一種抗豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種抗PRV和SIV疾病的疫苗組合物，該組合物除用于預(yù)防豬偽狂犬和豬流感外，還可預(yù)防其它病原感染所致的PRDC的臨床表現(xiàn)。本發(fā)明還提供了一種所述疫苗組合物在預(yù)防和/或控制免疫仔豬PRDC疾病藥物中的應(yīng)用。該組合物在使用過(guò)程不僅抗原之間不存在干擾，而且針對(duì)豬豬呼吸道病綜合征有令人意外的預(yù)防效果。因此，使用該疫苗組合物，可簡(jiǎn)化免疫程序，達(dá)到一針?lè)纼刹〉淖饔?。以抗豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物免疫仔豬后，可有效預(yù)防PRDC的流行。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種抗豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧類(lèi)生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及以豬偽狂犬活病毒抗原和豬流感病毒滅活抗原制得的疫苗組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是多種動(dòng)物共患的傳染病，引起家畜和野生動(dòng)物急性致死性的傳染病，以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎為主要癥狀，豬是其自然易感宿主，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，仔豬感染主要是神經(jīng)癥狀和急性死亡，成年豬則以呼吸道感染為主，該病已成為種豬繁殖障礙綜合癥和仔豬大量死亡的主要病因。
[0003]豬流感(Swine influenza, SI)是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要的呼吸系統(tǒng)疾病,主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽和呼吸困難等特征，是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)普遍存在且難以根除的群發(fā)性疫病之一。據(jù)國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道，豬體內(nèi)的A型流感病毒血清亞型有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2，國(guó)內(nèi)的豬流感病毒血清亞型主要以H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2為主，而其中又以HlNl和H3N2亞型為主。
[0004]豬呼吸道病綜合征(Porcinerespiratory disease complex, PRDC)是目前豬場(chǎng)危害最為嚴(yán)重的疾病。引起PRDC的原因是多方面的，通常是由病原(病毒、細(xì)菌、支原體、寄生蟲(chóng))、環(huán)境及飼養(yǎng)管理等多種因素相互作用所引起的，并且大多是由兩種或幾種病原混合感染所致。豬偽狂犬病毒和豬流感病毒作為主要的PRDC原發(fā)性病原體，除單獨(dú)感染外，還能夠混合感染以及繼發(fā)其它病原感染，加劇了疫病的嚴(yán)重程度，導(dǎo)致發(fā)病動(dòng)物的死亡率增加，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大。免疫接種是豬偽狂犬病和豬流感防制的重要措施，但目前市面上無(wú)豬偽狂犬病、豬流感二聯(lián)疫苗或疫苗組合物出售，其主要原因是:豬偽狂犬病毒能引起免疫抑制，和其它疫苗聯(lián)合使用時(shí)，可導(dǎo)致疫苗的免疫效果降低；另外，目前豬流感疫苗為滅活疫苗，而豬偽狂犬為活病毒疫苗，滅活疫苗中的滅活劑(如甲醛、β -丙內(nèi)酯)和疫苗佐劑(如礦物油佐劑)將對(duì)活病毒有滅活或干擾作用，將降低疫苗的免疫效果，因此，將豬偽狂犬、豬流感制備成二聯(lián)疫苗或疫苗組合物，需要解決滅活劑、佐劑、抗原之間的干擾問(wèn)題，以達(dá)到確實(shí)的免疫效果。
[0005]中國(guó)專(zhuān)利CN1624143A公開(kāi)了表達(dá)豬流感病毒血凝素基因的重組偽狂犬病毒及應(yīng)用，該重組病毒僅表達(dá)了 Η3亞型豬流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)基因，對(duì)其它亞型(如目前流行的Hl亞型豬流感)不能提供有效的保護(hù)，因?yàn)樨i流感病毒不同亞型血凝素差異較大，因而不同亞型間的交叉保護(hù)差，且用基因工程表達(dá)會(huì)對(duì)動(dòng)物存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]因此，目前存在的問(wèn)題需要研究開(kāi)發(fā)一種除用于預(yù)防豬偽狂犬和豬流感外，還可預(yù)防其它病原感染所致的PRDC的臨床表現(xiàn)的抗豬偽狂犬、豬流感的疫苗組合物。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種預(yù)防或治療PRV和SIV疾病的疫苗組合物，該組合物除用于預(yù)防豬偽狂犬和豬流感外，還可預(yù)防其它病原感染所致的PRDC的臨床表現(xiàn)。本發(fā)明還提供了一種所述疫苗組合物在預(yù)防和/或控制免疫仔豬PRDC疾病藥物中的應(yīng)用。該組合物在使用過(guò)程不僅抗原之間不存在干擾，而且針對(duì)豬豬呼吸道病綜合征有令人意外的預(yù)防效果。因此，使用該疫苗組合物，可簡(jiǎn)化免疫程序，達(dá)到一針?lè)纼刹〉淖饔谩?br> [0008]為此，本發(fā)明提供了一種抗PRV和SIV感染的疫苗組合物，其包含至少一種PRV抗原和至少一種SIV抗原。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述PRV抗原包括豬偽狂犬活病毒、改良/嵌合的豬偽狂犬活病毒、至少含有豬偽狂犬病毒的免疫原性氨基酸序列的重組病毒、豬偽狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒中的一種或任意幾種的組合。
[0010]PRV活疫苗分為天然基因缺失疫苗、人工傳代致弱疫苗和使用基因工程技術(shù)去除特定的和毒力有關(guān)的基因或基因片段而獲得的缺失疫苗共3種活疫苗。目前，全世界普遍使用的PRV活疫苗毒株有Bartha株、Bartha_K61株、Bucharest株、BUK株、SA215株和Ea株。PRV只有一個(gè)血清型，雖然不同毒株在毒力和生物學(xué)特征等方面存在差異，但其免疫原性相似，因?yàn)镻RV活疫苗毒株缺失的為毒力基因，具有免疫原性的蛋白均存在。因此，使用不同PRV毒株的活疫苗，均可取得不錯(cuò)的免疫效果。[0011]本發(fā)明所用的“免疫量”是指提供針對(duì)豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物的免疫的疫苗量，主要取決于以下因素:被免疫動(dòng)物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態(tài)以及動(dòng)物之前是否接受過(guò)對(duì)抗同樣病毒的疫苗。
[0012]在本發(fā)明中，所述PRV抗原為全病毒活疫苗。在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的PRV抗原含量為≥5.0X IO5 0TCID50/頭份。優(yōu)選所述的PRV抗原含量為1.0 X 106_tlTCID5tl/頭份。
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述PRV抗原包括豬偽狂犬病毒基因缺失SA215株(CCTCC N0.V200002)、Ea 株(CGMCC，保藏編號(hào) N0.0907)、WKQ-001 株(CCTCC，保藏號(hào)V200511)、豬偽狂犬病弱毒 Bartha 株、Bartha_K61 株、Bucharest 株、BUK 株、H 株(GCMCC，保藏號(hào)為N0.5013)和C株(CCTCC，保藏編號(hào)V201114)中的一種或任意幾種的組合。
[0014]本發(fā)明中，SIV抗原是指包含至少一種抗原的任何組合物，所述抗原在對(duì)豬給藥后可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)抗豬流感病毒感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述SIV抗原是完整的豬流感全病毒，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，流感抗原HA基因序列上的微小改變，對(duì)其免疫作用影響有限，即通過(guò)其它途徑分離的自然界中的野毒也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的功能。
[0015]根據(jù)本發(fā)明，所述SIV抗原包括完整的豬流感全病毒、含有至少SIV的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、任何其它SIV片段中的一種或任意幾種的組合。
[0016]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述完整的豬流感全病毒包括滅活形式的豬流感全病毒、改良的SIV活病毒或減毒的SIV病毒。優(yōu)選所述完整的豬流感全病毒包括HlNl亞型全病毒抗原或H3N2亞型全病毒抗原的至少一種。
[0017]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知:豬流感滅活疫苗以HlNl和H3N2亞型為主，不同病毒亞型間交叉保護(hù)差，但相同亞型間毒株存在交叉保護(hù)，因?yàn)榱鞲胁《镜闹饕Ｗo(hù)性蛋白為HA蛋白，相同亞型病毒的HA蛋白同源性高，具有相似的抗原表位。因此，HA蛋白制備的亞單位疫苗的免疫效果，一定程度上可達(dá)到全病毒滅活疫苗的免疫效果。[0018]根據(jù)本發(fā)明，在所述疫苗組合物中，所述HlNl亞型全病毒抗原滅活前≥1O7 tlTCID5ci/頭份。優(yōu)選所述HlNl亞型全病毒抗原滅活前為IO7 5TCID5tl/頭份。在所述疫苗組合物中，所述H3N2亞型全病毒抗原滅活前> 1O7 tlTCID5ci/頭份。優(yōu)選所述H3N2亞型全病毒抗原滅活前為107_ 5TCID5tl/頭份。
[0019]本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“頭份”是指每頭豬注射的疫苗量。
[0020]本發(fā)明中所述的“TCID5(i” (50%tissue culture infective dose)是指半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量，是表示病毒感染力的一種表示方式。本發(fā)明中所述的“血凝價(jià)”是指SIV全病毒抗原或HA亞單位抗原使0.5%的紅細(xì)胞發(fā)生100%凝集的最大稀釋倍數(shù)，是具有血凝性抗原含量的一種表不方法。
[0021]本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“抗PRV和SIV疾病的疫苗組合物”，是指預(yù)防和治療PRV和SIV疾病的疫苗組合物。
[0022]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述HlNl亞型全病毒抗原為豬流感病毒(H1N1亞型)ZJS 株(Swine influenza virus (HlNlsubtype) strainZJS),其保藏編號(hào)為:CCTCCN0.V201233，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年8月13日。
[0023]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述H3N2亞型全病毒抗原為豬流感病毒(H3N2亞型)WX 株(Swine influenza virus (H3N2subtype) strainWX),其保藏編號(hào)為:CCTCCN0.V201234，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年8月13日。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，所述其它SIV片段包括含SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位或其變異體。優(yōu)選所述其它SIV片段為含SIV HA基因的亞單位。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述其它SIV片段為含由SIV HA基因構(gòu)建的SIV HA蛋白的亞單位。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，所述SIV HA蛋白包括HlNl亞型的HA蛋白或H3N2亞型的HA蛋白。所述HlNl亞型HA蛋白的血凝價(jià)≥llLog2。所述H3N2亞型HA蛋白的血凝價(jià)≥llLog2。所述HlNl亞型的HA蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ N0.3所示。所述H3N2亞型的HA蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ N0.4所示。
[0026]本發(fā)明還提供了一種根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗組合物在預(yù)防和/或控制免疫仔豬PRDC疾病藥物中的應(yīng)用。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述疫苗組合物還包括凍干保護(hù)劑。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，所述凍干保護(hù)劑包括但不限于乳糖、脫脂牛奶、明膠、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉和維生素C中一種或幾種。
[0029]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的凍干保護(hù)劑是耐熱凍干保護(hù)劑，主要包括但不限于含有明膠、牛血清白蛋白、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉和維生素C中一種或幾種。
[0030]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述疫苗組合物還可以包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或賦形劑，并可以選擇包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
[0031]疫苗佐劑通?？煞譃橛托宰魟┖退宰魟?，油性佐劑一般是指疫苗中含油量在10%~60%之間，通常為礦物油。水性佐劑一般是指疫苗中含油量低于10%，通常為植物油或可降解油。油性佐劑應(yīng)激大,產(chǎn)生抗體慢,而水性佐劑應(yīng)激小,產(chǎn)生抗體快。
[0032]優(yōu)選地，本發(fā)明所述疫苗佐劑可以包括氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷如Quil A和QS-21、輕質(zhì)礦物油如Marcol52、由烯烴寡聚產(chǎn)生的類(lèi)異戊二烯油如角鯊?fù)榛蚪酋徬⒖ú?、MontanideTM Gel等水性疫苗佐劑。更優(yōu)選地，本發(fā)明中所述疫苗佐劑為水性疫苗佐劑，即卡波姆、按一定比例配制的水溶液。
[0033]此外，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種用于預(yù)防和治療PRV和SIV感染的疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟:
[0034]( 1)制備PRV活病毒抗原。
[0035]( 2)制備SIV滅活抗原。
[0036](3)將PRV活病毒抗原加入疫苗凍干保護(hù)劑真空凍干，另將SIV滅活抗原和水性疫苗佐劑(卡波姆、皂苷、左旋咪唑、膽固醇按一定比例配制的水懸液)按一定量混合，疫苗免疫時(shí)，將SIV滅活抗原稀釋PR凍干抗原，即成豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物。
[0037]其中，步驟(1)中制備PRV活病毒抗原方法不限于使用雞胚成纖維原代細(xì)胞培養(yǎng)，也可采用傳代細(xì)胞培養(yǎng)，如ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞。具體方法包括:將PRV毒種接種于ST細(xì)胞上，優(yōu)選毒種接種量為病毒感染復(fù)數(shù)(M.0.1.)為0.001~0.1，優(yōu)選培養(yǎng)溫度為33~37°C，優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為2-5天，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，收獲病毒。
[0038]其中，步驟(2)中制備SIV抗原包括制備制備SIV全病毒抗原和亞單位抗原，其方法不限于使用雞胚、MDCK細(xì)胞系、Vero細(xì)胞系、BHK細(xì)胞系、CEF細(xì)胞系及使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)等。
[0039]步驟(2)中SIV抗原制備方法包括:將SIV HlNl亞型毒種和H3N2亞型毒種分別接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的MDCK細(xì)胞中，優(yōu)選毒種的接種量M.0.1.為0.001~0.1，優(yōu)選培養(yǎng)溫度為33^370C，優(yōu)選培養(yǎng)基含有2%~?Ο%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)基，優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為24、6h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，收獲病毒。
[0040]步驟(3)中所述的凍干保護(hù)劑，優(yōu)選耐熱凍干保護(hù)劑，主要包括但不限于含有明膠、牛血清白蛋白、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉和維生素C。免疫佐劑優(yōu)選為角鯊烯、卡波姆、MontanideTM Gel等，更優(yōu)選為水性疫苗佐劑，即卡波姆、皂苷、左旋咪唑、膽固醇按一定比例配制的水懸液。
[0041]以上可見(jiàn)，本發(fā)明至少有以下優(yōu)點(diǎn):
[0042]1)本發(fā)明的預(yù)防和治療PRV和SIV感染的疫苗組合物，包含至少一種PRV抗原和至少一種SIV抗原。該疫苗組合物不僅不會(huì)產(chǎn)生兩種抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且PRV和SIV抗原混合后，PRV和SIV的抗原組合物有相互增強(qiáng)免疫效果的作用，而這出乎獸藥領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)料。
[0043]2)預(yù)防和治療PRV和SIV感染的疫苗組合物與PRV或SIV單疫苗的效力相比，在對(duì)豬注射免疫過(guò)程中，豬體的應(yīng)激反應(yīng)小，因此，本發(fā)明的疫苗組合物安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應(yīng)。
[0044]3)上述預(yù)防和治療PRV和SIV感染的疫苗組合物中豬流感抗原不僅可以是滅活的全病毒，還可以是滅活的亞單位蛋白(HA蛋白是病毒的主要抗原)，疫苗組合物的組成可為PRV活病毒抗原與滅活的豬流感抗原(全病毒或亞單位)組成。
[0045]4)通過(guò)使用耐熱凍干保護(hù)劑，疫苗組合物能在2l°C有效保存，較常規(guī)凍干保護(hù)劑，降低了成本，方便了運(yùn)輸?？朔四壳笆褂玫膬龈梢呙缤ǔ?15°C保存，需要冷鏈保藏和運(yùn)輸，成本昂貴且容易導(dǎo)致疫苗效果下降；此外，因此，開(kāi)發(fā)耐熱的豬偽狂犬、豬流感疫苗組合物，既能有效預(yù)防豬群中豬偽狂犬和豬流感的流行，又可簡(jiǎn)化免疫程序，達(dá)到一針?lè)纼刹〉淖饔谩?br> [0046]5)用抗豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物免疫仔豬后，可有效預(yù)防PRDC的流行。
[0047]菌種保藏
[0048]豬流感病毒(H1N1亞型)ZJS 株(Swine influenza virus (HlNlsubtype) strainZJS),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng):CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年8月 13 日，保藏編號(hào):CCTCC N0.V201233。
[0049]豬流感病毒(H3N2亞型)WX 株(Swine influenza virus (H3N2subtype) strainWX),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng):CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2012年8月 13 日，保藏編號(hào)=CCTCC N0.V201234。
【具體實(shí)施方式】
[0050]本發(fā)明中，PBS (0.01mM, pH7.4，按《分子克隆》第三版所述配制)。
[0051]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 [0052]實(shí)施例
[0053]實(shí)施例1:抗豬偽狂犬病、豬流感疫苗組合物的制備
[0054]1.豬偽狂犬病毒抗原的制備
[0055]用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法。將豬偽狂犬病毒基因缺失株(SA215株，為T(mén)K_/gE7gr三基因缺失，公開(kāi)于中國(guó)專(zhuān)利CN101186902，該毒株以保藏編號(hào)V200002保藏于CCTCC)用病毒稀釋液(無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基)作適當(dāng)稀釋?zhuān)碝.0.1=0.1接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的ST細(xì)胞(購(gòu)自CCTCC，編號(hào)⑶C0060)，輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶2周，37°C吸附30min，加入含3% (v/v)犢牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)(10~12轉(zhuǎn)/小時(shí))培養(yǎng)。每日觀察I~2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，37°C培養(yǎng)2~5日收獲細(xì)胞和細(xì)胞液，凍融3次，將病毒液用中空纖維濾柱(孔徑1.2 μ m與0.45 μ m)過(guò)濾，除去細(xì)胞碎片，置_20°C以下保存。
[0056]2.豬流感病毒(ZJS株和WX株)抗原的制備
[0057]用轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)法。將SIV HlNl亞型ZJS株和H3N2亞型WX株毒種分別按M.0.1=0.1的接種量分別接種于長(zhǎng)滿(mǎn)單層的MDCK細(xì)胞(購(gòu)自ATCC，編號(hào)CRL-34)，37°C吸附30min，加入含3% (v/v)犢牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)(10~12轉(zhuǎn)/小時(shí))培養(yǎng)。每日觀察I~2次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，37°C培養(yǎng)2~5日收獲細(xì)胞和細(xì)胞液，凍融3次，將兩種病毒液(ZJS株和WX株)分別用中空纖維(孔徑1.2 μ m與0.45 μ m)濾柱過(guò)濾，除去細(xì)胞碎片，再加入0.2%~0.3%的甲醛溶液37°C滅活18h，置-20°C以下保存。
[0058]3.豬流感病毒(ZJS株和WX株)亞單位抗原的制備
[0059]分別將SIV (ZJS株和WX株)的HA基因(即序列表中的SEQN0.1和SEQ N0.2所示的基因序列)分別克隆入桿狀病毒基因組中，并使其處在多角體基因的控制下，通過(guò)將桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)SIV(ZJS株和WX株)的HA基因。將構(gòu)建的重組病毒以M.0.1=0.01感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，在感染后5天收獲細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，12000rpm離心，取上清，置-20°C以下保存。
[0060]4.抗原含量測(cè)定及結(jié)果
[0061]豬偽狂犬病毒抗原含量測(cè)定:將病毒液做10倍系列稀釋?zhuān)ˇ│?ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—8、10_95個(gè)稀釋度，分別接種ST細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，同時(shí)設(shè)立陰性不接毒對(duì)照，放入5%C02溫箱中37°C培養(yǎng)48~72h，觀察細(xì)胞病變(CPE)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID5tl,結(jié)果為病毒含量108_ 5TCID5(l/ml。
[0062]豬流感病毒(ZJS株和WX株)抗原含量測(cè)定:將滅活前的豬流感病毒ZJS株和WX株分別做10倍系列稀釋?zhuān)?0_5、10_6、10' 10_8、10_95個(gè)稀釋度，分別接種MDCK細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，同時(shí)設(shè)立陰性不接毒對(duì)照，放入5%C02溫箱中37°C培養(yǎng)48~72h，觀察細(xì)胞病變(CPE)J^g Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID5tl，結(jié)果為豬流感ZJS株的病毒含量108_ 2TCID5cZml，豬流感WX株的病毒含量108_ 3TCID50/ml。
[0063]豬流感病毒(ZJS株和WX株)亞單位抗原含量測(cè)定:將豬流感病毒(ZJS株和WX株)亞單位抗原2倍稀釋后進(jìn)行血凝(HA)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為豬流感ZJS株的抗原含量17Log2，豬流感WX株的抗原含量18Log2。
[0064]5.疫苗組合物的制備
[0065]將豬偽狂犬活病毒和凍干保護(hù)劑(含V/V的1.5%明膠、2.5%牛血清白蛋白、10.0%海藻糖、6.0%聚乙烯吡咯烷酮、3.0%山梨醇、3.0%谷氨酸鈉和0.05%維生素C水溶液)按
I: I (V/V)比例混合后，充分搖均，定量分裝，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得豬偽狂犬活病毒；將豬流感(H1N1亞型和H3N2亞型)滅活病毒液/亞單位抗原按9:1 (V/V)加入水性疫苗佐劑(含W/V的1%卡波姆水溶液)，定量分裝，制備成豬流感滅活疫苗。共制備疫苗5種，其具體的抗原組成及含量見(jiàn)表1。
[0066]表1不同疫苗的抗原組成及含量配比
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種抗PRV和SIV感染的疫苗組合物，其包含至少一種PRV抗原和至少一種SIV抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于:所述PRV抗原包括豬偽狂犬活病毒、改良/嵌合的豬偽狂犬活病毒、至少含有豬偽狂犬病毒的免疫原性氨基酸序列的重組病毒、豬偽狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒中的一種或任意幾種的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于:所述PRV抗原為全病毒活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于:所述PRV抗原包括豬偽狂犬病病毒基因缺失SA215株、Ea株、WKQ-OOl株、豬偽狂犬病弱毒株Bartha株、Bartha~K61株、Bucharest株、BUK株、H株和C株中的一種或任意幾種的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于:所述SIV抗原包括完整的豬流感全病毒、含有至少SIV的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、任何其它SIV片段中的一種或任意幾種的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述完整的豬流感全病毒包括滅活形式的豬流感全病毒、改良的SIV活病毒或減毒的SIV病毒； 所述其它Siv片段包括含SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位或其變異體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述完整的豬流感全病毒包括HlNl亞型全病毒抗原或H3N2亞型全病毒抗原的至少一種； 所述其它SIV片段為含SIV HA基因的亞單位。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述HlNl亞型全病毒抗原為豬流感病毒(H1N1亞型)ZJS株(Swine influenzavirus (HlNlsubtype) strain ZJS)，其保藏編號(hào)為:CCTCC N0.V201233，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保臧中心； 所述H3N2亞型全病毒抗原為豬流感病毒(H3N2亞型)WX株(Swine influenzavirus (H3N2subtype) strain WX)，其保藏編號(hào)為:CCTCC N0.V201234，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。 所述其它SIV片段為含由SIV HA基因構(gòu)建的SIV HA蛋白的亞單位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述SIV HA蛋白包括HlNl亞型的HA蛋白或H3N2亞型的HA蛋白； 所述HlNl亞型HA蛋白的血凝價(jià)≥llLog2 ； 所述H3N2亞型HA蛋白的血凝價(jià)≥llLog2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、中任意一項(xiàng)所述的疫苗組合物在預(yù)防和/或控制免疫仔豬PRDC疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/245GK103893750SQ201210590377
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司