糖作用。實(shí)施例2(麥冬多糖MDG-1對(duì)血管生成抗體芯片實(shí)驗(yàn)的影響)1、細(xì)胞培養(yǎng)和加藥取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMEC-1細(xì)胞，放置于6孔板中，放置37"C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)達(dá)到106個(gè)時(shí)，換無(wú)血清MCDB131培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，然后加入用無(wú)血清MCDB131培養(yǎng)液配制的麥冬多糖MDG-1培養(yǎng)液。共兩組，其中一組加藥組(lmg/ml或50mg/ml)，另一組為空白對(duì)照組。加藥后分別于18h時(shí)提取蛋白。2、蛋白樣品制備每瓶細(xì)胞加lml4。C預(yù)冷的PBS。平放輕輕搖動(dòng)洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。100jil裂解液加0.5filPMSF(100mM)禾卩l(xiāng)pl抑制劑，搖勻置于冰上。每瓶細(xì)胞加IOOW裂解液，于冰上裂解30min后，4°C下14000rpm離心15min。3、蛋白含量的測(cè)定取樣品1.5ml至離心管中，每管加入4"C儲(chǔ)存的工作液lml?？瞻讓?duì)照組加入20pl水，樣品組加入5W樣品和15W水。采用分光光度法，以空白對(duì)照組為空白對(duì)照，測(cè)定595nm下樣品組吸光度。測(cè)定數(shù)值用y-0.7174x+0.0954計(jì)算，所得y值乘4即為蛋白濃度。4、免疫反應(yīng)將AngiogenesisAntibodyArray膜放入8孑L板中，力口入3ml1XBlockingBuffer,確保膜蛋白面向上，室溫孵化lh。移去1XBlockingBuffer,用4mlIXWashBufferII洗膜兩次，棄去多余液體。力口500nl樣品于膜的蛋白面，室溫孵化l2h。傾去樣品液，用4mllXWashBufferI在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4ml1XWashBufferII在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。取出膜，用濾紙吸去殘留液，裝入新孔中，將Biotin-ConjugatedAnti-AngiogenesisMix用lXWashBufferII稀釋至適當(dāng)濃度加入孔中。室溫下孵育2h后，用4mllXWashBufferI在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4mlIXWashBufferII在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。同上方法準(zhǔn)備lXStr印avidin-HRPConjugate稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育lh后，用4ml1XWashBufferI在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4mllXWashBufferII在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。5、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合后加在膜的蛋白面上，使其與混合液充分接觸；5min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。在暗室中，將lx顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X—光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小；打開(kāi)X-光片夾，把X—光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。6、凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果麥冬多糖MDG-150mg/ml組見(jiàn)圖1。麥冬多糖MDG-1lmg/ml組見(jiàn)圖2?？贵w芯片位點(diǎn)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3。結(jié)果分析見(jiàn)表2.1。如圖2所示，lmg/ml麥冬多糖MDG-1能使FGF-(3上調(diào)，使Leptin，TNFa，HGF下調(diào)。如圖1所示，50mg/ml麥冬多糖MDG-l能使IFNy，IL-12,FGF-P上調(diào)，使Leptin，TNFoc，HGF下調(diào)。表2.1抗體芯片位點(diǎn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8、實(shí)驗(yàn)結(jié)論血管生成抗體芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MDG-1能使Leptin，TNFa下調(diào)，由于Leptin，TNFa同糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)成發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，所以麥冬多糖MDG-1抑制Leptin和TNFa的作用有利于治療糖尿病以及減少糖尿病并發(fā)癥，其治療糖尿病的作用可能同抑制Leptin和TNFa通路相關(guān)。實(shí)施例3(麥冬多糖MDG-1片的制備)麥冬多糖MDG-110克；輔料HPMC、十八烷醇、硬脂酸鎂，共40克；制備將主藥及HPMC、十八垸醇充分混合均勻，過(guò)IOO目篩，加粘合劑制成軟材，過(guò)16目篩制粒，4(TC干燥，整粒。加硬脂酸鎂作潤(rùn)滑劑，混合后壓片，共制100片，每片0.5克，即可。本實(shí)施例制得的麥冬多糖MDG-1片，每片為一個(gè)攝入單位，每個(gè)攝入單位中含麥冬多糖MDG-10.1克，重量百分含量為20%。實(shí)施例4(麥冬多糖MDG-1膠囊的制備)取麥冬多糖MDG-115克；輔料淀粉、糊精、碳酸鈣等共45克；制備:將主藥及輔料充分混合均勻，裝膠囊，共制100粒，每粒0.5克，即可。本實(shí)施例制得的麥冬多糖MDG-1膠囊，每1粒為一個(gè)攝入單位，每個(gè)攝入單位中含麥冬多糖MDG-10.15克，重量百分含量為30%。實(shí)施例5(麥冬多糖MDG-1顆粒劑的制備)麥冬多糖MDG-1IO克；輔料淀粉、糊精、糖粉等，共90克；將主藥及輔料充分混合均勻，用適當(dāng)濃度的乙醇適量制軟材，制粒，干燥，整粒，分裝，每包2克，共制50包，即可。本實(shí)施例制得的麥冬多糖MDG-1顆粒，每包為一個(gè)攝入單位，每個(gè)攝入單位中含麥冬多糖MDG-10.2克，重量百分含量為10%。實(shí)施例6(麥冬多糖MDG-1口服液的制備)取麥冬多糖MDG-1500克，加適量水溶解，過(guò)濾，加入適量甜味劑及防腐劑溶解后，加水至1000ml，分裝，每瓶10ml，即可。本實(shí)施例制得的麥冬多糖MDG-1口服液，每瓶為一個(gè)攝入單位，每個(gè)攝入單位中含麥冬多糖MDG-15.0克，體積百分含量為50%。權(quán)利要求1、麥冬多糖MDG-1在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。2、權(quán)利要求l的用途，其特征是，麥冬多糖MDG-1以片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或其他適合于口服的固體或液體藥物的形式存在于一個(gè)攝入單位中。3、權(quán)利要求2的用途，其特征是，每個(gè)攝入單位含有麥冬多糖MDG-10.03—0.3g。4、權(quán)利要求2或3的用途，其特征是，每個(gè)攝入單位中麥冬多糖MDG-1的重量百分比為6-60%,余量為藥用輔料或附加劑。全文摘要本發(fā)明涉及麥冬多糖MDG-1在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。麥冬多糖MDG-1能夠改善DM大鼠的多食、多飲及多尿癥狀，且具有一定的降血糖作用，其作用機(jī)制可能涉及通過(guò)抑制Leptin和TNFα通路，起到治療糖尿病的作用。文檔編號(hào)A61P3/10GK101564399SQ200810043279公開(kāi)日2009年10月28日申請(qǐng)日期2008年4月23日優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日發(fā)明者怡馮,徐德生,曉林,嵐沈申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)