專利名稱：：用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于傷口愈合的中藥，具體涉及一種用于傷口愈合的復(fù)方兒茶制劑。
背景技術(shù)：
：目前對(duì)于治療傷口愈合的方法中，尚沒有專門用于治療傷品愈合的化學(xué)藥物，因?yàn)槌Ｓ玫奈魉幤分皇瞧渲鬃饔?，并無促進(jìn)肉芽組織生長生的作用。而傳統(tǒng)的中藥如生肌散，生肌玉紅膏，珍珠生肌散等，多用于淺表創(chuàng)傷的治療，對(duì)于深層創(chuàng)傷的療效不好；同時(shí)上述中藥達(dá)不到無菌的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能對(duì)深層創(chuàng)傷具有治療作用的用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏，并提供該軟膏的配制方法，從而解決上述問題。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏，它是由下列藥用原料配制而成兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白茨膠，原料的重量比為2:0.5-1.5:0.5-1.5:1.5~3.5:0.5~1.5:3~10。特別的所述兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠的重量比為2:0.8~1.2:0,8-1.2:1.8—2.2:0.8-1.2:4~8。特別的處方是乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠的重量比為2:1:1:2.4:1:5。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，它是將兒茶、乳香和沒藥分別粉粹后混合，或?qū)翰?、乳香和沒藥混合后粉粹；將紅參的提取物和黃芪的提取物與上述混合物進(jìn)行混合得第二混合物；將白芨膠水浸泡加熱與第二混合物混合均勻后，進(jìn)行滅菌處理得到復(fù)方兒茶軟膏。所述藥用原料兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠的重量比為2:0.5~1.5:0.5-1.5:1.5-3.5:0.5-1.5:3-10。所述紅參的提取物是乙醇回流法提出得到的提取物。所述黃芪的提取物是黃芪的水煎煮提取物。在兒茶、乳香和沒藥分別粉粹后分別通過不低于90目的過濾后在混合。特別的紅參提取物濃縮液中每毫升相當(dāng)0.04-lg生藥；黃芪提取物濃縮液中每毫升相當(dāng)0.1~2.4克生藥。該藥物中以兒茶活血散瘀，收斂止血、清熱解毒，生肌收濕為君藥，配乳香，沒藥以活血行氣止痛，消腫生肌為臣藥。佐以紅參、黃芪補(bǔ)益氣血、生肌斂瘡，以白芨收斂止血，消腫生肌為使藥，以上諸藥合用共奏活血散痹，行氣止痛，收斂消腫，收濕生肌之功效。對(duì)深層創(chuàng)傷具有優(yōu)良好促進(jìn)愈合的作用。其配制方法簡(jiǎn)單，質(zhì)量易控制，穩(wěn)定性好。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將20克兒茶、5克乳香、5克沒藥分別粉粹后，通過100目篩過濾后混合均勻待用；將15克黃芪加水90克，煎煮l次后的提取液進(jìn)行濃縮至每毫升相當(dāng)0.3g生藥待用，將紅參5克利用30克體積濃度為50%的乙醇回流提取1次后，濃縮后的提取物濃縮液提取物濃縮液每毫升相當(dāng)O.lg生藥待用。將黃芪的提取物濃縮液，紅參的提取物濃縮液與上述混合物混合均勻；將30克白芨膠水浸12小時(shí)后，加熱溶脹攪拌與上述濃縮液混合物均合均勻，制成稠膏后，利用微波滅菌得到無菌復(fù)方兒茶軟膏。實(shí)施例2將20克兒茶、8克乳香、8克沒藥分別粉粹后，通過100目篩過濾后混合均勻待用；將18克黃芪加水150克，煎煮3次后的提取液進(jìn)行濃縮至每毫升相當(dāng)0.36g生藥待用，將紅參8克利用60克體積濃度為50%的乙醇回流提取3次后，濃縮后的提取物濃縮液提取物濃縮液每毫升相當(dāng)0.16g生藥待用。將黃芪的提取物濃縮液，紅參的提取物濃縮液與上述混合物混合均勻；將40克白芨膠水浸12小時(shí)后，加熱溶脹攪拌與上述濃縮液混合物均合均勻，制成稠膏后，利用微波滅菌得到無菌復(fù)方兒茶軟膏。實(shí)施例3將40克兒茶、20克乳香、20克沒藥分別粉粹后，通過100目篩過濾后混合均勻待用；將48克黃芪加水400克，煎煮3次后的提取液進(jìn)行濃縮至每毫升相當(dāng)0.96g生藥待用，將紅參20克利用160克體積濃度為50%的乙醇回流提取3次后，濃縮后的提取物濃縮液提取物濃縮液每毫升相當(dāng)0.4g生藥待用。將黃芪的提取物濃縮液，紅參的提取物濃縮液與上述混合物混合均勻；將100克白復(fù)膠水浸12小時(shí)后，加熱溶脹攪拌與上述濃縮液混合物均合均勻，制成稠膏后，利用微波滅菌得到無菌復(fù)方兒茶軟膏。實(shí)施例4將20克兒茶、12克乳香、12克沒藥分別粉粹后，通過100目篩過濾后混合均勻待用；將22克黃芪加水170克，煎煮3次后的提取液進(jìn)行濃縮至每毫升相當(dāng)0.44g生藥待用，將紅參12克利用IOO克體積濃度為50%的乙醇回流提取3次后，濃縮后的提取物濃縮液提取物濃縮液每毫升相當(dāng)0.24g生藥待用。將黃芪的提取物濃縮液，紅參的提取物濃縮液與上述混合物混合均勻；將160克白芨膠水浸12小時(shí)后，加熱溶脹攪拌與上述濃縮液混合物均合均勻，制成稠膏后，利用微波滅菌得到無菌復(fù)方兒茶軟膏。實(shí)施例5將20克兒茶、15克乳香、15克沒藥分別粉粹后，通過100目篩過濾后混合均勻待用；將70克黃芪加水560克，煎煮3次后的提取液進(jìn)行濃縮至每毫升相當(dāng)1.4g生藥待用，將紅參15克利用120克體積濃度為50%的乙醇回流提取3次后，濃縮后的提取物濃縮液提取物濃縮液每毫升相當(dāng)0.3g生藥待用。將黃芪的提取物濃縮液，紅參的提取物濃縮液與上述混合物混合均勻；將200克白茨膠水浸12小時(shí)后，加熱溶脹攪拌與上述濃縮液混合物均合均勻，制成裯膏后，利用微波滅菌得到無菌復(fù)方兒茶軟膏。將上述無菌復(fù)方兒茶軟膏進(jìn)行檢測(cè)(1)理化鑒別①本品多種成分中含有還原性多糖，如白芨膠，乳香，沒藥，黃芪提取濃縮液和紅參提取濃縮液，故Fehling反應(yīng)和Molish反應(yīng)都呈陽性，現(xiàn)象容易觀察，但很多種中藥材中都含有還原性多糖，陰性對(duì)照干擾大，故此反應(yīng)鑒別意義不大。②取本品0.5g，加乙醇40ml，加活性炭少許，攪拌混勻，振搖，濾過，濾液加新配制的香草醛試液1~2滴，即顯紫紅色，此法為樹脂的特征鑒別反應(yīng)，可鑒別制劑中含樹脂的藥材沒藥、乳香和兒茶。(2)色鐠鑒別①兒茶鑒別取本品一支，加乙醚30ml，超聲處理10min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。再取不含兒茶的陰性樣品10g，同法制得陰性對(duì)照溶液。另取兒茶素對(duì)照品和表兒茶素對(duì)照品，加曱醇制成每mL各含0.2mg作為對(duì)照品溶液。照薄層色語法(ChP2005版一部附錄VIB)試驗(yàn)，取上述溶液5pL，對(duì)照溶液2iaL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-曱醇-乙酸乙酯(4:1:l)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以對(duì)二曱氨基苯甲醛溶液,于卯。C加熱5min,見供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色斑點(diǎn)，不含兒茶的陰性對(duì)照無干擾。②黃芪鑒別取本品三支，加乙醇30mL,加熱回流20min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?.3。/。NaOH溶液15mL^f吏溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5~6,用乙酸乙酯15mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含HU的陰性樣品25g,同法制得陰性對(duì)照溶液。再取HU對(duì)照藥材2g,同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色鐠法(ChP2005版一部附錄VIB)試—瞼，吸取上述兩種溶液各10pL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(10:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色i普中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。不含黃芪的陰性對(duì)照無干擾。③紅參鑒別取本品3支，力卩乙醇100ml,超聲15min，過濾，濾液蒸干，加水飽和正丁醇10min,超聲5min,取上清加3倍量的氨試液，搖勾，放置分層，取上層液蒸干，殘?jiān)訒醮糽mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含紅參提取液的陰性樣品25g,同法制得陰性對(duì)照溶液。再取紅參皂苷Rbl、紅參皂苷Re、紅參HS急香Rf、紅參皂苷Rgl對(duì)照品，加甲醇制成每lmL各含2mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色謙法(ChP2005版一部附錄VIB)試-驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各1~2pL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-曱醇-水(15:40:22:10)10。C以下放置后的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105。C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。5.檢查應(yīng)符合軟膏劑項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定(中國藥典2005版一部附錄IR)。此外，由于本軟膏是用于深度創(chuàng)傷，和肌肉組織接觸，故對(duì)其pH值也進(jìn)行;險(xiǎn)查。(l)粒度取本品適量，置于載玻片上,涂成薄層,覆以蓋玻片，共涂三片，照粒度測(cè)定法(中國藥典2005版一部附錄XIB第一法)測(cè)定.測(cè)定結(jié)果見表1表1粒度檢查試驗(yàn)數(shù)據(jù)批號(hào)U80um粒子0705200705240705221100%100%100%2100%100%100%100%100%100%由上表可以看出，三批制劑均未檢出大于180um的粒子，符合中國藥典2005版一部附錄IR軟膏劑粒度檢查項(xiàng)下規(guī)定。(2)pH值取本品，稱取5g,加入5mL水稀釋，按中國藥典2005版一部附錄VHG測(cè)定其pH值，要求pH值在4~7。三批制劑的測(cè)定結(jié)果見表2表2pH值測(cè)定試驗(yàn)數(shù)據(jù)批號(hào)07052007052207052414.654.674.6824.634.684.6734.644.694.66(3)無菌按中國藥典2005年版一部附錄XIIIB檢查。結(jié)果見表3表3復(fù)方兒茶軟膏無菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>6、含量測(cè)定本制劑處方中兒茶為君藥，所以選擇兒茶所含的有效成分兒茶素和表兒茶素作為本制劑的含量測(cè)定對(duì)象。中國藥典2005版一部規(guī)定兒茶中含兒茶素和表兒茶素總量不得少于21.0%，本品含兒茶0.4g/支，故本品的含量限度為本品每支含兒茶以兒茶素(C16H1408)和表兒茶素(C16H1408)總量計(jì)，應(yīng)不得少于84mg。(1)方法的選擇根據(jù)中國藥典2005版一部兒茶中兒茶素和表兒茶素含量測(cè)定方法，選擇高效液相法作為制劑兒茶素和表兒茶素含量測(cè)定方法.(2)選擇依據(jù)①測(cè)定波長的選擇a.根據(jù)中國藥典2005版一部兒茶含量測(cè)定項(xiàng)下HPLC法，選擇280nm作為測(cè)定波長.b.紫外掃描:將標(biāo)準(zhǔn)品按中國藥典2005版一部兒茶素和表兒茶素含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備方法，配制成含兒茶素和表兒茶素20ug/ml的溶液，在190nm-800nm范圍掃描，本品在280nm和230.lnm處有最大吸收峰，考慮到230.1nm處有溶劑的末端吸收，對(duì)流動(dòng)相的選擇要求更嚴(yán)格，所以選擇才企測(cè)波長為280nm。②色譜條件色鐠柱DiamonsiLTMQi柱(4.6*250mm,5—;流動(dòng)相曱醇-0.04M檸檬酸溶液一N,N-二曱基曱酰胺(13:45:8);流速lmL.min-1;4全測(cè)波長280nm;柱溫35°C;進(jìn)樣量20|aL。③系統(tǒng)適應(yīng)性取復(fù)方兒茶軟膏、不含兒茶的軟膏(陰性對(duì)照)及對(duì)照品兒茶素和表兒茶素按"2.8，，項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和對(duì)照品溶液，按上述色鐠條件分別進(jìn)樣20pL,記錄色譜圖，結(jié)果理論塔板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算不低于3000;兒茶素和表兒茶素與軟膏中其他物質(zhì)得到很好的分離，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定成分無干擾。線性關(guān)系；晴密稱取兒茶素和表兒茶素對(duì)照品10.50mg和6.60mg，50%甲醇溶解定容于50mL容量瓶，搖勻，精密吸取此液各0.5mL、lmL、2mL、3mL、4mL、5mL,分別置于10mL容量瓶，50%曱醇定容，搖勻，即得兒茶素和表兒茶素對(duì)照品溶液。取20pl注入高效液相色語儀中，記錄色譜圖，結(jié)果見表4和表5。將濃度與主峰面積進(jìn)行回歸，得兒茶素和表兒茶素線性方程分別A=0.2714C-0.1391，r=0.9994;A=0.2439C+0.1,r=0.9996。線性范圍分別為10.5~105fig.mL—1和6.6~66ng.mL—1。表4兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=6)C(pg/ml)10.5214263841052.7635.452511.006516.811223.257228.0346A2.76325.536711.025416.751223.192527.95782.83155.611411.208116.781423.449428.0384A平均值2.78595.533511.0816.781223.29928.0103RSD1.42%1.44%1.01%0.18%0.57%0.16%表5表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=6)C(pg/ml)6.613.226.439.652.8661.68213.3136.41279.680413.3716.0731.70983.37266.43259.603813.2616.044A1.73793.41586.51799.640113.15616.0589A平均值1.70993.36716.45449.641413.26216.0586RSD1.63%1.53%0.87%0.40%0.81%0.09%⑤檢測(cè)限和定量限:分別配制兒茶素和表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液,繼續(xù)用50%曱醇稀釋兒茶素稀釋到濃度為0.525ug/ml時(shí)，A為噪音信號(hào)的10倍，進(jìn)樣量是20ul,那么本法測(cè)定兒茶素的定量限為10.5ng;稀釋到0.1525ug/ml,A約為噪音信號(hào)的3倍，則本法測(cè)定兒茶素的檢測(cè)限為3.15ng.同理測(cè)得表兒茶素的定量限為13.2ng，；險(xiǎn)測(cè)限為3.96ng。(3)樣品的含量測(cè)定①對(duì)照品溶液的制備精密稱取兒茶素和表兒茶素對(duì)照品適量，50%甲醇溶解定容，即得。②供試品溶液的制備精密稱取本品適量，用曱醇20mL轉(zhuǎn)移溶解至25mL容量瓶，超聲10min，甲醇定容，搖勻，過0.45|iim濾膜，取續(xù)濾液5mL于10mL容量瓶，純凈水定容，搖勻，即得供試品溶液.③測(cè)定法:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20jil注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中兒茶素和表兒茶素的含量。見表6表6三批樣品兒茶素和表兒茶素素含量測(cè)定三批樣品兒茶素和表兒茶素素含量測(cè)定主峰面積平均峰面積RSD/%總含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>13.81000.81486.26670.5141對(duì)照16.20120.51236.20860.51410.880.376.〗5780.516114.12971.2898對(duì)照214.05861.314614.11941.29640.401.2314.11941.2964將上述無菌復(fù)方兒茶軟膏進(jìn)行藥理研究l.復(fù)方兒茶軟膏皮膚用藥安全性試驗(yàn)(1)皮膚急性毒性試驗(yàn)?zāi)康挠^察豚鼠完整皮膚及破損皮膚短時(shí)間接觸復(fù)方兒茶軟膏后所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。方法①完整皮膚急性毒性試驗(yàn)取上述豚鼠20只，依體重隨機(jī)分為2組，每組10只，A組復(fù)方兒茶軟膏；B組基質(zhì)。給藥前24hr，用電推剪將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積約為40cm2。24hr后，將受試物分別均勻涂布于各組對(duì)應(yīng)去毛區(qū)的皮膚上，給藥量為lg/只。涂藥后24hr,用溫水洗去殘留藥液，而后1、24、48、72hr至第七日每天觀察，觀察內(nèi)容為動(dòng)物的全身中毒表現(xiàn)和死亡情況，包括動(dòng)物皮膚、毛發(fā)、眼睛和粘膜的變化，呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等的變化。若有死亡動(dòng)物則進(jìn)行尸檢，當(dāng)有肉眼可見病變時(shí)，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。②破損皮膚急性毒性試驗(yàn)取豚鼠20只，稱取體重，按上述方法去毛、分組后，用砂紙將去毛消毒皮膚磨破以滲血為度，再按上述方法噴藥并觀察，觀察內(nèi)容與完整皮膚急性毒性試驗(yàn)組相同。結(jié)果觀察期內(nèi)，動(dòng)物皮膚、毛發(fā)、眼睛和粘膜及呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等均正常。未見動(dòng)物死亡，體重正常增加，與對(duì)照組比較，無明顯差異。(2)皮膚刺激性試驗(yàn)?zāi)康挠^察豚鼠完整皮膚及破損皮膚多次接觸復(fù)方兒茶軟膏后所產(chǎn)生的局部刺激反應(yīng)。方法取上述豚鼠12只，用電推剪將背部脊柱兩側(cè)去毛，去毛面積左右各約為12cm2。觀察24hr無刺激反應(yīng)后，按體重隨機(jī)分為2組，每組6只，雌雄兼用，其中一組進(jìn)行完整皮膚刺激性試驗(yàn)，另一組進(jìn)行破損皮膚刺激性試驗(yàn)，破損方法采用砂紙將去毛消毒皮膚磨破，以磨破表皮而不出血為度。給藥方法均為各組豚鼠左側(cè)脫毛區(qū)涂以0.5g復(fù)方兒茶軟膏，右側(cè)涂以0.5g基質(zhì)，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用粘貼手術(shù)巾固定，8hr后用溫水洗去殘留物。每日一次，連續(xù)給藥7天，每次去除藥物后lhr以及再次涂抹前觀察刺激情況。末次敷藥后，在去除藥物后1、24、48、72hr肉眼觀察皮膚刺激情況，并按《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算平均值，按"皮膚刺激性強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)"進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果給藥后，完整皮膚及破損皮膚組左右兩側(cè)皮膚未見明顯紅斑及水腫現(xiàn)象，各時(shí)間點(diǎn)刺激反應(yīng)平均分值均為0分，按刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷，屬無刺激性。結(jié)果見表7表7復(fù)方兒茶軟膏對(duì)豚鼠皮膚刺激反應(yīng)結(jié)果結(jié)、、、時(shí)果間\^完整皮膚受試物完整皮膚基質(zhì)破損皮膚受試物破損皮膚基質(zhì)1天00002天0011給3天0011藥4天0011中5天00116天00117天0011停lhr0011<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(3)皮膚過敏試驗(yàn)(BT)目的通過動(dòng)物皮膚重復(fù)涂抹復(fù)方兒茶軟膏后，觀察機(jī)體免疫系統(tǒng)在動(dòng)物皮膚上的反應(yīng)。方法取上述豚鼠30只，雌雄各半，稱其體重，于試驗(yàn)前一日用電動(dòng)推剪將其背部去毛(面積3x3cm2)。觀察24hr，驗(yàn)證脫毛區(qū)無紅斑、水腫、破損后，將動(dòng)物分為三組，各組10只。第一組為復(fù)方兒茶軟膏組，第二組為基質(zhì)組，第三組為陽性對(duì)照組。試驗(yàn)時(shí)取上述受試物，1%DNCB、基質(zhì)，按約0.2g/只劑量分別均勻噴布于相應(yīng)組別脫毛區(qū)左側(cè)，然后用二層紗布和一層玻璃紙覆蓋，再用粘貼手術(shù)巾固定，持續(xù)6hr后，用溫水洗去殘留物，第7天和第14天，以同樣方法各重復(fù)一次，共計(jì)三次。末次后第13天，將動(dòng)物肋腹部去毛，方法及面積同背部，次日，以背部給藥相同方法、劑量，于肋腹部脫毛區(qū)涂以相應(yīng)受試物、0.1%DNCB、基質(zhì)6hr后用溫水清洗殘留物，然后觀察1小時(shí)并于第24、48、72hr后觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，并按《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中皮膚過敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和皮膚過敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分和皮膚過敏性評(píng)價(jià)，同時(shí)觀察動(dòng)物是否有哞喘，站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)。結(jié)果觀察結(jié)果表明，受試物組及基質(zhì)組在激發(fā)給藥后的觀察期內(nèi)，豚鼠皮膚反應(yīng)正常，無紅斑、水腫，也無哮喘、站立不穩(wěn)及休克現(xiàn)象，致敏率為0%,按標(biāo)準(zhǔn)判定為無皮膚過敏性反應(yīng)。DNCB組動(dòng)物在各^見定時(shí)間點(diǎn)，均表現(xiàn)有明顯過敏反應(yīng)，有明顯的紅斑水腫，反應(yīng)率為100%，試驗(yàn)結(jié)果見表8表8復(fù)方兒茶軟膏豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0000.74.93.0100結(jié)論在上述試驗(yàn)條件下，復(fù)方兒茶軟膏及對(duì)照用復(fù)方兒茶軟膏按2g/只劑量對(duì)正常豚鼠皮膚及破損皮膚給藥，觀察期內(nèi)，均未見明顯急性毒性反應(yīng)。多次給藥對(duì)豚鼠正常皮膚及破損皮膚無刺激性。對(duì)動(dòng)物不產(chǎn)生局部及全身過敏反應(yīng)。2.創(chuàng)傷模型的制備及創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察機(jī)械性創(chuàng)傷修復(fù)模型常用的有兩種，一種是動(dòng)物背部切割傷模型，其實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察皮膚以及組織愈合后的抗撕裂強(qiáng)度、定量觀察創(chuàng)面肉芽組織的生成總量，以及創(chuàng)面肉芽組織中RNA、DNA......等含量變化；另一種模型是動(dòng)物背部全層皮膚切除模型，用于評(píng)價(jià)藥物療效和觀察創(chuàng)傷愈合的自然過程[13]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃u(píng)價(jià)復(fù)方兒茶軟膏的療效，以及探討其促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用機(jī)理，因此選用動(dòng)物背部全層皮膚切除模型。fl《動(dòng)物分組隨機(jī)分為4組，編組為高劑量組(100%)、中劑量組(50%)、低劑量組(25%)、陽性對(duì)照組(EGF)。每組各8只。分籠飼養(yǎng)。fl動(dòng)物模型的制備大鼠背部剪毛，10%硫化鈉脫毛，溫水洗凈，拭干。次日，用1%戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，在背部肩胛稍靠后，離脊柱兩側(cè)1.5cm處，各標(biāo)記一直徑1.6cm的圓形切口線。經(jīng)捵伏消毒皮膚后，用剪刀沿標(biāo)記線剪除全層皮膚至筋膜，形成兩個(gè)圓形創(chuàng)面，制成全層皮膚切除模型[14]。fi給藥方法左側(cè)為陰性對(duì)照側(cè)，右側(cè)為給藥側(cè)。模型制備2h后給藥，陰性對(duì)照側(cè)給O.lml生理鹽水，陽性組給0.1mlEGF,高、中、低劑量組用藥量均為0.4ml。然后用兩層紗布覆蓋包扎，再用粘貼手術(shù)巾固定。每創(chuàng)面給藥l次/天，連續(xù)3天，換藥前以生理鹽水沖洗創(chuàng)面。稱觀察指標(biāo)和方法①創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察每次清洗創(chuàng)面后，肉眼觀察創(chuàng)面情況，觀察肉芽組織生長情基質(zhì)100DNCB103.4況。②創(chuàng)面愈合率圓形全層皮膚切除后2h,用消毒的半透明稱量紙貼于創(chuàng)面，沿創(chuàng)緣劃線，用CAD軟件計(jì)算所測(cè)面積，作為傷口的原始面積。于術(shù)后第3、7天測(cè)傷口殘留面積，計(jì)算愈合率。愈合率=愈合面積/創(chuàng)口原始面積。結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察術(shù)后第1天，基本上每組的傷口都有滲液，有的有出血情況，僅高劑量組和低劑量組各有一只動(dòng)物給藥側(cè)傷口有少量肉芽生長，其余傷口均尚未開始愈合，觀察不出四組的區(qū)別。術(shù)后第7天，所有傷口均收縮明顯，創(chuàng)面干燥結(jié)痂。EGF組術(shù)后第2天，給藥側(cè)傷口干燥，無滲出，創(chuàng)面基底部可見鮮紅色的肉芽組織；對(duì)照側(cè)傷口與第1天相比無明顯變化，創(chuàng)面有較多滲液。術(shù)后第3天，給藥側(cè)表皮生長明顯，但基本無肌肉增生，愈合面低于正常皮膚；對(duì)照側(cè)傷口有滲液。高劑量組術(shù)后第2天，給藥側(cè)傷口有大量肉芽生長，創(chuàng)面鮮紅，滲出液基本消失，創(chuàng)面干燥；對(duì)照側(cè)傷口與第l天相比，無明顯變化，創(chuàng)面有較多滲液。術(shù)后第3天，給藥側(cè)傷口已完全被肉芽組織填充，表面呈顆粒狀，肉芽組織較堅(jiān)實(shí)，愈合面略低于正常皮膚；對(duì)照側(cè)傷口有滲液。中劑量組術(shù)后第2天，給藥側(cè)傷口有大量肉芽生長，創(chuàng)面鮮紅，滲出液基本消失，創(chuàng)面干燥；對(duì)照側(cè)傷口與第l天相比無明顯變化，創(chuàng)面有較多滲液。術(shù)后第3天，給藥側(cè)傷口肉芽生長量比高劑量組少，創(chuàng)面呈顆粒狀，愈合面高度低于正常皮膚(高度小于高劑量組);對(duì)照側(cè)有少許肉芽生長，長出白色皮膚組織(高度小于給藥側(cè))。低劑量組術(shù)后第2天，給藥側(cè)傷口均有少許肉芽生長，創(chuàng)面微紅，無滲液；對(duì)照側(cè)也有2只有生長情況，但肉芽生長量不及給藥側(cè)。術(shù)后第3天，給藥側(cè)與對(duì)照側(cè)均有愈合現(xiàn)象，但肉芽生長量不明顯，給藥側(cè)生長高度低于中劑量組?？傮w來說，兩側(cè)傷口生長情況無明顯區(qū)別。不同給藥組愈合率的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，比較給藥側(cè)與自身對(duì)照側(cè)的愈合率；采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，比較各給藥組的愈合率。結(jié)果見表9和表10表9復(fù)方兒茶軟膏對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表10各給藥組與EGF組愈合率比較結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注l-高劑量組，2-中劑量組，3-低劑量組，4-EGF組由上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，中劑量組和陽性對(duì)照組與自身對(duì)照相比，愈合率差異顯著(P<0.05);高劑量組與自身對(duì)照相比，愈合率差異有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);低劑量組與自身對(duì)照相比愈合率無顯著差異(P>0.05)。各給藥組與陽性對(duì)照組比較，高劑量組與陽性對(duì)照組的差異顯著(P<0.05)，中劑量組和低劑量組與陽性對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。由此可見，高劑量和中劑量的復(fù)方兒茶軟膏與EGF都能顯著的促進(jìn)傷口愈合，但低劑量的復(fù)方兒茶軟膏對(duì)傷口愈合的意義不大。討論創(chuàng)面愈合過程隨著組織創(chuàng)傷的開始而發(fā)動(dòng)。在傷后3天內(nèi)，主要是局部炎癥反應(yīng)，伴隨著修復(fù)細(xì)胞由靜止轉(zhuǎn)為激活形成最初的肉芽，3天后主要是肉芽組織大量增生。皮膚創(chuàng)面愈合率是衡量皮膚創(chuàng)面愈合快慢的中藥指標(biāo)。本研究采用大鼠背部全層皮膚圓形切除模型證實(shí)，創(chuàng)面局部使用本制劑可有效地提高創(chuàng)面愈合率，與生理鹽水組比較，有較顯著的差異。3.創(chuàng)面組織學(xué)觀察取大鼠創(chuàng)面新生組織，制作常規(guī)病理組織學(xué)切片，光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)創(chuàng)面的愈合情況。(1)標(biāo)本取材及處理分別于術(shù)后第4、7天，以鋒利手術(shù)刀取皮膚創(chuàng)緣及周圍0.5cm左右寬的組織，深達(dá)皮下組織，將組織塊置于10%中性緩和曱醛中固定5天后,常規(guī)石蠟包埋備用，將蠟塊常規(guī)脫水，包埋,切成5fam切片后作HE染色。(2)HE染色步驟①石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟5~10min,然后投入100%,95%，90%,80%,70%,50。/。等各級(jí)酒精各35min,再入蒸餾水3min;②蘇木精染液15~30min;③自來水沖洗變藍(lán)；④含1%HCL的70%酒精分色至粉紅色；⑤自來水沖洗變藍(lán)；⑥蒸餾水，50%,70%,80%，90。/。酒精各3min;⑦入^f尹紅染液染色lmin;⑧入100%酒精lmin⑨二曱苯透明，封片。染色結(jié)果普通顯微鏡下觀察，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色，膠原纖維呈紅色。(3V見測(cè)指標(biāo)和方法光鏡觀察皮膚及肉芽組織結(jié)構(gòu)改變,并在400倍光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞，取5個(gè)視野觀察值之均數(shù)作為各例的觀察值。結(jié)果陰性對(duì)照創(chuàng)傷后第4天，HE染色鏡下可見有幼稚肉芽組織增生，肉芽組織中有新生毛細(xì)血管形成，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、肥大。每視野內(nèi)炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞數(shù)目較多，成纖維細(xì)胞胞體較大，胞核呈圓形或橢圓形。創(chuàng)傷后第7天，可見有多量著色較深的成纖維細(xì)胞，血管增生活躍，炎癥細(xì)胞數(shù)量較少，可見新生增厚的上皮細(xì)胞層。陽'性^f照ia創(chuàng)傷后第4天，有眾多新生的毛細(xì)血管生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，炎癥細(xì)胞浸潤較少，成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，散在分布，胞體大，胞漿染色較淡。創(chuàng)傷后第7天成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞數(shù)量增多，染色深，毛細(xì)血管數(shù)量減少。高劑量組鏡下見創(chuàng)傷后第4天，新生毛細(xì)血管生成較多，成纖維細(xì)胞數(shù)量較低劑量組和陰性對(duì)照多，細(xì)胞雖散在分布，但排列呈束狀，較為整齊，胞體大，胞漿染色較淡，局部有炎癥細(xì)胞聚集。創(chuàng)傷后第7天，成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，染色深，毛細(xì)血管數(shù)量減少。中劑量組創(chuàng)傷后第4天，有較多毛細(xì)血管生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，局部有炎癥細(xì)胞聚集，淡染的成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，散在分布，胞體大。創(chuàng)傷后第7天，成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞增多，毛細(xì)血管成分多。低劑量組創(chuàng)傷后第4天，有眾多新生毛細(xì)血管生成，血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，炎癥細(xì)胞浸潤較少，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，核呈圓形或橢圓形，染色較深。創(chuàng)傷后第7天，細(xì)胞成分多，有較多的炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞數(shù)量多，染色較深，毛細(xì)血管成分多。結(jié)果見表11表11復(fù)方兒茶軟膏對(duì)大鼠創(chuàng)面組織成纖維細(xì)胞的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注*與陰性對(duì)照比較PO.05由表ll可知，陽性組、高劑量組和中劑量組均能顯著的促進(jìn)創(chuàng)面愈合組織成纖維細(xì)胞的增生。在創(chuàng)傷修復(fù)、愈合過程中，其關(guān)鍵的步驟之一是肉芽組織的形成，肉芽組織的質(zhì)量好壞直接影響著創(chuàng)面的修復(fù)愈合程度及其預(yù)后。肉芽組織的本質(zhì)是大量的毛細(xì)血管和微小血管及豐富的成纖維細(xì)胞。肉芽組織在損傷后2~3天內(nèi)即可出現(xiàn)，自下而上，或從周圍向中心生長推進(jìn)，隨著時(shí)間推移，肉芽組織按其生長的先后順序，逐漸成熟。其主要形態(tài)為間質(zhì)的水分逐漸減少；炎性細(xì)胞減少并逐漸消失，部分毛細(xì)血管管腔閉塞，數(shù)目減少，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生越來越多的膠原纖維，同時(shí)成纖維細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，變?yōu)槔w維細(xì)胞，時(shí)間再長，膠原纖維量更多，細(xì)胞和毛細(xì)血管成分更少[15]。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)面生長情況符合這一過程，且陽性組、高劑量組和中劑量組均能促進(jìn)這一過程的完成，與陰性對(duì)照相比，能顯著的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。4.創(chuàng)面新生組織中總蛋白及羥脯氨酸含量的測(cè)定膠原是機(jī)體非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，由于其在結(jié)締組織中提供穩(wěn)定性而具有重要特殊性，它構(gòu)成創(chuàng)面的基質(zhì)。膠原是極少數(shù)含有羥脯氨酸的蛋白質(zhì)之一，因此通過測(cè)定創(chuàng)面羥脯氨酸的含量來反映創(chuàng)面膠原的含量，從而評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合的能力。樣本前處理于術(shù)后第4、7天，切取創(chuàng)面組織，去除皮下脂肪，吸干水分，取約200mg精密稱重，于-200C水箱冷凍保存，備用。組織勻漿液的制備取待測(cè)組織，纟安重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3000轉(zhuǎn)/分，離心10min,然后取組織勻漿上清，再用生理鹽水按l:4稀釋成2%的組織勻漿，待測(cè)。3.創(chuàng)面組織中總蛋白含量測(cè)定(考馬斯亮蘭法)蛋白質(zhì)分子具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白-NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過測(cè)定吸光度可計(jì)算出蛋白含量。操作步驟見表12表12蛋白含量測(cè)定操作表空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管蒸餾水(ml)0.563g/L標(biāo)準(zhǔn)液(ml)樣品(ml)考馬斯亮蘭顯色劑(ml)0.050.053.00.053.0混勻，靜置10分鐘，于595nm處，lcm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管OD值。計(jì)算公式蛋白含踏/^IH^I^III^Ix標(biāo)準(zhǔn)管濃度fe/丄)(1)標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值創(chuàng)面組織中羥脯氨酸的含量測(cè)定(消化法)羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二曱基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，通過測(cè)定吸光度值可計(jì)算出羥脯氨酸的含(l)消化見表13,各管混勻，370C水浴3小時(shí)表13羥脯氨酸含量測(cè)定操作表空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管雙蒸水(ml)0.252|ug/ml標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(ml)0.25檢測(cè)液(ml)0.25消化液(ml)0.050.050.05(2)測(cè)定①各管加試劑一0.5ml，混勻，室溫靜置10分鐘；②各管加試劑二0.5ml，混勻，室溫靜置5分鐘；③各管加試劑三l.Oml，混勻，600C水浴15分鐘，流水冷卻后，3500轉(zhuǎn)/分離心，IO分鐘，取上清在550nm處，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度。(2)計(jì)算公式組織中羥脯氨酸含量-測(cè)定管吸光度-空白管吸光度(標(biāo)準(zhǔn)管濃度蛋白含量(〃g/附伊ro,)=標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度X(2傳/附/)5.結(jié)果(1)組織總蛋白含量的測(cè)定創(chuàng)傷后第4天，陽性組的創(chuàng)面組織平均總蛋白含量與陰性對(duì)照的創(chuàng)面組織平均總蛋白含量相比有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO.01),高劑量組和中劑量組與陰性對(duì)照相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，低劑量組與陰性對(duì)照相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)，高、中、低劑量組與陽性對(duì)照相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。創(chuàng)傷后第7天，高、中劑量組和陽性組的創(chuàng)面組織平均總蛋白含量與陰性對(duì)照的創(chuàng)面組織平均總蛋白含量相比均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),低劑量組與陰性對(duì)照相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)，高劑量組和中劑量組與陽性對(duì)照相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)，低劑量組與陽性組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。各組創(chuàng)面總蛋白含量隨時(shí)間增長而增加。結(jié)果見表14表14創(chuàng)面組織中總蛋白含量的測(cè)定(7±s,g/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注與生理鹽水組比4交，*P<0.05，**P<0.01(2)創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定創(chuàng)傷后第4天，EGF組和高劑量組的創(chuàng)面組織中平均羥脯氨酸含量與陰性對(duì)照的相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組與生理鹽水組相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)，高、中、低劑量組與EGF組相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。創(chuàng)傷后第7天，高劑量組和中劑量組的創(chuàng)面組織平均羥脯氨酸含量與生理鹽水組的創(chuàng)面組織平均羥脯氨酸含量相比均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PO.Ol)，EGF組與生理鹽水組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組與生理鹽水組相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05),高、中、低劑量組與EGF組相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉0.05)。各組創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量隨時(shí)間增長而增加。結(jié)果見表15表15創(chuàng)面組織中鞋脯氨酸的含量測(cè)定(7±s,ng/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注與陰性對(duì)照比較，*P<0.05，**P<0.0權(quán)利要求1、一種用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏，它是由下列藥用原料配制而成兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠，原料的重量比為2∶0.5～1.5∶0.5～1.5∶1.5～3.5∶0.5～1.5∶3～10。2、如權(quán)利要求1所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏，其特征在于所述兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠的重量比為2:0.8~1.2:0.8~1.2:1.8~2.2:0.8-1.2:4~8。3、如權(quán)利要求1所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏，其特征在于所述兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠的重量比為2:1:1:2.4:1:5。4、一種用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于它是將兒茶、乳香和沒藥分別粉粹后混合，或?qū)翰?、乳香和沒藥混合后粉粹；將紅參的提取物和黃荒的提取物與上述混合物進(jìn)行混合得第二混合物；將白芨膠水浸泡加熱與第二混合物混合均勻后，進(jìn)行滅菌處理得到復(fù)方兒茶軟膏，所述藥用原料兒茶、乳香、沒藥、黃萊、紅參和白芨膠的重量比為2:0.5~1.5:0.5~1.5:1.5~3.5:0.5~1.5:3~10。5、如權(quán)利要求4所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于所述紅參的提取物是乙醇回流法提出得到的提取物。6、如權(quán)利要求5所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于它是用5~IO倍于紅參重量，體積濃度為50%的乙醇至少回流提取1次后，濃縮后的提取物濃縮液(回流提取的工藝過程)。7、如權(quán)利要求4所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于所述黃芙的提取物是黃芪的水煎煮提取物。8、如權(quán)利要求7所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于它是用110倍于黃芪重量的水，至少煎煮提取l次后，濃縮后的提取物濃縮液。9、如權(quán)利要求4所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于兒茶、乳香和沒藥分別粉粹后分別通過不低于卯目的過濾后在混合。10、如權(quán)利要求6或8所述用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏的配制方法，其特征在于所述紅參提取物濃縮液中每毫升相當(dāng)0.04-lg生藥；黃芪提取物濃縮液中每毫升相當(dāng)0.1~2.4克生藥。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于傷口愈合的復(fù)方兒茶軟膏及其配制方法。它是將兒茶、乳香和沒藥分別粉粹后混合，或?qū)翰?、乳香和沒藥混合后粉粹；將紅參的提取物和黃芪的提取物與上述混合物進(jìn)行混合得第二混合物；將白芨膠水浸泡加熱與第二混合物混合均勻后，進(jìn)行滅菌處理得到復(fù)方兒茶軟膏，所述藥用原料兒茶、乳香、沒藥、黃芪、紅參和白芨膠的重量比為2∶0.5～1.5∶0.5～1.5∶1.5～3.5∶0.5～1.5∶3～10?；钛?，行氣止痛，收斂消腫，收濕生肌之功效。其配制方法簡(jiǎn)單，質(zhì)量易控制，穩(wěn)定性好。文檔編號(hào)A61P17/02GK101357191SQ200810196908公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者易以木申請(qǐng)人:易以木