專利名稱：Vegf在治療妊娠中胎兒生長遲緩中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對與妊娠中胎兒生長遲緩相關(guān)的疾病的治療。
背景技術(shù)：
妊娠與子宮灌注的大大增加相關(guān)，這是由增加的母體心排血量及 滋養(yǎng)層驅(qū)動的子宮螺旋動脈改變引起。這種正常生理過程的失功與兩種 最有挑戰(zhàn)性的產(chǎn)科并發(fā)癥的發(fā)病有關(guān)，這兩種并發(fā)癥為先兆子癇(PET) 和胎兒生長受限(FGR),亦稱為子宮內(nèi)生長遲緩(IUGR)。
FGR最多影響到所有妊娠的8%，并且與高圍生期死亡率、長期神 經(jīng)病損及生命后期心血管疾病發(fā)病率的增加有關(guān)；沒有有效的循證治療。 嚴(yán)重的早期FGR發(fā)作影響1:500的妊娠，并與高死亡率及存活者中長期 并發(fā)癥有關(guān)。受影響的胎兒可能永遠不能達到可存活的分娩體重(至少 500 g),父母面對的是在終止妊娠或使胎兒在子宮內(nèi)死亡之間作出殘酷 的選擇。胎兒生長的較小改善(如至700 g的出生體重)及出生時妊娠 時間的較小改善(例如從26至28周)可較大改善存活率及發(fā)病率。
為了檢出懷有生長受限的胎兒的婦女，設(shè)計了現(xiàn)行的產(chǎn)前檢查。 可用的策略有很多，例如母體血清標(biāo)記物和子宮動脈多普勒(Doppler) 超聲檢查，它們可以預(yù)測婦女形成這些病癥的可能性。然而，現(xiàn)在沒 有能成功預(yù)防FGR形成的治療策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于這樣的研究(見下文)，即該研究首次在體內(nèi)動物模 型中證明，腺病毒介導(dǎo)的局部VEGF過表達可導(dǎo)致子宮血流量增加及 子宮動脈的舒張。低VEGF水平和降低的子宮血流量被包括在FGR的 病因之中。這些結(jié)果表明這樣的治療有用性，即通過增加VEGF表達以 改善遭受嚴(yán)重FGR的妊娠的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明，VEGF受體的激動藥對于治療與妊娠中胎兒生長遲緩相關(guān)的疾病是有用的。
可以在本發(fā)明中使用的活性藥劑及載體被記載于WO98/20027中。
具體實施例方式
本文使用的VEGF激動藥是一種結(jié)合VEGF結(jié)合受體的分子。具 體而言，激動藥可以結(jié)合flk-l/KDR或flt-l受體。
VEGF激動藥可以具有任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，VEGF激動藥可以是 例如上限至10個氨基酸、上限至20個氨基酸、上限至50個氨基酸或者 上限至100個氨基酸的肽或多肽。激動藥可類似地為修飾肽或類肽 (peptoid )?？梢赃M行任何合適的修飾，包括糖基化、硫酸化(sulphation )、 COOH-酰胺化和乙酰化，例如N-末端乙酰化。另外或或者，可以存在修_ 飾的氨基酸和/或L-氨基酸。
或者，可以使用非肽VEGF激動藥。例如，可以使用模擬與VEGF 受體相互作用的VEGF部分的形狀的小分子。
可對本發(fā)明中所使用的其序列與天然出現(xiàn)的VEGF不同的VEGF蛋 白進行工程化，以使其活性不同于天然出現(xiàn)的VEGF。例如，可對它們 進行工程化，以具有更強的VEGF活性。這種操作一般是使用本領(lǐng)域中 已知的重組技術(shù)在核酸水平上進行。
在一個優(yōu)選的實施方案中，VEGF激動藥為VEGF肽，或者編碼或 表達VEGF肽的基因構(gòu)建體。在一個更優(yōu)選的實施方案中，VEGF肽為 VEGF國A或VEGF國D。
在實施本發(fā)明時，VEGF肽、編碼這種肽的基因構(gòu)建體、VEGF激 動藥或編碼VEGF激動藥的核酸可以以任意合適的形式被送遞至血管， 優(yōu)選至動脈。優(yōu)選地，VEGF激動藥被給藥至子宮動脈。核酸的送遞可 以以不與載體相連的"棵露"形式或者借助基因治療載體。具體而言，可 以使用病毒載體或非病毒載體。
載體(特別是病毒載體)可用于本發(fā)明中，以實現(xiàn)核酸或構(gòu)建體向 待治療受試者的細胞基因組中的整合，或者以使所述核酸或構(gòu)建體在細 胞質(zhì)中保持游離。優(yōu)選整合載體。
本發(fā)明中使用的基因構(gòu)建體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的 途徑被整合至非病毒栽體或病毒基因組中。然后可以通過任何合適的 步驟將病毒基因組包裝于病毒外殼或病毒殼體中。具體而言，任何合的使用使得可以在培養(yǎng)物中生成本發(fā)明的病毒載體。合適的包裝系包
括由PA317細胞、Y-2細胞、CRE細胞、CRIP細胞、E-86-GP細胞、 Fly細胞、系293細胞和293GP細胞派生出來的細胞系。
本發(fā)明的VEGF激動藥可以通過任何給藥形式被給藥，例如局部給 藥、皮膚給藥、非消化道給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥或經(jīng)皮給藥；或者 通過直接注入至血液中、直接注入至動脈壁中或周圍；或者通過直接施 用于粘膜組織。優(yōu)選地，通過注入至子宮動脈中的方式給藥。
VEGF激動藥的送遞可以通過置于血管(例如子宮動脈)外部的植 入物的方式。這種植入物包含VEGF激動藥并且提供了該藥劑的蓄積池。
VEGF激動藥的送遞優(yōu)選地以包含可藥用載體的藥物制劑的形式。 可以使用任何合適的藥物制劑。
例如，合適的制劑可包括水性的及非水性的無菌注射溶液，所述溶 液可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、殺細菌性抗生素以及^:得所述制 劑與預(yù)定受體的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性的及非水性的無菌懸液，所 述懸液可以包含助懸劑和增稠劑。所述制劑可以存在于單劑量或多劑量 的包裝體中，例如密封的安瓿和玻璃小瓶，并且可以被保存于冷凍或冷 凍干燥(凍千的)條件下，僅需要加入無菌的液體載體例如注射用水， 隨后立即使用。
應(yīng)理解的是，除了以上具體提到的成分之外，本發(fā)明的制劑可包含 本領(lǐng)域中常見的與目的制劑類型相關(guān)的其他藥劑。在可能的制劑中，優(yōu) 選無菌無熱源的水性的及非水性的溶液。
VEGF激動藥的送遞可以以任何合適的劑量并且可以使用任何合適 的給藥方案(dosage regime )。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可以才艮據(jù)多種因 素調(diào)整給藥量和給藥方案，以確對保待治療的具體病癥的最佳治療。一 些這種因素可以是待治療受試者的年齡、性別和臨床狀況。
用于通過病毒或非病毒栽體的方式送遞VEGF基因構(gòu)建體的劑量 將依賴于多種因素，包括載體將VEGF核酸送遞至細胞的效率以及 VEGF核酸在細胞內(nèi)表達的效率。劑量時間表也隨例如給藥途徑、受體 的物種及受體的狀況而變。然而，單劑量以及持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月的多劑量均被考慮。 研究
材料和方法
妊娠88天-102天之間(145天的妊娠期)的6只懷有單胎(n = 3 ) 或雙胎(n = 3)的Romney養(yǎng)殖母羊被用于這些實驗中。在接受陰道內(nèi) 孕酮栓劑(制造商)2周以誘導(dǎo)排卵之后，定時地將母羊交配。在整夜 斷飼料后，以硫賁妥鈉IV (20mg/kg，制造商)在母羊中誘導(dǎo)全身麻醉。 將母羊以11號氣管導(dǎo)管(Jorgen Kruuse， Denmark )插管，并通過Manley MP5通風(fēng)機(Blease Medical Equipment Ltd, UK)保持在含2%氟烷的 02中。在整個過程中測量母羊的脈率和呼吸速率、血壓、氧和二氧化碳 飽和度，以及核心溫度。母羊接受0.1 mg/kg 1M的丁丙諾啡(Alstoe Animal Health, UK)用于鎮(zhèn)痛，以及青鏈霉素(Penstrep )(普魯卡因青 霉素200 mg/ml和碌u酸雙氫鏈霉素250 mg/ml， Norbrook Laboratories Ltd，UK)以預(yù)防感染。這些母羊在拔管之后恢復(fù)。在手術(shù)的第二天^^用 超聲在所有動物中監(jiān)測胎兒存活情況和健康。在動物身上進行的所有步 驟均依照英國內(nèi)政部(UK Home Office)條例和Guidance for the Operation of Animals ( Scientific Procedures ) Act (1986 )進行。
##應(yīng)乂乙絲聲趁克.
Acuson 128 XP10超聲掃描儀(Siemens, Bracknell, UK)被用于所有 超聲成像。在手術(shù)前根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的測量評估胎兒的生物測量(fetal biometry),并用于確證確切的孕齡(Barbera A， Jones OW et al" 1995; Kelly RW & Newnham JP， 1989;Kelly RW & Newnham JP， 1989 )。向母
羊通風(fēng)30分鐘，以達到一個穩(wěn)定態(tài)的母體氧和二氧化碳水平、^^率和呼 吸速率以及溫度。使用Acuson C3 3.5MHz曲線型轉(zhuǎn)換器(curvilinear transducer)通過彩色多普勒測量評估子宮動脈中的血流。髂外動脈在其 從母體腹股溝流向下肢時被識別。子宮動脈(UtA)就在其與髂外動脈 交叉(cross over)時而被識別，并獲得具有至少3個完整心動周期的多 普勒波形。放置該轉(zhuǎn)換器，使得UtA與轉(zhuǎn)換器成90。。測量在以彩色多 普勒像素描繪的腔的外壁之間與血管腔垂直的血管直徑(D)。降低色彩 增益，直至血管滲色(vessel bleed)消除。然后調(diào)整轉(zhuǎn)換器，使得UtA 血流的方向與轉(zhuǎn)換器平行，并且最大在35。以內(nèi)。增大門(gate)以包圍所有的血管。然后在完成的心動周期上選擇波形，然后用這些周期產(chǎn)生
計算機生成的時間平均的平均流速(TAMx( time-average mean velocity )， m/sec )和峰值流速(Vmax )。 UtA血流量被確定為平均流速和該點的動 脈橫截面積的積，其中根據(jù)下式進行測量
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還從每個UtA記錄計算機生成的搏動指數(shù)(PI)和阻力指數(shù)(RI), 重復(fù)三次。還使用多普勒測速在臍的游離環(huán)(free loop)中檢查臍動脈 (UmA)并測定PI和RI。每條子宮動脈或臍動脈均測量3次，取測 量的平均值。
參參斧W手術(shù)'
外科手術(shù)在嚴(yán)格的無菌條件下進行。經(jīng)中線剖腹手術(shù)切開母羊的 腹部，并辨別出子宮動脈。在主血管的最近端部位手工地將主血管閉 合，并將包含VEGF-A ( n = 5母羊)或VEGF-D ( n = 1母羊)基因(10 ml生理鹽水中有5 x 1011個顆粒)的腺病毒載體經(jīng)23號(Gauge )針 頭和注射器用1分鐘緩慢地注入。將閉塞再保持4分鐘，以得到5分 鐘的總閉塞時間。用包含LacZ報告基因的腺病毒載體在對側(cè)重復(fù)該 操作。在整個實驗中，操作人員不知道哪一側(cè)已經(jīng)接受了 VEGF-A腺 病毒栽體。以Mersilene帶(制造商)封閉腹直肌鞘并且用1/0絲(制 造商)縫合皮趺。
彝岸
在外科手術(shù)后4-7天將母羊如上所述再次麻醉。向母羊通風(fēng)30分 鐘，以達到穩(wěn)定狀態(tài)，并使母體氧氣和二氧化碳水平、脈率和呼吸速 率及溫度盡可能地與手術(shù)前接近。然后，如上文詳細描述的重復(fù)進行 多普勒測量。將UtA及其分支從組織剝離開并松弛地打結(jié)。雖然處于麻 醉狀態(tài)，但還是使用過量的靜脈內(nèi)戊巴比妥(Euthatal, Rhone Merieux, Essex UK)使母羊安樂死。將UtA及其分支捆綁并無張拉地移出，置于 具有以下組成(以mM為單位)的Krebs-Henseleit緩沖液(pH 7.4 )中 115.21 NaCl、 4.7 KCl、 1.80 CaCl2、 1.16 MgS04、 1.18 KH2P04、 22.14 NaHC03、 11.1葡萄糖和0.03 Na2EDTA。清除動脈上脂肪和粘附組織， 并將它們分成5段用于分析。
器官浴實驗
將來自兩側(cè)的動脈分開，并切割成單個的環(huán)段(長度2-3 mm)。在包含Krebs-Henseldt緩沖液的25 ml器官浴液(用95% 02-5% C02 的混合物平衡以得到7.3-7.4的pH)中，每個環(huán)均被懸浮于兩個L-形的 不銹鋼針之間。將溫度保持在37。C下。將環(huán)拉伸至等效于lgr的被^張 力，以使得可以最大地檢測活性張力。在拉伸后，將環(huán)平衡lh，在該時 間過程中每15 min洗滌它們一次。在每次實驗開始時，將環(huán)段以KC1 (70 mM )去極化，以確定血管的最大收縮能力。然后，以Krebs-Henseleit 緩沖液將環(huán)徹底地洗滌，并使之平衡。內(nèi)皮的功能完整性被常規(guī)地確證， 即通過在以苯腎上腺素(PE ) (10_6 M)獲得的收縮過程中緩激肽(BK) 10"M誘導(dǎo)的舒張的存在。為了研究收縮，確定了 PE (1(T9M-10-5M) 的濃度-反應(yīng)曲線。為了研究內(nèi)皮依賴的舒張，以PE (EC7o)將血管預(yù) 收縮并構(gòu)建BK (10-1()M-l(r5M)的累積舒張曲線。 邀歡夢
將組織樣品在10%福爾馬林中固定過夜，轉(zhuǎn)移至70%乙醇中并包 埋于石蠟中。以蘇木精和伊紅染色切片，用于形態(tài)學(xué)評估。先使用小鼠 單克隆抗體(Promega， Southampton),然后進4亍標(biāo)準(zhǔn)的親和素-生物素 過氧化物酶方法，通過免疫組織化學(xué)檢測P-半乳糖苷酶。通過免疫組織 化學(xué)檢測VEGF。
丄"cZ孩普差^種或這
4吏用市售的測定試劑盒(Boehringer Mannheim， Mannheim, Germany)通過ELISA確定子宮動脈及其分支以及胎盤及其附屬物中 的P-半乳糖苷酶水平。將P-半乳糖苷酶水平標(biāo)準(zhǔn)化為各樣品的蛋白含量， 所述蛋白含量是通過二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)蛋白測定系統(tǒng)
(Pierce, Illinois)確定?；蛘?，將組織在100%乙醇中固定過夜，然后 用PBS洗滌。通過將所述組織與5-溴-4-氯-3-吲哚基-(5-D-半乳糖苷
(X-gal)在黑暗中孵育過夜，檢測了 p-半乳糖苷酶表達的組織化學(xué)定位。 將標(biāo)本在100%曱醇中脫水，并轉(zhuǎn)移至苯曱酸節(jié)酯和苯曱醇的混合物(2:1 v/v)中。在組織透明后，將樣品在解剖顯微鏡下使用數(shù)字照相機
(Olympus)進行拍照。 遂#浙
根據(jù)需要，使用Student's "檢驗分析數(shù)據(jù)。使用Minitab數(shù)字 (Minitab number )及(制造商)進行利用 一般線性模型(General Linear Model)函數(shù)和Tukey成對比較的雙尾ANOVA,用于UABF血流量分析。所有值表達為平均值士S.E.M或平均值士SD。對于器官浴實驗，收縮 效應(yīng)表達為對KC1 (70mM)反應(yīng)的百分比。舒張表達為對苯腎上腺素-誘導(dǎo)的收縮的抑制百分比。產(chǎn)生半-最大效應(yīng)(EQ。值)的激動藥濃度表 達為pD2 (-log ECso)。通過非配對,-檢驗和雙尾ANOVA比較pDz值。w 值表示供體的數(shù)目?？山邮艿慕y(tǒng)計顯著性為P<0.05。 結(jié)果
實驗步驟之后的存活率為100%,對尸體檢查沒有發(fā)現(xiàn)明顯的胎兒 或母羊的病態(tài)。母體脈率、呼吸速度和血壓沒有被腺病毒載體的注入顯 著地改變。
#義應(yīng)乂" 絲被
腺病毒VEGF-A或lacZ的送遞增加了每只動物的注入側(cè)子宮動樂，血 流量，但這種增加在VEGF-A側(cè)要大的多。平均從408 ml/min( ± SD 273， 范圍159 - 925 )增加至1321 ml/min (± SD 727，范圍391 - 2505 )。 p值 顯示于表l中(下文)。
子宮動脈血流量在腺病毒lacZ注入側(cè)也從561 ml/min (± SD 281， 范圍195 - 862 )的均值增加至755 ml/min (± SD 193,范圍461 - 1040 ) 的均值?？傋訉m動脈血流量平均增加1106 ml/min (±SD 767，范圍286-2564 )o
利用使用GLIM函數(shù)和Tukey成對比較的雙尾ANOVA,在注入 VEGF-A之前或之后的血流量中觀察到最顯著的差異(p = 0.005 )。 VEGF-A注入之后的血流量與lacZ注入之前的血流量相比也是顯著升高 的(p = 0.019 ),但與lacZ注入之后的血流量沒有顯著差異(p = 0.085 )。 lacZ注入之前的血流量與VEGF-A注入之前相比或者與lacZ注入之后 相比沒有顯著差異。
表l
/ac2^
IacZ前0.0190.卯20.940
VEGF前0.0050.600
lacZ后0.085
VEGF-D的注入在一只母羊中沒有增加子宮動脈血流 (VEGF-D 注入側(cè)注入之前1059 ml/min ± SD 105與之后1017 ml/min ± SD 76;lacZ注入側(cè)之前702 ml/min ± SD 20與之后724 ml/min ± SD 74 )。
還使用多普勒測速研究了臍動脈的血流量。在注入VEGF-A或
VEGF-D之前和之后Pl、 Rl或胎兒心率均沒有顯著變化。 器紹賴
苯腎上腺素產(chǎn)生了濃度依賴的收縮，這種收縮在以Ad.VEGF-A轉(zhuǎn) 導(dǎo)的動脈中的幅度比在以Ad.lacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)的血管中的低(Emax分別為148± SEM 10.9和228.2± SEM 27.5;兩組都是n=6; P< 0.05 )。緩激肽(10" 一 l(T6moI/L)引起了內(nèi)皮依賴的舒張。該舒張在以Ad.VEGF-A轉(zhuǎn)導(dǎo)的動 脈中比在以Ad.lacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)的血管中的顯著增大(pD2(-log EC50)值分別為 9.11±0.01和8.65士0.11;兩組都是n-6; P< 0.05 )。 5只動物均接受VEGF-A， l只接受VEGF-D。
使用VEGF ELISA分析(R and D systems, MN， USA)在4只動物 的UtA和1只動物的胎盤及其附屬物(placentome )中檢測VEGF蛋白 表達，并且以VEGF的免疫組織化學(xué)進4亍確證。
以腺病毒lacZ載體注入的子宮動脈表達了 p-半乳糖苷酶。在組織取 樣的第二天進行的X-gal染色顯示在3只動物的子宮動脈中有陽性lacZ 表達。
通過ELISA的定量顯示了 p-半乳糖苷酶在同樣這3只動物的子宮動 脈及分支中具有顯著的表達水平。取自其他兩只動物的子宮動脈樣品太 少不足以分析，這可能導(dǎo)致了這些動物中的陰性結(jié)果。
在所有實例中，以腺病毒VEGF-A或VEGF-D注入的子宮血管作為 陰性對照被分析，并且通過Xgal組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)或ELISA分 析顯示無LacZ表達。
討論
在該研究中，在懷孕的綿羊中檢查了腺病毒-介導(dǎo)的VEGF的局部表 達對子宮動脈的影響。使用多普勒超聲測速，檢查了子宮動脈中的血流 量，并且已經(jīng)證明在接受腺病毒VEGF載體的 一側(cè)與以攜帶報告基因的 腺病毒注入的對側(cè)對照相比顯示出了顯著增加。
當(dāng)對這些子宮動脈進行體外檢查的時候，與對照側(cè)相比，它們對緩 激肽的舒張反應(yīng)是顯著增強的，并且它們對苯腎上腺素的收縮反應(yīng)是顯著減弱的。這些結(jié)果表明VEGF表達出現(xiàn)于注射的子宮動脈中，并且這 一點受VEGF和P-半乳糖苷酶的免疫組織化學(xué)、X-gal組織化學(xué)和P-半 乳糖苷酶ELISA的結(jié)果的支持。
該研究的結(jié)果表明，如果給予VEGF,那么到子宮動脈的血流量會 顯著地增加。這種血流量的增加可能足以獲得胎兒生長的增加并使得在 適于存活的出生體重和孕齡情況下將嬰兒娩出。
權(quán)利要求
1.一種用于治療與妊娠中胎兒生長遲緩相關(guān)的疾病的VEGF受體激動藥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的激動藥，所述激動藥為一種VEGF肽或者編 碼或表達這種肽的基因構(gòu)建體。
3. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的激動藥，用于子宮內(nèi)生長遲緩的治療。
4. VEGF受體的激動藥用于制造一種藥劑中的用途，所述藥劑用于 與妊娠中胎兒生長遲緩相關(guān)的疾病的治療。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述激動藥為一種VEGF肽或者 編碼或表達這種肽的基因構(gòu)建體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5的用途，用于子宮內(nèi)生長遲緩的治療。
全文摘要
VEGF受體的激動藥可用于治療與胎兒生長遲緩相關(guān)的疾病例如子宮內(nèi)生長遲緩。所述VEGF激動藥可以為一種VEGF肽或者編碼或表達這種肽的基因構(gòu)建體。
文檔編號A61K38/19GK101622006SQ200880006142
公開日2010年1月6日 申請日期2008年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月26日
發(fā)明者C·H·露德克, J·F·馬丁 申請人:Ark治療學(xué)有限公司