專利名稱：：核黃素酯類衍生物用于制備治療糖尿病及其并發(fā)癥藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核黃素酯類衍生物用于制備治療糖尿病及其并發(fā)癥藥物的用途。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種全球性的臨床常見的代謝性疾病。近年來隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的患病率正在世界范圍內(nèi)迅速上升。據(jù)統(tǒng)計，全球糖尿病患者總數(shù)達(dá)到1.9億，每年新出現(xiàn)的糖尿病患者達(dá)到700萬人到800萬人。糖尿病在亞洲已經(jīng)成為一種流行病。我國糖尿病患者估計約有三千多萬。非胰島素依賴型即11型糖尿病約占90%。國外資料預(yù)計到2025年，全球?qū)⒂谐^2.5億名糖尿病患者，到2030年糖尿病患者達(dá)3.66億?？梢娞悄虿∫殉蔀槔^心腦血管、惡性腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的嚴(yán)重疾病。糖尿病的病程長，如血糖控制不好，常很快有并發(fā)癥發(fā)生，如眼網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病足等。糖尿病并發(fā)癥會嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量，嚴(yán)重的導(dǎo)致死亡。因此，糖尿病及其并發(fā)癥的防治已成為全世界新藥研究開發(fā)者的重大課題。國內(nèi)外制藥企業(yè)均投入巨資研究和開發(fā)新的抗糖尿病藥物，相繼開發(fā)出了品種多樣的糖尿病及其并發(fā)癥的防治藥物。目前抗糖尿病藥物有促胰島素分泌劑、雙胍類藥物、a-糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制劑、胰島素類。促胰島素分泌劑分磺脲類(如第一代磺脲類藥物甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、醋磺己脲、妥拉磺脲等；第二代藥物有格列本脲、格列吡嗪、格列齊特、格列波脲、格列喹酮和格列美脲等)和非磺脲類促胰島素分泌劑(如瑞格列奈和那格列奈等)。雙胍類藥物主要作用機制包括提高外周組織(如肌肉、脂肪)對葡萄糖的攝取和利用、抑制糖異生和糖原分解、降低過高的肝葡萄糖輸出、降低脂肪酸氧化率、提高葡萄糖的運轉(zhuǎn)能力、改善胰島素敏感性、減輕胰島素抵抗等，對血糖正常者無降血糖作用，主要有二甲雙胍和苯乙雙胍。a-糖苷酶抑制劑可延遲碳水化合物吸收，降低餐后高血糖，尤其適用于空腹血糖正常(或不太高)而餐后血糖明顯升高者，制劑包括阿卡波糖和伏格列波糖。胰島素增敏劑主要通過結(jié)合和活化過氧化物酶增殖物激活受體y(PPARy)起作用，PPARy受體被激活后通過誘導(dǎo)脂肪生成酶和與糖代謝調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞的分化，并提高細(xì)胞對胰島素作用的敏感性，減輕胰島素抵抗，主要品種為羅格列酮。DPP-IV抑制劑主要通過與DPP-IV活性部位的205位和206位谷氨酸形成鹽橋而抑制DPP-IV的活性、使血清GLP-1水平升高、導(dǎo)致葡萄糖刺激的胰島素分泌增加。胰島素是糖尿病患者胰島功能喪失的最終選擇，按起效作用快慢和維持間長短分為短(速)效、中效和長效三類。還有胰島素類似物，包括賴脯胰島素、門冬胰島素、甘精胰島素等。除上述臨床常用治療糖尿病藥物外，國內(nèi)外正在開發(fā)的藥物還有糖異生抑制劑、胰島素樣生長因子-1、胰高血糖素-受體拮抗劑、促胰島分泌活化蛋白質(zhì)、AMP蛋白激酶(AMPK)激動劑等。比較理想的抗糖尿病藥物的標(biāo)準(zhǔn)有(1)顯著的降低血糖作用、但不易引起低血糖反應(yīng)；(2)有胰島素增敏作用；(3)對胰島P細(xì)胞有保護(hù)作用、或促進(jìn)胰島P細(xì)胞功能恢復(fù)；(4)口服給藥，使用方便；(5)對糖尿病并發(fā)癥有預(yù)防或治療作用。已上市的抗糖尿病藥物，各有優(yōu)缺點，離比較理想的抗糖尿病藥物還存在一定距離。如長期使用促胰島素分泌劑，反而可導(dǎo)致胰島P細(xì)胞衰竭，患者最終需要注射胰島素。目前市場上銷售的胰島素增敏劑如馬來酸羅格列酮，臨床長期使用能引發(fā)骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨折或誘發(fā)心肌梗塞。胰島素是晚期糖尿病的必然選擇，但需要注射給藥，且對給藥劑量要求嚴(yán)格，否則極易引起低血糖反應(yīng)?？傊?，目前多數(shù)臨床上使用的抗糖尿病藥物實際上是降糖藥物，而非真正意義上的抗糖尿病藥物，對改善患者的胰島P細(xì)胞功能無益，甚或加重?fù)p害。因此，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新類型的、具有顯著優(yōu)點的抗糖尿病藥物意義重大。核黃素，即維生素B2，它是一種水溶性B族維生具有一個核糖醇側(cè)鏈的異咯嗪的衍生物。核黃素的生物活性形式是黃素單核苷酸(F麗)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)兩種黃素輔酶。這兩種輔酶與多種蛋白結(jié)合形成黃素蛋白。核黃素的主要生理功能是參與生物氧化及能量的代謝，維持皮膚黏膜完整性，參與藥物代謝、抗氧化和視覺感光過程，影響腎上腺素產(chǎn)生和紅細(xì)胞形成等。核黃素還具有不少藥理作用，可用于腫瘤的輔助治療、心腦血管疾病等。但單獨服用只有15%的吸收率，核黃素在生物體儲存量不多，多余的在尿液中排出。因此，臨床上主要用于維生素B2缺乏癥。核黃素衍生物在臨床上也有很多用途，核黃素四丁酸酯用于防止血栓形成、動脈粥樣硬化，也可用于維生素B2缺乏、口腔潰瘍、陰囊炎、脂溢性皮炎。核黃素月桂酸酯用于病后恢復(fù)期及因缺乏核黃素而引起的各種疾病，還試用于放療化療引起的消化道粘膜炎。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供核黃素酯類衍生物的新用途，具體涉及核黃素酯類衍生物在制備治療糖尿病及其并發(fā)癥新型藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)過廣泛深入的研究，在篩選治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物中出人意料地發(fā)現(xiàn)核黃素酯類衍生物在體外具有明顯的促進(jìn)前脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗，利用PPARy激動劑篩選模型，發(fā)現(xiàn)這些酯類生物具有顯著的PPARy激動作用，從而提示可能有胰島素增敏作用。進(jìn)一步在糖尿病的動物模型上研究，發(fā)現(xiàn)其顯著降糖作用、胰島素增敏作用、對胰島p細(xì)胞保護(hù)作用和治療糖尿病并發(fā)癥(眼網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病足等)的作用。由此，核黃素酯類衍生物可用作制備防治I型、II型糖尿病及其并發(fā)癥的藥物。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。本發(fā)明第一方面目的是提供通式(I)的核黃素酯類衍生物用于防治糖尿病及其并發(fā)癥的應(yīng)用；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)其中&、R2、R3、R4分別為氫、C2-C12的直鏈脂肪酸、C2-C12的支鏈脂肪酸、C2-C12的芳香酸、金剛烷酸、煙酸、無機酸。其中RhR2、R3、R4不能同時為氫，所述的無機酸為磷酸或硫酸。本發(fā)明的另一個目的是提供核黃素酯類衍生物(I)在制備治療糖尿病并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。所述的糖尿病并發(fā)癥是指其慢性并發(fā)癥，包括糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病足。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種用于治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥藥物的組合物，其包括作為活性成份的核黃素酯類衍生物及藥用賦形劑或載體。其中所述的藥物組合物可被制成片劑、膠囊、注射液。根據(jù)本發(fā)明，核黃素酯類衍生物可以從核黃素酯化反應(yīng)得到，方法簡便，產(chǎn)率高，反應(yīng)產(chǎn)物通過結(jié)晶法可得到。為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將介紹核黃素酯類衍生物的合成過程和藥理試驗的結(jié)果來說明其在制備防治糖尿病及其并發(fā)癥的新型藥物中的應(yīng)用。具體實施例方式實施例l:核黃素月桂酸酯的制備稱取核黃素(購自湖北廣濟藥業(yè)有限公司，以下同)28.8g置于三口反應(yīng)瓶內(nèi),加入吡啶192ml，攪拌油浴加熱至100°C，滴加月桂酰氯18.6ml并在15-20分鐘內(nèi)滴加完畢，繼續(xù)加熱升溫至118'C回流1.5小時后，再慢慢滴加18.6ml月桂酰氯至反應(yīng)液透明，冷卻過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后，加入240ml甲醇回流，析出結(jié)晶，過濾，在75。C干燥，可得核黃素月桂酸酯18g，熔點為23-245。C，溶于180mlDMF(二甲基甲酰胺)中，采用15X150cmLH2。層柱，經(jīng)2-3次分離和重結(jié)晶，可分別獲得核黃素-5'-月桂酸單酯，核黃素-5'，4'_月桂酸雙酯及核黃素-5'，4'-3'-月桂酸三酯和核黃素-5'，4'，3'，2'-月桂酸四酯，如下圖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>核黃素一5'—單月桂酸酯核黃素一5',4'—雙月桂酸酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>核黃素一5'，4'，3'—三月桂酸酯核黃素一5'，4'，3'，2'—四月桂酸酯其中核黃素-5-月桂酸單酯，mp249-250。C，元素分析，計算值%):C62.34，H7.58，N10.03;實測值(％):C62.08，H7.74，N9.68。比旋度[a]=-8.4(C0.5，CH2C12:CH30H1:1);UV(max，C驅(qū))225.8nm，269.2nm，361.4nm,444.2nm:IR(cnf",3420(Br，20H)，3178(0H)，1728(Br，2C=0)，1661(00)。MS(m/Z)分子離子峰與目標(biāo)化合物分子量相同。'H-麗R(CJ)5N)，5(ppm)，8.19(s，1H，Ar)，7.89(s，1H，Ar)，5.55(m，1H，HOCH)，5.35(m，2H，0CH2)，5.10(m，1H，HOCH)，4.90(m，2H，NCH2)，4.60(Br，1H'HOCH)，2.31(t,2H，COCH2),1.4(s，3H，ArCH3),2.15(s，3H，ArCH3),1.59(m，2H，CH3CH2)，0.83(t，3H,CH線;3C-麗R(CsDsN)(ppm)，173.9(C=0),160.91(C)，159.9(C)，146.6(C),137.6(C)，136.2(C)，135.0(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH),71.5(CH)，71.3(CH),70.9(CH);67.6(CH2)，49.0(CH2)，48.99(CH2)，32.1(CH2)，29.8(CH2)，29.7(CH2);(ppm),173.9(C=0)，160.91(C)，159.9(C),146.6(C),137.6(C)，136.2(C)，135.0(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH)，70.9(CH);67.6(CH2)，49.0(CH2),48.99(CH2)，32.1(CH2),29.8(CH2)，29.7(CH2)，29.5(CH2),29.4(CH2)，25.3(CH2)，22.9(CH2)，20.8(CH2)，19.8(CH3)，14.4(CH3);(ppm)，173.9(C=0)，160.91(C)，159.9(C),146.6(C),137.6(C)，136.2(C);(ppm),173.9(C=0)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，137.6(C),136.2(C)，135.0(C)，133.0(C)，131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH),70.9(CH);67.6(CH2)，49.0(CH2)，48.99(CH2)，32.1(CH2)，29.8(CH2)，29.7(CH2);(ppm)，173.9(C=0)，160.91(C)，159.9(C)，146.6(C)，1376(C)，136.2(C)，135.0(C)，133.0(C),131.7(CH)，118.1(CH)，71.5(CH)，71.3(CH)，70.9(CH);67.6(CH2)，49.0(CH2)，48.99(CH2)，32.1(CH2)，29.8(CH2)，29.7(CH2)，29.5(CH2)，29.4(CH2)，25.3(CH2)，22.9(CH2)，20.8(CH2)，19.8(CH3)，14.4(CH3)。實施例2:核黃素異丁酸酯的合成將核黃素5g懸浮于50g異丁酸酐(購自ACROS公司)中，攪拌加熱至40°C時，慢慢滴加濃硫酸6ml，加畢后于50-60'C繼續(xù)攪拌反應(yīng)7小時，反應(yīng)液呈透明，冷卻過濾，濾液倒入冰水中攪拌析出沉淀，過濾，用水多次洗滌，然后用40ml甲醇加熱溶解并用少量活性碳過濾，冷卻結(jié)晶，再用甲醇精制一次，即可得到核黃素-四異丁酸酯。mpl25-128。C。元素分析，計算值(%),.53;實測值N8.32。實施例3:核黃素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯的制備稱取核黃素5g，2，6-二甲氧基苯甲酰氯llg(購自ACROS公司)，投入三角瓶中，加熱攪拌在80-90'C反應(yīng)1小時，冷卻下加入10ml甲醇，倒入2L水中析出黃色結(jié)晶，過濾，水洗，干燥，約定11.4g粗品。粗品溶于80ml吡啶中過濾,濾液倒入2L水中析出結(jié)晶，過濾干燥，再用甲醇重結(jié)晶即得核黃素-2,6-二甲氧基苯甲酸酯，mp162-166。C元素分析，計算值(％):C61,58,H5.07，N5.42;實測值C61.41，H5.24,N5.29。實施例4:核黃素金剛垸酸(Adamantanecarboxylicacid)酯的合成在備有金剛垸酸酰氯(購自ACR0S公司)20g的反應(yīng)瓶中，加入核黃素5g，吡啶40ml，攪拌下慢慢加熱至回流，核黃素逐漸全溶，再繼續(xù)回流2小時，冷卻過夜，過濾，以除去未反應(yīng)的部分核黃素，將濾液減壓蒸餾除去吡啶，殘渣用甲醇溶解，加活性碳回流脫色過濾，濾液倒入水中即析出結(jié)晶，冷卻過濾，得粗品，將粗品用少量甲醇溶解，冷凍結(jié)晶析出，過濾，干燥，所得化合物的mp118-120。C元，元素分析，計算值(。/。)C71.46，H7.47，N5.46;實測值(％):C70.52，H7.20，N5.45。實施例5:核黃素四乙酸酯的合成稱取5g核黃素于100ml反應(yīng)瓶中，加入50g醋酐(北京化工廠)，攪拌加熱到4(TC，再緩慢滴加6ml硫酸，控制溫度在48-5(TC反應(yīng)3小時,冷卻到室溫后，倒入800ml冰水中析出沉淀，過濾，水洗，抽干將濾餅溶于100ml甲醇，加熱使其全溶并加少量活性碳，趁熱過濾,冷卻結(jié)晶，再過濾，甲醇洗滌，收獲結(jié)晶，干燥即得，測得mp246-248°C。實施例6:核黃素戊酸酯的制備稱取5g核黃素于100ml反應(yīng)瓶中，加入80g戊酐(購自ACROS公司)，攪拌加熱到4CTC，再緩慢滴加6ml硫酸，控制溫度在48-50。C反應(yīng)6小時，冷卻到室溫后，倒入800ml冰水中析出油狀物，加6N氫氧化鈉調(diào)pH至中性，使沉淀完全，除去水，再用1N氫氧化鈉洗滌粘稠物沉淀2-3次，最后用水反復(fù)洗滌多次后過濾獲得固體，再用甲醇100ml加熱溶解，活性碳脫色過濾，冷卻結(jié)晶，再過濾，甲醇洗滌，收結(jié)晶干燥即得，測得mp94-96°C。實施例7:核黃素?zé)熕狨サ闹苽溆谌诜磻?yīng)瓶內(nèi)，先后投入4g核黃素和15g煙酰氯鹽酸鹽(購自ACROS公司)，再加入30ml吡啶，攪拌油浴加熱至100-120。C回流反應(yīng)兩小時，反應(yīng)呈均相，冷卻至室溫,加入80ml甲醇，攪拌下倒入200ml水中析出沉淀，過濾，水洗,抽干，并經(jīng)PA真空干燥后用40ml氯仿溶解，過濾除去不溶物，濾液倒入800ml己烷中析出結(jié)晶，再重結(jié)晶一次，可得3.5g核黃素?zé)熕狨?，測得mpl48-15rC。元素分析，計算值(％):C61.81，H4.05，N14.06;實測值(％):C60.99，H4.25，N13.84。實施例8:核黃素酯類衍生物促進(jìn)前脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗3T3-L1前脂肪細(xì)胞株是一種從小鼠胚胎中分離克隆獲得，廣泛用于藥物對脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的研究，是常用的抗糖尿病藥物的體外研究模型。3T3-L1細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫。實驗所需的核黃素酯類衍生物包括核黃素四月桂酸酯(簡稱核黃素月桂酸酯)、核黃素-5'-月桂酸單酯、核黃素一5，，4，一雙月桂酸酯、核黃素一5，，4，，3，一三月桂酸酯、核黃素異丁酸酯、核黃素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯、核黃素金剛烷酸酯、核黃素四乙酸酯、核黃素戊酸酯和核黃素?zé)熕狨?，均為發(fā)明者實驗室合成，純度》98%。核黃素四丁酸酯(重慶大新藥業(yè)股份有限公司)，核黃素磷酸鈉(武漢市寶源醫(yī)藥有限公司)，核黃素(湖北廣濟藥業(yè)有限公司)。胰島素、1-異丁基-3_甲基-黃嘌呤(Sigma公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，葡萄糖試劑盒(葡萄糖氧化酶法，購自中生北控生物科技股份有限公司)。3T3-Ll細(xì)胞用含10%胎牛血清、1X105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，37°C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。首先要將3T3-Ll細(xì)胞誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)液采用DMEM培養(yǎng)基配制，其中含1-異丁基-3-甲基-黃嘌呤0.5咖ol/L、地塞米松0.25mnol/L和胰島素lmg/L。誘導(dǎo)6天后換成普通培養(yǎng)液，加入不同濃度的待測樣品(核黃素及其酯類衍生物)和陽性藥物胰島素。作用2天后，取細(xì)胞上清培養(yǎng)液150叱，用葡萄糖試劑盒測培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度。計算葡萄糖消耗率，公式為葡萄糖消耗率(%)二[(空白孔葡萄糖濃度-給藥孔葡萄糖濃度)/空白孔葡萄糖濃度]X100。/。。結(jié)果表明，核黃素酯類衍生物均能促進(jìn)分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗，與陽性對照品胰島素比較，作用相當(dāng)，而核黃素的作用不明顯(見表1)。表1樣品對誘導(dǎo)分化后3T3-Ll細(xì)胞葡萄糖(GLU)消耗的影響終濃度Ug/ml)GLU消耗率(y。)~0.18.8核黃素四乙酸酯5012.758.30.51.3核黃素四丁酸酯5023.2511.50.55.3核黃素異丁酸酯5021.5513.50.58.082o液對素蕎白島培空胰9(續(xù)上表)核黃素戊酸酯5014.758.60.52.5核黃素月桂酸酯5020.3512.20.55.5核黃素金剛烷酸酯5015.4510.20.53.4核黃素一5，，4，，3，一三月桂酉W5025.1512.20.57.1核黃素一5'，4'一雙月桂酸酯5024.1512.40.56.1核黃素-5'-月桂酸單酯5022.1510.20.56.2核黃素金剛垸酸酯5015.4510.20.53.4核黃素?zé)熕狨?024.3510.20.53.2核黃素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯5024.2512.10.54.3核黃素磷酸鈉5015.254.10.51.3核黃素504.252.10.51.1實施例9:核黃素酯類衍生物對PPARy的激動作用配體與過氧化物酶增殖物激活受體y(PPARy)結(jié)合后，與靶基因上相應(yīng)的結(jié)合序列(PPRE)結(jié)合誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)糖和血脂代謝，用于治療糖尿病。本試驗將pCMX-PPARy質(zhì)粒和pTAL-PPRE-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞株，篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。這樣可能通過檢測細(xì)胞株中報告基因(熒光素酶Luc.)表達(dá)產(chǎn)物的化學(xué)發(fā)光值來確定樣品是否對PPARy有激活作用(參考文獻(xiàn)基于報告基因和PPARY信號通路的藥物篩選模型的建立，中國藥理學(xué)通報，2005，21(4):504-507)。試驗所用陽性對照品馬來酸羅格列酮(商品名為文迪雅)為市售產(chǎn)品，培養(yǎng)液溶解后過濾除菌使用。核黃素及其酯類衍生物來源同實施例8。無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)、活性炭-Dextran處理的無雌活性的胎牛血清(Hyclone公司)、熒光素酶化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Promega公司)、潮霉素B(Solarbio公司)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞接種于24孔板(無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液，10%無雌血清，200ug/ml潮霉素B)，完全貼壁后加入樣品(10、1、0.1Pg/ml)和馬來酸羅格列酮(10、1Pg/ml)誘導(dǎo)表達(dá)報告基因Luc.，24h后測Luc.活性，樣品孔的化學(xué)發(fā)光值/培養(yǎng)液對照孔的化學(xué)發(fā)光值作為樣品通過PPARy誘導(dǎo)報告基因表達(dá)的倍數(shù)，反映樣品對PPARy的轉(zhuǎn)錄激活強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對照品馬來酸羅格列酮能誘導(dǎo)報告基因表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)為3.6倍。在核黃素酯類衍生物中，核黃素四乙酸酯、核黃素四丁酸酯、核黃素戊酸酯、核黃素月桂酸酯類、核黃素異丁酸酯、核黃素金剛烷酸酯、核黃素?zé)熕狨?、核黃素磷酸鈉和核黃素均具有一定的誘導(dǎo)報告基因表達(dá)的活性，以核黃素四乙酸酯、核黃素四丁酸酯等誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)較高，表明這些衍生物具有明顯的胰島素增敏作用(見表2)。表2樣品對PPRE介導(dǎo)的Luc.誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)的影響樣品終濃度Ug/ml)表達(dá)倍數(shù)培養(yǎng)液對照一馬來酸羅格列酮103.612.1核黃素四乙酸酯103.712.30.11.1核黃素四丁酸酯103.212.50.11.311(續(xù)上表)核黃素異丁酸酯103.012.50.11.0核黃素戊酸酯103.211.60.10.9核黃素月桂酸酯103.112.50.11.1核黃素一5，，4，，3，一三月桂酸酯103.312.80.11.1核黃素一5',4'—雙月桂酸酯103.412.20.11.4核黃素-5'-月桂酸單酯103.612.00.11.1核黃素金剛烷酸酯103.012.20.11.0核黃素?zé)熕狨?03.311.20.11.1核黃素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯102.111.00.10.8核黃素磷酸鈉102.311.20.11.0核黃素101.211.10.10.8實施例10:核黃素酯類衍生物拮抗四氧嘧啶(ALX)致小鼠糖尿病ALX損傷動物胰島P細(xì)胞導(dǎo)致胰島素分泌減少，引起實驗性糖尿病。此糖尿病模型具有發(fā)病率高、造模時間短、發(fā)病時間和病情嚴(yán)重程度較為統(tǒng)一等特點，是抗糖尿病藥物研究的常用動物模型。四氧嘧啶(ALX)(Sigma公司)，陽性對照藥鹽酸二甲雙胍片(MET)(雙鶴藥業(yè))，核黃素及其酯類衍生物來源同實施例8。OneTouchUltra血糖檢測儀和試紙條(強生公司)。雄性KM種小鼠(北京維通利華公司)。禁食1618h后，小鼠按體重先分出正常對照組和ALX模型組，ALX模型組小鼠尾靜脈注射ALX，劑量為80mg/Kg。2天后尾靜脈取血測血糖，按血糖值進(jìn)行分組，每組血糖值相差不大于20mg/dl。糖尿病小鼠分組如下模型對照組、陽性對照MET組(200mg/kg)、核黃素酯類衍生物(見下表)高劑量和低劑量組(劑量分別為100tng/kg或10mg/kg)，每組10只。灌胃給藥，每天上午給藥1次。給藥7天后，禁食1618h，尾靜脈取血測血糖。結(jié)果表明，與模型對照組比較，陽性藥MET能明顯降低小鼠的血糖。核黃素酯類衍生物也有不同程度的降血糖作用，以核黃素四丁酸酯、核黃素四戊酸酯等降血糖作用明顯，核黃素也有一定程度的降糖作用，但降糖幅度不大，作用顯著弱于核黃素四丁酸酯、核黃素四戊酸酯等幾個核黃素酯類衍生物(見表3)。表3核黃素酯類衍生物對ALX所致小鼠糖尿病模型血糖的影響組別劑量(mg/kg)血糖(簡1/L)正常對照組4.2±0.91氺水氺模型對照組-23.3土7.4MET組20010.0±5.核黃素四乙酸酯1001012.5±4.8*17.0±5.1*核黃素四丁酸酯100108.6±1.9*柳10.0±2.1林#核黃素異丁酸酯1001010.3±4.7**#12.0±7.3核黃素四戊酸酯100109.1土5.4**tt13.0±4.2*核黃素月桂酸酯1001011.8±2.9**15.3±7.2核黃素一5'，4'，；r—三三月桂酸酯1001013.2±3.4*16.0±7.5核黃素一5'，4'-一雙月桂酉10013.2±3.3*(續(xù)上表)1018.2±7.5核黃素-5'-月桂酸單酯10012.0±4.8*1015.0±7.5核黃素-2，6-二甲氧基苯甲酸酯10013.1±3.9*1016.1±8.5核黃素金剛垸酸酯10013.1±8.9*1018.2±6.2核黃素?zé)熕狨?0011.3±5.l林1017.0±6.8核黃素磷酸鈉10012.8±3.9*1017.0±8.1核黃素10017.7±5.4*1020.2士6.7注與模型對照組比較，*P<0.05，氺氺P〈0.01，***P<0.001。與核黃素組比較，#P<0.05，##P〈0.01.實施例11:核黃素酯類衍生物對KK"小鼠血糖的影響和胰島的保護(hù)KKAY小鼠為典型的自發(fā)性遺傳性糖尿病小鼠，體重3640g，約9周齡，雄性，SPF級，采用特殊飼料，動物與飼料均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。實驗用陽性對照藥馬來酸羅格列酮、核黃素酯類來源同實施例8，速效胰島素(批號0704227，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)。小鼠自由飲水，禁食16h以上，尾靜脈采血測血糖。根據(jù)血糖值分組溶媒對照組(A組)、馬來酸羅格列酮(30mg/kg)組(B組)、核黃素四丁酸酯高劑量組(C組)、低劑量組(D組)、核黃素四戊酸酯高劑量組(E組)、低劑量組(F組)、核黃素磷酸鈉高劑量組(G組)、低劑量組(H組)、核黃素高劑量組(I組)、低劑量組(J組)。高劑量組劑量為30mg/kg，低劑量組劑量為10mg/kg，每組均8只。各組均灌胃給藥0.2ml/10g，溶媒對照組灌以同體積0.5%羧甲基纖維素鈉，每天1次，連續(xù)給藥35天。每周測1次血糖。在給藥35天后，動物禁食16h以上，進(jìn)行胰島素耐量試驗，測基礎(chǔ)血糖后，腹腔注射速效胰島素，劑量為0.5U/kg，給予胰島素后30min，60min，120min采血測血糖值。上述實驗結(jié)束后，處置動物取胰腺，用10%甲醛固定3天后，病理切片，HE染色，光鏡下觀察胰島病變程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各給藥組的血糖較溶媒對照組低，以陽性藥、核黃素四丁酸酯、核黃素四戊酸酯、核黃素磷酸鈉(高劑量)降糖作用明顯，核黃素高劑量組也有一定降糖作用，但作用相對較弱(見表4)。各組動物注射胰島素后血糖的變化也呈相似變化，陽性藥和核黃素四丁酸酯等組的血糖下降更顯著，表明其胰島素的增敏作用，而核黃素?zé)o明顯胰島素增敏作用(表5)。光鏡下檢査發(fā)現(xiàn)溶媒對照組表現(xiàn)為胰島體積變小，數(shù)量明顯減少，部分動物胰腺泡上皮細(xì)胞發(fā)生脂肪變性；上述降糖明顯的核黃素酯類衍生物劑量組小鼠的胰島體積增大，數(shù)量增多。結(jié)果表明，核黃素酯類衍生物具有明顯的降低血糖和胰島素增敏作用，改善胰島功能及形態(tài)。表4核黃素酯類衍生物對KK"小鼠的降糖作用組劑量血糖(mmol/L)別mg/kgd0d7d14d21d28d35A-5.6±1.86.7±1.18.2±1.316.5±4.014.5±2.29.1±2.7B306.0±1.46.6±1.86.6±1.99.0±2.4種10.0±1.47.5±1.0C306.±0.85.9±2.06.9±1.67.8±3.8**#8.3±1.4*#7.1±3.9D105.7±1.76.0±2.67.8±1.39.1±2.2氺10.9±4.58.4±2.9E306.1±0.95.4±1.97.2±1.68.0±1.8氺8.5±2.5*8.1±2.4F105.7±1.76.1±1.67.9±1.99.3±3.6求9.4±3.59.2±3.5G306.1±1.36.7±1.97.0±1.610.1±3.5*11.0±1.97.2±2.6H106.2±1.46.6±1.68.1±1.513.3±3.414.4±2.49.4±6.5I306.0±1.56.5±3.97.5±3.612.1±2.7水13.1±3.99.1±3.6了105.8±1.26.8±2.68.1±2.514.3±5.413.2±5.49.7±5.2注與溶媒對照組(A)比較，*P<0.05，林P〈0.01;與核黃素組(I)比較，ttP〈Q,05.表5核黃素酯類衍生物對KK"小鼠的胰島素耐量的影響組別劑量_血糖(,1/L)_(mg/kg)Omin30min60min120minA—9.1±2.78.2±2.46.4±2.38.8±2.9B307.5士1.05.7±1.3承6.0±1.76.8±1.7C307.1±3.94.7±1.1*#4.6±1.4氺4.6±1.3*D108.4±2.95.7±2.86.1±1.46.1±1.2氺E308.1±2.45.2±2.0氺5.4±2.35.0±1.9氺F109.2±3.57.7±1.36.0±1.45.8±2.0氺G307.2±2.65.1±1.7*#5.3±1.95.6±1.1*H109.4±6.57.7±3.86.1±3.67.3±2.5I309.1±3.67.6±1.56.2±1.97.4±3.2了109.7±5.28.0±2.46.5±3.27.8±2.6注與模型對照組(A)比較，*P〈0.05;與核黃素組(I)比較，#P〈0.05.實施例12:核黃素酯類衍生物對糖尿病大鼠血糖的影響和腎臟等組織的保護(hù)成年Wistar大鼠，北京維通利華公司繁殖，雄性，大鼠體重為180士20g，清潔級。實驗用陽性對照藥馬來酸羅格列酮、核黃素酯類衍生物來源同實施例8。大鼠喂以高糖高脂詞料(其中含20%蔗糖，10%豬油，1%豬膽鹽，2%膽固醇，67%基礎(chǔ)飼料)4周，繼以低劑量鏈脲菌素(STZ)(Sigma公司)30mg/kg，腹腔注射1次(注射前禁食1618h，自由飲水)，并繼續(xù)喂以高糖高脂飼料4周，使之產(chǎn)生高血糖癥。同時另設(shè)8只大鼠喂以普通飼料作為正常對照組，動物室溫度為18-22'C。尾靜脈采血測血糖。根據(jù)血糖值均衡原則分組模型對照組(A)、馬來酸羅格列酮(30mg/kg)組(B)、核黃素四乙酸酯高劑量組(C)、核黃素四乙酸酯低劑量組(D)、核黃素四丁酸酯高劑量組(E)、核黃素四丁酸酯低劑量組(F)、核黃素四戊酸酯高劑量組(G)、核黃素四戊酸酯低劑量組(H)、核黃素磷酸鈉高劑量組(1)、核黃素磷酸鈉低劑量組(J)、核黃素高劑量組(K)、低劑量組(L)，高劑量組劑量為30mg/kg，低劑量組劑量為10mg/kg，每組均16只。另設(shè)同窩正常對照組(N)，8只。各組均灌胃給藥0.2ml/100g體重，模型對照組灌以同體積0.5%羧甲基纖維素鈉，每天1次，連續(xù)給藥3周。動物禁食16h以上，測血糖后，處置動物取腎臟組織、眼球，用10%甲醛固定3天后，病理切片，HE染色，光鏡下觀察胰島、腎臟、視網(wǎng)膜和晶狀體病變程度。另取腓腸神經(jīng)行常規(guī)HE染色和鋨染色，然后用多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行有髓神經(jīng)纖維計數(shù)，測定神經(jīng)纖維總截面積、神經(jīng)纖維密度和神經(jīng)纖維平均截面積。實驗結(jié)束時模型對照組動物已有不同程度的肢端病變，糖尿病足癥狀積分標(biāo)準(zhǔn)l分皮膚無開放性病灶，顏色發(fā)黑2分皮膚有輕度開放病灶，可見水泡、血泡，但病灶未涉及深部組織；3分病灶已侵入深部肌肉組織，可見感染、潰瘍及較多的膿性分泌物。用以上三個等級對糖尿病足大鼠的四肢進(jìn)行評分，然后計算每只大鼠的總積分和每組的平均積分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各給藥組的血糖較模型對照組低，以陽性藥馬來酸羅格列酮、核黃素四乙酸酯兩劑量組、核黃素四丁酸酯兩劑量組、核黃素四戊酸酯高劑量組和核黃素磷酸鈉高劑量組降糖作用明顯，其中核黃素四乙酸酯、核黃素四丁酸酯、核黃素四戊酸酯的三個高劑量組的降糖作用強于核黃素高劑量組(見表6)。光鏡下檢査可見，正常對照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型對照組腎小球基底膜增厚，膠原纖維增生明顯，腎小球肥大，腎小管尤其是近曲小管上皮出現(xiàn)明顯灶狀空泡樣變，呈現(xiàn)糖尿病腎病的典型病變。核黃素酯類衍生物給藥組腎臟病變明顯減輕，尤其是核黃素四丁酸酯高劑量組的腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常。光鏡下，模型對照組視網(wǎng)膜毛細(xì)血管迂曲怒張，形成鈕結(jié)及血管絆，走行不規(guī)則。毛細(xì)血管管徑不規(guī)則，管腔粗細(xì)不一，管壁邊緣不規(guī)則。視網(wǎng)膜周細(xì)胞核腫脹，染色變淺，部分細(xì)胞核呈影細(xì)胞樣改變，周細(xì)胞數(shù)量減少。核黃素酯類衍生物組動物視網(wǎng)膜在低倍鏡下可見完整的血管網(wǎng)，血管管徑粗細(xì)均一。高倍鏡下可見核較大，核染色質(zhì)疏松，一般位于毛細(xì)血管中央部位的內(nèi)皮細(xì)胞及核染色質(zhì)較致密，位于毛細(xì)血管一側(cè)的周細(xì)胞。相對而言，核黃素組仍可見視網(wǎng)膜毛細(xì)血管迂曲，視網(wǎng)膜周細(xì)胞核腫脹，病變?nèi)暂^明顯，無明顯改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核黃素酯類衍生物組大鼠的神經(jīng)纖維數(shù)量、神經(jīng)纖維總截面積和神經(jīng)纖維數(shù)密度較模型對照組明顯增多或增大(表7)。模型對照組大鼠四肢出現(xiàn)明顯的糖尿病足癥狀，以皮膚顏色發(fā)黑、可見水泡和皮膚破損等為主，少量動物足病變嚴(yán)重，病灶已侵入深部肌肉組織，出現(xiàn)感染、潰瘍及較多的膿性分泌物，而給藥組的大鼠足癥狀相對較輕。通過對糖尿病大鼠足癥狀的評分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核黃素酯類衍生物(尤其是高劑量組)的積分明顯低于模型對照組，而核黃素組的癥狀改善不明顯(表8)。結(jié)果表明，核黃素酯類衍生物具有明顯的降低血糖作用，減輕糖尿病性腎臟、視網(wǎng)膜、周圍神經(jīng)和足的病變。表6核黃素酯類衍生物對糖尿病大鼠的血糖影響組別劑量(mg/kg)血糖(腿ol/L)正常對照組(N)一5.1±0.4氺本模型對照組(A)—20.2土7.0馬來酸羅格列酮組(B)307.4±4.6氺核黃素四乙酸酯高劑量組(c)308.3±4.0*#核黃素四乙酸酯低劑量組(D)1010.1±2.4氺核黃素四丁酸酯高劑量組(E)306.2±4.核黃素四丁酸酯低劑量組(F)109.4±3.4氺核黃素四戊酸酯組高劑量組(G)308.6±4.4*#核黃素四戊酸酯組低劑量組(H)1010.3±4.6核黃素磷酸鈉高劑量組(I)3011.4±4.1*核黃素磷酸鈉低劑量組(J)1014,5±5.4核黃素高劑量組(K)3013.2±3.7沐核黃素低劑量組(L)1019.3±7.2注與模型對照組比較，*P〈0.05,**P〈0.01;與核黃素組高劑量組比較，#P<0.05.表7核黃素酯類衍生物對糖尿病大鼠神經(jīng)纖維病變的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注與模型對照組(A)比較，*P<0.05，**P〈0.01.表8核黃素酯類衍生物對大鼠糖尿病足癥狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注與模型對照組比較，*P<0.05;與核黃素組高劑量組比較，ttP〈0.05.權(quán)利要求1、下式(I)的核黃素酯類衍生物用于制備治療I型糖尿病和II型糖尿病藥物的應(yīng)用。其中R1、R2、R3、R4分別為氫、C2-C12的直鏈脂肪酸、C2-C12的支鏈脂肪酸、C2-C12的芳香酸、金剛烷酸、煙酸或無機酸。2、如權(quán)利要求l所述的核黃素酯類的應(yīng)用，所述的無機酸為磷酸或硫酸。3、如權(quán)利要求1的核黃素酯類衍生物(I)在制備治療糖尿病并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求3中所述的糖尿病并發(fā)癥是指其慢性并發(fā)癥，包括糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病足。5、一種用于治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥藥物的組合物，其包括作為活性成份的權(quán)利要求1的核黃素酯類衍生物及藥用賦形劑或載體。6、權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述藥物組合物可被制成片劑、膠囊、注射液。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明涉及的
技術(shù)領(lǐng)域：
，是將核黃素酯類衍生物及含有上述成分的組合物用于制備治療糖尿病及其并發(fā)癥藥物中的用途。本發(fā)明所述的核黃素酯類衍生物加入輔料后可制成膠囊、片劑、顆粒劑和針劑等劑型。核黃素酯類衍生物具有促進(jìn)前脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗，激活過氧化物酶體增殖體激活受體γ，降低糖尿病動物模型的血糖，增加對胰島素的敏感性，改善胰島功能及形態(tài)，減輕糖尿病性神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腎臟和足的病變。文檔編號A61K31/525GK101584699SQ200810097870公開日2009年11月25日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者崔福貴申請人:崔福貴