嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于嘔吐毒素單克隆抗體的免疫親和柱的制備方法。通過細(xì)胞融合所得到的單克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖4B偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑填充與固相萃取管中得到了可以特異性吸附嘔吐毒素的免疫親和柱。本發(fā)明制備的免疫親和柱能特異性的與嘔吐毒素結(jié)合，最大結(jié)合容量約為240ngDON；重復(fù)使用三次，回收率不低于90%。本發(fā)明可用于谷物及谷物制品檢測嘔吐毒素殘留的前處理方法。
【專利說明】嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及涉及一種嘔吐毒素的免疫親和柱的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嘔吐毒素，又稱脫氧雪腐鐮刀菌煉醇(Deoxynivalenol, DON),是于1970年從被禾谷鐮刀菌污染的玉米中分離出來的一種能引起嘔吐的毒素，主要由禾谷鐮刀菌(.Fusarium graminearum)/5^,屬單端孢霉煉族化合物B型。對熱比較穩(wěn)定,一般的烹調(diào)和加熱都不能破壞其毒性，對堿性環(huán)境比較敏感，用碳酸鈉溶液洗滌糧食，可以除掉70%左右的 DON。
[0003]動物DON中毒后表現(xiàn)為嘔吐，食欲減退，體重下降，流產(chǎn)，弱仔和死胎，死亡率增高。人類DON中毒后會出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃部不適、腹痛、腹瀉、頭痛、頭暈，還可能有口干、全身無力的癥狀，少數(shù)患者會出現(xiàn)顏面潮紅、發(fā)燒。DON還具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變的毒性、免疫毒性等危害，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為最危險的自然發(fā)生食品污染物之一。1998年，在國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評價報(bào)告中，嘔吐毒素被列為三類致癌物。
[0004]許多國家已制定了谷物中嘔吐毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國制定供人類食用的小麥嘔吐毒素允許限量≤2 mg/kg，歐盟規(guī)定谷粉及玉米粉中允許限量≤0.75 mg/kg。我國GB2715-2005《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定小麥、大麥、玉米及其成品糧中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為lOOOyg/kg，GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》規(guī)定小麥和玉米的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為1000 μ g/kg。
[0005]目前嘔吐毒素常用的檢測多為儀器檢測方法，如高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等。儀器方法檢測具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是對樣本的純度要求較高，需要經(jīng)過復(fù)雜的凈化過程，傳統(tǒng)的樣本前處理技術(shù)，如液-液萃取、固相萃取、固相微量萃取等，步驟繁瑣、缺乏選擇性、容易受其他成分干擾、準(zhǔn)確度低。而且嘔吐毒素毒性劇烈，前處理過程中操作人員反復(fù)暴露在嘔吐毒素的環(huán)境中，增加了實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險。因此建立快捷有效的樣品前處理技術(shù)已成為嘔吐毒素檢測分析中亟待解決的問題。
[0006]免疫親和色譜柱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是一種新型的樣本前處理技術(shù)，它是將免疫反應(yīng)與色譜分析方法相結(jié)合，利用抗原抗體結(jié)合的高度特異性和親和力，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑻禺愋缘目乖蚩贵w結(jié)合到層析載體上，以便有效的分離和純化各自互補(bǔ)的免疫物質(zhì)。目前已在抗體、激素、多肽、病毒以及亞細(xì)胞化合物的分析中廣泛應(yīng)用。本發(fā)明旨在提供一種嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，作為谷物及谷物制品檢測嘔吐毒素的前處理方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，所研制的親和柱是采用嘔吐毒素單克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖4B (CNBr-Sepharose 4B)偶聯(lián)后填充在固相萃取柱中，用于純化含有嘔吐毒素的待測樣品。
[0008]本發(fā)明所述的嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行:
Cl)偶聯(lián):取純化后的嘔吐毒素單克隆抗體與溶脹后的CNBr-S印harose 4B凝膠共同放置于偶聯(lián)緩沖液中，室溫下震蕩偶聯(lián)；
(2)封閉:在偶聯(lián)凝膠產(chǎn)物中加入其5~10倍體積的封閉緩沖液，室溫下震蕩反應(yīng)
2h ；
(3)洗滌:分別用5~10倍封閉后凝膠體積的醋酸鹽緩沖液和Tris-HCL緩沖液交替洗滌3次，然后用5~10倍封閉后凝膠體積的PBS緩沖液洗滌2次，制備得到免疫親和吸附劑；
(4)裝柱:將得到的免疫親和吸附劑填充到固相萃取柱中，加入PBS緩沖液后自然沉降，得到嘔吐毒素免疫親和柱，4度保存待用。
[0009]所述固相載體可以為纖維素、葡聚糖凝膠、丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等，優(yōu)選為Sepharose 4B。
[0010]所述的嘔吐毒素單克隆抗體與CNBr-S^harose 4B干粉的質(zhì)量比為1:80 ;所述的偶聯(lián)緩沖液為0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的緩沖液為1.0mmol /T, HCL0
[0011]所述的封閉緩沖液為0.1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，用以封閉未偶聯(lián)的活化位點(diǎn)。
[0012]所述的醋酸鹽緩沖液為0.1 mol/L、pH4.0的醋酸鹽緩沖液；所述Tris-HCL緩沖液為 0.1 mol/L、ρΗ8.0 的 Tris-HCL 緩沖液。
[0013]本發(fā)明制備的嘔吐毒素免疫親和柱可以用于谷物及谷物制品檢測嘔吐毒素殘留的前處理方法。具有以下顯著特點(diǎn):1)減少了操作人員接觸到嘔吐毒素的幾率；2)通過特異性的抗體與嘔吐毒素結(jié)合，一次凈化能夠去除絕大部分的干擾物；3)所制備的免疫親和柱最大結(jié)合容量為240ng DON ；4)所制備的免疫親和柱重復(fù)使用三次，回收率不低于90%。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0015]實(shí)施例1嘔吐毒素免疫親和柱的制備
(I)偶聯(lián)
取IOmg經(jīng)過辛酸-硫酸銨法純化后的針對嘔吐毒素的單克隆抗體在0.1 mol/LNaHC03溶液中透析過夜，將濃度調(diào)整至2mg/mL ；
稱取CNBr-S印harose 4B干膠800mg，在IOmL 1.0 mmol/L HCL中充分溶脹；用10倍以上濕膠體積的0.1 mol/L NaHC03溶液洗漆3次，5000rpm離心Imin ；
將濕膠與抗體充分混勻，室溫下攪拌過夜；
用50mL 0.1 mol/L NaHC03溶液洗滌，收集洗滌液，紫外鑒定，計(jì)算偶聯(lián)率。偶聯(lián)率的計(jì)算公式為:
【權(quán)利要求】
1.一種嘔吐毒素免疫親和柱的制備，其特征在于，是由固相載體和預(yù)期偶聯(lián)的嘔嘔吐毒素單克隆抗體組成，具體步驟為:
(1)偶聯(lián):取純化后的嘔吐毒素單克隆抗體與溶脹后的CNBr-S印harose4B凝膠共同放置于偶聯(lián)緩沖液中，室溫下震蕩偶聯(lián)； (2)封閉:在偶聯(lián)凝膠產(chǎn)物中加入其5~10倍體積的封閉緩沖液，室溫下震蕩反應(yīng)2h ； (3)洗滌:分別用5~10倍封閉后凝膠體積的醋酸鹽緩沖液和Tris-HCL緩沖液交替洗滌3次，然后用5~10倍封閉后凝膠體積的PBS緩沖液洗滌2次，制備得到免疫親和吸附劑； (4)裝柱:將得到的免疫親和吸附劑填充到固相萃取柱中，加入PBS緩沖液后自然沉降，得到嘔吐毒素免疫親和柱，4度保存待用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于所述的固相載體為 CNBr-Sepharose 4B。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于所述的嘔吐毒素單克隆抗體與CNBr-S印harose 4B干粉的質(zhì)量比為1:80 ;所述的偶聯(lián)緩沖液為0.1 mol/L NaHC03溶液；溶解CNBr-S印harose 4B干粉的緩沖液為1.0 mmol/L HCL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于所述的封閉緩沖液為0.1 mol/L Tris-HCL (pH 8.0)，以封閉未偶聯(lián)的活化位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嘔吐毒素免疫親和柱的制備方法，其特征在于其中步驟(3)中所述的醋酸鹽緩沖液為0.1 mol/L、pH4.0的醋酸鹽緩沖液；所述Tris-HCL緩沖液為0.1mol/L、pH8.0 的 Tris-HCL 緩沖液。
6.嘔吐毒素免疫親和柱可用于谷物及谷物制品檢測嘔吐毒素殘留的前處理方法。
【文檔編號】B01D15/38GK103801110SQ201210439205
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月7日
【發(fā)明者】杜道林, 曾昆 申請人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司