專利名稱：一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬獸醫(yī)生物新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地講涉及一種豬繁殖與呼吸綜合 征滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的繁 殖障礙性和呼吸道的傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失， 嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，已經(jīng)成為豬病研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)在由于對(duì)豬繁殖 與呼吸綜合征尚無有效治療方法，注射疫苗是防制該病的重要手段。目前國(guó)內(nèi) 外已研制出許多疫苗來預(yù)防和控制豬繁殖與呼吸綜合征，但由于使用豬繁殖與 呼吸綜合征弱毒疫苗預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征有潛在的生物安全危險(xiǎn)，因而獸 醫(yī)科技工作者和生產(chǎn)人員多主張采用滅活苗預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是公開一種豬繁殖與呼吸綜合征 滅活疫苗的制備方法，該滅活疫苗可以有效地防止豬繁殖與呼吸綜合征，并且 具有生產(chǎn)方便，使用安全，易于保存的優(yōu)點(diǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
所述一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
① 、生產(chǎn)用毒種的制備將已長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液，以含 0. 01TCIDs。/個(gè)細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時(shí) 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM維持液，在37'C含5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察 48小時(shí)，凍融1次收獲感染細(xì)胞毒液，裝于滅菌容器內(nèi)。
② 、制苗用病毒液的制備將生長(zhǎng)良好的單層Marc-145細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液，按照0. 01TCIDs。/細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產(chǎn)用毒種，37'C吸附 1小時(shí)后，加入含2%新生牛血清的DMEM維持液，置37。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至48小時(shí)收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量^107』TCID5。/ml病毒液在4。C滅活48小時(shí) 后，取滅活病毒液94 98份(體積份)，加入2 6份(體積份)的吐溫-80混合制 成水相；取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨 攪拌至透明為止，加熱到121'C、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相 與油相混合，混合之比為1:1.5 1:2.5—起乳化，分裝，入庫。
所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株是本公司自行在國(guó)內(nèi)分離的豬繁殖與呼 吸綜合征病毒流行株CQ株，為國(guó)內(nèi)流行的美洲型基因型毒株，與國(guó)內(nèi)同期其它 分離株的同源性都在95%以上，該毒株繁殖特性好。在Marcl45細(xì)胞上的毒價(jià) 可達(dá)108()/ml以上。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株的取得通過對(duì)從河南省豬繁殖與呼吸綜 合征流行豬場(chǎng)送檢的高熱病流產(chǎn)死胎肺臟分離的病毒株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)特性 觀察、病毒理化特性測(cè)定、病毒核酸類型測(cè)定、病毒中和試驗(yàn)、RT-PCR鑒 定和動(dòng)物回歸等試驗(yàn)，證實(shí)分離的病毒株均為為豬繁殖與呼吸綜合征病毒。 試驗(yàn)分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒株能被美洲型抗血清所中和。另外， 本研究應(yīng)用美洲型PRRSV特異的引物進(jìn)行的RT-PCR反應(yīng)，能對(duì)本分離株擴(kuò) 增出特異性DNA片段，對(duì)歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒則不能，進(jìn)一步 證實(shí)分離毒為美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。將其命名為豬繁殖與呼吸 綜合征病毒CQ株。
所述制苗用病毒液創(chuàng)新采用低溫滅活，2 8'C經(jīng)48小時(shí),可徹底滅活病毒， 并不影響其免疫原性。該豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗采用的油相的配方與常規(guī)不同，白油94份, 司本-80 6份，無硬鋁。實(shí)驗(yàn)證明沒有硬脂酸鋁的油苗粘度更小，穩(wěn)定性也好， 對(duì)動(dòng)物機(jī)體的刺激性也小。
由于采用了如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下積極效果
① 、采用的毒株為在國(guó)內(nèi)分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行株，免疫原 性良好，用其制備的疫苗免疫國(guó)內(nèi)豬群能更好的抵抗野毒的攻擊，為豬繁殖與 呼吸綜合征疫情的防控提供了技術(shù)保障。
② 、采用了轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的方法，而且采用先進(jìn)科學(xué)的接毒工藝，不僅提高了 產(chǎn)量，而且所收獲的病毒液毒價(jià)也高。豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株在 Marc-145細(xì)胞上增殖過程中，接種劑量為0.01 0.1TCID5(/個(gè)細(xì)胞，最佳收毒時(shí) 間為48 60h,最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，凍融次數(shù)以一次為宜，這大大的降低 了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。
③ 、本發(fā)明采用低溫滅活，4'C經(jīng)48小時(shí)，可徹底滅活病毒，并不影響其免 疫原性。
、使用的佐劑屬于免疫增強(qiáng)劑中的一類，單獨(dú)使用時(shí)一般沒有免疫原性， 與抗原物質(zhì)合并使用時(shí)，能增強(qiáng)抗原物質(zhì)的免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答， 或者改變機(jī)體免疫應(yīng)答類型。本發(fā)明采用的佐劑是白油、吐溫-80、司盤，沒有 加入硬脂酸鋁穩(wěn)定劑，實(shí)驗(yàn)證明沒有硬脂酸鋁的油苗粘度更小，穩(wěn)定性也好， 對(duì)動(dòng)物機(jī)體的刺激性也小。本發(fā)明成品檢驗(yàn)效力檢驗(yàn)部分采用血清學(xué)的方法評(píng) 價(jià)，比常規(guī)的攻毒檢測(cè)方法更為準(zhǔn)確、直觀、快速、結(jié)果更可靠，而且更符合生 物安全的原則。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1: 一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下① 、生產(chǎn)用毒種的制備將已長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液，以含 0. 01TCID5。/個(gè)細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時(shí) 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM維持液，在37"C含5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察 48小時(shí)，凍融1次收獲感染細(xì)胞毒液，裝于滅菌容器內(nèi)。
② 、制苗用病毒液的制備將生長(zhǎng)良好的單層Marc-145細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液， 按照0. 01TCID5。/細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產(chǎn)用毒種，37'C吸附 l小時(shí)后，加入含2M新生牛血清的DMEM維持液，置37。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至48小時(shí)收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量》l()7。TCID5。/ml病毒液在4。C滅活48小時(shí) 后，取滅活病毒液94份(體積份)，加入6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相； 取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨攪拌至透 明為止，加熱到12rC、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油混合， 混合之比為1:1.5—起乳化，分裝，入庫。
實(shí)施例2: —種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
① 、生產(chǎn)用毒種的制備將已長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液，以含 0. 01TCID5。/個(gè)細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時(shí) 后，加入含2y。新生牛血清的DMEM維持液，在37。C含5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察 48小時(shí)，凍融1次收獲感染細(xì)胞毒液，裝于滅菌容器內(nèi)。
② 、制苗用病毒液的制備將生長(zhǎng)良好的單層Marc-145細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液， 按照0. 01TCIDs。/細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產(chǎn)用毒種，37。C吸附 1小時(shí)后，加入含2%新生牛血清的DMEM維持液，置37。C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至48小時(shí)收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量》l(TTCID5。/ml病毒液在4'C滅活48小時(shí)后，取滅活病毒液96份(體積份)，加入4份(體積份)的吐溫-80混合制成水相； 取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨攪拌至透 明為止，加熱到12rC、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混 合，混合之比為1:2.0—起乳化，分裝，入庫。
實(shí)施例3: —種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下
① 、生產(chǎn)用毒種的制備將已長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液，以含 0. 01TCIDs。/個(gè)細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37'C吸附1小時(shí) 后，加入含2呢新生牛血清的DMEM維持液，在37t:含5^C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察 48小時(shí)，凍融1次收獲感染細(xì)胞毒液，裝于滅菌容器內(nèi)。
② 、制苗用病毒液的制備將生長(zhǎng)良好的單層Marc-145細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液， 按照0. 01TCIDs。/細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產(chǎn)用毒種，37'C吸附 1小時(shí)后，加入含2%新生牛血清的DMEM維持液，置37-C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至48小時(shí)收 獲病毒液。
③、滅活疫苗制備將病毒含量》l(TTCID5。/ml病毒液在4'C滅活48小時(shí) 后，取滅活病毒液98份(體積份)，加入2份(體積份)的吐溫-80混合制成水相； 取注射用白油94份(體積份)，司本-80 6(體積份)份混合后，隨加隨攪拌至透 明為止，加熱到12rC、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混 合，混合之比為1:2.5—起乳化，分裝，入庫。
權(quán)利要求
1、一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其特征是其制備步驟如下①、生產(chǎn)用毒種的制備將已長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞倒去生長(zhǎng)液，以含0.01TCID50/個(gè)細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小時(shí)后，加入含2％新生牛血清的DMEM維持液，在37℃含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察48小時(shí)，凍融1次收獲感染細(xì)胞毒液，裝于滅菌容器內(nèi)；②、制苗用病毒液的制備將生長(zhǎng)良好的單層Marc-145細(xì)胞，倒去生長(zhǎng)液，按照0.01TCID50/細(xì)胞接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒CQ株生產(chǎn)用毒種，37℃吸附1小時(shí)后，加入含2％新生牛血清的DMEM維持液，置37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至48小時(shí)收獲病毒液；③、滅活疫苗制備將病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃滅活48小時(shí)后，取滅活病毒液94～98份(體積份)，加入2～6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相；取注射用白油94份(體積份)，司本-806(體積份)份混合后，加熱到121℃、壓力103kPa滅菌后備用，即為油相；將水相與油相混合，混合之比為1∶1.5～1∶2.5，一起乳化，分裝，入庫。
全文摘要
一種豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下①生產(chǎn)用毒種的制備；②制苗用病毒液的制備；③滅活疫苗制備將病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml病毒液在4℃滅活48小時(shí)后，取滅活病毒液94～98份(體積份)，加入2～6份(體積份)的吐溫-80混合制成水相；取注射用白油94份(體積份)，司本-806(體積份)份混合后制成油相；將水相與油相混合之比為1∶1.5～1∶2.5一起乳化即制成，分裝，入庫。該方法具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，制出的豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗效果好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101607082SQ20081005004
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2008年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者喬榮岑, 習(xí)向鋒, 孫進(jìn)忠, 孟照國(guó), 晉春霞, 楊海岳, 榮駿弓, 閔亞杰 申請(qǐng)人:洛陽普萊柯生物工程有限公司