專利名稱：抗霍亂弧菌、其毒素雞卵黃抗體及其制備與應用的制作方法
(二)、技術背景霍亂是由霍亂弧菌所引起的烈性腸道傳染病。發(fā)病急、傳播快，是亞洲、非洲大部分地區(qū)腹瀉的重要原因?？砂l(fā)生世界性大流行，屬國際檢疫傳染病。在我國《傳染病防治法》中列為甲類?；魜y的傳染源是病人和帶菌者，帶菌者和輕癥病人遠較典型(中、重型)病人為多，因此霍亂更具隱蔽性，控制和消除的難度也更大。這也可能是霍亂世界性大流行迄今未能控制的重要原因之一。人群對霍亂普遍易感，感染后是否發(fā)病取決于人體免疫狀態(tài)(抵抗力)及感染病原菌的數(shù)量。本病隱性感染占75％，即無癥狀者，顯性感染(有癥狀者)占25％。因此霍亂的治療措施一直是人們關注的領域，目前主要治療措施是補液療法和抗菌藥物治療，而在預防的研究中主要是采用口服滅活菌苗、口服減毒基因工程菌苗和自然減毒活菌苗等措施，但目前所用菌苗的效果均不理想，較為有效的腸道免疫制劑目前正在研究之中。
霍亂病原菌(包括古典生物型霍亂弧菌、埃爾托生物型霍亂弧菌流行株、O139群霍亂弧菌)具有獨特的分子生物學特征和毒力特性?；魜y發(fā)病機制是霍亂病原菌進入人體小腸后，粘附于腸道粘膜，大量繁殖并產(chǎn)生致瀉極強的腸毒素(CT)。CT由A、B兩個亞單位組成，其結構組成為一個A亞單位(CTA，Mr27.2×103)，位于毒素的中心部位，周圍連接5個呈環(huán)狀的B亞單位(CTB，Mr11.6×103)，B亞單位可以和小腸粘膜細胞上的GM1受體結合，有利于A亞單位進入細胞發(fā)揮毒性作用；A亞單位可以激活胞內的腺苷環(huán)化酶，使胞內cAMP濃度升高，細胞分泌增加，大量腸液積聚，形成嚴重的水樣腹瀉綜合癥，故CT毒素分子是霍亂弧菌的主要致病因子。
雞卵黃抗體(IgY)是來自雞血清的IgG(免疫球蛋白G)，IgY的結構與IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空間構象。研究表明IgY具有高度的穩(wěn)定性，對熱、酸、堿環(huán)境中具有優(yōu)良的耐受性，同時IgY還具有成本低、易于形成規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點。目前國內已有病毒、細菌等顆粒性抗原誘導雞卵黃表達特異性抗體的研究報告。
現(xiàn)有技術中未見有通過采用霍亂弧菌及其毒素作為抗原，免疫健康母雞，收集其所產(chǎn)的卵，再從卵中提取抗-VcIgY和抗-CTIgY方法的報道。
(三)、發(fā)明的內容本發(fā)明通過以Vc或提取Vc細胞毒素蛋白CT，以它們?yōu)榭乖?，免疫健康產(chǎn)蛋母雞，提取活性成分(抗-VcIgY、抗-CTIgY、抗-CTIgY)。為治療Vc感染提供一條新思路和新方法，并為進一步制備抗Vc的免疫生物制劑奠定基礎。因此本發(fā)明所要解決的技術問題之一是針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種具有抗體活性的抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)。
本發(fā)明所要解決的技術問題之二是提供上述抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術問題之三是提供上述抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)在制備用于因感染霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病的預防或治療的藥物制劑或保健品應用，以及在制備用于霍亂弧菌的臨床診斷或檢測的檢測試劑的應用。
本發(fā)明解決上述技術問題之一所提供的抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)，其特征在于所述抗-VcIgY、抗-CTIgY按YSDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western-blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰單一的特異性酶染條帶；用紫外分光光度計進行雙波長測定以計算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明解決上述技術問題之二是通過采用這樣的技術方案實現(xiàn)的，即一種制備抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗-VcIgY、抗-CTIgY)的方法，其特征在于采用如下的步驟完成1.制備Vc菌體抗原產(chǎn)霍亂病原菌(古典生物型霍亂弧菌、埃爾托生物型霍亂弧菌流行株、O139群霍亂弧菌)菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37C培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集菌體的Vc菌液，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
2.制備CT毒素抗原(1)提取法①.Vc細胞株的培養(yǎng)產(chǎn)霍亂病原菌菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集培養(yǎng)上清，通過超濾和親和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得CT毒素抗原。
②.毒性蛋白的制備A.超濾法根據(jù)已經(jīng)知道的CT的分子量(78000)、采用膜過濾的方法制備。B、層析分離法參考Kelstein等的方法，采用親和層析柱分離提取CT毒素，最后冷凍干燥保存。
或(2)合成法構建含有CT細胞毒素A亞單位和B亞單位的基因表達質粒，在大腸桿菌系統(tǒng)中進行表達，表達產(chǎn)物經(jīng)分離純化，制備CT毒素A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)毒素，單獨CTB或按重量比1∶1混合作為免疫抗原，加入等體積的福氏佐劑，乳化混勻得CT毒素抗原。
3.將菌體抗原和CT毒素抗原按以下的步驟制備抗體(1).對產(chǎn)卵母雞的免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)。進行雞皮下多點注射，如五點，菌體為109CFU/ml，毒素蛋白量相當于1010CFU/ml細菌所產(chǎn)生。以后每兩周加強免疫一次，共計免疫8次；于7天后開始收集雞蛋，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> (2).卵黃抗體的提取①.采用水溶法提取卵黃抗體。從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調整適當PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-VcIgY、抗-CTIgY?；颌诓捎媚み^濾法提取卵黃抗體。分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質，冷凍干燥得到抗-VcIgY、抗-CTIgY。
本發(fā)明所提供的上述抗-VcIgY和抗-CTIgY產(chǎn)品由霍亂弧菌及其毒素免疫產(chǎn)卵母雞而得，具有特異性，對防治霍亂弧菌感染引起的烈性腸道傳染病具有良好的效果。本發(fā)明采用母雞所產(chǎn)雞卵為載體，安全無毒，易于產(chǎn)業(yè)化。
(四)、附圖
的說明附圖給出了本發(fā)明制備方法的工藝流程圖。
實施例2Vc菌體抗原的制備，產(chǎn)霍亂病原菌菌株，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h。收集菌體的Vc菌液，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。
實施例3細胞毒素CT抗原的制備，分離得到產(chǎn)毒素的CT菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，通過超濾和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得CT毒素抗原。
實施例4構建含有CT細胞毒素A亞單位和B亞單位的基因表達質粒，在大腸桿菌系統(tǒng)中進行表達，表達產(chǎn)物經(jīng)分離純化，制備CT毒素A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)毒素，單獨CTB或按重量比1∶1混合作為免疫抗原，加入等體積的福氏佐劑，乳化混勻得CT毒素抗原。
實施例5采用如下方式分離提取抗-VcIgY和抗-CTIgY從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調整適當PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-VcIgY和抗-CTIgY。
實施例6分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質，冷凍干燥得到抗-VcIgY和抗-CTIgY。
實施例7取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY純度檢查用PAGE電泳檢測純化的卵黃抗體的純度，電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶，即為提純的卵黃抗體。
實施例8取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY濃度檢查將提取的用PBS作5-10倍的稀釋，然后用紫外分光光度計進行測定以計算出蛋白濃度。
蛋白濃度(mg/ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)實施例9取實施例1、5、6中的產(chǎn)品進行IgY效價測定采用奧氏雙擴散方法進行IgY效價測定，IgY效價為1∶640-1∶25600。
實施例10采集抗-VcIgY免疫蛋50個，分離得到800ml蛋黃，加水稀釋至5000ml，離心得到清液4000ml，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400ml待用，其中含有精提(即指純度在99.5％以上的IgY抗-VcIgY)12克。將麥芽糖10克加入5ml水溶解，100℃滅菌30分鐘，將處理過的輔料與50ml超濾液混合均勻，冷凍干燥，無菌粉碎包裝成袋，每小袋內含0.5克，用于治療因CT感染引起的烈性腸道傳染病。
實施例11采集抗-CTIgY免疫蛋50個，分離得到800ml蛋黃，加水稀釋至5000ml，離心得到清液4000ml，采用中空纖維超濾提取，最后濃縮至400ml待用，其中含有精提(即指純度在99.5％以上的IgY抗-CTIgY)10克。將醫(yī)用淀粉10克加入5ml水溶解，100℃滅菌30分鐘，將處理過的輔料與50ml超濾液混合均勻，冷凍干燥，無菌粉碎包裝成袋，每小袋內含0.5克，用于治療因CT感染引起的烈性腸道傳染病。
實施例12采集抗-VcIgY免疫蛋100個，得到1600ml蛋黃，加2倍PBS稀釋液，并加入3.5％PEG6000攪拌靜置2小時，離心得到清液3500ml，再加PEG6000至終濃度為12％，靜置2小時，離心收集沉淀。以100ml蒸餾水溶解IgY沉淀，通過細菌過濾器除菌，冷凍干燥，以每個普通膠囊裝200mg粗提抗-VcIgY進行灌裝，所得產(chǎn)品用于預防CT感染，人體服用方法每天2-3次，每次3粒膠囊。
實施例13采集抗-CTIgY免疫蛋100個，得到1600ml蛋黃，加2倍PBS稀釋液，并加入3.5％PEG6000攪拌靜置2小時，離心得到清液3500ml，再加PEG6000至終濃度為12％，靜置2小時，離心收集沉淀。以100ml蒸餾水溶解IgY沉淀，通過細菌過濾器除菌，冷凍干燥，以每個普通膠囊裝250mg粗提抗-CTIgY進行灌裝，所得產(chǎn)品用于預防CT感染，人體服用方法每天2-3次，每次4粒膠囊。
實施例14體外實驗①.分子量檢測SDS-PAGE電脈，分離膠長度8％，濃縮膠濃度5％，穩(wěn)流11mA電脈5h，Marker采用低相對分子質量標準蛋白質，取下凝膠用于常規(guī)銀染色法和電轉移電脈。
②.純度分析免疫印跡，參照文獻進行。
③.活性檢測ELISA間接試驗，操作方法參照常規(guī)ELISA間接法，所用抗原、抗-VcIgY(或抗-CTIgY)、酶標抗體均按棋盤滴定法確定工作濃度，毒素抗原濃度為100ug/ml，包被板每孔加樣100ml，被測抗-VcIgY濃度為5ug/ml(抗-CTIgY為8ug/ml)，每孔加樣100ml，辣板過氧化物酶標抗IgY-IgG(Sigma公司)工作稀釋度為1∶1000，底物為OPD，2ml/濃硫酸終止反應，酶標儀492nm下測定OD值。
實施例15CT細胞毒素對IEC細胞株毒性及IgY抗體保護作用①.形態(tài)學觀察正常IEC細胞呈貼壁的多形性生長，且折光良好。CT毒素作用后，細胞球形變，胞漿內出現(xiàn)多顆粒，當濃度＞50ug/ml時，IEC細胞多以裂解，殘余細胞體積明顯皺縮。透時電鏡呈現(xiàn)類似改變。
②.生化檢測通過測定細胞MTT、LDH(乳酸脫氫酶)、cAMP也發(fā)現(xiàn)CT毒素作用后，MTT呈進行性下降，而LDH和cAMP濃度持續(xù)增高。
③.細胞因子(炎癥介質)的釋放IL-6(白介素-6)TNF-2(腫瘤壞死因子-2)的活性檢測，結果發(fā)現(xiàn)都有不同程度的升高。
實施例16抗-CTIgY體外拮抗毒素生物活性實驗抗-CTIgY(10ug～200ug/ml)與CT毒素(30～90ug/ml)在無菌條件下1∶1混合。37℃2h后，取0.1ml上清加入IEC細胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)IgY濃度在100～200ug/ml可完全阻斷CT毒素對IEC細胞的毒性作用；其后的系列稀釋，其保護活性亦隨之減低，顯微鏡形態(tài)學觀察亦獲得相同結果正常IEC細胞呈貼壁的多形性生長，細胞內無顆粒，且折光良好。CT毒素作用后，細胞球形變，胞漿內出現(xiàn)多顆粒，當濃度＞50ug/ml時，IEC細胞多以裂解，殘余細胞體積明顯皺縮。拮抗毒素后，細胞的形態(tài)改變減輕。
實施例17抗-VcIgY和抗-CTIgY在體生物學活性觀察參照相關文獻建立嚙齒類動物Vc感染的模型，試驗分為治療組(低劑量(10mg/Kg)、中劑量(25mg/Kg)、高劑量(50mg/Kg)抗-VcIgY)，對照組；治療10、20、30天后，觀察動物的腹瀉情況，腸粘膜病理學檢查，Vc細菌檢測和CT毒素含量測定等指標。結果發(fā)現(xiàn)中、高劑量組在治療5天后，腹瀉癥狀減輕，粘膜毒素含量明顯下降，10天后動物的腸粘膜病理學檢查指標有明顯改善，毒素含量為進一步降低。
實施例18抗-VcIgY和抗-CTIgY與抗生素聯(lián)合應用生物學活性觀察參照相關文獻建立嚙齒類動物Vc感染的模型，試驗分為單純抗-VcIgY治療組、單純抗-CTIgY治療組、單純抗生素(復方磺胺甲噁唑)治療組、聯(lián)合組。治療5、10、15天后，觀察動物腹瀉情況，腸粘膜病理學檢查，Vc細菌檢測和CT毒素含量測定等指標。結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組較兩單純組在治療5天后，動物的腹瀉情況，腸粘膜病理學改善、粘膜毒素含量和Vc數(shù)量均有明顯下降；單純抗-CTIgY治療組的腸粘膜毒素含量小于單純抗生素治療組和單純抗-VcIgY治療組。
權利要求
1.一種抗霍亂弧菌及其毒素的雞卵黃抗體(抗-VcIgY和抗-CTIgY)，其特征在于上述抗體按YSDS-PAGE電泳(7.5％分離膠)檢測，圖譜呈現(xiàn)單一區(qū)帶；經(jīng)電泳考馬斯亮蘭R250染色呈藍色；免疫印記Western-blotting檢測中高分子量帶處出現(xiàn)清晰單一的特異性酶染條帶；用紫外分光光度計進行雙波長測定以計算出蛋白濃度(mg/ml)為(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×稀釋倍數(shù)。
2.一種制備抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體，即抗-VcIgY和抗-CTIgY的方法，其特征在于采用如下的工藝步驟(1)制備菌體抗原產(chǎn)霍亂病原菌(古典生物型霍亂弧菌、埃爾托生物型霍亂弧菌流行株、O139群霍亂弧菌)菌株，涂布于TCBS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，得純菌種后，在TCBS肉湯培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24h；收集菌體的VC菌液，超聲波破碎，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得菌體抗原。(2)制備CT毒素抗原①.提取法產(chǎn)毒霍亂病原菌菌株在TCBS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，通過超濾和親和層析分離得到毒素，按重量比1∶1加入完全福氏佐劑，乳化得CT毒素抗原?；颌?合成法構建含有CT細胞毒素A亞單位和B亞單位的基因表達質粒，在大腸桿菌系統(tǒng)中進行表達，表達產(chǎn)物經(jīng)分離純化，制備CT毒素A亞單位(CTA)和B亞單位(CTB)毒素，單獨CTB或按重量比1∶1混合作為免疫抗原，加入等體積的福氏佐劑，乳化混勻得CT毒素抗原。(3)再將所得的菌體和CT毒素抗原按以下的步驟制備抗體①.對產(chǎn)卵母雞的免疫選用產(chǎn)卵母雞(健康)隔離飼養(yǎng)，進行雞皮下注射，菌體為109CFU/ml，毒素蛋白量相當于1010CFU/ml細菌所產(chǎn)生，以后每兩周加強免疫一次，共計免疫8次，4℃儲存?zhèn)溆?；?卵黃抗體的提取A.采用水溶法提取卵黃抗體；從免疫雞卵中分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，調整適當PH值4℃靜置8h，離心取上清濃縮、冷凍干燥，得到抗-VcIgY和抗-CTIgY；或B.采用膜過濾法提取卵黃抗體分離得蛋黃，以蒸餾水稀釋，4℃靜置12h后，以分子量為200KD和150KD的膜分別過濾，收集150KD-200KD的蛋白物質，冷凍干燥得到抗-VcIgY和抗-CTIgY。
3.抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體，即抗-VcIgY和抗-CTIgY在制備用于治療因霍亂弧菌感染引起的相關疾病藥物或保健品中的應用。
4.抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體，即抗-VcIgY和抗-CTIgY在制備用于檢測因霍亂弧菌感染引起的相關疾病的制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗體活性的抗霍亂弧菌及其毒素雞卵黃抗體(抗－VcIgY、抗－CTIgY)、制備該抗體的方法及其在制備用于治療因霍亂弧菌感染引起的相關疾病藥物或保健品中和在制備用于檢測因霍亂弧菌感染引起的相關疾病的制劑中的應用。上述抗體經(jīng)IgY純度檢查:用PAGE電泳檢測純化的卵黃抗體的純度,電泳中只出現(xiàn)一條電泳帶;用紫外分光光度計進行測定以計算出蛋白濃度(mg/ml)為:(1.45×OD
文檔編號A61P31/04GK1362418SQ0113372
公開日2002年8月7日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權日2001年12月21日
發(fā)明者陳君, 雁杰 申請人:重慶和潤實業(yè)(集團)有限公司