專利名稱：人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程的生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人源化異種細(xì)胞 外基質(zhì)材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
器官和組織中的細(xì)胞，其行為不僅取決于細(xì)胞內(nèi)在的基因序列，在很 大程度上還受到外界環(huán)境因素的影響，包括細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。 細(xì)胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞生長提供支持和保護(hù)，更重要的是細(xì)胞與細(xì)胞外基 質(zhì)的相互作用能調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生過程，影響細(xì)胞生存、遷移、增殖和 功能代謝。因此，在組織工程研究中制備利于種子細(xì)胞粘附、增殖和分化 的細(xì)胞外基質(zhì)材料是十分重要和迫切的。
細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間 質(zhì)中的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組 織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。細(xì)胞外基質(zhì)是由機(jī)體細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞 外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要是膠原蛋白、非膠原糖蛋 白、氨基聚糖與蛋白聚糖、以及彈性蛋白。細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的形狀、結(jié) 構(gòu)、功能、存活、增殖、分化、遷移等一切生命現(xiàn)象具有全面的影響，因 而無論在器官形成過程中，或在維持成體結(jié)構(gòu)與功能完善(包括免疫應(yīng)答 及創(chuàng)傷修復(fù)等)的一切生理活動(dòng)中均具有不可忽視的重要作用。
細(xì)胞外基質(zhì)在體內(nèi)能引導(dǎo)、支持宿主細(xì)胞生長，逐漸完全降解，適用于
組織工程的支架材料。而且細(xì)胞外基質(zhì)中含有多種細(xì)胞生長因子，即使經(jīng)過 脫細(xì)胞處理后仍然含有這些生長因子，在創(chuàng)傷愈合的早期階段可以為組織再 生創(chuàng)造合適的微環(huán)境。這是其它天然材料和人工聚合物(如膠原、殼聚糖和 聚乳酸、聚羥基乙酸)所不能比擬的。
目前獲取細(xì)胞外基質(zhì)的方法主要來源于動(dòng)物。然而，異種細(xì)胞外基質(zhì) 的成分主要是由動(dòng)物細(xì)胞分泌合成，與人體的成分存在有差異，因此植入體 內(nèi)后難以與人體相融合，可能激發(fā)機(jī)體的異物反應(yīng)或免疫排斥反應(yīng)，使其在 使用中受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種人源化異種細(xì)胞外基 質(zhì)材料及其制備方法，使所制備的材料不僅具有異種細(xì)胞外基質(zhì)的特征， 而且含有來自人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和多種生長因子，能用于修 復(fù)軟組織器官缺損并促進(jìn)損傷愈合，具有生物相容性高、無毒害、顯著降低 免疫排斥反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所提出的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料，是在異種細(xì)胞外基質(zhì)上 復(fù)合有人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞生長因子所構(gòu)成的干燥多孔
泡沬狀材料；所述的異種細(xì)胞外基質(zhì)是將哺乳動(dòng)物組織經(jīng)脫細(xì)胞處理后所 形成的生物醫(yī)用材料，可以是脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、脫細(xì)胞筋膜、脫細(xì)胞小腸粘 膜下層、脫細(xì)胞膀胱粘膜下層、脫細(xì)胞羊膜、脫細(xì)胞硬腦膜、脫細(xì)胞肌肉、 脫細(xì)胞肌腱、脫細(xì)胞血管、脫細(xì)胞神經(jīng)的任一種；所述的人體細(xì)胞為成體細(xì) 胞、或是成體干細(xì)胞，包括皮膚細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、 脂肪干細(xì)胞的任一種或是幾種，其選擇是根據(jù)所修復(fù)組織受區(qū)的需求來確定。 本發(fā)明人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備方法，包括細(xì)胞獲取、異種 細(xì)胞外基質(zhì)制備以及人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備，具體步驟如下
1) 、細(xì)胞的獲取細(xì)胞來自人體組織，根據(jù)所修復(fù)組織受區(qū)的需求選擇 細(xì)胞的類型，按常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行體外培養(yǎng)，細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增可釆
用細(xì)胞工廠、生物反應(yīng)器的方法進(jìn)行；
2) 、異種細(xì)胞外基質(zhì)的制備將獲取的動(dòng)物皮膚、或筋膜、或小腸粘膜 下層、或羊膜、或肌肉、或肌腱、或血管、或神經(jīng)的任一種生物材料切成小 塊，置于含有過氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小時(shí)，用磷酸鹽 緩沖液(PBS)漂洗；(若是采用較厚的生物材料，如皮膚真皮層，此時(shí)需 置于-80°C冷凍半小時(shí)以上，確保材料內(nèi)外溫度達(dá)到 一致，取出后自然解凍， 如此反復(fù)凍融2 5次，使細(xì)胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗)；將其置 于0. 1 ~ 1M的NaOH溶液浸泡進(jìn)行脫脂、脫細(xì)胞處理；用PBS溶液浸洗至pH 中性，再置于含有DNA酶和cx-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分鐘以上， 去除殘留的DNA和orgal天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS漂洗；為使
種植細(xì)胞更容易貼附，經(jīng)脫水干燥后使用牛血清或膠原蛋白或多聚賴氨酸或 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)的任一種溶液浸泡20分鐘以上；再經(jīng)干
燥后形成異種細(xì)胞外基質(zhì)，滅菌消毒；其中，所述的過氧乙酸和乙醇終濃度 的體積百分比分別為0.1~0. 5%和2~10%;所述DNA酶的終濃度為30 ~ 50U/ml, a-半乳糖苷酶的終濃度為10~25U/ml;
3) 、專用培養(yǎng)液的配制，其組分按體積百分比包括有商用最低必需培 養(yǎng)液DMEM67. 5°/。、商用培養(yǎng)液F12 22.5%、胎牛血清5~15%,胰島素1~
50 ^g/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子1~10 ng/ml、氫化可的松10 ~ 500 ng/ml、腺嘌呤0. 2 ~ 0. 25 mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白1 ~ 10 ^g/nil、維生素C 10 ~ 50pg/ml。
4) 、人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞用細(xì)胞 培養(yǎng)液懸浮，按104~106個(gè)/2的密度滴加在異種細(xì)胞外基質(zhì)表面，在5 。/oC02環(huán)境中37'C條件下靜置貼附，置入專用培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 3天；棄去 培養(yǎng)液，將異種細(xì)胞外基質(zhì)未種植細(xì)胞的一面向上，再按照上述方法以 104~106個(gè)/(^2的密度種植細(xì)胞(其兩面種植的細(xì)胞可以是不同的)，靜置 后加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)2 ~ 3天；再將兩面復(fù)合有紐胞的異種細(xì)胞外基質(zhì)置 于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架上，用專用培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6~10天，每2天換 液，培養(yǎng)完成；上述的培養(yǎng)條件均為37。C的5。/。C02環(huán)境；
5) 、干燥將完成培養(yǎng)后的材料浸泡于冷凍保護(hù)液中25分鐘以上，經(jīng)冷 凍干燥、滅菌消毒后，得到復(fù)合有人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞生 長因子的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)干燥多孔泡沬狀材料；所述的冷凍保護(hù)液為 Hanks平衡鹽溶液中加有O. 1-10°/。葡萄糖、0. 1~5%蔗糖、0. 1~5%海藻糖、 0. 1 ~ 0. 5%人血清白蛋白(均為重量比)。
本發(fā)明制備的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料，是在去除細(xì)胞和天然抗原 成分的動(dòng)物來源的異種細(xì)胞外基質(zhì)上復(fù)合了人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基 質(zhì)成分和多種細(xì)胞生長因子,使得異種細(xì)胞外基質(zhì)在經(jīng)過人體細(xì)胞改造后具 有人體組織的部分特征，不僅具有異種細(xì)胞外基質(zhì)良好的機(jī)械性能，同時(shí) 還提高了生物相容性、顯著降低了免疫排斥反應(yīng)，其應(yīng)用到創(chuàng)面后可引導(dǎo)創(chuàng) 周細(xì)胞的長入、血管的生成、誘導(dǎo)干細(xì)胞向皮膚細(xì)胞的分化，因此可以明顯 促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。由于冷凍干燥過程不僅可使細(xì)胞失活，其保存期大大延長;
而且可保護(hù)材料中的蛋白質(zhì)(細(xì)胞生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)等蛋白質(zhì))活性， 發(fā)揮其正常生物學(xué)功能。同時(shí)由冷凍干燥所形成的干燥多孔泡沬狀結(jié)構(gòu)能為 創(chuàng)面的細(xì)胞提供三維空間結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的長入、增殖，可加速組織的愈合。
本發(fā)明人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的主要功能有(l)修復(fù)機(jī)體組織缺損 說、瘺等營養(yǎng)不良和感染創(chuàng)面)；(2)作為組織充填材料而使局部豐滿，修復(fù) 顏面部凹陷畸形；(3)做為生物支架材料用于其他組織工程器官的制備。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。 實(shí)例一
1) 、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的獲取無菌獲取人皮膚組織，去除脂肪層， 切成5mmx5mm大小，中性蛋白酶消化后，分離表皮和真皮組織；用300U/ml 膠原酶消化真皮組織，消化完成后將真皮組織吹散收集細(xì)胞液，離心后棄上清 獲取成纖維細(xì)胞，接種入培養(yǎng)瓶補(bǔ)足成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，擴(kuò)增培養(yǎng)至所需數(shù)量； 將分離的表皮用0.25%胰酶消化液消化后，吹散收集細(xì)胞液，離心后棄上清獲 取表皮細(xì)胞，接種入培養(yǎng)瓶補(bǔ)足表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，擴(kuò)增培養(yǎng)至所需數(shù)量；
2) 、脫細(xì)胞小腸粘膜下層的制備將豬空腸用蒸餾水沖洗干凈，切成10cm 片段，置于含有0.4% (v/v)過氧乙酸和8% (v/v)乙醇的水溶液中浸泡消 毒1小時(shí)；用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后沿縱向剖開，機(jī)械刮除小腸粘膜、 肌層和漿膜，用PBS漂洗后，獲得粘膜下層；再置入0. 4M的NaOH溶液中4 土2。C條件下脫細(xì)胞處理1小時(shí)，用PBS漂洗至pH值中性；將其置入含有 40U/ml的DNA酶和20U/ml的a-半乳糖苷酶的混合溶液中，37"C環(huán)境下處理 半小時(shí)，去除殘留的DNA和a-gal天然抗原成分，用PBS漂洗，經(jīng)脫水干燥 后，使用胎牛血清浸泡30分鐘，再經(jīng)冷凍干燥后，環(huán)氧乙烷滅菌消毒；
3) 、專用培養(yǎng)液的配制，各組分按體積百分比為商用最低必需培養(yǎng)液 DMEM 67.5 %、商用培養(yǎng)液F12 22.5%、胎牛血清10%,胰島素10嗎/ml、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子2 ng/ml、氫化可的松15 ng/ml、腺p票吟0. 2 mM、 轉(zhuǎn)鐵蛋白8 pg/tnl、維生素C 40蹄/ml。
4) 、人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備將體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和表 皮細(xì)胞消化、離心，分別用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，按105個(gè)/^2的密度將成纖維 細(xì)胞滴加在脫細(xì)胞小腸粘膜下層表面，于5%0)2環(huán)境中37。C條件下靜置30 分鐘，加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，棄去培養(yǎng)液，將脫細(xì)胞小腸粘膜下層未 種植細(xì)胞的一面向上，再按照上述方法以105個(gè)/cm2的密度種植表皮細(xì)胞， 靜置后加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，再將兩面復(fù)合有細(xì)胞的異種細(xì)胞外基質(zhì) 置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架上，用專用培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8天，每2天換液， 即培養(yǎng)完成；上述的培養(yǎng)條件均為37。C的5%0)2環(huán)境；
5) 、干燥將完成培養(yǎng)后的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料浸泡于冷凍保護(hù) 液中30分鐘；冷凍保護(hù)液為Hanks平衡鹽溶液中加有1%葡萄糖、2%蔗糖、 1%海藻糖、0. 1。/。人血清白蛋白(均為重量比)；經(jīng)真空冷凍干燥后，環(huán)氧乙 烷滅菌消毒，得到凍干的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料。
本實(shí)例制備的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料包含有人成纖維細(xì)胞和表皮 細(xì)胞合成分泌的多種人源性細(xì)胞生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括bFGF、 EGF、 TGF- Pl、 IL-8、膠原蛋白等，可直接用于修復(fù)軟組織器官缺損并 促進(jìn)損傷愈合，能抑制瘢痕形成和創(chuàng)面重塑。 實(shí)例二 1) 、脂肪干細(xì)胞獲取無菌獲取人脂肪組織，切成lrm^大小，用400U/ml 膠原酶液消化后，將脂肪組織吹散收集細(xì)胞液，離心后棄上清獲取脂肪干 細(xì)胞；加入細(xì)胞培養(yǎng)液后吹懸細(xì)胞，接種入培養(yǎng)瓶，擴(kuò)增培養(yǎng)至所需數(shù)量；
2) 、脫細(xì)胞豬皮基質(zhì)的制備將去除脂肪層的豬皮膚切成5cmxl0cm薄 片狀，用蒸餾水沖洗干凈，置于含有0. 2%過氧乙酸和3%乙醇的水溶液中浸 泡消毒1.5小時(shí)；用磷酸鹽緩沖液漂洗后，置于-8(TC冷凍40分鐘，使豬皮 內(nèi)外溫度達(dá)到一致，取出后自然解凍，如此反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞完全破裂 崩解；用去離子水清洗后將其置于O. 8M的NaOH溶液浸泡l小時(shí)；再用PBS 液浸洗至pH值中性，將其置干50U/ml的DNA酶和25U/ml的a-半乳糖苷酶 的混合溶液中1小時(shí)，去除殘留的DNA和a-gal天然抗原成分，用PBS清洗； 經(jīng)脫水干燥后在0. 1%多聚賴氨酸溶液浸泡50分鐘；再經(jīng)冷凍干燥即成為脫 細(xì)胞豬皮基質(zhì)，鈷60滅菌消毒。
3) 、專用培養(yǎng)液的配制，各組分按體積百分比為商用最低必需培養(yǎng)液 DMEM67. 5%、商用培養(yǎng)液F12 22。 5%、胎牛血清10°/。，胰島素40蹄/ml、堿 性成纖維細(xì)胞生長因子5ng/mi、氫化可的松100ng/ml、腺嘌呤0. 22mM、轉(zhuǎn) 鐵蛋白6ug/ml、維生素C 30蹄/ml。
4) 、人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備將體外培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞消化、 離心后，用細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮，按106個(gè)/(^2的密度滴加在脫細(xì)胞豬皮基 質(zhì)表面后，于5%(:02環(huán)境中37X:條件下靜置30分鐘，加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng) 2天，棄去培養(yǎng)液，將脫細(xì)胞豬皮基質(zhì)未種植細(xì)胞的一面向上，再按上述方 法以105個(gè)/^2的密度種植脂肪干細(xì)胞，靜置后加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)3天， 再將其取出置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架上，用專用培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8天，培
養(yǎng)期間每2天換液，即完成培養(yǎng)；上述的培養(yǎng)條件均為37°C, 5%0)2環(huán)境。 5)、干燥將完成培養(yǎng)后的材料浸泡于冷凍保護(hù)液中50分鐘；冷凍保 護(hù)液為Hanks平衡鹽溶液中加5%葡萄糖、0. 5%蔗糖、4%海藻糖、0. 2%人血 清白蛋白(均為重量比)；經(jīng)冷凍干燥，環(huán)氧乙烷滅菌消毒后，得到凍干的 人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料。
本實(shí)例制備的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料含有脂肪干細(xì)胞合成分泌的生 長因子可對(duì)成纖維細(xì)胞影響來加速創(chuàng)面愈合，用于治療軟組織缺損的愈合。 實(shí)例三
1) 、成纖維細(xì)胞的獲取同實(shí)例一；
2) 、脫細(xì)胞小腸粘膜下層的制備同實(shí)例一；
3) 、專用培養(yǎng)液的配制，各組分按體積百分比為商用最低必需培養(yǎng)液 DMEM 67.5%、商用培養(yǎng)液F12 22.5°/。、胎牛血清10%,胰島素20 pg/ml、 堿性成纖維細(xì)胞生長因子10 ng/ml、氫化可的松200 ng/ml、腺嘌呤0. 25 mM、 轉(zhuǎn)鐵蛋白10 pg/ml、維生素C 50|ig/ml。
4) 、人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備將成纖維細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液懸 浮，按106個(gè)"1112的密度滴加在脫細(xì)胞小腸粘膜下層表面，于5%(:02環(huán)境中 37。C條件下靜置30分鐘，加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，棄去培養(yǎng)液，將脫細(xì) 胞小腸粘膜下層未種植細(xì)胞的一面向上，再按照上述方法以1()6個(gè)/cm2的密 度種植成纖維細(xì)胞，靜置后加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)2天，再將兩面復(fù)合有細(xì) 胞的脫細(xì)胞小腸粘膜下層置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架上，用專用培養(yǎng)液繼 續(xù)培養(yǎng)10天，每2天換液，完成人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的培養(yǎng)；上述 的培養(yǎng)條件均為37。C、 5%0)2環(huán)境；5)、干燥將完成培養(yǎng)后的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料浸泡于冷凍保護(hù)
液中30分鐘；冷凍保護(hù)液為Hanks平衡鹽溶液中加有0. 5%葡萄糖、2%蔗 糖、1%海藻糖、0. 5%人血清白蛋白(均為重量比)；經(jīng)真空冷凍干燥，鈷60 滅菌消毒后，得到凍干的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料。
本實(shí)例制備的凍干人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料經(jīng)細(xì)胞失活處理、冷凍 干燥后可保存12個(gè)月，便于臨床使用，其含有豐富的人成纖維細(xì)胞合成分 泌的多種人源性細(xì)胞生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，如bFGF、 TGF-P1、 IL -8、膠原蛋白等，能參與肉芽組織及瘢痕形成和后期創(chuàng)面重塑，可用于修 復(fù)軟組織器官缺損并促進(jìn)損傷愈合。
權(quán)利要求
1.一種人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料，其特征在于，是在異種細(xì)胞外基質(zhì)上復(fù)合有人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞生長因子所構(gòu)成的干燥多孔泡沫狀材料；所述的異種細(xì)胞外基質(zhì)是哺乳動(dòng)物組織經(jīng)脫細(xì)胞處理后所形成的生物醫(yī)用材料；所述的人體細(xì)胞為成體細(xì)胞或是成體干細(xì)胞。
2、 制備權(quán)利要求l所述人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的方法，包括有細(xì) 胞獲取的步驟，其特征在于，具體步驟如下1) 、細(xì)胞的獲取根據(jù)所修復(fù)組織受區(qū)的需求選擇細(xì)胞的類型，按常規(guī) 的細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行體外培養(yǎng)和大規(guī)模擴(kuò)增；2) 、異種細(xì)胞外基質(zhì)的制備將獲取的動(dòng)物皮膚、或筋膜、或小腸粘膜下層、或羊膜、或肌肉、或肌腱、或血管、或神經(jīng)的任一種生物材料切成小塊，置于含有過氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小時(shí)；用磷酸鹽 緩沖液漂洗；置于NaOH溶液浸泡處理后，用磷酸鹽緩沖液浸洗至pH中性， 再置于含有DNA酶和a-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分鐘以上，用磷酸鹽緩沖液漂洗；經(jīng)脫水干燥后使用牛血清或膠原蛋白或多聚賴氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的任一種溶液浸泡20分鐘以上；再經(jīng)干燥后形成異種細(xì)胞 外基質(zhì)，滅菌消毒；3) 、專用培養(yǎng)液的配制，其組分按體積百分比包括有商用最低必需培 養(yǎng)液DMEM67. 5%、商用培養(yǎng)液F12 22.5°/。、胎牛血清5 ~ 15%，胰島素1~ 50 |ig/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子1~10 ng/ml、氬化可的松10-500 ng/ml、腺P票呤0. 2 ~ 0. 25 mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白1 ~ 10 pg/ml、維生素C 10 ~ 50pg/ml;4) 、人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料的制備將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮，按104~106個(gè)/(^2的密度滴加在異種細(xì)胞外基質(zhì)表面，在5 %(:02環(huán)境中37匸條件下靜置貼附后，置入專用培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3天；棄去培養(yǎng)液，將異種細(xì)胞外基質(zhì)未種植細(xì)胞的一面向上，再按照上述方法以 10" 106個(gè)/cm2的密度種植細(xì)胞，靜置后加入專用培養(yǎng)液培養(yǎng)2-3天；再將兩面復(fù)合有細(xì)胞的異種細(xì)胞外基質(zhì)置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架上，用專 用培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6~10天，每2天換液，培養(yǎng)完成；上述的培養(yǎng)條件均 為371的5%0)2環(huán)境；5)、干燥將完成培養(yǎng)后的材料浸泡于冷凍保護(hù)液中25分鐘以上，經(jīng)冷 凍干燥、滅菌消毒后，得到復(fù)合有人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞生 長因子的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)干燥多孔泡沬狀材料。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中所述過 氧乙酸的終濃度體積比為0. 1~0.5%,乙醇的終濃度體積比為2~10%;所述 DNA酶的終濃度為30~50U/nil， a-半乳糖苷酶的終濃度為10~25U/ml。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中所述的浸泡 消毒清洗后，NaOH溶液浸泡前，將材料置于-8(TC冷凍半小時(shí)以上，取出后自 然解凍，如此反復(fù)凍融2 5次，用磷酸鹽緩沖液清洗后再于NaOH溶液浸泡。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在步驟5)中所述的冷 凍保護(hù)液為Hanks平衡鹽溶液中按重量比加有0. 1 ~ 10%葡萄糖、0. 1 ~ 5%蔗 糖、0. 1~5%海藻糖、0. 1~0. 5%人血清白蛋白。
全文摘要
一種人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料，本發(fā)明是異種細(xì)胞外基質(zhì)上復(fù)合有人體細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞生長因子構(gòu)成的干燥多孔泡沫狀材料；所制備的人源化異種細(xì)胞外基質(zhì)材料去除了細(xì)胞和天然抗原成分，其應(yīng)用到創(chuàng)面后，可直接參與創(chuàng)面的修復(fù)，所含的細(xì)胞生長因子，能引導(dǎo)創(chuàng)周細(xì)胞的長入、血管的生成、誘導(dǎo)干細(xì)胞向皮膚細(xì)胞的分化，因此可以明顯促進(jìn)創(chuàng)面的愈合；另外，所制備的產(chǎn)品為干品，使保存期大大延長，不僅具有人體組織的部分特征，和異種細(xì)胞外基質(zhì)良好的機(jī)械性能，同時(shí)還對(duì)人體的生物相容性高、顯著降低免疫排斥反應(yīng)，可覆蓋創(chuàng)面、充填軟組織缺損、促進(jìn)創(chuàng)周細(xì)胞的生長和增殖，修復(fù)軟組織器官缺損并促進(jìn)損傷愈合。
文檔編號(hào)A61L27/56GK101366976SQ200810150789
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日
發(fā)明者王愛軍 申請(qǐng)人:陜西瑞盛生物科技有限公司