專利名稱：：鉤吻素子在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鉤吻生物堿單體的應(yīng)用，尤其是涉及鉤吻素子(Koumine)在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景嚴重的急慢性疼痛困擾著數(shù)以千萬計的患者，其中以慢性疼痛最為多見最為嚴重。慢性疼痛主要有兩種類型炎性疼痛和神經(jīng)病理性(神經(jīng)性)疼痛。我國有慢性疼痛病史者占20%30%，美國占35%，加拿大占29%，患者的平均病程約為10.7年。慢性疼痛不但多發(fā)、遷延，而且嚴重影響患者的工作與生活。藥物鎮(zhèn)痛是目前臨床上治療病人疼痛的主要手段之一，其中嗎啡等阿片類鎮(zhèn)痛藥和阿司匹林等解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥最為常用。目前，全球解熱鎮(zhèn)痛藥年產(chǎn)量已達20余萬噸，其中撲熱息痛、阿司匹林、布洛芬、萘普生、雙氯芬酸為5大支柱產(chǎn)品，年銷售額可達50多億美元。鎮(zhèn)痛藥嗎啡近20年來產(chǎn)量增加10倍，現(xiàn)全球年產(chǎn)量超過20000公斤。因此，治療疼痛的藥物是當今全球各大制藥公司競爭的熱點。但是，阿片類鎮(zhèn)痛藥易產(chǎn)生耐受性、成癮性，以及呼吸抑制、減少胃腸蠕動等副作用；解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥鎮(zhèn)痛效力弱，胃腸道反應(yīng)、胃潰瘍、胃出血等不良反應(yīng)嚴重，其臨床應(yīng)用受限。因此，尋找能有效控制疼痛和減少毒副作用的新型鎮(zhèn)痛藥物是當前新藥研發(fā)熱點之一。目前，國外許多科學家正致力于從動植物取材，開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥。鉤吻(Ge/^w/wme/eg(msBenth.)為馬錢科植物胡蔓藤的全草，分為中國鉤吻和北美鉤吻兩種。1887年HGerrad等將其制成格林制劑，為一些國家副藥典所收載；美國藥物索引及日本《世界的民間藥》中均有鉤吻的記載。我國對鉤吻的研究歷史更為悠久，《神農(nóng)本草》、《本草綱目》己有記載，中國鉤吻，盛產(chǎn)于福建、浙江、廣東等地，具有多種生理藥理活性，如抑制呼吸中樞、抗腫瘤、抗炎、松弛平滑肌、散瞳、抑制血小板聚集等作用。民間外用鉤吻治療各類疼痛，尤其是慢性神經(jīng)性疼痛與癌性疼痛。研究發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)鉤吻的主要有效成分為吲哚類生物堿，目前己知有40余種單體。20世3紀60年代，海軍422醫(yī)院和416醫(yī)院用鉤吻總生物堿配制成"止痛靈"注射液院內(nèi)用藥，發(fā)現(xiàn)對多種疼痛均有良好療效。臨床和基礎(chǔ)研究表明，鉤吻總生物堿具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，效能僅次于嗎啡，而高于其他生物堿，且其無成癮性、耐受性，無明顯副作用(譚建權(quán)，邱成之，鄭林忠.鉤吻堿的鎮(zhèn)痛作用和無依賴性.中藥藥理與臨床，1988，4(1):24-28);值得關(guān)注的是，其作用機制可能不同于阿片類或阿司匹林類鎮(zhèn)痛藥，提示鉤吻生物堿具有開發(fā)為新型鎮(zhèn)痛藥的潛在價值。在鉤吻鎮(zhèn)痛效應(yīng)方面的研究，現(xiàn)有學術(shù)文獻以及1篇相關(guān)的專利申請文獻(一種抗癌鎮(zhèn)痛的重要鉤吻總生物堿和含它的藥物組合物及其制備方法，公開號CN1528767A，公開日2007.9.15)，僅涉及鉤吻總生物堿，未涉及鉤吻生物堿單體研究。鉤吻總生物堿盡管無累積性毒性，但是其治療量卻與中毒量較接近，治療指數(shù)約為3'5，安全治療窗較窄，限制了鉤吻總生物堿作為鎮(zhèn)痛藥物的應(yīng)用，臨床應(yīng)用受到限制。目前已知鉤吻生物堿包括多種單體，如鉤吻素子、甲、己等以及胡蔓藤堿甲、乙、丙、等，共40余種。各種單體的毒性大小不一，如小鼠腹腔注射鉤吻素子、甲、己的LD5Q分別為100mg/kg、56.2mg/kg和0.185mg/kg。因而近年在鉤吻顯著的臨床療效誘惑下，對其研發(fā)又日趨活躍，但研發(fā)方向從鉤吻總生物堿轉(zhuǎn)向鉤吻生物堿單體。鉤吻素子(Koumine)，是鉤吻生物堿中的一種單體，為中國鉤吻生物堿中含量最高的單體，分子式為C2。H22N20，結(jié)構(gòu)式為1鉤吻素子的來源目前主要為從鉤吻植物中提取分離，如使用柱層析法，或使用本發(fā)明人發(fā)明的"高速逆流色譜法從鉤吻中分離制備鉤吻生物堿單體的方法"(已另案申請專利)，該發(fā)明提供了高效、速效分離純化鉤吻素子單體的途徑，為鉤吻素子的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。近年對鉤吻素子研究較為深入，發(fā)現(xiàn)其具有多種生理藥理活性，如抗腫瘤作用(吳達榮，秦瑞，蔡晶，遲德彪.鉤吻素子抗腫瘤作用研究，中藥藥理與臨床，2006，22(5):6-8)、調(diào)節(jié)免疫功能作用(孫莉莎，雷林生，方放治，楊淑琴，王劍.鉤吻素子對小鼠脾細胞增殖反應(yīng)及體液免疫反應(yīng)的抑制作用，中藥藥理與臨床，1999，15(6):10-12)、治療銀屑病(張?zhí)m蘭，黃昌全，張忠義，等.鉤吻素子治療銀屑病樣動物模型的療效觀察.第一軍醫(yī)大學學報，2005，25(5):547-549)以及抗血小板聚集作用(方放治，單春文，陳平雁.鉤吻素子對兔血小板聚集的影響，中藥藥理與臨床，1998，14(1):21-24)等。但現(xiàn)有的鉤吻素子潔性研究，未涉及其在鎮(zhèn)痛方面效應(yīng)的研究，更未涉及其對慢性疼痛鎮(zhèn)痛作用的研究。有關(guān)鉤吻素子抗慢性疼痛作用及其可能的用途未見文獻以及專利報道。本發(fā)明公開了鉤吻素子抗慢性疼痛作用及其在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種鉤吻生物堿單體鉤吻素子對慢性疼痛具有強效低毒鎮(zhèn)痛作用的新用途，涉及鉤吻素子及其藥學上可接受的鹽在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是鉤吻素子在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。所述的鉤吻素子，是鉤吻生物堿單體之一，分子式為C2QH22N20，結(jié)構(gòu)式為1鉤吻素子及其藥學可接受的鹽具有制備治療慢性疼痛藥物的應(yīng)用。所述的慢性疼痛包括炎性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、癌性疼痛。動物慢性疼痛鎮(zhèn)痛實驗證明鉤吻素子具有劑量依賴性的強效鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛效價優(yōu)于經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥阿司匹林和吲哚美辛，治療指數(shù)遠遠高于鉤吻總生物堿，可能無耐受性、成癮性且副作用小，表明鉤吻素子鎮(zhèn)痛作用具有強效低毒的特點，其作用機制可能不同于臨床常用的阿片類或阿司匹林類鎮(zhèn)痛藥。本發(fā)明的有益效果是-1.克服鉤吻總生物堿在鎮(zhèn)痛方面的安全性缺陷，大幅度提高治療指數(shù)鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的治療指數(shù)估達54，詳見實施例1，顯著拓展安全治療窗，可能無耐受性、成癮性且副作用小，其作用機制可能不同于臨床常用的阿片類或阿司匹林類鎮(zhèn)痛藥。較之鉤吻總生物堿，更適于制備治療慢性疼痛的藥物。2.潛在的重大經(jīng)濟效應(yīng)。目前全球鎮(zhèn)痛藥市場巨大嗎啡近20年來產(chǎn)量增加10倍，現(xiàn)全球年產(chǎn)量超過20000公斤；解熱鎮(zhèn)痛藥全球年產(chǎn)量已達20余萬噸，其中撲熱息痛、阿司匹林、布洛芬、萘普生、雙氯芬酸為5大支柱產(chǎn)品，年銷售額可達50多億美元。如前所述，這兩類常用藥各自有其缺陷，不是理想鎮(zhèn)痛藥物。鉤吻素子，一種鉤吻生物堿單體，較之鉤吻總生物堿具有強效低毒的鎮(zhèn)痛作用，鉤吻素子及其藥學可接受的鹽具有制備治療慢性疼痛藥物的應(yīng)用，無上述兩類臨床常用鎮(zhèn)痛藥的缺點，按照國家創(chuàng)新藥物審批辦法開發(fā)研制，有望成為鎮(zhèn)痛療效強包括對炎性疼痛、神經(jīng)病理性和癌性疼痛等慢性疼痛有效、無耐受性與成癮性且副作用小、具有我國獨立自主知識產(chǎn)權(quán)的國家1類新型鎮(zhèn)痛藥，產(chǎn)業(yè)化前景明確。3.本發(fā)明的鉤吻素子可來源于天然植物鉤吻的提純，鉤吻植物在我國盛產(chǎn)，因而可以推動相關(guān)藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。圖1為頸背部皮下注射給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的抑制作用。圖中橫坐標表示時間min，縱坐標表示每5分鐘小鼠累積舔足次數(shù)；1為生理鹽水組，2為嗎啡10mg/kg組、3為賴氨匹林100mg/kg組、4為鉤吻素子10mg/kg組，5為鉤吻素子5mg/kg組，6為鉤吻素子2.5mg/kg組，7為鉤吻素子1.875mg/kg組，8為鉤吻素子1.25mg/kg組。圖2為福爾馬林注射側(cè)足底皮下給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的抑制作用。圖中橫坐標表示時間min，縱坐標表示每5分鐘小鼠累積舔足次數(shù)；l為生理鹽水組，2為嗎啡3.76mg/kg組，3為吲哚美辛7.16mg/kg組，4為鉤吻素子6.12mg/kg組，5為鉤吻素子3.06mg/kg組，6為鉤吻素子1.53mg/kg組。圖3為福爾馬林注射對側(cè)足底皮下給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的抑制作用。圖中橫坐標表示時間min，縱坐標表示每5分鐘小鼠累積舔足次數(shù)；1為生理鹽水組，2為鉤吻素子6.12mg/kg組。具體實施方式本發(fā)明在動物慢性疼痛模型上，通過不同給藥方式(頸背部皮下注射給予、福爾馬林注射側(cè)足底皮下給予、福爾馬林注射對側(cè)足底皮下給予)說明鉤吻素子在制備治療慢性疼痛藥物中的用途。實施例1頸背部皮下注射給予鉤吻素子對福爾馬林致小鼠慢性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。1.1藥品和試劑鉤吻素子由本發(fā)明申請人從天然植物鉤吻提取分離純化獲得，純度〉98.5%(精密稱取鉤吻素子，以lmo1/1HC1溶解，加生理鹽水稀釋，以lmo1/1NaOH調(diào)pH(4<pH<7)，用生理鹽水稀釋至各劑量組所需溶液。)。鹽酸嗎啡注射液(10mg/ml)，沈陽第一制藥廠產(chǎn)品，批號102090936065021。注射用賴氨匹林凍干粉針(9g/支，有效成分為阿司匹林)，上海新亞藥業(yè)有限公司，批號H31020058。甲醛溶液，天津市北辰方正試劑廠，批號20070828。1.2動物昆明種小鼠，雄性，18-22g，福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。于25。C室溫光暗周期12/12h下詞養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)實驗室3天后用于正式實驗。1.3方法小鼠80只，按體重隨機分為生理鹽水組、嗎啡陽性對照組、賴氨匹林陽性對照組、鉤吻素子不同劑量處理組(1.25，1.875，2.5，5，10mg/kg)，實驗共分8組，每組10只。各組小鼠按下述實施相應(yīng)干預(yù)1)嗎啡陽性對照組小鼠皮下注射嗎啡10mg/kg;2)賴氨匹林陽性對照組小鼠皮下注射100mg/kg(以阿司匹林成分計)3)鉤吻素子不同劑量處理組小鼠分別皮下注射鉤吻素子1.25,1.875,2.5，5，10mg/kgs4)生理鹽水組小鼠皮下注射等體積生理鹽水。30min后，小鼠左足足底皮下注射5%福爾馬林溶液20(11，觀察記錄福爾馬林注射后60min內(nèi)小鼠的活動情況。以5min為一單元，統(tǒng)計小鼠各單元累積舔足(福爾馬林注射足)時間，前兩個單元(l-10min)舔足時間合計稱為1相舔足時間，反映中樞急性疼痛情況；其余單元(10-60min)舔足時間合計稱為2相舔足時間，反映炎癥引起的慢性疼痛情況。以2相舔足時間為指標，評價鉤吻素子對福爾馬林致慢性疼痛的影響。按以下公式計算鉤吻素子疼痛抑制率。疼痛抑制率=(生理鹽水組第二相舔足時間-給藥組第二相舔足時間)+生理鹽水組第二相舔足時間X100M。以機率單位法計算藥物的ED5。將抑制率超過50%的動物記為有效鎮(zhèn)痛動物，以有效鎮(zhèn)痛動物數(shù)、每組動物例數(shù)和給藥劑量，Bliss法計算ED5。。1.4結(jié)果各組小鼠于福爾馬林注射后60min內(nèi)的舔足反應(yīng)如附圖1所示，對2相舔足時間及疼痛抑制率的影響見表1。表1頸背部皮下注射給予鉤吻素子對福爾馬林致慢性疼痛的鎮(zhèn)痛作用(x±SD，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果顯示各劑量組鉤吻素子能劑量依賴性降低福爾馬林致小鼠2相舔足反應(yīng)，具有統(tǒng)計意義；鎮(zhèn)痛效價遠優(yōu)于賴安匹林(有效成分為經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥阿司匹林)。表明鉤吻素子對炎癥引起的慢性疼痛具有顯著鎮(zhèn)痛作用。將2相疼痛抑制率超過50%的動物記為有效鎮(zhèn)痛動物，經(jīng)機率單位法計算得鉤吻素子鎮(zhèn)痛的半數(shù)有效劑量(ED5C)為1.85mg/kg，95%可信區(qū)間為1.352.54mg/kg。經(jīng)査文獻，鉤吻素子小鼠腹腔注射的半數(shù)致死劑量(LD5Q)為100mg/kg，按照治療指數(shù)(TI)計算公式TI=LD5Q/ED5C，初步推算鉤吻素子的TI為54丄可見單體鉤吻素子的安全性遠遠高于鉤吻總生物堿，具有開發(fā)成緩解慢性疼痛藥物的潛在應(yīng)用價值。實施例2福爾馬林注射側(cè)足底皮下給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。2.1藥品和試劑鉤吻素子由本發(fā)明申請人從天然植物鉤吻提取分離純化獲得，純度>98.5%(精密稱取鉤吻素子，以lmol/1HC1溶解，加生理鹽水稀釋，以lmo1/1NaOH調(diào)pH(4<pH<7)，用生理鹽水稀釋至各劑量組所需溶液。)。鹽酸嗎啡注射液(10mg/ml)，沈陽第一制藥廠產(chǎn)品，批號102090936065021。吲哚美辛凍干粉針，SIGMA公司，批號115K06S9。甲醛溶液，天津市北辰方正試劑廠，批號20070828。2.2動物昆明種小鼠，雄性，18-22g，福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。于25"C室溫光暗周期12/12h下詞養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)實驗室3天后用于正式實驗。2.3方法小鼠60只，按體重隨機分為生理鹽水組、嗎啡陽性對照組、吲哚美辛陽性對照組、鉤吻素子不同劑量處理組(1.53，3.06，6.12mg/kg)，實驗共分6組，每組10只。各組小鼠按下述實施相應(yīng)干預(yù)(足底皮下注射體積為lOpl):1)嗎啡陽性對照組小鼠右側(cè)足底皮下注射嗎啡3.76mg/kg;2)吲哚美辛陽性對照組小鼠右側(cè)足底皮下注射7.16mg/kg(以吲哚美辛成分計)；3)鉤吻素子不同劑量處理組小鼠分別右側(cè)足底皮下注射鉤吻素子1.53，3.06，6.12mg/kg;4)生理鹽水組小鼠右側(cè)足底皮下注射等體積生理鹽水。30min后，小鼠右側(cè)足底皮下注射5%福爾馬林溶液10pl，觀察記錄福爾馬林注射后60min內(nèi)各組小鼠的活動情況，統(tǒng)計2相舔足時間，并計算疼痛抑制率。疼痛抑制率=(生理鹽水組第二相舔足時間-給藥組第二相舔足時間)+生理鹽水組第二相舔足時間X100。/()。3.4結(jié)果各組小鼠于福爾馬林注射后60min內(nèi)的舔足反應(yīng)如附圖2所示，對2相舔足時間及疼痛抑制率的影響見表2。表2福爾馬林注射側(cè)足底皮下給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的鎮(zhèn)痛作用(xiSD，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>><0.05，"PO.Ol，與生理鹽水組比較結(jié)果顯示福爾馬林注射側(cè)足底皮下給予各劑量組鉤吻素子均能減弱福爾馬林致小鼠2相舔足反應(yīng)，具有統(tǒng)計意義。表明鉤吻素子對炎癥引起的慢性疼痛具有顯著鎮(zhèn)痛作用。實施例3福爾馬林注射對側(cè)足底皮下給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。3.1藥品和試劑鉤吻素子由本發(fā)明申請人從天然植物鉤吻提取分離純化獲得，純度>98.5%(精密稱取鉤吻素子，以lmol/1HC1溶解，加生理鹽水稀釋，以lmol/1NaOH調(diào)pH(4<pH<7)，用生理鹽水稀釋至各劑量組所需溶液。)甲醛溶液，天津市北辰方正試劑廠，批號20070828。3.2動物昆明種小鼠，雄性，18-22g，福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供。于25'C室溫光暗周期12/12h下飼養(yǎng)，自由飲食，適應(yīng)實驗室3天后用于正式實驗。3.3方法小鼠20只，按體重隨機分為生理鹽水組、鉤吻素子對側(cè)給藥組(6.12mg/kg)，實驗共分2組，每組10只。各組小鼠按下述實施相應(yīng)干預(yù)(足底皮下注射體積為，)1)鉤吻素子處理組小鼠右側(cè)足底皮下注射鉤吻素子6.12mg/kg;2)生理鹽水組小鼠右側(cè)足底皮下注射等體積生理鹽水。30min后，小鼠左足足底皮下注射5%福爾馬林溶液10|il，觀察記錄福爾馬林注射后60min內(nèi)小鼠的活動情況，統(tǒng)計2相舔足時間并計算鉤吻素子疼痛抑制率。疼痛抑制率=(生理鹽水組第二相舔足時間-給藥組第二相舔足時間)+生理鹽水組第二相舔足時間X100M。3.4結(jié)果各組小鼠于福爾馬林注射后60min內(nèi)的舔足反應(yīng)如附圖3所示，對2相舔足時間及疼痛抑制率的影響見表3。表3福爾馬林注射對側(cè)足底皮下給予鉤吻素子對小鼠慢性疼痛的鎮(zhèn)痛作用(x±SD，n=10)組別2相舔足時間(s)2相疼痛抑制率(％)生理鹽水組333±60/鉤吻素子6.12mg/kg組117±75*46.87><0.05，*》<0.01，與生理鹽水組比較結(jié)果顯示福爾馬林注射對側(cè)足底皮下給予各劑量組鉤吻素子能減弱福爾馬林致小鼠2相舔足反應(yīng)，具有統(tǒng)計意義。表明鉤吻素子對炎癥引起的慢性疼痛具有顯著鎮(zhèn)痛作用。權(quán)利要求1.一種結(jié)構(gòu)式如下的鉤吻生物堿單體鉤吻素子在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用。2.鉤吻素子在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，其特征是鉤吻素子及其藥學可接受的鹽具有制備治療慢性疼痛藥物的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求l、2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的慢性疼痛可為炎性疼痛。4.根據(jù)權(quán)利要求l、2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的慢性疼痛可為神經(jīng)病理性疼痛。5.根據(jù)權(quán)利要求l、2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的慢性疼痛可為癌性疼全文摘要本發(fā)明公開了鉤吻素子在制備治療慢性疼痛藥物中的應(yīng)用，屬鉤吻生物堿單體的應(yīng)用。動物慢性疼痛鎮(zhèn)痛實驗證明，鉤吻素子具有劑量依賴性的強效鎮(zhèn)痛作用，鎮(zhèn)痛效價優(yōu)于經(jīng)典的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥阿司匹林和吲哚美辛，治療指數(shù)遠高于鉤吻總生物堿，可能無耐受性、成癮性且副作用小，表明鉤吻素子鎮(zhèn)痛作用強效低毒，其作用機制可能不同于臨床常用的阿片類或阿司匹林類鎮(zhèn)痛藥。鉤吻素子及其藥學可接受的鹽具有制備治療慢性疼痛藥物的應(yīng)用，無臨床常用鎮(zhèn)痛藥的嚴重缺點，可開發(fā)為包括對炎性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛和癌性疼痛等慢性疼痛鎮(zhèn)痛作用強、無耐受性與成癮性且副作用小的新型鎮(zhèn)痛藥，產(chǎn)業(yè)化前景明確。文檔編號A61K31/439GK101322705SQ20081007146公開日2008年12月17日申請日期2008年7月28日優(yōu)先權(quán)日2008年7月28日發(fā)明者俞昌喜,浩劉,盈許申請人:福建醫(yī)科大學