肝源性表達(dá)ng2的干細(xì)胞群作為種子細(xì)胞在體外3-d培養(yǎng)重建人工肝臟中的應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及肝源性表達(dá)神經(jīng)-膠質(zhì)抗原2陽(yáng)性細(xì)胞群(NG2+HSC)作為種子細(xì)胞通過條件培養(yǎng)基微環(huán)境在體外3-D培養(yǎng)誘導(dǎo)NG2+HSC重建肝臟器官中的應(yīng)用，還涉及利用NG2+HSC重建肝臟器官的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]終末期肝病(End-stageliver diseae, ESLD)包括肝硬化(Liver cirrhosis)和急性肝衰竭(Acute liver failure)死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康。而當(dāng)前唯一有效治療手段是肝移植，但是肝移植又受到供體匱乏原因故難以廣泛應(yīng)用。因此，尋找有效的肝臟功能替代技術(shù)是解決這一問題的關(guān)鍵。目前借助體外等暫時(shí)輔助或替代肝臟等人工肝臟方法，例如生物型人工肝臟(B1artificial liver，BAL)和物理型人工肝臟，雖然能夠清除因肝衰竭產(chǎn)生或增加的各種有害物質(zhì)，補(bǔ)充需肝臟合成或代謝的蛋白質(zhì)等必須物質(zhì)，改善患者水、電解質(zhì)及酸堿平衡等內(nèi)環(huán)境，但BAL只是暫時(shí)改善了晚期肝病患者癥狀，始終無(wú)法實(shí)現(xiàn)肝臟功能的全部替代。雖然近年發(fā)展的天然去細(xì)胞肝臟支架已取得進(jìn)步，但由于缺乏有效的種子細(xì)胞以及誘導(dǎo)其生成功能性全肝器官的微環(huán)境，故使最大程度仿造原有肝臟器官以達(dá)到制成工程化的新器官的目的至今世界科學(xué)家們未能如愿以償。
[0003]為此，急需提供一種生成功能性全肝的種子細(xì)胞，通過科學(xué)培養(yǎng)，能夠生成工程化的新型肝臟樣器官。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供生成功能性全肝的種子細(xì)胞即NG2+HSC，該細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后能夠發(fā)育為類肝樣組織，并具有肝臟結(jié)構(gòu)和功能；本發(fā)明的目的之二在于提供利用NG2+HSC細(xì)胞群在體外重建人工肝臟的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)研宄，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]1、肝源性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群NG2+HSC作為種子細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所指的肝源性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群是表達(dá)神經(jīng)-膠質(zhì)抗原2 (Neuro-glia antigen2，NG2)的肝源性干細(xì)胞 / 祖先細(xì)胞(Hepatic stem/progenitorcells, HSC)(簡(jiǎn)稱為NG2+HSC)，NG2+HSC可以來源于胚胎期未發(fā)育成熟的肝臟，也可以來源于成體肝臟，來源于成體肝臟的表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群制備方法見公開號(hào)為102899291A的中國(guó)專利，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中的其他方法分離，即只要肝源性的具有發(fā)育學(xué)特性和干細(xì)胞潛能的NG2陽(yáng)性細(xì)胞群同樣能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明目的。
[0008]2、肝源性表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2的干細(xì)胞群NG2+HSC作為種子細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)重建人工肝臟的方法，包括如下步驟:將NG2+HSC注入全肝去細(xì)胞生物支架(Wholedecellualrized liver scaffold,WDLS)中，然后加入能使NG2+HSC重建為人工肝臟的條件培養(yǎng)基，模擬肝組織器官發(fā)育的微環(huán)境體外3-D培養(yǎng)，誘導(dǎo)NG2+HSC生成(重建)人工肝臟。
[0009]本發(fā)明中的WDLS可以按照本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法制備，優(yōu)選的，所述WDLS按如下方法制備:
[0010](I)取離體全肝供體，然后從腹主動(dòng)脈灌注生理鹽水洗出紅細(xì)胞；
[0011](2)從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無(wú)菌雙蒸水開始去除細(xì)胞成分；
[0012](3)從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液繼續(xù)去除細(xì)胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA ；
[0013](3)從門靜脈和肝動(dòng)脈灌注無(wú)菌雙蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；
[0014](4)從門靜脈和肝動(dòng)脈灌注無(wú)菌I XPBS，恢復(fù)生理狀態(tài)，制得全肝去細(xì)胞生物支架。
[0015]更優(yōu)選的，按如下步驟制備全肝去細(xì)胞生物支架:
[0016](I)取離體全肝供體，然后以速度為5mL/min體內(nèi)腹主動(dòng)脈灌注生理鹽水0.5小時(shí)；
[0017](2)以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無(wú)菌雙蒸水2小時(shí)；
[0018](3)以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小時(shí)，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的胰酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%的EDTA ；
[0019](4)以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無(wú)菌雙蒸水6小時(shí)；
[0020](5)以5mL/min速度從門靜脈和肝動(dòng)脈同時(shí)灌注無(wú)菌I XPBS 1.5小時(shí)，制得全肝去細(xì)胞生物支架。
[0021]本發(fā)明中，能使成體肝臟NG2+HSC通過體外3_D誘導(dǎo)培養(yǎng)重建為人工肝臟的條件培養(yǎng)基均可實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選的，所述能使成體肝臟NG2+HSC通過體外3-D誘導(dǎo)培養(yǎng)重建為人工肝臟的條件培養(yǎng)基包括CMl培養(yǎng)基，CM2培養(yǎng)基和CM3培養(yǎng)基；
[0022]所述CMl培養(yǎng)基(誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化和維持其生長(zhǎng))為含有內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Endothelial cell growth supplements，ECGS)、細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4;
[0023]所述CM2培養(yǎng)基(誘導(dǎo)肝前體細(xì)胞分化和維持其生長(zhǎng))為含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatic growth factor，HGF)、喊性成纖維生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor，bFGF)、牛胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、左旋甲狀腺素、亞砸酸鈉、腐胺、孕激素、細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4 ;
[0024]所述CM3培養(yǎng)基(誘導(dǎo)成熟肝細(xì)胞分化和維持其生長(zhǎng))為含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(Pepnotech, cat.n0.100-188)、抑瘤素(Oncostatin)M、地塞米松、細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的混合液，所述細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液和DMEM完全培養(yǎng)液的體積比為1:4 ;
[0025]所述DMEM完全培養(yǎng)液包括如下組分:100U/mL青霉素-G，100 μ g/mL鏈霉素，5mML-谷氨酰胺，I X非必須氨基酸(原液為100X)，1X丙酮酸鈉(原液為100X)和25mMHEPESo
[0026]更優(yōu)選的，所述CMl培養(yǎng)基中，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為20ng/mL ；
[0027]所述CM2培養(yǎng)基中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為10ng/mL，堿性成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為5ng/mL，牛胰島素的濃度為0.5mg/mL，人轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為0.5mg/mL，左旋甲狀腺素的濃度為40 μ g/mL,亞砸酸鈉的濃度為34 μ g/mL,腐胺的濃度為0.5 μ g/mL,孕激素的濃度為 6 μ g/mL ；
[0028]所述CM3培養(yǎng)基中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為100ng/ml，堿性成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為50ng/mL、抑瘤素M的濃度為20ng/mL、地塞米松的濃度為0.1 μΜ。
[0029]使用本發(fā)明的條件培養(yǎng)基成本較低、經(jīng)濟(jì)適用，培養(yǎng)周期短，21天即能形成完整的肝臟器官樣輪廓。
[0030]進(jìn)一步，本發(fā)明CMl培養(yǎng)基，CM2培養(yǎng)基和CM3培養(yǎng)基中由于使用胚胎期哺乳動(dòng)物肝臟濾液，為防止培養(yǎng)基中其他細(xì)胞的增殖，特別是胚胎干細(xì)胞或祖先細(xì)胞的繁殖，因此需要將細(xì)胞破碎破壞細(xì)胞的增殖特性，然后過濾去除細(xì)胞碎片制得細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液，去除后檢測(cè)0X43和0X44陽(yáng)性造血干細(xì)胞、Thy-1陽(yáng)性肝臟胚胎肝細(xì)胞，如果上述細(xì)胞呈陰性，表明濾液中不含有干細(xì)胞和祖先細(xì)胞，可以用于培養(yǎng)。根據(jù)哺乳類肝臟器官發(fā)育成熟的理論基礎(chǔ)，本發(fā)明中胚胎期哺乳動(dòng)物肝臟濾液由以下方法制備:取哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝樣組織，勻漿，過濾，收集濾液，然后將濾液反復(fù)凍融至少3次，每次至少30mim，最后固液分離，收集液體，得細(xì)胞破碎并去除細(xì)胞碎片的哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝臟濾液；哺乳動(dòng)物發(fā)育期肝樣組織優(yōu)選為7到15天哺