專利名稱：：作為體內(nèi)造血刺激劑的tat-hoxb4h重組蛋白質(zhì)及其醫(yī)療組成物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種C-端含有組胺酸標(biāo)記的H0XB4重組蛋白質(zhì)，特別涉及一種C端含有六個(gè)組胺酸殘基(residue)的重組蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：在再生醫(yī)學(xué)發(fā)展蓬勃的今日，各種關(guān)于尋找器官特異干細(xì)胞或可自我更生(self-renewing)細(xì)胞的研究不斷。所述可自我更生細(xì)胞中最常被研究的是造血干細(xì)胞，因?yàn)閺陌┌Y、新陳代謝疾病到免疫不全，造血干細(xì)胞皆是較好的治療選擇。"造血，，是指血液細(xì)胞生成的過(guò)程，可通過(guò)位于骨髓中的造血干細(xì)胞的分裂而取代紅血球及白血球。造血干細(xì)胞(HSCs)是一群具有自我更新能力與分化為所有血球或免疫細(xì)胞能力的細(xì)胞。然而，控制造血干細(xì)胞自我更新與分化的基因機(jī)轉(zhuǎn)多半仍屬未知。目前，自成人骨髓、動(dòng)員后周邊血液以及臍帶血移植的人類造血千細(xì)胞，已在臨床上用于治療血癌(白血病與淋巴瘤)，以及用于幫助免疫系統(tǒng)由非血癌的高劑量化療復(fù)原。然而有效的移植需要大量的不同來(lái)源的造血干細(xì)胞，并且可能需要進(jìn)行干細(xì)胞增生(expansion)。造血干細(xì)胞可來(lái)自骨髓、周邊血液以及臍帶血。取出骨髓細(xì)胞需要進(jìn)行手術(shù)以及相當(dāng)痛苦的步驟，因而成為較差的手段。使用周邊血液細(xì)胞也有缺陷，因?yàn)楹茈y由造血機(jī)能受損的罹病或化療患者取得合適與足量的造血干細(xì)胞。臍帶血相對(duì)容易取得并且造血干細(xì)胞的質(zhì)量也較好，然而此法所能取得的造血干細(xì)胞數(shù)量仍有限。每次取得的細(xì)胞數(shù)量足夠用于小孩，但要用于成人就可能不足。為解決上述問(wèn)題，就必須干擾干細(xì)胞自我更生過(guò)程來(lái)加速造血干細(xì)胞體外增生。新近的證據(jù)指出轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在調(diào)控干細(xì)胞的基因表現(xiàn)、與干細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程扮演重要角色(0rkin、S.H,Nat.Rev.Genet1,57-64、2000)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可通過(guò)與目標(biāo)基因的結(jié)合與否或是本身濃度來(lái)構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞生理調(diào)控機(jī)制。一群稱為DNAbindinghomebox(H0X)的轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育扮演重要角色，并且在近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HOX轉(zhuǎn)錄因子家族在造血干細(xì)胞發(fā)育也扮演了重要角色(Buske、C.et.al.J.Hematol,71,301-308、2000)。蒙特婁大學(xué)(UniversityofMontreal)的蓋.薩瓦格(GuySauvageau)博士曾經(jīng)探討骨髓中造血干細(xì)胞的HOX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控造血干細(xì)胞更新的現(xiàn)象，它的研究顯示同位序列基因(homeoboxgene)H0XB4對(duì)于造血干細(xì)胞自我更新的調(diào)控十分重要，可維持造血干細(xì)胞在骨髓中的群集大小。最早證明HOX基因會(huì)在血球細(xì)胞表現(xiàn)，是利用人類及老鼠的細(xì)胞抹(cellline)而證實(shí)的。有些HOX基因在不同的細(xì)胞形態(tài)有明顯廣泛的表現(xiàn)，有些HOX基因則只活化表現(xiàn)于特定細(xì)胞中。例如人類的HOXB串群中的八個(gè)成員會(huì)在紅血球細(xì)胞發(fā)育之初表現(xiàn)，有些HOXB基因包括H0XBA及H0XB7也會(huì)在T細(xì)胞及B細(xì)胞表現(xiàn)。Sauvageau等人證實(shí)有九個(gè)HOXA基因、八個(gè)HOXB基因及四個(gè)HOXC基因會(huì)在CD34+骨髓細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)，其中又以HOXB2、HOXB9及HOXA10在CD34+的細(xì)胞族群內(nèi)的紅血球原始細(xì)胞表現(xiàn)最多。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也檢測(cè)出在CD34—的細(xì)胞群中，沒(méi)有HOX基因表現(xiàn)。因此，"H0XB4"蛋白已最常被用于做為活體外造血干細(xì)胞(HSC)增生之有效刺激劑。近來(lái)已證實(shí)人類，"HOXB4，，基因可以病毒或重組蛋白質(zhì)形式來(lái)有效增生造血干細(xì)胞。TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)室等級(jí)，已被用于增生干細(xì)胞而不會(huì)有反轉(zhuǎn)錄病毒插入之風(fēng)險(xiǎn)或與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)之風(fēng)險(xiǎn)(參見(jiàn)Krosl、J.etal.、NatureMedicine9、1428-1432、2003)。因此，"H0XB4"蛋白已常用于做為促進(jìn)活體外造血干細(xì)胞增生的刺激劑。最近已有i正據(jù)指出在H0XB4的N端加上一TAT蛋白質(zhì)序列后，外源的H0XB4即可被運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)。此TAT序列系可導(dǎo)引H0XB4由細(xì)胞外至細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，H0XB4可藉由護(hù)衛(wèi)蛋白(Chaperon)HSP90而重新折迭成其原始的構(gòu)形。TAT-HOXB4能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞增生達(dá)2-6倍(Amsellem、S.等人，NatureMedicine9、1423-1427,2003;及Krosl、J.等人，NatureMedicine9、1428-1432，2003)。然而，該TAT-HOXB4重組蛋白質(zhì)自大腸桿菌宿主的純化回收產(chǎn)率偏低，且多為不可溶形式。為了增加該TAT-H0XB4重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，已發(fā)展出C-端另具有一段6個(gè)組胺酸殘基(His-6)標(biāo)記的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)制造方法，其產(chǎn)率較原始蛋白質(zhì)的純化效率高出3-5倍。此制造方法已詳細(xì)描述于PCT/CN2006/000646。上述TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)可用于人類周邊血液或臍帶血干細(xì)胞增生，并且所增生的干細(xì)胞仍保有其多能性(pluripotency)。此外，將上述TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)處理過(guò)的干細(xì)胞加入在非肥胖型糖尿病合并重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)的骨髓內(nèi)之后，可以在其周邊白血球中發(fā)現(xiàn)人類白血球，由此可知小鼠免疫與造血機(jī)能已成功重建。然而，TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)從未被用于做為體內(nèi)造血的刺激劑，特別是，從未被用于增進(jìn)造血機(jī)能重建、擴(kuò)增、骨髓重生(re-population)以及增加周邊循環(huán)干細(xì)胞的數(shù)目，特別是在化療或放射線治療之后。Krosl等人G003)以及Amsellem等人(2003)無(wú)法獲得擴(kuò)增造血干細(xì)胞臨床研究所需的大量高純度且高度安定的H0XB4蛋白質(zhì)。使用現(xiàn)有技術(shù)由一公升培養(yǎng)液純化而得的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)總量約為l-2毫克，產(chǎn)率較低。使用現(xiàn)有技術(shù)方法表現(xiàn)TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)的pTAT-HA-H0XB4質(zhì)體，是加拿大蒙特婁大學(xué)(UniversityofMontreal)的蓋薩瓦格(GuySauvageau)博士所贈(zèng)，Krosl等人(2003)曾報(bào)告說(shuō)，在血清培養(yǎng)4小時(shí)后，其純化的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)會(huì)喪失大部分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于后述研究結(jié)果當(dāng)TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)給予一有需要的使用者之后，其可增加骨髓內(nèi)以及周邊血液內(nèi)的造血干細(xì)胞的數(shù)目。本發(fā)明一方面提供了一種TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)制造方法。該方法包含(a)提供一宿主細(xì)胞，其包含一具有上述蛋白質(zhì)編碼的載體；(b)在該宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)該蛋白質(zhì)；(c)收取該表現(xiàn)蛋白質(zhì)的一不純?nèi)芤海?d)以下列步驟由該溶液純化該蛋白質(zhì)(i)將該溶液通入一HisTrap管柱；(ii)沖洗該HisTrap管柱；(iii)將該部分純化的蛋白質(zhì)由該HisTrap管柱溶離出，而形成一部分純化的蛋白質(zhì)溶液；(iv)將該部分純化的蛋白質(zhì)溶液通入一MonoSP管柱；(v)沖洗該MonoSP管柱；(vi)將純化的蛋白質(zhì)，呈變性形式，由該MonoSP管柱溶離出；(e)利用疏水性化合物將溶離出的變性蛋白質(zhì)以下列步驟再折迭(i)將該溶離出的變性蛋白質(zhì)與一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白質(zhì)與疏水性化合物溶液；(ii)將該蛋白質(zhì)與疏水性化合物溶液去鹽而得一蛋白質(zhì)與疏水性化合物去鹽溶液；(iii)利用超過(guò)濾制程將該疏水性化合物由該蛋白質(zhì)與疏水性化合物去鹽溶液中移除。本發(fā)明另一方面提供了一種促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的方法。該方法包含a)給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)；b)允許該TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)增加該使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目，由此促進(jìn)造血干細(xì)胞動(dòng)員至該使用者的周邊血液。本發(fā)明再一方面向提供了一種用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的方法。該方法包含a)給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)；b)允許該TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)增加該使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。本發(fā)明再一方面提供了一種用以促進(jìn)造血干細(xì)胞由一有需要的使用者的骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物。本發(fā)明的醫(yī)療組成物包含一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)，其足以增加該使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目，由此促進(jìn)造血干細(xì)胞動(dòng)員至該使用者的周邊血液。本發(fā)明所述醫(yī)療組成物可給予進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植的患者，用以改善其造血干細(xì)胞移植后的恢復(fù)時(shí)間。本發(fā)明所述醫(yī)療組成物，可作為顆粒球細(xì)胞生長(zhǎng)因子(G-CSF)的替代物，給予G-CSF不每文感患者，用以動(dòng)員造血干細(xì)胞至周邊血液。本發(fā)明所述醫(yī)療組成物可給予造血干細(xì)胞捐贈(zèng)者，由此可以由捐贈(zèng)者之外圍血液以較不具侵略性的方式取得足量的造血干細(xì)胞以供移植，而不須由其骨髓取得。本發(fā)明再一方面提供了治療先天性造血干細(xì)胞缺乏而造成的疾病，其通過(guò)全身性給藥方式，給予上述疾病患者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB411重組蛋白質(zhì)或其醫(yī)療組成物。所給予的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)會(huì)增加該使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。本發(fā)明再一方面提供了一種用以改善造血干細(xì)胞移植患者的恢復(fù)時(shí)間的方法，其通過(guò)全身性給藥方式，給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)或其醫(yī)療組成物。本發(fā)明再一方面提供了一種用以改善放射線治療患者或化療患者的造血干細(xì)胞回復(fù)的方法，其通過(guò)全身性給藥方式，給予一有需要的使用者一有效量的以上述方法制造的TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)或其醫(yī)療組成物。圖1為本發(fā)明中造血干細(xì)胞(HSC)從體內(nèi)擴(kuò)增動(dòng)員至外圍血液(PB)的示意圖2為本發(fā)明中pTAT-HOXB4H的選殖與構(gòu)筑在修改過(guò)的pET21b質(zhì)體內(nèi)的示意圖3為本發(fā)明中pTAT-H0XB4H的DNA序列圖；(pTAT-H0XB4HN-端及C-端額外的六個(gè)組胺酸殘基加底線標(biāo)示，并且標(biāo)上TAT)圖4為本發(fā)明中pTAT-H0XB4H的蛋白質(zhì)序列圖5為本發(fā)明中以10%SDS-polyacrylamide凝膠(1.5mm)證明TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)的純化，其以coomassieblue染色分析圖示pTAT-H0XB4H的蛋白質(zhì)序列；其中M:分子量標(biāo)記(M)，0.3|ig;lane1:來(lái)自未誘導(dǎo)BL21(DE3)pLysSTAT-HOXB州蛋白質(zhì)表現(xiàn)細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，1ng蛋白質(zhì)；lane2:來(lái)自誘導(dǎo)后BL21(DE3)pLysSTAT-H0XB4H蛋白質(zhì)表現(xiàn)細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物，1ng蛋白質(zhì)；lane3:純化的TAT-H0XB4H,0.7jig蛋白質(zhì)；lane4:純化的TAT-H0XB4(0.2iag蛋白質(zhì));用以表現(xiàn)TAT-H0XB4蛋白質(zhì)9(lane5)的pTAT-HA-H0XB4質(zhì)體，是加拿大蒙特婁大學(xué)(UniversityofMontreal)的蓋薩瓦4各(GuySauvageau)博士所贈(zèng)。lane3及l(fā)ane4是加入相同體積的由MonoSP管柱收集的流份(fraction)。圖6為本發(fā)明中以SDS-polyacrylamide凝膠分析純化后TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)的安定性圖；(其儲(chǔ)存在PBS，4°C，0小時(shí)(A)與16小時(shí)(B)，其中M代表分子量標(biāo)記，0代表在4。C0小時(shí),16代表在4。C16小時(shí))圖7為本發(fā)明中以SDS—polyacrylamide凝膠以及coomassie染色分析TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)儲(chǔ)存在-4°C以及-20。C，PBS以及IMDM緩沖液的安定性圖；(箭頭指示TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)band)圖8A為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析G-CSF對(duì)于小鼠骨髓中CD34+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖8B為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析PBS對(duì)于小鼠骨髓中CD34+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖8C為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析TAT-11(^8411蛋白質(zhì)對(duì)于小鼠骨髓中0034+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖9A為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析G-CSF對(duì)于恒河猴骨髓中CD34+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖；。圖9B為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析TAT-HOXB4H蛋白質(zhì)加上G-CSF對(duì)于恒河猴骨髓中CD34+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖9C為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)對(duì)于恒河猴骨髓中CD34+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖9D為本發(fā)明中以流式細(xì)胞儀分析PBS對(duì)于恒河猴骨髓中CD34+干細(xì)胞數(shù)目的刺激效果圖；圖IO為本發(fā)明中TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)對(duì)于N0D-SCID小鼠的造血回復(fù)影響圖；圖ll為本發(fā)明中TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)對(duì)于接受Cisplatin化療后Balb/c小鼠的造血回復(fù)影響圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。I.TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)本發(fā)明由一公升培養(yǎng)液純化而得的TAT-HOXB4H重組蛋白質(zhì)總量約為6-10毫克，而本發(fā)明的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)純化方法具有體內(nèi)給予蛋白質(zhì)所需提升的產(chǎn)率。本發(fā)明的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)，即使在血清培養(yǎng)4星期后，仍顯出明顯較佳的安定性，此處將TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)用于臨床研究的關(guān)鍵。本發(fā)明所提供的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)的制造方法，具有能夠提高產(chǎn)率以及安定性的優(yōu)點(diǎn)，使得上述蛋白質(zhì)可用于體內(nèi)給藥。此TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)為包含三個(gè)基因片段(element)(TAT、H0XB4以及組胺酸標(biāo)記)的構(gòu)體(construct)。H0XB4是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HOX家族的一員，其可促進(jìn)造血干細(xì)胞增生。TAT使得H0XB4部分得以被輸送至細(xì)胞核內(nèi)。組胺酸標(biāo)記可使重組表現(xiàn)源的初始純化產(chǎn)率增加，本發(fā)明的制造方法可進(jìn)一步增加蛋白質(zhì)產(chǎn)率。pTAT-HOXB4H的構(gòu)筑如圖2所示，DNA序列系如圖3所示。TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)系指C端含有六個(gè)組胺酸殘基(residue)標(biāo)記(參見(jiàn)圖4)的TAT-H0XB4融合蛋白質(zhì)。除非另外指明，蛋白質(zhì)的氨基酸序列(或稱"初級(jí)結(jié)構(gòu)"或"初級(jí)序列")是由氨基端至羧基端。在非生物系統(tǒng)(例如使用固態(tài)合成者)，蛋白質(zhì)(包含雙硫(半胱氨酸)鍵位置)的初級(jí)結(jié)構(gòu)可由使用者自訂。"刪除(deletion)"是指氨基酸(或核苷酸)序列由于缺失一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸殘基(或核苷酸)所造成的改變。"插入(insertion)或增加"是指氨基酸(或核苷酸)序列的改變?cè)斐稍谝环肿踊蚱浔憩F(xiàn)物，相較于一參照序列(例如自然存在分子所發(fā)現(xiàn)的序列)，增加一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸殘基(或核苷酸)。"取代"是指一個(gè)或一個(gè)以上的氨基酸(或核香酸)被不同的氨基酸(或核香酸)取代。與本發(fā)明序列相似或同源(例如序列有7oy。相同)的序列也是本發(fā)明的一部分。在某些實(shí)施例中，序列相同度可以是90。/。、、91%、92°/。、93%、94%、95%、96%、97%、98°/。、99%或更高。此外，實(shí)質(zhì)相同也存在于當(dāng)核酸片段可以與其互補(bǔ)股雜交(例如在高度嚴(yán)格的條件下)時(shí)。核酸可出現(xiàn)在全細(xì)胞、細(xì)胞溶解物或呈半純化或純化形式。兩序列間"同源性"或"序列相同性"(兩者在此處可交換使用)的計(jì)算方法如下所示。先將序列以最適合比較的方式對(duì)齊(例如可在第一或第二氨基酸(或核酸)序列加上缺口(gap)以最適合比較，并且比較時(shí)可去掉不同源的片段)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，參照序列用于對(duì)齊比較的長(zhǎng)度可以是參照序列長(zhǎng)度的至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、更佳至少60%、更佳至少70%、80%、90%、100°/。。然后比較對(duì)應(yīng)位置上的氨基酸殘基(或核苷酸)。當(dāng)?shù)谝恍蛄幸约暗诙蛄邢鄬?duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基(或核苷酸)時(shí)，則在該位置相同(在此氨基酸(或核酸)"相同，，指等同于氨基酸(或核酸)"同源")。兩序列之間的相同度百分比指兩序列間共同擁有相同位置的數(shù)目的函數(shù)，其需考慮為了最佳化對(duì)齊所加入的缺口的數(shù)目與每一缺口的長(zhǎng)度。兩序列之間的序列比較與相同百分比可以利用一數(shù)學(xué)算法達(dá)成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施利中，兩氨基酸序列之間的相同百分比可以利用已并入GCG軟件包(http:〃雨.gcg.com)GAP程序的NeedlemanandW畫ch(1970)(J.Mol.Biol.48:444-453)算法決定，使用Blossum62matrix或PAM250matrix以及16、14、12、10、8、6或4的缺口加權(quán)與1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度加^又。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施利中，兩氨基酸序列之間的相同百分比可以利用GCG軟件包(http:〃w麗.gcg.com)決定，使用麗Sgapdna.CMPmatrix以及40、50、60、70或80的缺口加權(quán)與1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度加權(quán)。一組優(yōu)選的參數(shù)組(當(dāng)不確定哪些參數(shù)可用以決定一分子是否為本發(fā)明相同或同源的序列時(shí)，可使用此纟且參凄t)為，j吏用Blossum62scoringmatrix以及12的擊失口罰分(penalty)、4的缺口延伸罰分與5的框架位移(frameshift)缺口罰分。兩氨基酸(或核苷an線MUler((1989)CABI0S、4:11-17)算法決定，使用PAM120weightresiduetable以及12的缺口長(zhǎng)度罰分與4的缺口罰分。II.TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)制造方法A.選殖與表現(xiàn)用于在各種宿主細(xì)胞中選殖與表現(xiàn)蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，在本領(lǐng)域中已經(jīng)廣為人知。適用于制造蛋白質(zhì)的纟田月包，例3口Fernandezetal.(1999)GeneExpressionSystems。簡(jiǎn)而言之，適合的宿主細(xì)胞包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞(例如E.coli)。本領(lǐng)域中用于異源蛋白質(zhì)表現(xiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包含淋巴細(xì)胞抹(例如NS0)、HEK293cells、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、COScells、HeLacells、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、卯母細(xì)胞以及來(lái)自基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物的細(xì)胞，例如乳腺上皮細(xì)胞。合適的載體可以構(gòu)筑成含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包含啟動(dòng)子序列、基因終止序列、多聚腺苷化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因以及其它序列。載體可含有質(zhì)體或病毒骨架。細(xì)節(jié)參見(jiàn)Sambrooketal.:MolecularCloning:ALaboratoryManual、2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。許多載體相關(guān)技術(shù)，包含操作、制備、形成突變、序歹'J角竿i賣以及DNA專爭(zhēng)染(transfection)4笛述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,SecondEdition,Ausubeletal.eds.,JohnWiley&Sons(1992)。本發(fā)明還提供了一種將核香酸送入宿主細(xì)胞的方法。對(duì)于原核細(xì)胞，適合的轉(zhuǎn)染技術(shù)包含磷酸鈣、DEAE-Dextran、電穿孔、脂小體中介轉(zhuǎn)染以及利用反轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒，例如牛痘病毒(vaccinia)或才干^1犬病毒(baculovirus)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，適合的纟支術(shù)包含氯化釣轉(zhuǎn)化(transformation)、電芽孑L以及利用脂小體中介轉(zhuǎn)染以及利用噬菌體轉(zhuǎn)染。DNA送入之后，可以接著以選擇方法(例如藥物抵抗)來(lái)選4奪含有核苷酸的細(xì)胞。B.純化與在再折迭TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)可以利用本領(lǐng)域任何已知的適當(dāng)手段由重組宿主細(xì)胞單離。例如當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)可^皮分泌時(shí)，其可以由細(xì)胞上清液中分離；或者蛋白質(zhì)可由細(xì)胞溶解產(chǎn)物中分離。TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)可以利用層析法純化，其包含(a)將細(xì)胞溶解產(chǎn)物或細(xì)胞上清液(假如蛋白質(zhì)可被分泌)通入一HisTrap管柱；(b)以一緩沖溶液沖洗該HisTrap管柱；(c)將該部分純化的蛋白質(zhì)由該HisTrap管柱溶離出；(d)將由HisTrap管柱收到的部分純化的蛋白質(zhì)通入一MonoSP管柱；(e)以一緩沖溶液沖洗該MonoSP管柱；(f)將純化的蛋白質(zhì)由MonoSP管柱溶離出。細(xì)胞溶解產(chǎn)物或細(xì)胞上清液(假如蛋白質(zhì)可被分泌)可以在4。C下以20,000xg離心30分鐘使其澄清。將上清液調(diào)整至IOraM咪唑并加入HisTrap螯合管柱(AmershamPharmacia)。以8M尿素，20mMHEPES,0.5mMDTT，lOOmMNaClpH8.0緩沖溶液以及IOmM咪唑沖洗管柱，以移除未結(jié)合蛋白質(zhì)。部分純化的蛋白質(zhì)可利用高濃度的咪唑以及鹽由該HisTrap管柱溶離。進(jìn)一步純化指將由HisTrap管柱收到的部分純化的蛋白質(zhì)通入MonoSP管柱(AmershamPharmacia)。以4M尿素，20mMHEPES,50mMNaClpH6.5緩沖溶液一緩沖溶液沖洗管柱，以移除未結(jié)合蛋白質(zhì)。結(jié)合的TAT-H0XB4H可利用高濃度的鹽溶離。此純化步驟所得的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)系呈變性形式。接著，利用疏水性化合物將由HisTrap管柱溶離的呈變性的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)以下列步驟再折迭(i)將該溶離出的變性蛋白質(zhì)與一疏水性化合物溶液混合形成一蛋白質(zhì)與疏水性化合物溶液；(ii)將該蛋白質(zhì)與疏水性化合物溶液去鹽而得一蛋白質(zhì)與疏水性化合物去鹽溶液；(iii)利用超過(guò)濾制程將該疏水性化合物由該蛋白質(zhì)與疏水性化合物去鹽溶液中移除。本發(fā)明中，"疏水性化合物"是指任何可以在變性去鹽步驟中，保護(hù)蛋白質(zhì)使其不產(chǎn)生不溶性沈積的疏水性化合物。適用于本發(fā)明的疏水性化合物系描述于Oganesyanetal.、Pha函ge畫ics(2004)71、22-26。合適的疏水性化合物包括TritonX-IOO、tween-20或多苯環(huán)化合物。該超過(guò)濾制程或緩沖溶液轉(zhuǎn)換可藉由蛋白濃縮管柱(centricontube)或蛋白超濾膜(stircell)進(jìn)行。該超過(guò)濾制程或緩沖溶液轉(zhuǎn)換的條件視蛋白質(zhì)的種類而定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在含有H0XB4H蛋白質(zhì)的去鹽溶液中的疏水性化合物系藉由5-10次的緩沖溶液轉(zhuǎn)換(每次以1000-2500xg離心10分鐘)來(lái)移除，該緩沖溶液轉(zhuǎn)換系以由低至高濃度的大分子疏水性物質(zhì)(例如環(huán)糊精(cyclodextrin))溶液進(jìn)行，藉此使變性的H0XB4H蛋白質(zhì)再折迭恢復(fù)成天然形式(nativeform)。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，純化的TAT-HOXB4H蛋白質(zhì)可儲(chǔ)存在IMDM(HyClone)培養(yǎng)基(儲(chǔ)存緩沖溶液l)中，4。C或-20。C。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，純化的TAT-HOXB^蛋白質(zhì)可儲(chǔ)存在DMEM(HyClone)培養(yǎng)基(儲(chǔ)存緩沖溶液2)中，4。C或-20。C。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)C端的組胺酸標(biāo)記可以在進(jìn)行體內(nèi)給藥的前移除。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)N端的組胺酸標(biāo)記可以在進(jìn)行體內(nèi)給藥的前移除。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)N端的及C端的組胺酸標(biāo)記可以在進(jìn)行體內(nèi)給藥的前移除。C.制備醫(yī)療組成物當(dāng)與藥學(xué)上可接受的載劑結(jié)合時(shí)，TAT-H0XB4H可作為醫(yī)療組成物使用。除了TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)與載劑之外，此醫(yī)療組成物可包含各式各樣的稀釋劑、填充劑、鹽類、緩沖劑、安定劑、助溶劑以及本領(lǐng)域中其它已知的材料。"藥學(xué)上可接受"是指不會(huì)干擾活性劑生物活性的有效性的無(wú)毒材料。載劑的特性視給藥途徑而定。由于劑量均一以及服用方便，將組成物配方成劑量單元形式系較有利的。劑量單元形式在此處指，用于被治療對(duì)象單元?jiǎng)┝康奈锢砩峡煞珠_(kāi)的單元。每一單元含有一預(yù)先設(shè)定量的活性劑，用以結(jié)合所要的醫(yī)藥載體，產(chǎn)生所要的治療效果。本發(fā)明劑量單元形式的規(guī)格系視活性劑的獨(dú)特性質(zhì)、所要達(dá)成的特定治療效果而定。典型的給藥路徑，包含口服、外用、非腸道(例如舌下或口含)、舌下、直腸、陰道以及鼻內(nèi)。"非腸道(parenteral)"在此處包含皮下的(subcutaneous)、皮內(nèi)的(intracutaneous)、靜月永內(nèi)的(intravenous)、月幾肉注射(intramuscular)、胸骨內(nèi)的(intrasternal)、陰莖海綿體內(nèi)注射、鞘內(nèi)的(intrathecal),耳道內(nèi)(intrameata)、尿道內(nèi)(intraurethral)注射以及任何適當(dāng)?shù)淖⑷爰夹g(shù)。醫(yī)療組成物指配方成容許其所含有的活性劑在給予患者時(shí)具16有生物可利用性。醫(yī)療組成物可以一個(gè)或一個(gè)以上的劑量單元^^予患者，例如一個(gè)錠劑可以是單一劑量單元，而以噴霧劑形式的容器可含有復(fù)數(shù)個(gè)劑量單元。當(dāng)以口服給予治療有效量的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)時(shí)，結(jié)合劑可以是以錠劑、膠嚢、藥粉、溶液或酏劑(elixir)的形式。當(dāng)以錠劑形式給藥時(shí)，本發(fā)明的醫(yī)療組成物可另包含固體載劑例如明膠，或佐劑。錠劑、膠嚢、藥粉可含有5%至95%的結(jié)合劑(bindingagent)，優(yōu)選為含有25°/。至90%的結(jié)合劑。也可加入顯色劑或調(diào)味劑?？墒褂媚ひ聦?。當(dāng)以液體形式給藥時(shí)，可加入液體載劑例如水、石油(petroleum)、動(dòng)物油或才直物油(例j!o花生油、》戶4勿油、大豆油、芝麻油)或合成油。以液體形式的醫(yī)療組成物可另包含生理食鹽水、葡萄糖或其它醣類溶液或二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當(dāng)以液體形式給藥，醫(yī)療組成物可含有O.5%至90%的結(jié)合劑，優(yōu)選為含有1%至50%的結(jié)合劑。當(dāng)以靜脈、皮膚或皮下注射給予一治療有效量的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)時(shí)，可以是無(wú)致熱原的非腸道(parenterally)可接受的水溶液的形式。制備具有應(yīng)有的pH值、等張性、安定性的非腸道可接受蛋白質(zhì)溶液，屬于該
技術(shù)領(lǐng)域：
的公知技術(shù)。在某些實(shí)施例中，用于靜脈、皮膚或皮下注射的醫(yī)療組成物可包含等張載體，例如氯化鈉注射液、林格氏液、葡萄糖注射液、葡萄糖及氯化鈉注射液、乳酸林格注射液或其它本領(lǐng)域公知的載體。本發(fā)明的醫(yī)療組成物還可包含安定劑、防腐劑、緩沖劑、抗氧化劑或其它本領(lǐng)域公知的添加劑。在進(jìn)行本發(fā)明治療方法或使用本發(fā)明時(shí)，先將治療有效量的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)給予使用者，例如一哺乳類動(dòng)物，當(dāng)然，也可以是人類。"治療有效量，，在此處指該醫(yī)療組成物中活性劑的總量足以產(chǎn)生積極的效果，例如癥狀減輕、治愈或增加治愈率。當(dāng)用在單一活性劑且單獨(dú)給藥時(shí)，"治療有效量"單指該活性劑。當(dāng)用于一組合時(shí)，"治療有效量"指所有活性劑足以產(chǎn)生治療效果的總合量，不論該些活性劑指系列性組合給藥或同時(shí)組合給藥。TAT-H0XB化蛋白質(zhì)在本發(fā)明醫(yī)療組成物中的含量一見(jiàn);欲治療癥狀的嚴(yán)重性與本質(zhì)、患者先前接受的治療本質(zhì)以及患者的年齡及性別而定。最后，主治醫(yī)師可以決定個(gè)別患者活性劑給藥量。剛開(kāi)始，主治醫(yī)師可以給予低劑量的活性劑，并觀察患者的反應(yīng)。可給予較大劑量的活性劑直到患者得到適當(dāng)?shù)闹委熜Ч?，此時(shí)一般不會(huì)再增加劑量。用以實(shí)施本發(fā)明方法的醫(yī)療組成物可含有每公斤體重約lg至約lmg的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)。給予使用者的劑量范圍可選自1|ig/kg至1mg/kg、1|ig/kg至0.5mg/kg、1pg/kg至0.1mg/kg、10pg/kg至0.5mg/kg、10pg/kg至0.lmg/kg、100pg至0.5mg/kg、250pg/kg至0.5mg/kg。此外，劑量范圍可選自50pg至100mg、100jig至50mg、500)ig至50mg、1mg至50mg。4吏用本發(fā)明醫(yī)療組成物的靜脈注射時(shí)間視》欠治療的疾病嚴(yán)重性以及個(gè)別患者的特異反應(yīng)而定。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，施以本發(fā)明TAT-HOXB4H蛋白質(zhì)的時(shí)間可以是l2至24小時(shí)的連續(xù)靜脈注射。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，本發(fā)明TAT-HOXB4H蛋白質(zhì)可持續(xù)使用，只要患者繼續(xù)在進(jìn)行化療或放射線治療。TAT-HOXB4H蛋白質(zhì)可以靜脈注射10-100ng/kg,—天兩次，4.5至5天。一次治療循環(huán)可能就足以在體內(nèi)擴(kuò)增造血干細(xì)胞。最后，主治醫(yī)師可以決定使用本發(fā)明醫(yī)療組成物的適當(dāng)靜脈注射時(shí)間。化合物毒性以及治療效價(jià)可以標(biāo)準(zhǔn)的藥劑學(xué)程序以細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物決定，例如LDs。(總數(shù)50%致死劑量)以及EDs。(總數(shù)50。/。有效治療劑量)。毒性以及治療間的劑量比例即為治療指數(shù)，其可以LDs。/EDs。表示。細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)據(jù)可以用來(lái)評(píng)估用于人類的劑量范圍?；衔飫┝靠梢栽诎珽Ds。且毒性小或無(wú)毒的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。視所使用的劑型與給藥途徑，劑量可在上述范圍內(nèi)變化。TAT-HOXB4H的有效治療劑量可以由細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)初步估計(jì)。在動(dòng)物模型中，劑量可以是達(dá)到包含ICs。(也即測(cè)試蛋白質(zhì)達(dá)到最大癥狀抑制一半的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍，就如同細(xì)胞培養(yǎng)決定的方式。血漿濃度可以利用高效液相層析測(cè)定。任何特定劑量的效果可以藉由適當(dāng)?shù)纳?險(xiǎn)定法(Bioassay)監(jiān)測(cè)。適合的生物檢定法包含，但不限于，利用標(biāo)記有熒光探針(例如FITC)的CD3f干細(xì)胞抗體來(lái)量測(cè)在單核細(xì)胞內(nèi)的CD34+干細(xì)胞，以及利用流式細(xì)胞儀量測(cè)在外圍血液或骨髓造血干細(xì)胞中的LY5細(xì)胞比例。本發(fā)明的多核普酸與蛋白質(zhì)系預(yù)期可展現(xiàn)下述的一個(gè)或一個(gè)以上的用途或生物活性。本發(fā)明蛋白質(zhì)的用途或活性可以由給藥或使用此蛋白質(zhì)的方式提供，也可由給藥或使用編碼此蛋白質(zhì)的多核苷酸的方式(例如基因療法或適用于送入DNA的載體)提供。III.體內(nèi)造血刺激方法A.需要治療的患者本發(fā)明的醫(yī)療組成物可用于治療自體免疫疾病、免疫不全癥以及血液疾病。此外，本發(fā)明的醫(yī)療組成物可用于改善造血干細(xì)胞移植后的恢復(fù)時(shí)間。本發(fā)明的醫(yī)療組成物可用于治療罹患淋巴瘤、白血病、霍奇金氏癥以及骨髓增生性疾以本發(fā)明的醫(yī)療組成物治療。此外，本發(fā)明的醫(yī)療組成物可用于造血干細(xì)胞捐贈(zèng)者以及顆粒球細(xì)胞生長(zhǎng)因子(G-CSF)不敏感患者。在本發(fā)明又一實(shí)施例中，TAT-H0XB4H是被用來(lái)動(dòng)員造血干細(xì)胞的唯一活性劑，并且氟脲嘧啶(5-FU)并未給予捐贈(zèng)者，不論是作為預(yù)處理或綜合治療計(jì)劃?？梢杂帽景l(fā)明醫(yī)療組成物治療的額外的疾病或與增加細(xì)胞生存相關(guān)的癥狀包括惡性腫瘤及相關(guān)疾病的進(jìn)行及/或轉(zhuǎn)移，例如早幼粒細(xì)胞白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細(xì)胞性白血病，急性髓細(xì)胞性白血病(包括髓細(xì)胞、19早幼粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅白血病))和慢性白血病(例如慢性粒細(xì)胞(顆粒細(xì)胞)白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)，骨髓形成異常癥(myelodysplasticsyndrome),真性紅血球增多癥(polycythemiavera)，淋巴瘤(例如霍奇金氏癥和非霍奇金氏癥)，多發(fā)性骨髓瘤，Waldenstr加巨球蛋白血癥以及實(shí)體瘤，包括肉瘤和癌瘤，例如纖維肉瘤，黏液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內(nèi)皮細(xì)胞肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內(nèi)皮瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，胰臟癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，基底細(xì)胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，嚢腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細(xì)胞癌，肝癌，膽道癌，絨癌，精母細(xì)胞瘤，胚胎瘤，威姆氏瘤，子宮頸癌癌，睪丸腫瘤，肺癌，小細(xì)胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，膠質(zhì)瘤，星形細(xì)胞瘤，髓母細(xì)胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果腺瘤，血管母細(xì)胞瘤，聽(tīng)神經(jīng)瘤，膠質(zhì)瘤，黑色素瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。本發(fā)明并不限于特定的方法、實(shí)驗(yàn)計(jì)劃、細(xì)胞株、動(dòng)物物種或?qū)倩蛳率龅脑噭?。所用?lái)描述特定實(shí)施例的術(shù)語(yǔ)不能用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍應(yīng)以權(quán)利要求書的范圍為準(zhǔn)。此處使用的，單數(shù)形式的"一"與"該"，除非文意另有所指外，也包含復(fù)數(shù)個(gè)。因此，舉例來(lái)說(shuō)，"一個(gè)細(xì)胞"是指一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，并且包括本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的均等物。除非另外定義，否則所有的技術(shù)和科學(xué)所用詞匯具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟悉此技術(shù)者相同涵義的理解。雖然任何方法，組件和材料相似或均等于在此描述的，都可用于實(shí)踐或試驗(yàn)本發(fā)明，優(yōu)選的方法，組件和材料于現(xiàn)在描述。所有此處提及的刊物和專利在此并入用以描述和公開(kāi)，舉例來(lái)說(shuō)，描述于刊物內(nèi)的構(gòu)造和方法，可與目前所描述的發(fā)明結(jié)合。先前以及本文中討論的刊物僅提供作為本案有效日期前的公開(kāi)。所有皆不可解釋為承認(rèn)發(fā)明人無(wú)法憑借先前發(fā)明來(lái)預(yù)見(jiàn)此公開(kāi)。定義"干細(xì)胞"是一種多能或多潛能細(xì)胞，其有能力自我更新，以保持未分化，以及成為已分化。干細(xì)胞，至少在動(dòng)物自然存在的一生中，可以無(wú)限分裂。干細(xì)胞并非末期分化，即它們不是在分化途徑末端。當(dāng)干細(xì)胞分裂，每個(gè)子細(xì)胞，可仍然是一個(gè)干細(xì)胞或可以走向出一條導(dǎo)致末期分化的路。"嵌合體"干細(xì)胞是指干細(xì)胞的一部分DNA屬于一個(gè)異種生物體。"造血"細(xì)胞是指涉及造血過(guò)程(也即前體細(xì)胞形成成熟血液細(xì)胞的過(guò)程)的一種細(xì)胞。在成人，造血發(fā)生在骨髓。在發(fā)育早期，在不同發(fā)育P介段，造血發(fā)生在不同的地點(diǎn)；原始血液細(xì)胞出現(xiàn)于卵黃嚢，后來(lái)，血液細(xì)胞形成在肝、脾和骨髓。造血有復(fù)雜的調(diào)控，包括激素(例如紅血球生成素，生長(zhǎng)因子(例如集落刺激因子和細(xì)胞因子(例如介白素)))。此處使用的"載體"是指能夠運(yùn)送另一種核酸的核酸分子，該另一種核酸連接于該核酸分子上。一種類型的載體是一個(gè)"質(zhì)體"，這指的是一個(gè)圓形雙股DNA環(huán)，額外的DNA片段可接合在其中。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可接合在病毒基因體中。某些載體有能力在所送入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有一個(gè)細(xì)菌復(fù)制來(lái)源的細(xì)菌載體和附加體質(zhì)粒(episoma1)哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加體質(zhì)粒(episomal)哺乳動(dòng)物載體)可以在送入宿主細(xì)胞時(shí)整合到宿主細(xì)胞的基因體中，從而隨著宿主基因體復(fù)制。此外，某些載體，是有能力指揮其所連接的基因表現(xiàn)。這種載體在此是稱為"重組表現(xiàn)載體，，(或簡(jiǎn)單地說(shuō)"表現(xiàn)載體")。一般來(lái)說(shuō)，用于DNA重組技術(shù)的表現(xiàn)載體通常是以質(zhì)體的形式。在本發(fā)明中，"質(zhì)體"與"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)體是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明包括具有等同功能的其它形式的表現(xiàn)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。此處使用的"轉(zhuǎn)化，，是指將一個(gè)外源多核苷酸送入宿主細(xì)胞，不論用什么方法送入舉例來(lái)說(shuō)，直接吸收轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染以及感染等。特定的轉(zhuǎn)染方法見(jiàn)于下文。外源多核苷酸可能是以未插入載體的形式(例如質(zhì)粒)，或者可能被整合到宿主基因體中。一般來(lái)說(shuō)，"蛋白質(zhì)"是指任何兩個(gè)或兩個(gè)以上的個(gè)別氨基酸由勝肽鍵(peptidebond)接合的聚合物(不論是否自然發(fā)生)，該勝肽4定指當(dāng)4建結(jié)在一個(gè)氨基酸(或氨基酸殘基)的a碳的羧酸基的羧基碳原子，與鍵結(jié)在相鄰氨基酸(或氨基酸殘基)的cx碳的胺基的氨基氮原子，所形成的共價(jià)鍵結(jié)。該勝肽鍵連接及其所包含的原子(也即a碳原子、羧基碳原子(以及其氧原子取代基)以及氨基氮原子(以及其氫原子取代基))形成蛋白質(zhì)的"多勝肽骨架"。此外，此處使用的"蛋白質(zhì)"可以理解為包括"多勝肽，，以及"勝肽，，(其有時(shí)可以交互使用)。同樣，蛋白質(zhì)片段，類似物，衍生物以及突變物可在此稱為"proteins",除非另有說(shuō)明，也應(yīng)被視為是一"蛋白質(zhì)"。蛋白質(zhì)"片段"是指包含少于一個(gè)蛋白質(zhì)所有氨基酸殘基的多勝肽。可以理解的是，蛋白質(zhì)"片段"可能是一個(gè)在N端、C端或內(nèi)部(例如受天然的剪接(splicing)所致)截短的蛋白質(zhì)，可以是突變物及/或衍生物。蛋白質(zhì)"功能區(qū)塊(domain)"也是一個(gè)片段，其包含賦予蛋白質(zhì)生化活性所需的氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)于自然存在的蛋白質(zhì)。"重組，，在此處指一個(gè)核酸分子，基因組，基因，病毒，半合成，或合成的，其一部分或全部的多核苷酸并非天然。"重組，，相對(duì)于一蛋白質(zhì)或多勝肽而言，指以重組多核苷酸表現(xiàn)產(chǎn)生的多勝肽。一個(gè)"單離的"、"純化的"、"實(shí)質(zhì)上單離的"或"實(shí)質(zhì)上純化的"分子(如一個(gè)多勝肽或核苷酸)指被人為操作使相較于自然有較高的濃度。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)標(biāo)的蛋白質(zhì)^L單離、純化、實(shí)質(zhì)上單離或?qū)嵸|(zhì)上純化，指至少有50%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%，93%，94%，95%，96%,97%,98%,99%或以上的天然存在的非標(biāo)的蛋白質(zhì)物質(zhì)被移除。此處使用的"單離的"、"純化的"、"實(shí)質(zhì)上單離的"或"實(shí)質(zhì)上純化的"分子包括重組分子。SCID"小鼠"指重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠模型，SCID會(huì)造成免疫系統(tǒng)發(fā)育的嚴(yán)重缺陷。無(wú)論是T或B淋巴球，這些小鼠皆不足或完全缺乏。該SCID突變似乎損害抗原受體基因的重組，導(dǎo)致缺乏功能性的T與B淋巴球。其它造血細(xì)胞類型可正常發(fā)展和運(yùn)作。SCID小鼠隨時(shí)支持正常淋巴球分化，并且可與來(lái)自同基因或異基因小鼠的正常淋巴球重組或與人類淋巴球重組。這些小鼠還支持異基因和異種基因腫瘤的生長(zhǎng)。因此，SCID小鼠允許一些人類腫瘤的擴(kuò)散增長(zhǎng)，特別是血液系統(tǒng)疾病以及惡性黑色素瘤，因此可用于研究惡性肺瘤。"使用者"、"個(gè)人"、"宿主"以及"病人"在此處可互換使用，用以指活的動(dòng)物，包括人類和非人類的動(dòng)物。使用者可能是，舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)擁有免疫細(xì)胞的有機(jī)體，該免疫細(xì)胞能對(duì)抗源刺激產(chǎn)生反應(yīng)，并且能對(duì)經(jīng)由細(xì)胞表面的受體結(jié)合傳遞的刺激和抑制信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。使用者可以是一個(gè)哺乳類動(dòng)物，例如人或非人類的哺乳動(dòng)物，例如狗，貓，豬，牛，綿羊，山羊，馬，大鼠以及小鼠。"使用者，，并不排除，相對(duì)于疾病或各方面，完全正常的個(gè)人。"治療"指的是一個(gè)治療性或預(yù)防性的措施。治療可施加于具有醫(yī)療疾病的使用者或最終會(huì)得到疾病者，用以預(yù)防、治療、延誤、減少嚴(yán)重性或改善一個(gè)或一個(gè)以上疾病或反復(fù)發(fā)生的疾病的癥狀，或用以延長(zhǎng)使用者生存期間使其超過(guò)沒(méi)有治療所預(yù)期的生存期間。"治療有效量"是指主化合物可引起預(yù)期反應(yīng)(例如經(jīng)由研究員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它的臨床醫(yī)師所認(rèn)定的組織、制度、動(dòng)物、動(dòng)物或人類的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng))的量。以下具體的例子是，以被視為僅僅是說(shuō)明性的，無(wú)論在任何情況皆不是用以限定本發(fā)明的其它部分。本
技術(shù)領(lǐng)域：
中普通技術(shù)人員可基于本申請(qǐng)文件的敘述而實(shí)施本發(fā)明。實(shí)例例1:pET21b-His-TAT-H0XB4-His質(zhì)體的構(gòu)筑(a)N-端及C-端含有組胺酸標(biāo)記及TAT訊號(hào)勝肽的pET21b質(zhì)體的修改N-端含有組胺酸標(biāo)記及TAT訊號(hào)勝肽的pET21b表現(xiàn)載體由在pET21b質(zhì)體插入下列寡核苷酸而得5，-TATGCACCACCACCACCACCACTACGGCCGCAAGAAACGCCGCCAGCGCCGCCGGCG-3'(正股(sense))及5，-CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3，(反股(antisense))。C-端組胺酸標(biāo)記原本就存在于pET21b質(zhì)體中。(b)將H0XB4選殖入修改后的pET21b表現(xiàn)質(zhì)體含有H0XB4開(kāi)放讀框(ORF)以及額外六組胺酸編碼序列的DNA片段，以MGC54130質(zhì)體(GeneDiscovery，Taipei,Taiwan.Cat.No.5533346)為模板，利用聚合酵素鏈鎖反應(yīng)(PCR)放大而得，將PCR所得的H0XB4cDNA片段次選殖(subclone)到修改后的pET21b表現(xiàn)質(zhì)體。構(gòu)筑的質(zhì)體以及核酸序列系如圖2及圖3所示。實(shí)例例2:在大腸桿菌表現(xiàn)TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)將pET21b-His-TAT-H0XB4-His表現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS(Novagen)大腸桿菌抹。令經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞于37。C下生長(zhǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋成起始0D6。。值為O.05，并置于37。C下生長(zhǎng)至OD綱值為0.5,接著以l爐異丙基;5危代-p-D-半乳糖(IPTG)于37°C下進(jìn)行誘導(dǎo)表現(xiàn)3小時(shí)，期間伴隨劇烈搖晃。實(shí)例例3:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)的純化在誘導(dǎo)作用后，將細(xì)胞以離心收集并再懸浮于緩沖液A(8M尿素，20mMHEPES,0.5mMDTT及100mMNaClpH8.0)中。將細(xì)胞懸浮液通過(guò)Frenchpress三次，并將細(xì)胞溶解產(chǎn)物以20,000xg于4。C下離心30分鐘使其澄清。將上清液調(diào)整至10mM咪峻并加樣至HisTrap螯合管柱(AmershamPharmacia)。將結(jié)合的蛋白以50、100及250mM配制于緩沖液A中的咪唑進(jìn)行溶離。將含有TAT-H0XB4H的流份(fraction)加樣至存在緩沖液B(4M尿素,20mMHEPES及50mMNaClpH6.5)的MonoSP管柱，以l.5MNaCl及20mMHEPES(pH8.0)溶離。實(shí)例例4:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation)將溶離流份中的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)溶解并變性于一含有變性鹽類(例如胍鹽酸鹽(guanidinehydrochloride))的溶液，然后將其與D-PBS-T緩沖溶液(含有O.1%TritonX-IOO的兩倍磷酸鹽緩沖溶液)混合。TAT-HOXB纟H蛋白質(zhì)溶液與D-PBS-T緩沖溶液的比例為1:4。將所成的混合液力口入以水(10mlor3ml)前處理的10K蛋白濃縮管柱(centricontube)(50mlor15ml)，離心3000rpm,10分鐘。在此步驟中，變性鹽類系被D-PBS-T緩沖液置換，D-PBS-T緩沖液中的TritonX-100系可與HOXB4H蛋白質(zhì)的疏水性(Hydrophobic)區(qū)域結(jié)合接著以10K蛋白濃縮管柱(centricontube)進(jìn)行超過(guò)濾或緩沖溶液置換步驟10次，以IOOO—2500g/min離心速度，依序?qū)⒕彌_液置換為含l慮、2慮、3mM、4raM及5mM|3-環(huán)糊精(beta-cyclodextrin)的IMDM儲(chǔ)存緩沖液，其中于各離心速度下以每種濃度置換離心兩次。收集濃縮管柱中留存的樣品，并保存于-2(TC冰箱。25純化后TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)的均一'f生系以SDS-polyacrylamide凝月交以及coomassie染色分析。如圖5所示，經(jīng)HisTrapandMonoSP純化的TAT-H0XB4財(cái)交原始TAT-HOXB4蛋白質(zhì)的產(chǎn)率增加大約3-5倍。pTAT-HA-H0XB4質(zhì)體，系加拿大蒙特婁大學(xué)(UniversityofMontreal)的蓋薩瓦格(GuySauvageau)博士所贈(zèng)。pTAT-HA-HOXB4質(zhì)體系轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS(Novagen)，TAT-H0XB4蛋白質(zhì)的純化系如Krosl等人(2003)所述。實(shí)例例5:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)的安定性TAT-H0XB4H的安定性系以SDS-polyacrylamide凝月交分析。儲(chǔ)存時(shí)，全長(zhǎng)的TAT-HOXB4H可能會(huì)降解為30kD與10kD片段。如圖6所示，本發(fā)明的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)即使在PBS，-4。C中儲(chǔ)存16小時(shí)依然安定。此外，儲(chǔ)存在-4°C以及-20°C,PBS以及IMDM緩沖液的TAT-HOXB化，以10%SDS-polyacrylamide凝膠電泳以及coomassie染色分析。如圖7所示，當(dāng)儲(chǔ)存在IMDM儲(chǔ)存緩沖液中，本發(fā)明的TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)可維持4星期。實(shí)例例6:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)對(duì)于Balb/c小鼠的造血影響TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)對(duì)于造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至外圍血液的可能影響系利用Balb/c小鼠研究。每天四次皮下注射4天給予小鼠TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)(在PBS中)。為了解劑量反應(yīng)性，試驗(yàn)組(n=21)的劑量為lpg、5pg、10pg、15pg...to100pg/kg體重。一組對(duì)照組只施打PBS，另一組對(duì)照組則每天兩次皮下注射4天5pg/kg體重的G-CSF。取各組周邊血液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，可得到0034+干細(xì)胞在單核細(xì)胞(MNC)中的比例。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式列于表一。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>周邊血液內(nèi)CD3^/MNC的比例系列于表一。接受TAT-H0XB4H的第3-21實(shí)驗(yàn)組(劑量至少為10jug/kg體重以上)顯示類似于注射G-CSF對(duì)照組的動(dòng)員效果。取實(shí)驗(yàn)組3(TAT-HOXB4H劑量為10Mg/kg體重)小鼠的骨髓以及注射G-CSF與PBS的對(duì)照組小鼠的骨髓，以CD3fFITC-conjugated抗體(BectonDickinson)表型，并以流式細(xì)胞儀分析。注射TAT-H0XB4H的小鼠骨髓(圖8C),其CD34+干細(xì)胞比注射G-CSF與PBS的小鼠骨髓多。這些結(jié)果顯示注射TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)可以同時(shí)增加小鼠骨髓中以及外圍血液中的造血干細(xì)胞。實(shí)例例7:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)對(duì)于恒河猴的造血影響TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)在猴類的效力系利用成年的公恒河猴研究。試驗(yàn)組I(n=5)系每天四次靜脈注射4天給予TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)(劑量IOpg/kg體重)。試驗(yàn)組II(n=5)系每天四次靜脈注射4天給予TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)(劑量10pg/kg體重)以及皮下注射G-CSF(劑量5|ig/kg體重)。對(duì)照組I只施打PBS,對(duì)照組II則每天兩次皮下注射4天G-CSF(劑量5pg/kg體重)。取所有猴子的周邊血液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，可得到0034+干細(xì)胞在單核細(xì)胞(MNC)中的比例。結(jié)果列于表二。表二<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表二所示，只接受TAT-H0XB4H的猴子(實(shí)驗(yàn)組I)顯示出比注射G-CSF的猴子(對(duì)照組II)更好的動(dòng)員效果。同時(shí)注射TAT-H0XB4H以及G-CSF的浙吳子(實(shí)驗(yàn)組II)顯示出比注射G-CSF的猴子(對(duì)照組n)的動(dòng)員效果好一點(diǎn)。取注射TAT-H0XB4H、G-CSF以及PBS的《吳子骨髓樣本，以CD34+FITC-conjugated^t體(BectonDickinson)表型，并以;危式細(xì)月包4義分才斤。注射TAT-H0XB4H的猴子骨髓(圖9C)，其CD34+干細(xì)胞系遠(yuǎn)多于注射G-CSF的猴子骨髓(圖9A)、注射TAT-HOXB^+G-CSF的猴子骨髓(圖9B)及注射PBS的猴子骨髓(圖9D)中的CD34+干細(xì)胞。實(shí)例例8:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)對(duì)于NOD-SCID小鼠的造血回復(fù)影響將104Lin7CD34+細(xì)胞以及經(jīng)放射線照射的105CD3f輔助細(xì)胞注射至NOD-LtSz-scid/scid(NOD-SCID)小鼠(經(jīng)放射線照射(2.5Gy))中。將上述小鼠隨機(jī)分為兩組，一組(n=28)每日靜脈注射兩次TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)(劑量10pg/kg體重)，另一組(n=28)每日注射兩次PBS。植入后，以人類CD45+細(xì)胞存在鼠類周邊血液中的比例達(dá)O.1°/。以上的小鼠數(shù)目來(lái)評(píng)估造血回復(fù)。如圖10所示，注射TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)的小鼠可觀察到較佳的造血回復(fù)。實(shí)例例9:TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)對(duì)于接受Cisplatin化療后Balb/c小鼠的造血回復(fù)影響重復(fù)以cisplatin靜脈注射五周大Balb/c小鼠，直到其外圍血液中Ly5(murineCD45)細(xì)胞數(shù)目降為原始數(shù)目的10%。將注射過(guò)cisplatin的小鼠隨機(jī)分為兩組，一組(n=28)每日靜脈注射兩次TAT-H0XB4H蛋白質(zhì)(劑量IOpg/kg體重)，另一組(n=28)每日注射兩次PBS。以流式細(xì)胞儀周期性量測(cè)分析所有小鼠外圍血液中存在的Ly5細(xì)胞。造血回復(fù)比例系以外圍血液中的Ly5細(xì)胞數(shù)目相對(duì)于原始數(shù)目的比例來(lái)評(píng)估。如圖ll所示，注射TAT-H0XB4H重組蛋白質(zhì)的小鼠可觀察到較佳的造血回復(fù)。這些實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物模型已在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中被確認(rèn)為可用以預(yù)測(cè)人類患者的結(jié)果，例如Broxmeyer等人(2005)TheJournalofExperimentalMedicine,201,1307-1318;Larochelle等人(2006)Blood107,3772-3778。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。權(quán)利要求1、一種促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于其至少包含一有效量的TAT-HOXB4H重組蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的量足以增加一有需要的使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目，從而促進(jìn)造血干細(xì)胞動(dòng)員至所述使用者的周邊血液。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一造血干細(xì)胞捐贈(zèng)者。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述有需要的使用者為一進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植的患者。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一顆粒球細(xì)胞生長(zhǎng)因子不敏感患者。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性造血干細(xì)胞缺乏而造成的疾病。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性再生不良貧血。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述使用者系罹患血液疾病、實(shí)體瘤或免疫疾病。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，其特征在于所述血液疾病系選自由淋巴瘤、白血病、霍奇金氏癥以及骨髓增生性疾病所組成的族群。9.一種用以改善造血干細(xì)胞移植患者、》文射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于至少包含一有效量的TAT-H0XB化重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的量系足以增加一有需要的使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一造血干細(xì)胞捐贈(zèng)者。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一進(jìn)行自體造血干細(xì)胞移植的患者。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述有需要的使用者系為一顆粒球細(xì)胞生長(zhǎng)因子不敏感患者。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性造血干細(xì)胞缺乏而造成的疾病。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述使用者系罹患先天性再生不良貧血。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述使用者指罹患血液疾病、實(shí)體瘤或免疫疾病。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，其特征在于所述血液疾病指選自由淋巴瘤、白血病、霍奇金氏癥以及骨髓增生性疾病所組成的族群。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種作為體內(nèi)造血刺激劑的TAT-HOXB4H重組蛋白質(zhì)及其醫(yī)療組成物，涉及一種C-端含有組胺酸標(biāo)記的HOXB4重組蛋白質(zhì)。解決了現(xiàn)有技術(shù)中由培養(yǎng)液純化而得到的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量少且安定性差的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明促進(jìn)造血干細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至周邊血液的醫(yī)療組成物，至少包含一有效量的TAT-HOXB4H重組蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的量足以增加使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目，從而促進(jìn)造血干細(xì)胞動(dòng)員至使用者的周邊血液。本發(fā)明用以改善造血干細(xì)胞移植患者、放射線治療患者或化療患者的恢復(fù)時(shí)間的醫(yī)療組成物，至少包含一有效量的TAT-HOXB4H重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的量足以增加使用者骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。本發(fā)明應(yīng)用于增加骨髓內(nèi)以及周邊血液內(nèi)的造血干細(xì)胞的數(shù)目。文檔編號(hào)A61P35/00GK101524527SQ200810111350公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2008年5月27日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者吳國(guó)瑞,黃濟(jì)鴻申請(qǐng)人:臺(tái)灣尖端先進(jìn)生技醫(yī)藥股份有限公司