專利名稱：一種內(nèi)包裹免疫毒素外連接抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于牛物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了 一種內(nèi)包裹毒素外連 接抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米顆粒、其制備方法及用途。
背景技術(shù)：
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免疫毒素是由抗體或抗體片段和蛋白毒素(如綠膿桿菌外毒素PE)進行化學(xué) 交聯(lián)或基因融合而形成的復(fù)合物。目前，PE構(gòu)建的免疫毒素是把除去細胞結(jié)合 部分的PE和抗體片段進行基因融合而形成的。盡管PE構(gòu)建的免疫毒素在腫瘤 的臨床治療中取得了令人矚目的成就，然而，其臨床應(yīng)用仍然受限于免疫毒素 的嚴(yán)重的非特異毒性，這些非特異毒性主要表現(xiàn)為肝毒性一由于免疫毒素和正
常組織非特異性結(jié)合造成的一種非特異毒性，re構(gòu)建的免疫毒素中的毒素部分
在非特異毒性中起著重要的作用。最近人們發(fā)現(xiàn)， -些方法(如降低免疫毒素 的等電點)可以用作來降低免疫毒素的非特異毒性。此外，針對PE構(gòu)建的免疫 毒素中的毒素部分的免疫反應(yīng)是治療固體腫瘤的主要障礙，克服免疫毒素的免 疫原性的方法一般為聯(lián)合使用免疫抑制劑(CTLA4Tg或Rit:iximab)。如果能減 小免疫毒素的免疫原性和非特異毒性，我們便可以加大免疫毒素的臨床使用劑 量，從而得到更好的臨床效果。但是，除了聚乙二醇修飾免疫毒素以外，目前 很少有同時可以解決這兩個問題的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，將通常應(yīng)用于包裹小分子藥物、減少這些 藥物毒副作用的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)來包裹PE毒素，這里優(yōu)選 PE38KDEL的I型突變體:PK38KDEL I，為了增加其靶向性，本發(fā)明的發(fā)明人在 包裹了 PE38K此L工的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)表面通過碳化二亞胺技 術(shù)連接人源化SM5-1單克隆抗體的Fab'片段，得到了一種內(nèi)包裹PE38KDEL I 型突變體，外連接人源化SM5 1抗體的聚乳酸 羥基乙酸共聚物納米顆粒。
本發(fā)明的發(fā)明人利用本發(fā)明得到的內(nèi)包裹PE:化KDEL I型突變體外連接人源 化SM5-1抗體Fab'片段的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒(以下簡稱 PE-NP-S)進行了一系列的實驗，實驗結(jié)果表明PE NP-S顯示出更好的抗腫瘤活 性，而且具有更小的非特異毒性和免疫原性，對抗PE中和性抗體的敏感度更低， 達到了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的發(fā)明人還公開了制備上述納米顆粒的方法，包括首先制備包裹免 疫毒素的納米顆粒，然后在納米顆粒表面連接抗體兩個步驟。
類似地，利用本發(fā)明公開的方法，還可以連接其它完整抗體或其它人源化 抗體片段(例如Fab'片段或F(ab' h)得到外部連接上述抗體或片段的包裹了 PE38KDELI型突變體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒，這些完整抗體或人源 化抗體片段可為被腫瘤細胞內(nèi)吞的抗體或其片段，如重組人源化抗HER2單克隆 抗體(rhuMAbHER2)和重組人源化抗CD22單克隆抗體。
相應(yīng)地，利用本發(fā)明公開的方法，還可以利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物包裹 其他類型的毒素然后再在其外部連接上述的抗體或抗體片段得到各種納米顆 粒，這些毒素可以為篦麻毒素和白喉毒素之--。本發(fā)明公開的納米顆?？梢院推渌帉W(xué)上可接受的輔料 一 起組成藥物制
劑。這些藥物制劑可以用于治療腫瘤。腫瘤可以是SM5-1結(jié)合蛋白抗原表達陽 性的腫瘤，或者是HER2、 CD22表達陽性的腫瘤。
所述的治療SM5 l結(jié)合蛋白抗原表達陽性的腫瘤藥物，包括但不限于緩解或 /和減輕SM5 -1結(jié)合蛋tl抗原表達陽性的腫瘤的各種癥狀的藥物。這里所述的 SM5 - l結(jié)合蛋白抗原農(nóng)達陽性的腫瘤包拈肝癌、乳腺癌及黑色素瘤等， 優(yōu)選肝癌。
更具體地，本發(fā)明公開了
1. 一種內(nèi)包裹免疫毒素外連接抗體的聚乳酸--羥基乙酸共聚物納米顆粒。
2. 如l所述的納米顆粒，其中免疫毒素為篦麻毒素、fi喉毒素、PE38KDEL I型突變體之一，抗體為人源化抗體或人源化抗體的Fab'片段。
3. 如2所述的納米顆粒為內(nèi)包裹PE38KDEL I型突變體外連接人源化SM5-1 抗體Fab'片段的聚乳酸.羥基乙酸共聚物納米顆粒。
4. 如3所述的納米顆粒，其粒徑為70 140 nm，包裹效率為35 45 V 抗體連接效率為15 25tig /mg納米顆粒。
5. —種制備如1至4任-所述的納米顆粒的方法，包括首先制備包裹免疫 毒素的納米顆粒，然后在納米顆粒表面連接抗體兩個步驟。
6. 如5所述的方法，其中制備包裹免疫毒素的納米顆粒步驟包括
a) 將免疫毒素溶解到水性溶液中然后和聚乳酸羥基乙酸共聚物一起加入 到油性溶劑，超聲得到油包水的初乳；
b) 利用a)得到的初乳制備復(fù)乳；
c) 復(fù)乳再加入到聚乙烯醇溶液中后，攪拌使有機溶劑揮發(fā)，溶液經(jīng)過離心、水洗，低溫凍干即制得成品納米顆粒。
7. 如6所述的方法，其中歩驟a)中的水性溶液為PBS，油性溶劑為乙酸乙酯。
8. 如6所述的方法，其中歩驟a)還包括在溶解了免疫毒素的水性溶液中加 入海藻糖。
9. 如5的方法，其中在納米顆粒表面連接抗體步驟包括將包裹免疫毒素的 納米顆粒和EDC、 NHS在避光的條件下共同孵育，然后將溶于服PES (pH 7.4)
的抗體或抗體片段加入到沉淀的納米球中避光反應(yīng)而得。
10. 如1-4任一所述的納米顆粒在制備治療腫瘤藥物中的用途。
11. 如10所述的用途，其中腫瘤為SM5-1結(jié)合蛋白抗原或Her2表達陽性 的腫瘤。
12. 如11所述的用途，其中SM5- 1結(jié)合蛋白抗原表達陽性的腫瘤為乳腺癌、 黑色素瘤和肝癌。
13. 如12所述的用途，其中SM5-1結(jié)合蛋白抗原表達陽性的腫瘤為肝癌。 在本發(fā)明中，如沒有特別說明，PE-NP S指的是本發(fā)明公開的內(nèi)包裹
PE38KDEL I型突變休外連接人源化SM5 1 Fab'片段的聚乳酸- 羥基乙酸共聚物 納米顆粒，Mut-1為SM5--1單鏈抗體和PE38KDEL I突變體進行基因融合后的免 疫毒素(以下如果沒有特別說明，PE38KDEL I均指PE38KDEL I突變體，各附圖 中也均同)，PE-NP為包裹PE38KDEL I的PLGA納米顆粒，F(xiàn)ITC-PE-NP-S為FITC 標(biāo)記的PE-NP-S， PE-NP-CD25為連接anti 〔:D25的Fab，片段的PE-NP。 NP 'S 為不含免疫毒素的PLGA納米顆粒(NP)連接上SM5 l的Fab'片段。


圖1: PE-NP-S納米顆粒的形態(tài)學(xué)和粒徑分布圖，其中圖]1: PE-NP-S投 射電鏡(TEM)的形態(tài)學(xué)照片，分辨率為().2微米，圖l 2: PE NPS通過粒徑儀測 定的粒徑分布圖。
圖2:競爭結(jié)合實驗結(jié)果，其中l(wèi)Xl(TCh h印-3細胞和亞飽和濃度的F工TC 標(biāo)記的鼠源SM5-1 (mSM5-l)、逐漸增高濃度的Mi」t-1、 CD25-PE38匿L或納米顆 粒在4。C孵育1小時，細胞洗滌后用流式進行分析。最大熒光強度定義為在沒 有競爭抗體時，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠源SM5- 1對(〕h h叩3細胞進行染色得到的平均 熒光強度。所有數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。
圖3: FITC-PE-NP-S結(jié)合并被Ch h印3細胞內(nèi)吞的過程分析，Ch--h印 3細 胞在下列時間被染色0， l和30分鐘。圖3 1: Ch-h印-3細胞，孵育時間為l 分鐘，圖3-2: Ch-h印-3細胞，孵育時間為30分鐘，圖3-3: QGY7701細胞， 孵育時間為30min，其中圖3-1-1為相差，圖3-1-2為FITC的綠炎光，圖3-1-3 為4',6 二脒基-2-苯吲哚鹽酸(對細胞核進行染色)的藍熒光，圖3-1-4為重疊 圖象，圖3-2-1， 3--2'2， 3 2-3， 3 2 4及3.3-1， 3-3-2， 3-3-3， 3-3-4均同， 分辨率為10 (im。
圖4:抗PE抗體測定結(jié)果，圖4 1:鼠對PE38KDEL I的IgG反應(yīng)，5組小鼠在 箭頭所指的時間分別免疫了l mg/kg的PE NP-S， PE-NP, PE-NP-CD25， Mut-1,和 PE3服DELI，血清中抗PE TgG水平在第21天被檢測；對照組免疫PBS; *,代O. 05; 圖4-2:抗PE中和性測定結(jié)果。
圖5: Mut-工和PE-NP S對BALB/c裸鼠的抗腫瘤效應(yīng)，5 X 10'、 Ch-h印-3 細胞在第O天皮下注射到小鼠中，--旦腫瘤K到了 50min1，在第5， 7和9天(箭頭所指)，小鼠接受每天兩次的靜脈治療，每組6只小鼠。數(shù)據(jù)顯示為平均腫瘤
體積士標(biāo)準(zhǔn)差(n::6)。圖5有八個治療組，分別為PBS、 PFIDELI (5 mg/kg)、 PR-NP (5 mg/kg，按包裹的PE38KDEL I計算)+ SM5-1 Fab，(按實際抗體連 接效率弓毒素包裹效率折算，抗體量與5mg/kg劑量的PR NP CD25上連接的抗 體等量)、PE-NI〕 CD25 (5 mg/kg，包裹的Pl:i38KDI':L :1.的并連接anti CD25牟-抗 Fab'片段的PLGA納米顆粒，按包裹的PE38KDEL I計算)、PE NP -S (0. 5 mg/kg， 包裹PE38KDEL I并連接SM5 1 Fab，片段的PLGA納米顆粒，按包裹的PE38KDEL I計算)、PE-NP-S (2. 5 mg/kg，按包裹的PE38KDEL T計算)、Mut-1 (0. 5 mg/kg)、 Mut-I (5 mg/kg)。
具體實施例方式
以下實施例、實驗例僅僅對本發(fā)明進行進一歩的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā) 明的限制。
PE38KDEL I的制備、純化和分析方法見(Wang H， Song S, Kou G， et al. Treatment of hepatocellular carcinoma in a mouse xenograft model with an i咖unotoxin which is engineered to elirm'nate vascular leak syndrome. Cancer Immunol Immunother 2007; 56(11):1775…1783. Song S， Xue J， Fan K, et al. Preparation and characterization of fusion protein truncated Pse(jdomonas Exotoxin A (PE38KDEL-I) In Escherichia, coli. Protein Expr Purif 2005;44:52-7.);人源化SM5 l單克隆抗體通過Li B， Wang H, Zhang D， et al. Construction and characterization of a highaffinity humanized SM5-1 monoclonal antibody. Biochem Biophys Res Commun 2007; 357 (4) :951-6中提供的方法，用P:rote:m A杵對表達人源化SM5 1單克隆抗體的CH0細胞(中國 倉鼠卵巢癌細胞)的細胞上清進行親和層析后得到；另外，除非特別提及，本 文中的SM5-1指人源化SM5- 1 ，人源化SM5 1單克隆抗體和人源化ariti-CD25單克 隆抗體的Fab'片段的方法制備得參見Martin FJ， Hubbe:l.l WL， Papahad,jopoulos D. Immunospeci—fi.c targeting of liposomes to cells: a novel and efficient: method for (;ovalent attachment of Fab' fragments via disulfide bonds. Biochemistry 1981; 20:4229-38.;三株肝癌細胞株 Ch-h印-1， Ch-h印-3 和QGY7701公開資料參見Pr印a:ration and Characterization of PaclitaxeHoadcd PIGA Narioparticles Coated with Cationic SM5-1 Single-chain Antibody, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vo. 40， No. 5, S印tember 2007, page 731-739; PLGA (乳酸和乙醇胺的摩爾比為50: 50， RG503，分子量為40 75 kDa)購買自德國 Boehringer Inge丄heim公司;Mut I的制備方法參見:Wang H， Song S， Kou G， et al. Treatment of hepatocellular carcinoma in a mouse xenograft model with an i鵬unotoxin which is engineered to eliminate vascular leak syndrome. Cancer Immunol Iramuriother 2007 ; 56 (11) : 1775--1783; 其余化學(xué) 試劑均購自sigma，為分析級純度。 實施例l:包裹PE38KDEL I的納米顆粒PE-NP的制備
PE38KDEL工按2 mg/ml的濃度溶于PBS (pH 7. 4)，稱取15毫克的海藻糖 加入150 ul上述蛋白溶液，顛倒混勻至完全溶解后，再和40毫克的PLGA共 同加入到1. 5毫升的乙酸乙酯屮，在冰浴中超聲15秒(功率為1.4瓦)(Branson Sonicator 450)得到初乳。然后，2毫升的聚乙烯醇(分子量25-35kDa)，水溶液(質(zhì)量體積比為1%)加入到制備得到的初乳(油包水)中，再超聲15秒 (功率為14瓦)得到復(fù)乳水(油包水)。得到的復(fù)乳再加入到50毫升的聚 乙烯醇(分子量:25 35kDa)水溶液屮(質(zhì)量休積比為().3%)。最終的溶液再 攪拌8小時使有機溶劑揮發(fā)，最后制得的納米顆粒經(jīng)過離心(30000 g X 30min)， 水洗三次后，再低溫凍干(凍干過程樣品分裝至凍干瓶中，2 5ml/瓶，在一20 r條件下預(yù)凍4小時，置凍千機內(nèi)，層板溫度設(shè)定為一40"C，待樣品溫度至一 3(TC以后，開啟真空泵，凍干24小時，無菌條件下釋放真空，并取出樣品)即 制得成品納米顆粒PE NP。空納米顆粒NP的制備也是按照上述方法制備(不含 2 mg/kg的PE38KDEL 1)。
實施例2: FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的PLGA納米顆粒的制備
100 mg的PLGA溶于5毫升的無水二氯甲烷中，然后用1， 3 — 二環(huán)己基碳 二亞胺(0.7毫克)和N—羥基琥珀酰亞胺(0.4毫克)進行活化。反應(yīng)4小時 以后，副產(chǎn)品dicyclohexyliosurea用透析的方法除去(透析方法參見 Ataman-0nal， Y. ， Murder, S. ， Ganee， A. ， Terra.t:， C. , Durand， R Y. ， Battail， N. ， Ma,rtinon, F. ， Le， G. R. ， Charles, M. H. ， Delair， T. and Verrier, B. (2006) Surfactantfree anionic PLA nanopartic]es coated with HIV-1 p24 protein induced enhanced cellular and humeral immune responses in various animal models. J. Control. Release 112， 175-185.)。透析后，在上述反 應(yīng)液中加入0. 7毫克氨茶堿，反應(yīng)4小時使PLGA的succinimidyl酯基團轉(zhuǎn)變 為伯胺基團，反應(yīng)完畢，加入到500毫升的的20"C預(yù)冷乙醚用沉淀法進行純化， 然后進行真空千燥(真空度20 Pa 、干燥溫度為25°C、干燥時間12小時)。 將溶于二甲亞砜(DMS0)的FITC (1.2 mg)禾n 50毫克的具有伯胺基團的PLGA(真空干燥后的產(chǎn)品)反應(yīng)。產(chǎn)物對去離子水透析(透析方法上面所述方法相
同)后，凍干。將FITC標(biāo)記的PLGA聚合物和PLGA按照1: 9的比例混合后， 按照實施例1的復(fù)乳法來制得F1TC標(biāo)記的PLGA納米顆粒F工TC PE NP。 實施例3:靶向納米顆粒的制備
1毫升的PLGA納米顆粒(實施例1產(chǎn)品P1': NP)溶液(5 yg/ul， PE-NP溶于 pH 6. 3的10 mM NaHJ〕a水溶液)禾口 10y 1 的 50 rag/ral EDC
(1-ethyl-3--(3-dimethylaminopropyl)-'carbodiiniide) 7JC溶液、10 u 1的50 mg/ml NHS (N-hydroxysuccinimide)水溶液共同避光孵育20分鐘后，30000g離 心10分鐘后除去卜.清，然后將溶于50 mM HEPES緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸， 4一- (2—hydroxyerhyl) pipe:razirie'」1-一 erhar)esulfonic acid) (pH 7. 4)白勺SM5國—1 或anti--CD25 Fab' (1 y g/'y 1)加入到沉淀的納米顆粒中避光反應(yīng)2小時后， 離心，水洗后制得連接抗休片段的納米顆粒PE NP S或PE NP Cl〕25。 NP-S的制備可以利用實施例l得到的NP經(jīng)過實施例3的步驟得到。 FITC-- PE-NP-S的制各可以利用實施例2得到的FITC-PE-NP通過實施例3的步 驟得到。 實驗例
除非特別說明，以下實驗例均利用上述實施例得到的產(chǎn)品進行實驗 實驗例1:包裹效率、平均粒徑和粒徑分布測定
被PLGA納米顆粒包裹進去的PE38KDEL I的百分比為包裹效率，每毫克納 米顆粒中PE38KDEL I的含藥量為PE38KDEL I的載藥量，抗體片段連接效率為 每毫克的PLGA納米球連接的抗體片段的質(zhì)量，包裹效率、PE38KDEL I的載藥量 和抗體片段連接效率都是通過Micr。BCA protein assay kit (Pierce, Rockford，IL)按說明書方法-進行測定(()f.ra Ber、ny， Maayan Duvshani Eshet， Theresa Cargioli， Lorenzo Bello, Andreas Bikfalvi， Rora S. Carroll, andMarcelle Mach丄uf, Continuous Delivery of Endogenous Inhibitors from Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) Polymeric Microspheres —Inhibits Glioma Tumor Growth, Clinical Cancer Research 2005; 768 (U) : 768 76)。納米顆粒的 平均粒徑和粒徑分布是由粒徑儀Zeta Sizer 3000HS (Ma]vern， UK)測定的。納 米顆粒的表面形態(tài)和粒徑是通過投射電鏡JE()L 2010 Transmission Electronic Microscopy觀'J定白勺。
結(jié)果PE-NP-S的包裹效率為41.8 ± 2.3%， PE38KDEL I的載藥量是8. 5 ± 0.2 ug/mg，抗休連接效率是19. 4 ± 2. 4 iig SM5-1的Fab' /mg納米顆 粒(mean ± SD; n = 4)。通過Zel:a Sizer 3000HS粒徑儀測量，PE-NP-S的平 均直徑為107.7 ± 30.9 ran (mean ± SD; n : 10)。通過透射電鏡TEM的觀察， 我們發(fā)現(xiàn)PE-NP-S的形狀為圓形，而且粒徑分布比較狹窄為107. 67 ± 27, 6 nm， 見圖1。
對于PE-NP-CD25進行上述實驗也得到了相同的結(jié)果。 實驗例2:競爭性結(jié)合的結(jié)合和內(nèi)吞活性實驗
競爭性結(jié)合實驗lXl(TCh-hep--3細胞和亞飽和濃度的FITC標(biāo)記的鼠源 SM5-1(制備方法參見U. Trefzer, N. Rietz， Y. Chen， H. Audring, G. Herberth， P. Siegel, S. Reinke， P. Koniger, S. Wu， J. Ma， Y. Liu， H. Wang, W. Sterry, Y. Guo, SM5-1: a new monoclonal antibody which is highly sensitive and specific for melanocyt丄c lesions, Arch. Dermato丄.Res. 292 (2000) 583 - 589.)和逐漸增高濃度的鼠源SM5-1、 Mut -T或PE-NP-S在4"C孵育1小時，同時以CD25-PE38KDEL、 PE NP CD25作為陰性對照。細胞通過離心洗滌以后用 流式細胞儀進行分析。流式細胞儀結(jié)果用FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose， CA)來分析。競爭者的ICM (半數(shù)抑制濃度)用四參數(shù)算 法來計算，結(jié)果見圖2，結(jié)果表明PE-NP-- S和Mut I都可以競爭性阻斷鼠源SM5-1 結(jié)合Ch-hep-3細胞，意味著它們都保留r特異性結(jié)合SM5 J結(jié)合蛋白抗原的 能力。PE-NP-S的親和力(平均IC5o士SD，n二3)為0.40 ± 0.02呢/ml，大大高于 Mut陽I的親和力(16.47 ± 2.69 (ig/ml)，而和鼠源SM5-1的親和力(0.32 ± 0.03 嗎/ml)相似，意味著把SM5-1的Fab'抗體片段連接到納米顆粒上沒有改變它的 結(jié)合活性，最大熒光強度定義為在沒有競爭抗體時，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠源SM5-1對 Ch-hep-3細胞進行染色得到的平均熒光強度。
結(jié)合和內(nèi)吞實驗通過共聚焦顯微鏡來測定Ch-h印-3細胞和PE-NP-S在37 。C孵育0， l或30分鐘，然后用PBS洗滌兩次，用10毫升的4XPFA(多聚甲醛) 固定30分鐘。最后，細胞用Leica TCS SP2 Corifoca] Spectral Microscope (UV-VIS)進行拍照，照片用Leica共聚焦軟件分析，結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示通 過l分鐘的孵育，F(xiàn)ITC的熒光僅僅在Ch-h印-3細胞表面被檢測到(圖3-1)， 在孵育30分鐘以后，F(xiàn)ITC熒光可以在Ch-h印-3細胞胞質(zhì)內(nèi)可以清楚的被檢測 到(圖3-2)。然而，在SM5-1結(jié)合蛋白抗原表達陰性的細胞株QGY7701，則沒 有檢測到任何FITC熒光(圖3-3)。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人利用PE-NP和PE-NP-CD25進行了同樣的實驗，實 驗結(jié)果表明PE-NP和PE-NP-CD25與PE-NP--S結(jié)果相反，表明其均不能結(jié)合到細 胞表面抗原從而不能被Ch hep-3細胞內(nèi)吞。
本發(fā)明的發(fā)明人利用另外一株SM5-1結(jié)合蛋白抗原表達陽性的細胞株Ch-hep-1也得到了與上述實驗相似的結(jié)果。 實驗例3:體外細胞毒性實驗
二株肝癌細胞在96孔板中以1 X 107孔的密度在37°C， 7. 5XC02中培養(yǎng) 24小時后，和PE-NP-S、 Mut--1或PE38KDEL I 、 PE--NP + SM5 -1 Fab' 、 PE-NP-CD25 在37。C共孵育兩天，藥物中PE38KDEL 1的濃度為丄到10， 000 pM。細胞生存率 用細胞效價非放射性細胞增殖試劑盒(Cell Titer 96 non--radioactive cell proliferation assay kit, P畫ega， Madison, WI， USA)來進行測定。簡要 地說，20 til of MTS/PMS溶液加到每個孔中，在37-C孵育兩個小時以后，用 全自動定量繪圖酶標(biāo)儀在490 nm波長進行讀數(shù)，結(jié)果見表1。
"數(shù)據(jù)顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3).
表1顯不，高表達SM5-1結(jié)合蛋白抗原的Ch -h印-3細胞對PE-NP-S最敏感 (IC鄧二 32. 39 pM)。中度表達SM5-1結(jié)合蛋白抗原的Ch-h印-1細胞對PE-NP-S 也比較敏感(IC5。 = 82. 26 PM)。然而，表達SM5-1結(jié)合蛋白抗原陰性的QGY7701 細胞對PE-NP-S相當(dāng)不敏感 〔IC,W 〉2000 pM)。對Mut-1來說，我們得到了相 似的結(jié)果，這意味著PE-NP-S和Mut-工對表達SM5--1結(jié)合蛋白抗原的乳腺癌細 胞株的特異性結(jié)合活性對細胞毒性起著關(guān)鍵性作用。和Mut-1比起來，PE-NP-S 對Ch-h印-3細胞的細胞毒性更大(PE-NP-S的IC'5。為32.39 ± 5.36 pM，而 Mut-I的IC,。為82.26 ± 9.58 pM (mean ± SD);兩者具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，
表1藥物對肝癌細胞株的IC5G (pM)
IC50 (pM)
gGY7701
>2000代0.05)(表1)。在Ch-h印-l細胞中也得到了相似的結(jié)果。然而，PE-NP和SM5-1 的Fab，的混合物(SM5-1的Fab'量和結(jié)合到PE-NP-S上的SM5-1的F油'的 量一樣)、PE-NP-CD25對這二株細胞株有非常高的工C:，。值，意味著PE-NP-S的細 胞毒性是依賴結(jié)合在納米顆粒上的SM5 -1的Fab'，而不是游離的SM5-1的Fab'。
本發(fā)明的發(fā)明人同時也利用未包裹PE38KDEL I的NP和NP -朋R進行了上述 的細胞毒性實驗，結(jié)果表明未包裹PE38KDELI，這些納米顆粒幾乎無細胞毒性。 實驗例4:非特異毒性和肝臟酶實驗
8只雌性BALB/c小鼠靜脈注射200 u 1劑量逐漸提高的藥物，在兩個星期 內(nèi)觀察動物的死亡率。U^,定義為殺死50%的動物需要的PE38KDEL I的劑量， 是通過trimmed Spearman-Karbar統(tǒng)計方法來得出。肝臟損害則通過對血漿中 ALT的酶活性來進行定量分析(上海生物制品研究所提供的ALT檢測試劑盒檢 測)。不同劑量的藥物通過靜脈注射的方式注射入BALB/c小鼠，幾乎所有的死 f:均發(fā)生在注射3天之內(nèi)，Mut-1和PE38KDEL I的LD.^值為11.56 mg/kg，相 反的是，PLGA包裹的PE38KDEL I則能夠很好的被小鼠耐受PE-NP-'S， PE-NP 和PE-NP-CD25的LDs(,值為52. 79 mg/kg。為了評估PLGA包裹PE38KDEL I的肝 臟毒性，小鼠在接受各種藥物的靜脈注射以后(劑量為5 mg/kg PE38KDEL 1)， 在3小時和24小時我們收集了血樣品，PLGA包裹的PE38KDEL I的劑量指的是 PE-NP在37°C中24小時釋放PE38KDEL I的累積量，在注射Mut-'I和PE38KDEL I 以后，血漿中的ALT水平顯著增加，然而，在注射等量的PE-NP-S， PE-NP和 PE-NP-CD25以后，ALT的血漿水平?jīng)]有顯著改變。 實驗例5:抗PE抗體測定實驗
小鼠對PE38KDEL I的IgG反應(yīng)實驗24只雌性BALB/c小鼠( 20 g)分為6組，每組在第1、 14天時腹腔免疫1 mg/kg的PE38KDEL I，血樣在第天 免疫后在第21天收集。ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)平板用PE38KDEL I進行包 被后，通過ELISA來測定血清中對PE38KDEL I的特異性IgG抗體。測定抗體是 連接HRP(辣根過氧化物酶)羊抗鼠IgG抗體(Zymod Lab， San Francisco, CA)， DAB (3,3' 二氨基聯(lián)苯胺)用作反應(yīng)底物。第1天免疫以后的第21天收集血清 樣品，用ELISA來測定血清中的鼠抗PE38KDEL I IgG抗體水平，PE-NP-S、 Mut--1: 及相關(guān)對照品的測定也同，結(jié)果見圖4-1,結(jié)果顯示，PE NP-S和Mut-I相比其 吸光度有統(tǒng)計學(xué)差異，PE38KDEL I和Miit- I的產(chǎn)生了.高滴度的抗PE38KDEL I IgG。 相反的是，PENP-S的免疫原性則很低。
抗PE中和性實驗是用SM5-l結(jié)合蛋白抗原表達陽性的乳腺癌細胞株來進行 在96孔板中每孔接種1X1(T Ch-h印-3細胞，在37"C孵育24小時。第二天，小鼠 免疫l mg/kg PE38KDEL I (在第l,， 14和28天分別免疫一次)后收集的第42天的 血漿樣品在56i:熱滅活30分鐘后，用培養(yǎng)液十倍比稀釋。200 pM PE-NP-S或者 Mut-1 (PE38KDEL I劑量)加到每個稀釋血漿樣品后孵育30分鐘后，將混合物和 各種對照都加入到Ch-h印 3細胞中，在37。C繼續(xù)孵育48小時，細胞生存率用細 胞效價非放射性細胞增殖試劑盒(Promega， Madison, WI， USA)來進行測定， 結(jié)果見圖4-2，結(jié)果表明Mut--I對C:h-h印-3的細胞毒性能被抗PE中和性血清劑量 依賴性抑制。特別的，禾[J200pMMut-:1、未稀釋的中和性血清共孵育的Ch-h印3 的細胞生存率為98%，這意味著Mut-I的細胞活性完全被消除了。然而，PE-NP-S 對Ch-h印-3的細胞毒性則沒有被抗PE中和性血清顯著影響(數(shù)據(jù)顯示為平均值 土標(biāo)準(zhǔn)差(n :二 4). ***，.代O. 001; PE-NP-S和Mut. I組的細胞生存率的比較顯 示出統(tǒng)計學(xué)差異(two-sample individual t test))。在Ch--h印l細胞中我們也得到了相似的結(jié)果。
同時，我們也用ELISA來證實了抗PE中和性血清不能中和SM5-1或SM5-l的
F油'。
實驗例6:抗腫瘤活性實驗
5 X ](f Ch -h印 3細胞在第0天皮下注射到MLB/c:裸鼠( 20 g)中， 在第5天腫瘤體積達到了 50 mm:1。從第5天開始，小鼠開始接受靜脈注射藥物， 在第5， 7,和9天進行，每天兩次。共有八個治療組，分別為PBS、 PE38KDEL1 (5mg/kg)、PE-N:P(5mg/kg) 聯(lián)合SM5-1Fab， (5. 25 mg/kg) 、PE NP-CD25 (5mg/kg)、 PE-NP…S (0. 5 mg/kg) > PE-NP-S (2. 5 mg/kg) 、 Mut-1 (0. 5 ing/kg)、 Mul:I (5mg/kg)，每組都有6只老鼠，腫瘤每5夭用游標(biāo)卡尺測量 一次，共觀 察40天。腫瘤體積=(寬2X長)/2。所有的老鼠都來自上海屮科院，老鼠放 在無病原微生物的環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)--星期以后再用作實驗小鼠。
實驗結(jié)果見圖5，實驗結(jié)果表明Mut :I和PE-NP -S對腫瘤的抑制顯示出劑量 依賴性。對于完全的腫瘤消退，定義為完全的腫瘤消失達50天。我們發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/kg X 6的Mut-1可以使1只小鼠完全腫瘤消退。在5mg/kg X 6的Mut-1 治療組，在6只小鼠中我們觀察到了完全的腫瘤消退。然而，PE-NPS的抗腫瘤 活性得到了極大的提高；在0.5mg/kg X 6的PE--NP-S治療組，有2只小鼠完 全腫瘤消退；而在2. 5mg/kg X 6的PE-NP-S治療組，所有的小鼠達到了完全 的腫瘤消退；這些數(shù)據(jù)清楚的顯示了提高免疫毒素治療劑量的有效性。相反， 高達5 mg/kg PE38KDEL I的對照藥物治療沒有任何抗腫瘤活性。這些數(shù)據(jù)顯示 /給更髙免疫毒素治療劑量的有效性。
綜合上述實驗例，可以看出，PE--NP-S禾口 Mut-1對小鼠的毒性PE-NP-S的LD「，',為52. 79 mg/kg，而Mut-1的LD「v,為U. 56 mg/kg，注射5 rag/kg的PE-NP-S 沒有引起肝臟明顯的損害，相反，5mg/kg的Mut I對肝臟有嚴(yán)重的損害，這些 結(jié)果提示PE38KDEL :[通過PLGA包裹后，其毒性大大減小。另夕卜，PE-NP-S比 Mut-i有更小的免疫原性，而且在體外對抗PE中和性抗體更加不敏感，抗PE 抗體測定證實了和抗PE中和性血清共孵育后，PE-NP-S的對SM5-1結(jié)合蛋白抗 原陽性的肝癌細胞株的細胞毒性沒有被明顯影響，相反，Mut-1則完全喪失了它 的細胞毒性。此外，在預(yù)免疫PE38KDEL I、長有高表達SM5-1結(jié)合蛋白抗原肝 癌小鼠中的PE-NP-S和Mut-1的抗腫瘤活性中，盡管在血循環(huán)中存在抗PE中和 性抗體，PE-NP S仍然顯示出強大的抗腫瘤活性，而Mut-I則沒有。PE-NP-S減 少的敏感性可能是由于PLGA的包裹和它的快速內(nèi)吞。PE-"NP-S對SM5 1結(jié)合蛋 白抗原有特異性的結(jié)合，而且?guī)缀跬耆籗M5-1結(jié)合蛋白抗原陽性腫瘤細胞內(nèi) 吞。由于選擇性的內(nèi)吞，PE-NP--S可以有效的引起SM5-1結(jié)合蛋白抗原陽性細胞 死亡，而對SM5-〗結(jié)合蛋白抗原陰性細胞毒性較小。PE -NP-S選擇性殺傷SM5 1 結(jié)合蛋白抗原陽性細胞的原因是納米顆粒表面的SM5-1抗體片段介導(dǎo)了內(nèi)吞， 然后納米顆粒巾的藥物釋放出來殺傷細胞。對SM5-1結(jié)合蛋白抗原陽性肝癌細 胞株的細胞毒性比Mut-1更大是因為靶向納米顆粒比免疫毒素具有更高的轉(zhuǎn)運、 結(jié)合能力。體內(nèi)抗腫瘤實驗證實了 PE-NP-S的抗腫瘤活性是Mut-1的兩倍，另 外，PE-NP-S的體內(nèi)毒性是Mut-1的1/5;所以> PE-NP-S的治療效率提高了 10 倍。PE-NP--S有效的抗腫瘤效應(yīng)的機制可能是由于靶向納米顆粒的雙相轉(zhuǎn)運在 第 一相轉(zhuǎn)運中，納米顆粒的在腫瘤組織中緩慢聚集，而且由于增強的滲透和滯 留效應(yīng)，納米顆粒在腫瘤組織的濃度會得到進一步提高；在第二相，通過配體--
受體互相作用，靶向納米顆粒結(jié)合并被腫瘤細胞內(nèi)吞。關(guān)于re靜-S的組織分布的進一步研究則在進行中。另外，納米顆粒的粒徑對其在體內(nèi)的分布起著重
要的作用。100 200mii的納米顆粒可以逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，在體內(nèi)的循 環(huán)時間達到最長。通過復(fù)乳溶劑蒸發(fā)法，得到了平均粒徑為107.67 ± 27.6 nm 的PE NP S，具有長循環(huán)的特征。更為重要的是，本發(fā)明的發(fā)明人選擇了 t葉u扁〕SM5 l結(jié)合蛋白抗原的Fab'片段，而不是完整的抗體來作為PE -NP-S的 靶向分子，這也可以減少腫瘤相關(guān)巨噬細胞對納米顆粒的吞噬，而且納米顆粒 對實體瘤的滲透也更加廣泛。
本發(fā)明的發(fā)明人還對本發(fā)明中公開的PE-NP-S進行了體外釋放實驗(體外 釋方夂實馬僉參照、Gaspar MM， Blanco D， Cruz ME， Alonso MJ. Formulation of I. 'aspamgjna.se-loaded poly (lactidc-co-glycolide) nanopa:rt.:i cles: -jn.nuerice of polymer properties on enzyme loading, activity and [,_//:ro release. J Control Release 1998;52:53--62.進行)，實驗結(jié)果顯示1小時以 后，僅僅2. 9%的PE38KDEL I從PE-NP中釋放出來，使得中和性抗體不太可能 完全中和PE，因為接種PE構(gòu)建的免疫毒素后，動物會引起抗PE免疫反應(yīng)， PE-NP- S對中和性抗體減小的敏感性可以增加重復(fù)應(yīng)用藥物的有效性，這些研究 為克服針對PE38KDEL I的中和性抗體提供了有益的嘗試。PE-NP-S有更小的免 疫原性，原因可能為納米顆粒的粒徑較小，100 200nm的納米顆粒更少被巨噬 細胞吞噬，而巨噬細胞吞噬在激活免疫反應(yīng)方面起著重要的作用。
總之，PE-NP-S顯示出更好的抗腫瘤活性，而且具有更小的非特異毒性和免 疫原性，對抗PE中和性抗體的敏感度更低。 對照例包裹蛋白的生物學(xué)活性實驗
利用與實施例1相同的方法(只是沒有加入10%海藻糖或加入其它添加劑(如]%甘油，]%PEG400)替代海藻糖)得到的PE-NP與利用實施例1的制備 方法得到的PE-NP進行了包裹蛋白的生物學(xué)活性實驗(實驗方法參見用Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System體外蛋白翻譯試劑盒測定蛋白的生物學(xué) 活性(Promcga公司))，未包裹的PE38KDEL的ICW)值(半數(shù)抑制濃度)為4. 76 ±2.25 pmol (mean ± SD， n —」3)，而包裹后的PE38KDEL的ICS"值為4.99 ±2.96 praol (mean ± SD， n 二 3)， P〉 0.05，兩者比較沒有顯著性差異，表 明利用實施例1的制備方法得到的PE-NP提取出來的PE38KDEL I保持了和未包 裹的PE38KDEL I相似的活性。而對于沒有加入10%海藻糖或加入其它添加劑(如 1%甘油，1%PEG400)替代海藻糖利用實施例1相同的方法得到的PE--NP，提取 得到的PE38K!〕RL .[的活性和未包裹的PE38KDEL :f相比，其活性均大大降低。
本發(fā)明的發(fā)明人按照實施例中公開的方法得到了內(nèi)包裹蓖麻毒素外連接 人源化SM5 1抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒，取得了和上述試驗例一 致的抗腫瘤效果。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人還利用包裹PE38KDEL I型突變體的聚乳酸-羥基乙 酸共聚物連接抗Her2的人源化單克隆抗體的Fab'片段用于治療Her2表達陽性 的腫瘤，也獲得了與本發(fā)明目的一致的良好的治療效果。
權(quán)利要求
1. 一種內(nèi)包裹免疫毒素外連接抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒。
2. 權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中免疫毒素為篦麻毒素、白喉毒素、PE38KDEL I型突變體之一，抗體為人源化抗體或人源化抗體的Fab'片段。
3. 權(quán)利要求2所述的納米顆粒為內(nèi)包裹re38KDEL :1型突變體外連接人源化 SM5-i抗體Fab'片段的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒。
4. 權(quán)利要求3所述的納米顆粒，其粒徑為70 140 nm，包裹效率為35 45 %， 抗體連接效率為15 25yg /mg納米顆粒。
5. —種制備權(quán)利要求:1罕:4任一所述的納米顆粒的方法，包括首先制備包裹免 疫毒素的納米顆粒，然后在納米顆粒表面連接抗體兩個步驟。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中制備包裹免疫毒素的納米顆粒步驟包括a) 將免疫毒素溶解到水性溶液屮然后和聚乳酸羥基乙酸共聚物一起加入到油 性溶劑，超聲得到油包水的初乳；b) 利用a)得到的初乳制備復(fù)乳；c) 復(fù)乳再加入到聚乙烯醇溶液中后，攪拌使有機溶劑揮發(fā)，溶液經(jīng)過離心、水 洗，低溫凍干即制得成品納米顆粒。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟a)中的水性溶液為PBS，油性溶劑為乙酸 乙酯。
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟a)還包括在溶解了免疫毒素的水性溶液中 加入海藻糖。
9. 權(quán)利要求5的方法，其中在納米顆粒表面連接抗體步驟包括將包裹免疫毒素 的納米顆粒和EDC、 NHS在避光的條件下共同孵育，然后將溶于HEPES (pH7.4)的抗體或抗體片段加入到沉淀的納米球中避光反應(yīng)而得。
10. 權(quán)利要求l-4任一所述的納米顆粒在制備治療腫瘤藥物中的用途。
11. 權(quán)利要求10所述的用途，其中腫瘤為SM5 1結(jié)合蛋白抗原或Her2表達陽 性的腫瘤。
12. 權(quán)利要求ll所述的用途，其中SM5 l結(jié)合蛋白抗原表達陽性的腫瘤為乳腺 癌、黑色素瘤和肝癌。
13. 權(quán)利要求12所述的用途，其中SM5 1結(jié)合蛋1二—l抗原表達陽性的腫瘤為肝癌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種內(nèi)包裹毒素外連接抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米顆粒、其制備方法及用途。本發(fā)明公開的內(nèi)包裹PE38KDEL I型突變體外連接人源化SM5-1抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物具有抗腫瘤活性高、非特異毒性和免疫原性小、對抗PE中和性抗體的敏感度低的優(yōu)點，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K47/48GK101450215SQ20081017793
公開日2009年6月10日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者庚 寇, 李博華, 皓 王, 郭亞軍, 潔 高 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司