專利名稱：：一種胃黏膜定標(biāo)液及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種能安全、有效并長期標(biāo)記體腔內(nèi)黏膜的標(biāo)記液及制備方法。
背景技術(shù)：
：臨床眾多胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)較長的變化歷程，如對胃癌前病變的變化和較小腫瘤手術(shù)切除后都需要長期的隨訪觀察，內(nèi)鏡檢查及其內(nèi)鏡下病理活檢是診斷病變變化的最為準(zhǔn)確的指標(biāo)，監(jiān)測中的準(zhǔn)確定位是實(shí)現(xiàn)長期隨訪的關(guān)鍵。但第一次活檢看到的病灶，在下一次復(fù)查時(shí)很難再準(zhǔn)確切取，即便是同一內(nèi)鏡醫(yī)生在治療前后做胃鏡也不可能取同一部位的組織，前后幾次的病理報(bào)告因活檢部位的不一致也缺乏可比性，大大降低了疾病的檢出率。如何有效地進(jìn)行病變的長期隨訪是一個(gè)困惑醫(yī)學(xué)界的難題。而利用標(biāo)記液標(biāo)記病灶，能幫助病變的精確定位和觀察，如能使這種標(biāo)定保持至下一次的隨訪檢查，更能準(zhǔn)確的、科學(xué)的判斷病變變化，并且評價(jià)干預(yù)阻斷治療是否有效。這要求標(biāo)記液將在黏膜中可存留較長時(shí)期，便于下一次復(fù)檢識(shí)別，達(dá)到對病灶黏膜隨訪觀察病灶監(jiān)測的目的。但是目前尚沒有可以有效、安全并較長期標(biāo)記病灶的試劑可以選用。目前用于體內(nèi)黏膜標(biāo)記的試劑主要有酚紅、盧戈氏液、美蘭、甲苯胺藍(lán)、靛卡紅，羥甲苯紫、剛果紅、吲哚靛綠及印度墨汁等，其中大多數(shù)染料屬功能染色、對比染色或反應(yīng)性染色，為短暫性的噴灑性染色，并不適用于長期內(nèi)鏡隨訪，只有印度墨汁，吲哚靛綠可能用于黏膜及皮膚的較長期標(biāo)記。研究報(bào)道8種不同的染料對結(jié)腸黏膜注射標(biāo)記后觀察效果，僅吲哚靛綠和印度墨汁可清晰的存在超過24小時(shí)。對于癌前病變監(jiān)測需長達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年的隨訪，短效的定標(biāo)液，如吲哚靛綠等顯然不能滿足要求。印度墨汁作為最廣泛的醫(yī)用染料之一，其主要成分是碳顆粒的懸膠，數(shù)十年來廣泛用于皮膚紋身術(shù)，沒有明顯的毒副作用的發(fā)生。Ponsky和King等人曾在內(nèi)鏡下進(jìn)行結(jié)腸病變處作印度墨汁定標(biāo)，以方便手術(shù)中病灶的尋找。已有文獻(xiàn)報(bào)道使用印度墨汁在食管、結(jié)腸黏膜進(jìn)行短期定標(biāo)，認(rèn)為是安全有效，但未見系統(tǒng)的長期研究。目前更缺乏印度墨汁在胃黏膜定標(biāo)的長期觀察的報(bào)告，但從皮膚紋身、食管和結(jié)腸定標(biāo)的成功考慮，因此考慮選擇選用印度墨汁作為胃黏膜定標(biāo)液較為合適，但由于胃內(nèi)特殊的酸性環(huán)境，其選用定標(biāo)液的濃度、有效性和安全性等都需要進(jìn)行進(jìn)一步研制和評估。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服目前胃黏膜標(biāo)記液不能提供長期、安全、有效標(biāo)記的不足，提供一種新型的胃黏膜定標(biāo)液，由醫(yī)用印度墨汁原液與無菌注射用水分別配制成為i:io，i:ioo，i:iooo的濃度，外觀呈黑色懸膠液，均勻一致，無塊狀物或沉淀，pH值為8-8.3，含碳量0.60%。所述印度墨汁的原液(Pelikan，Hanover，Germany)為德國原裝進(jìn)口，質(zhì)量符合歐洲藥品標(biāo)準(zhǔn)。原液主要成分為碳，乙烯乙二醇、四硼酸鈉十水化合物及氨水。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備這種胃黏膜定標(biāo)液的方法，由以下步驟實(shí)現(xiàn)將印度墨汁原液震蕩搖勻后，在無菌環(huán)境下用無菌注射用水按照體積比稀釋為i:io，i:ioo，i:iooo的濃度，裝入玻璃小瓶，用流通蒸汽法ioo。c，30分鐘濕熱滅菌。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述方法制備的定標(biāo)液在黏膜長久性標(biāo)記中應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確定標(biāo)液的有效性和安全性和標(biāo)記存在的長期性，具有如下特點(diǎn)(1)作為注射至活體體內(nèi)較長期存留的標(biāo)定液，可較長久性標(biāo)記，且安全無毒副作用，符合國家標(biāo)準(zhǔn)；(2)本發(fā)明的定標(biāo)液存留時(shí)間長，可超過復(fù)診期(一年以上)，完全滿足胃鏡隨訪活檢取樣的要求；(3)本發(fā)明的定標(biāo)液不干擾影響組織病理觀察，不影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)和黏膜層形態(tài)、腸上皮化生等癌前病理變化的識(shí)別，不影響對正常組織形態(tài)的判斷。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使用pH測定器(825MP，F(xiàn)isherScientific,Pittsburgh,PA)對各種稀釋度的印度墨汁測定pH值。碳含量的測定用元素分析法進(jìn)行(元素分析儀器:ThermoFi皿igan，型號FlashEA1U2)。圖l是本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。圖2是1:10改良印度墨汁定標(biāo)后15個(gè)月病理表現(xiàn)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1本發(fā)明提供的一種新型的胃黏膜定標(biāo)液，由醫(yī)用印度墨汁原液與無菌注射用水配制成體積比l:IO的濃度，外觀呈黑色懸膠液，均勻一致，無塊狀物或沉淀，pH值為8.2，含碳量0.60%。按定標(biāo)液的醫(yī)學(xué)要求并參考國內(nèi)外醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)，對各種定標(biāo)液原料進(jìn)行篩選，最后我們選擇印度墨汁的原液(Pelikan,Hanover,Germany)為德國原裝進(jìn)口，質(zhì)量符合歐洲藥品標(biāo)準(zhǔn)。原液主要成分為碳，乙烯乙二醇、四硼酸鈉十水化合物及氨水。實(shí)施例2根據(jù)最低濃度、最小劑量、最長時(shí)間和最清晰顯示的原則進(jìn)行制備定標(biāo)液。所用的定標(biāo)液為醫(yī)用印度墨汁。印度墨汁原液震蕩搖勻后，在無菌環(huán)境下用無菌注射用水稀釋至i:io，i:ioo，i:iooo的濃度，裝入玻璃小瓶。用流通蒸汽法濕熱滅菌(IO(TC，30分鐘)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)外觀應(yīng)呈黑色懸膠液，均勻一致，無塊狀物或沉淀。pH值中性，使用pH測定器(825MP，F(xiàn)isherScientific,Pittsburgh,PA)對各種稀釋度的印度墨汁測定pH值。碳含量的測定用元素分析法進(jìn)行(元素分析儀器:ThermoFinnigan，型號FlashEA1112)。醫(yī)用印度墨汁一一稱重一一8(TC烘干48h—一干燥器內(nèi)冷卻一一稱重一一元素分析以l:10稀釋的印度墨汁3ml為例，分析檢測結(jié)果如下樣品濕重4.1515g樣品干重0.0555g元素分析結(jié)果碳44.55%，氫3.62%，氮4.17%。碳含量分析C%=(0.0555x0.4455/4.1515)xl00=0,60%表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具體操作-由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院制劑室研究，初步確定定標(biāo)液的生產(chǎn)工藝。(一)、安培的洗滌1.取割頸圓口曲頸易折中性硬質(zhì)玻璃安培(5ml/支)用常水沖洗內(nèi)外壁二遍，除去浮塵。2.用二級反滲透水沖洗內(nèi)外壁三遍，除去雜質(zhì)。3.用注射用水灌注煮沸10(TC30min后趁熱甩干(讓玻璃表面的磷酸鹽水解微量的游離堿和金屬離子溶解，使安培的化學(xué)穩(wěn)定性提高)4.用注射用水加噴射氣水洗滌法洗滌每支安培，甩干后排列于潔凈的搪瓷方盤內(nèi)。(二)、干燥滅菌16(TC干熱滅菌2小時(shí)備用。(三)、配制取IndiaInk按1:10的比例用新鮮注射用水稀釋至刻度。(四)、灌裝無菌操作法，精確分裝于5ml安培內(nèi)，2.5ml/支(五)熔封以拉封法嚴(yán)密封口。(六)成品滅菌流通蒸氣滅菌，IOO'C，30min(七)檢漏減壓法檢漏(八)貼簽、包裝。實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證定標(biāo)液的性能、有效性和安全性研究不同濃度、不同劑量的定標(biāo)液的清晰度及引起的局部組織學(xué)反應(yīng)情況。明確合適的定標(biāo)液濃度和劑量、標(biāo)記的有效性、長期性和安全性。全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在邵逸夫醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為國家三級醫(yī)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。1、新西蘭大白兔實(shí)驗(yàn)材料與方法-采用開腹手術(shù)的方式定標(biāo)。新西蘭大白兔，雌性成年，體重2-2.5公斤。共6只兔子。兩只一組，組內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件一致，組間劑量不等。按每點(diǎn)注射定標(biāo)液的劑量不同分為A、B、C三組，每點(diǎn)A組0.3ml，B組0.5ml，C組0.7ml。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前空腹8小時(shí)以上。耳緣靜脈注射麻醉下，備皮，消毒，鋪巾開腹手術(shù)，沿大彎側(cè)分層切開胃壁全層，仔細(xì)觀察胃黏膜的情況，然后用定標(biāo)活檢鉗直視下在胃竇、胃體的前壁和后壁各取一點(diǎn)，分別注射不同濃度的印度墨汁(原液，1:10，1:100，1:1000)并取活檢。直接觀察定標(biāo)活檢鉗注射的深度和活檢樣本的大小，結(jié)果見表2。復(fù)查時(shí)間標(biāo)定后1周，2周，l月，6月，12月共5次。復(fù)査方式開腹手術(shù)直接觀察。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果標(biāo)定時(shí)發(fā)現(xiàn)由于新西蘭大白兔的胃壁較薄，定標(biāo)活檢鉗注射時(shí)有時(shí)深達(dá)肌層或槳膜下。1周和2周復(fù)查時(shí)發(fā)現(xiàn)印度墨汁原液注射，引起2處活動(dòng)性炎癥及肉芽組織增生。另外由于術(shù)后觀察需再次開腹，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷大。3次手術(shù)后動(dòng)物死亡率高，也不符合正常人體的情況后停止對新西蘭大白兔的定標(biāo)試驗(yàn)。結(jié)論印度墨汁的原液不適合直接定標(biāo)注射。2、家豬實(shí)驗(yàn)材料與方法健康家豬一只，2月齡，40公斤，雌性。常規(guī)飲食喂養(yǎng)。定標(biāo)后胃鏡定期復(fù)查，定標(biāo)后滿15個(gè)月后處死并取病理標(biāo)本。模擬人體胃鏡途徑定標(biāo)活檢。術(shù)前準(zhǔn)備(1)空腹8小時(shí)以上。(2)麻醉和固定用氯胺酮(0.1g-0.4g)和硫賁妥鈉(0.4g-1.5g)分次腹腔注射麻醉。取左側(cè)臥位將豬的四肢固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用開口器將口腔打開，用特制的含牙墊的條狀木塊橫置于口腔，以固定口墊，防止滑脫。用含消泡劑的利多卡因膠漿灌胃后進(jìn)行胃鏡檢査。(3)實(shí)驗(yàn)操作過程電子胃鏡經(jīng)口、食管進(jìn)入胃，先將定標(biāo)活檢鉗插入活檢孔道，定好目標(biāo)，張開活檢鉗，將針頭刺入黏膜下，注射定標(biāo)液同時(shí)回拉手柄閉合活檢鉗。定標(biāo)活檢共9點(diǎn)，每點(diǎn)定標(biāo)液的濃度和劑量各不相同。在胃竇小彎、胃竇大彎、胃竇后壁的黏膜下層各注射2點(diǎn)印度墨汁(2點(diǎn)間隔5cm)，近端點(diǎn)每點(diǎn)0.5ml，遠(yuǎn)端點(diǎn)每點(diǎn)o.7mi。印度墨汁濃度分別為i:io，i:ioo,i:iooo。在胃體小彎、胃體大彎、胃體后壁的黏膜下層各注射1點(diǎn)印度墨汁，每點(diǎn)0.3ml，印度墨汁濃度分別為i:io，i:ioo,i:iooo。結(jié)果參見表3、圖l和圖2。參見圖i，將i:io稀釋的印度墨汁通過內(nèi)窺鏡注射針直接注射到豬胃黏膜下層(1)，并分別在l個(gè)月(2)、6個(gè)月(3)和15個(gè)月(4)胃鏡復(fù)査l:IO印度墨汁定標(biāo)點(diǎn)的標(biāo)記情況，并取定標(biāo)相應(yīng)位置胃黏膜活檢，病理觀察定標(biāo)后的組織學(xué)變化(9);同期還進(jìn)行了l:IOO的改良印度墨汁的定標(biāo)觀察(5，6，7，8)。圖l中A:1:10改良印度墨汁定標(biāo)后；B:1:10改良印度墨汁定標(biāo)后l個(gè)月；C-1:10改良印度墨汁定標(biāo)后6個(gè)月；D:1:10改良印度墨汁定標(biāo)后15個(gè)月；E:1:100改良印度墨汁定標(biāo)后；F:1:100改良印度墨汁定標(biāo)后l個(gè)月；G:1:100改良印度墨汁定標(biāo)后6個(gè)月；H:1:100改良印度墨汁定標(biāo)后15個(gè)月；參見圖2:是15個(gè)月胃鏡復(fù)查1:IO印度墨汁定標(biāo)點(diǎn)的標(biāo)記情況，并取定標(biāo)相應(yīng)位置胃黏膜活檢，病理觀察定標(biāo)后的組織學(xué)變化。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(4)觀察指標(biāo)及胃鏡復(fù)査時(shí)間定標(biāo)后1天，3天，l周，l個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月，12個(gè)月，15個(gè)月復(fù)査胃鏡，其中3天，1周，1月時(shí)取定標(biāo)點(diǎn)組織送病理學(xué)檢査。觀察定標(biāo)活檢鉗的操作性能和定標(biāo)液的性能。觀察指標(biāo)包括(1)定標(biāo)液對活檢標(biāo)本的影響標(biāo)本重量，大小，深度以及是否滿足組織學(xué)檢查的要求(0=不夠，1=較好，2=很好)。由資深的病理醫(yī)生對活檢標(biāo)本的大小、深度及是否滿足組織學(xué)檢査的要求幾方面做出評價(jià)(表4)，該醫(yī)生對標(biāo)本來源情況不知。(2)定標(biāo)活檢鉗單次操作時(shí)間和傳統(tǒng)方法操作時(shí)間。定標(biāo)液性能包括定標(biāo)的清晰度和病理學(xué)組織反應(yīng)。清晰度及病理學(xué)組織反應(yīng)描寫見表5。表4_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果-(1)滿15個(gè)月后，豬體重上升至約120公斤，生長發(fā)育良好，實(shí)驗(yàn)按期終止，處死動(dòng)物。(2)定標(biāo)后ld，3d,l周，l個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月，12個(gè)月，15個(gè)月復(fù)査胃鏡，3d，l周，l個(gè)月同時(shí)復(fù)査病理。結(jié)果如表。內(nèi)鏡下定標(biāo)活檢后15個(gè)月時(shí)內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)印度墨汁1:10，0.5ml的濃度和劑量能達(dá)到清晰度與炎癥反應(yīng)均較理想，未出現(xiàn)壞死性炎、血管周圍炎、肉芽腫等嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。清晰度及炎癥反應(yīng)程度與注射劑量及濃度相關(guān)，同樣濃度時(shí)劑量越大，炎癥反應(yīng)越重。僅1:100濃度0.3ml注射的炎癥反應(yīng)較同樣濃度0.5ml者重。結(jié)果參見表6、表表6定標(biāo)后各點(diǎn)清晰度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表7定標(biāo)后各點(diǎn)炎癥反應(yīng)情況的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)論定標(biāo)液用1:10濃度的印度墨汁0.5ml定標(biāo)最佳，定標(biāo)清晰且局部組織無明顯改變。權(quán)利要求1.一種胃黏膜定標(biāo)液，其特征是由醫(yī)用印度墨汁原液與無菌注射用水分別配制成為1∶10，1∶100，1∶1000的濃度，該定標(biāo)液外觀呈黑色懸膠液，均勻一致，無塊狀物或沉淀，pH值為8-8.3，含碳量0.60％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述一種胃黏膜定標(biāo)液的制備方法，其特征是由以下步驟實(shí)現(xiàn)將印度墨汁原液震蕩搖勻后，在無菌環(huán)境下用無菌注射用水按照體積比稀釋為i:io，i:ioo，i:iooo的濃度，裝入玻璃小瓶，用流通蒸汽法10(TC，30分鐘濕熱滅菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胃黏膜定標(biāo)液在黏膜長久性標(biāo)記中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種胃黏膜定標(biāo)液，由醫(yī)用印度墨汁原液與無菌注射用水分別配制成為固定的濃度，外觀呈黑色懸膠液，均勻一致，無塊狀物或沉淀，pH值為中性，含碳量0.60％。是通過將印度墨汁原液震蕩搖勻后，在無菌環(huán)境下用無菌注射用水按照體積比稀釋，裝入玻璃小瓶，用流通蒸汽法100℃，30分鐘濕熱滅菌制得。本發(fā)明作為注射至活體體內(nèi)較長期存留的標(biāo)定液，可較長久性標(biāo)記，且安全無毒副作用，符合國家標(biāo)準(zhǔn)；可超過復(fù)診期存留，完全滿足胃鏡隨訪活檢取樣的要求；不干擾影響組織病理觀察，不影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)和黏膜層形態(tài)、腸上皮化生等癌前病理變化的識(shí)別，不影響對正常組織形態(tài)的判斷。文檔編號A61K49/00GK101406705SQ20081016249公開日2009年4月15日申請日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者姒健敏,孫蕾民,王良靜,陳淑潔申請人:杭州博通胃腸病診治技術(shù)有限公司;浙江大學(xué)